JP2003048897A - 抗菌たんぱく質の製造方法 - Google Patents
抗菌たんぱく質の製造方法Info
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
(57)【要約】
【課題】 抗菌たんぱく質の製造方法を提供する。
【解決手段】 誘導耐性を生起するように処理された植
物の葉抽出物についてのたんぱく非変性分画化法と抗病
原性アッセイの組合せを使用する。
物の葉抽出物についてのたんぱく非変性分画化法と抗病
原性アッセイの組合せを使用する。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、抗菌たんぱく質の
製造方法に関する。
製造方法に関する。
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】（関連
技術）本発明は植物から単離したたんぱく質を用いた菌
類増殖の阻害に関する。本発明は活性な該たんぱく質の
調製方法およびその機能的成型物を提供する。また、本
発明には該たんぱく質をコードする遺伝子を構成的に、
もしくは植物の１つ以上の部分で調節的に発現させるこ
とを特徴とする菌類感受性が低下した植物および該植物
の作製方法が含まれる。 （関連分野）抗菌活性を有する植物たんぱくは公知であ
る。大豆から精製されたキチナーゼはTrichoderma vird
e菌（fungus）の増殖の阻害を起す（Sch1umbaum et a
1.,（1986）, Nature 324, 365-367）。寒天プレートテ
ストでトリコデルマビリデ（Trichoderma viride）に関
する阻害効果を示すエンドウマメのキチナーゼに関して
はマウチ（Mauch）等（1988, Plant Physiol, 88, 936-
942）の報告がある。しかし、この酵素はたとえば子嚢
菌であるクラドスポリウムククメリナム（C1adosporium
cucumerinum）には限定された効果を示すが、とりわけ
卵菌類のフィトフソラカクトラム（Phytophthoracactor
um）、フィチウムアファニデルマタム（Phytium aphani
dermatum）およびフィチウムアルチマム（Pythium u1ti
mum）の増殖には効果を示さない。このようにこの酵素
には限られた範囲にしかその効果を示さないという重大
な欠点がある。同様のテストでβ−1，3−グルカナーゼ
にはフサリウムサラニ f. sp. ピサイ（Fusarium so1an
i f. sp. pisi）の増殖阻害効果があることが確かめら
れた。トマト由来のエンド−β−1，3−グルカナーゼ精
製物と菌類由来のニクソ−β−1，3−グルカナーゼを組
合せた、バーチシリウムアルボートラム（Verticillium
alboatrum）の細胞壁単離物に関する加水分解効果を有
する調製物がヤング（Young）およびペグ（Pegg）によ
って報告されている（1982, Physiol. Plant Patho1, 2
1, 411-423）。いずれの酵素も自分自身のものには効果
を示さない。
技術）本発明は植物から単離したたんぱく質を用いた菌
類増殖の阻害に関する。本発明は活性な該たんぱく質の
調製方法およびその機能的成型物を提供する。また、本
発明には該たんぱく質をコードする遺伝子を構成的に、
もしくは植物の１つ以上の部分で調節的に発現させるこ
とを特徴とする菌類感受性が低下した植物および該植物
の作製方法が含まれる。 （関連分野）抗菌活性を有する植物たんぱくは公知であ
る。大豆から精製されたキチナーゼはTrichoderma vird
e菌（fungus）の増殖の阻害を起す（Sch1umbaum et a
1.,（1986）, Nature 324, 365-367）。寒天プレートテ
ストでトリコデルマビリデ（Trichoderma viride）に関
する阻害効果を示すエンドウマメのキチナーゼに関して
はマウチ（Mauch）等（1988, Plant Physiol, 88, 936-
942）の報告がある。しかし、この酵素はたとえば子嚢
菌であるクラドスポリウムククメリナム（C1adosporium
cucumerinum）には限定された効果を示すが、とりわけ
卵菌類のフィトフソラカクトラム（Phytophthoracactor
um）、フィチウムアファニデルマタム（Phytium aphani
dermatum）およびフィチウムアルチマム（Pythium u1ti
mum）の増殖には効果を示さない。このようにこの酵素
には限られた範囲にしかその効果を示さないという重大
な欠点がある。同様のテストでβ−1，3−グルカナーゼ
にはフサリウムサラニ f. sp. ピサイ（Fusarium so1an
i f. sp. pisi）の増殖阻害効果があることが確かめら
れた。トマト由来のエンド−β−1，3−グルカナーゼ精
製物と菌類由来のニクソ−β−1，3−グルカナーゼを組
合せた、バーチシリウムアルボートラム（Verticillium
alboatrum）の細胞壁単離物に関する加水分解効果を有
する調製物がヤング（Young）およびペグ（Pegg）によ
って報告されている（1982, Physiol. Plant Patho1, 2
1, 411-423）。いずれの酵素も自分自身のものには効果
を示さない。
【０００２】インヒドロのテストで有意な抗菌効果を示
すチオニン、とりわけ大麦、とうもろこし、小麦、ライ
麦およびいくつかの双子葉植物由来のチオニンがボール
マン（Bohlmann）によって報告されている。さらに、抗
生物質の菌類阻害活性の促進効果を有する植物たんぱく
質が国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８８／３４２０に報告さ
れている。一般にこれらの植物たんぱく質は相乗抗菌た
んぱく質またはＳＡＦＰと呼ばれる。ＳＡＦＰはそれ自
身植物病原菌に対して活性を持つポリオキシンおよびニ
コマイシンと組合せて用いられる。すなわちＳＡＦＰと
組合せることによりその効果を１０〜１００倍も増加す
ることができる。ＳＡＦＰ自身は抗菌作用を持たない。
植物においてキチナーゼおよびグルカナーゼは他のいわ
ゆる病原関連（ＰＲ−）たんぱく質と同様に、とりわけ
不適合性植物病原により開始する過敏性応答として知ら
れている現象を伴うことが分っている。実際に、この過
敏性応答により広範囲の病原に対する植物の耐性が発現
される。同様に、ＰＲたんぱく質の合成は菌類細胞壁断
片、サリチル酸塩など多くの生物性および非生物性の因
子によって誘導され、植物の巾広い病原耐性が得られ
る。非適合病原または生物的因子または非生物因子また
は化学物質による。誘導を介して得られるこれらの耐性
は“誘導耐性"と呼ばれる。この誘導耐性やこれらのＰ
Ｒたんぱく質の役割についてはなお多くの研究が必要で
あるがこれまでにいくらかの分類がなされている。タバ
コの場合、タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）による処
理により少なくとも５クラスのＰＲ関連たんぱく質が誘
導される。この分類は、分子量、血清学的関係、アミノ
酸配列ホモロジー、およびもし分子なら酵素活性などの
特性に基づいている。これらのクラスの中でさらに細胞
内および細胞外たんぱく質に分けられる。これらのたん
ぱく質はそれらの植物中における細胞に関する位置以外
に先に述べた特性に関して互いに対応づけられる（ボル
（Bo1）J. F.等、1990, Annu, Rev, Phytopathol. 28,
113-138）。これらのたんぱく質はいくぶん病原耐性に
関係していると考えられているので、ＰＲたんぱく質群
内の強力な抗病原性たんぱく質の同定について多大の努
力が払われている。
すチオニン、とりわけ大麦、とうもろこし、小麦、ライ
麦およびいくつかの双子葉植物由来のチオニンがボール
マン（Bohlmann）によって報告されている。さらに、抗
生物質の菌類阻害活性の促進効果を有する植物たんぱく
質が国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８８／３４２０に報告さ
れている。一般にこれらの植物たんぱく質は相乗抗菌た
んぱく質またはＳＡＦＰと呼ばれる。ＳＡＦＰはそれ自
身植物病原菌に対して活性を持つポリオキシンおよびニ
コマイシンと組合せて用いられる。すなわちＳＡＦＰと
組合せることによりその効果を１０〜１００倍も増加す
ることができる。ＳＡＦＰ自身は抗菌作用を持たない。
植物においてキチナーゼおよびグルカナーゼは他のいわ
ゆる病原関連（ＰＲ−）たんぱく質と同様に、とりわけ
不適合性植物病原により開始する過敏性応答として知ら
れている現象を伴うことが分っている。実際に、この過
敏性応答により広範囲の病原に対する植物の耐性が発現
される。同様に、ＰＲたんぱく質の合成は菌類細胞壁断
片、サリチル酸塩など多くの生物性および非生物性の因
子によって誘導され、植物の巾広い病原耐性が得られ
る。非適合病原または生物的因子または非生物因子また
は化学物質による。誘導を介して得られるこれらの耐性
は“誘導耐性"と呼ばれる。この誘導耐性やこれらのＰ
Ｒたんぱく質の役割についてはなお多くの研究が必要で
あるがこれまでにいくらかの分類がなされている。タバ
コの場合、タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）による処
理により少なくとも５クラスのＰＲ関連たんぱく質が誘
導される。この分類は、分子量、血清学的関係、アミノ
酸配列ホモロジー、およびもし分子なら酵素活性などの
特性に基づいている。これらのクラスの中でさらに細胞
内および細胞外たんぱく質に分けられる。これらのたん
ぱく質はそれらの植物中における細胞に関する位置以外
に先に述べた特性に関して互いに対応づけられる（ボル
（Bo1）J. F.等、1990, Annu, Rev, Phytopathol. 28,
113-138）。これらのたんぱく質はいくぶん病原耐性に
関係していると考えられているので、ＰＲたんぱく質群
内の強力な抗病原性たんぱく質の同定について多大の努
力が払われている。
【０００３】今日までの抗菌たんぱく質のスクリーニン
グおよび同定法は分子量、ｐＩ、または酵素活性などす
でに知られている性質を有するＰＲたんぱく質のスクリ
ーニングである。このことは特にキチナーゼおよびβ−
１，３−グルカナーゼについて行なわれている。これら
の酵素の基質はほとんどの病原体および、または寄生体
の細胞壁または外皮に生成する。この方法の欠点の１つ
は酵素（すなわちキチナーゼおよびグルカナーゼ）活性
と抗菌効果にはほとんどあるいは全く関係が見られず、
この事によりしばしば有意な抗菌効果がないと分子まで
に非常に手間のかかるたんぱく質の単離操作が必要なこ
とである。第２の欠点は大部分のＰＲたんぱく質がそう
であるように活性や機能が分っていないこれらのＰＲた
んぱく質を単離することが非常に困難であることであ
る。それゆえ、所定の病原に対して有意な抗病原効果を
有するたんぱく質を得るための有効で信頼性の高い方法
の開発が必要である。
グおよび同定法は分子量、ｐＩ、または酵素活性などす
でに知られている性質を有するＰＲたんぱく質のスクリ
ーニングである。このことは特にキチナーゼおよびβ−
１，３−グルカナーゼについて行なわれている。これら
の酵素の基質はほとんどの病原体および、または寄生体
の細胞壁または外皮に生成する。この方法の欠点の１つ
は酵素（すなわちキチナーゼおよびグルカナーゼ）活性
と抗菌効果にはほとんどあるいは全く関係が見られず、
この事によりしばしば有意な抗菌効果がないと分子まで
に非常に手間のかかるたんぱく質の単離操作が必要なこ
とである。第２の欠点は大部分のＰＲたんぱく質がそう
であるように活性や機能が分っていないこれらのＰＲた
んぱく質を単離することが非常に困難であることであ
る。それゆえ、所定の病原に対して有意な抗病原効果を
有するたんぱく質を得るための有効で信頼性の高い方法
の開発が必要である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】（本発明の概要）本発明
は抗病原活性を有するたんぱく質を得る方法を提供す
る。さらに本発明は該方法で得られる抗病原性たんぱく
質、特に抗菌たんぱく質を提供する。また、本発明に従
がう抗菌たんぱく質を含む新しい抗菌調製物が提供され
る。さらに、本発明は本発明の抗菌たんぱく質をコード
するオープンリーディングフレームの発現により菌類に
対する感受性が低減した植物を提供する。好ましい態様
において、植物内における抗菌たんぱく質の生産が細胞
該空隙への抗菌たんぱく質の移項を伴ない、これによっ
て抗菌効果の増加が起こる。
は抗病原活性を有するたんぱく質を得る方法を提供す
る。さらに本発明は該方法で得られる抗病原性たんぱく
質、特に抗菌たんぱく質を提供する。また、本発明に従
がう抗菌たんぱく質を含む新しい抗菌調製物が提供され
る。さらに、本発明は本発明の抗菌たんぱく質をコード
するオープンリーディングフレームの発現により菌類に
対する感受性が低減した植物を提供する。好ましい態様
において、植物内における抗菌たんぱく質の生産が細胞
該空隙への抗菌たんぱく質の移項を伴ない、これによっ
て抗菌効果の増加が起こる。
【０００５】
【発明の実施の形態】（本発明の詳細な説明）本発明
は、以下のステップ、 １）誘導耐性を示す植物の抽出物を調製する、 ２）抗病原性決定法で抗病原活性の存在に関し該抽出物
をテストする、 ３）たんぱく質精製法および抗病原性検定法を用いて抽
出物を分画することにより抗病原活性を精製する、 ４）該抗病原活性のたんぱく質性質を確証する、を含む
植物由来の抗病原性たんぱく質を得る新しい方法を提供
する。本明細書で用いている“病原体”という言葉は植
物の増殖、発生、バイオマス、生存力、栄養価または魅
力を減ずるような病気や他の影響を植物に起こし得る全
ての生物を意味し、それらにはネマトーダ、菌類、バク
テリア、ウィルスおよび昆虫などの寄生体などが含まれ
る。抗病原性検定は抽出物または画分の抗病原効果を該
抽出物または画分の部分標本を培地に投与するか、また
はそれを病原体に与える食物に添加し、その病原体を発
芽および、または増殖および、または発生を起こす条件
下で発芽および、または増殖および、または発生させる
ことにより測定する試験法である。本発明の好ましい態
様では以下に示すステップ； １）非適合性病原体を有する植物を、その植物中で耐性
を誘導する生物性、または非生物性因子で処理する、 ２）該植物の葉抽出物を調製する、 ３）葉抽出物を脱塩し、ついでこの葉抽出物を４℃でイ
ンキュベーションする、 ４）インキュベートした葉抽出物を遠心する、 ５）発見すべき抗菌たんぱく質が作用する菌類の存在
下、該菌類の増殖および、または発芽に適した条件下で
ステップ４）の遠心後に得られる葉抽出物上清の一部を
インキュベートし、かつ抗菌活性を含まないインキュベ
ーションとその菌類の増殖および、または発芽を比較す
ることにより該上清の抗菌活性を検定する、 ６）１つ以上の非変性たんぱく質分画法を用いて該上清
を分画する、 ７）ステップ５）で上清について説明した画分部分標本
のテストにより抗菌活性を含む画分を選択する、 ８）１つ以上の非変性たんぱく質分画法を用いて選択し
た画分をさらに精製する、 ９）もし必要なら抗菌たんぱく質が他のたんぱく質を実
質的に含まなくなるまでステップ７）および８）を繰り
返す、を含む植物から抗菌たんぱく質を得る方法が提供
される。
は、以下のステップ、 １）誘導耐性を示す植物の抽出物を調製する、 ２）抗病原性決定法で抗病原活性の存在に関し該抽出物
をテストする、 ３）たんぱく質精製法および抗病原性検定法を用いて抽
出物を分画することにより抗病原活性を精製する、 ４）該抗病原活性のたんぱく質性質を確証する、を含む
植物由来の抗病原性たんぱく質を得る新しい方法を提供
する。本明細書で用いている“病原体”という言葉は植
物の増殖、発生、バイオマス、生存力、栄養価または魅
力を減ずるような病気や他の影響を植物に起こし得る全
ての生物を意味し、それらにはネマトーダ、菌類、バク
テリア、ウィルスおよび昆虫などの寄生体などが含まれ
る。抗病原性検定は抽出物または画分の抗病原効果を該
抽出物または画分の部分標本を培地に投与するか、また
はそれを病原体に与える食物に添加し、その病原体を発
芽および、または増殖および、または発生を起こす条件
下で発芽および、または増殖および、または発生させる
ことにより測定する試験法である。本発明の好ましい態
様では以下に示すステップ； １）非適合性病原体を有する植物を、その植物中で耐性
を誘導する生物性、または非生物性因子で処理する、 ２）該植物の葉抽出物を調製する、 ３）葉抽出物を脱塩し、ついでこの葉抽出物を４℃でイ
ンキュベーションする、 ４）インキュベートした葉抽出物を遠心する、 ５）発見すべき抗菌たんぱく質が作用する菌類の存在
下、該菌類の増殖および、または発芽に適した条件下で
ステップ４）の遠心後に得られる葉抽出物上清の一部を
インキュベートし、かつ抗菌活性を含まないインキュベ
ーションとその菌類の増殖および、または発芽を比較す
ることにより該上清の抗菌活性を検定する、 ６）１つ以上の非変性たんぱく質分画法を用いて該上清
を分画する、 ７）ステップ５）で上清について説明した画分部分標本
のテストにより抗菌活性を含む画分を選択する、 ８）１つ以上の非変性たんぱく質分画法を用いて選択し
た画分をさらに精製する、 ９）もし必要なら抗菌たんぱく質が他のたんぱく質を実
質的に含まなくなるまでステップ７）および８）を繰り
返す、を含む植物から抗菌たんぱく質を得る方法が提供
される。
【０００６】精製の際、加熱および、またはプロテアー
ゼ処理により抗菌活性物のたんぱく質をテストすること
ができる。もし可能なら抗菌活性物の十分な精製および
それがたんぱく質であることの確認後、最良の精製結果
を得るためより選択的に次の分画または精製操作を選べ
るように分子量、等電点、疎水性、酵素活性等その物理
パラメータを測定する。先に述べた物理パラメータに基
づく至適たんぱく質精製操作（その組合せ）の選択はた
んぱく質精製の分野でよく知られている。推定では、た
とえば使用する植物原料と実際に精製した抗菌たんぱく
質に依存して、至適条件の確定には試行錯誤が必要であ
り、実験が不備なためと考えるべきではない。一度抗菌
たんぱく質が十分純粋となれば、他の植物病原菌類、動
物またはヒト病原菌類、バクテリア、ネマトーダである
可能性がある他の菌類に関する使用範囲を調べることが
できる。各々が全ての場合に、その安定性および、また
は抗菌効果に関する至適な濃度、ｐＨおよびイオン強度
を測定し得る。根や茎などの部分も含めてステップ１）
の種々の植物原料、および種々の植物変異体または植物
種を用いて本方法を行ない得る。誘導耐性を示す植物系
列、変異体または植物種を選ぶことが好ましい。実質的
に抗菌たんぱく質を他のたんぱく質および、または他の
物質から精製したならば該抗菌たんぱく質の（部分）ア
ミノ酸配列を決定する。このアミノ酸配列をヌクレオチ
ド配列に逆翻訳して一連のプローブを化学合成し、菌類
感受性が低減した植物を作製するのに使用し得る抗菌た
んぱく質（の一部分）をコードするｃＤＮＡまたはゲノ
ムクローンを単離し得る。おわりに、抗菌たんぱく質
（の一部分）をコードするｃＤＮＡ一またはＤＮＡフラ
グメントなどのオープンリーディングフレームは植物細
胞中での発現に必要な要素とうまく会合している。もし
この抗菌たんぱく質が細胞内たんぱく質であるなら、こ
のオープンリーディングフレームは発現の際、細胞外空
隙に該たんぱく質を移行させるよう変化させる。
ゼ処理により抗菌活性物のたんぱく質をテストすること
ができる。もし可能なら抗菌活性物の十分な精製および
それがたんぱく質であることの確認後、最良の精製結果
を得るためより選択的に次の分画または精製操作を選べ
るように分子量、等電点、疎水性、酵素活性等その物理
パラメータを測定する。先に述べた物理パラメータに基
づく至適たんぱく質精製操作（その組合せ）の選択はた
んぱく質精製の分野でよく知られている。推定では、た
とえば使用する植物原料と実際に精製した抗菌たんぱく
質に依存して、至適条件の確定には試行錯誤が必要であ
り、実験が不備なためと考えるべきではない。一度抗菌
たんぱく質が十分純粋となれば、他の植物病原菌類、動
物またはヒト病原菌類、バクテリア、ネマトーダである
可能性がある他の菌類に関する使用範囲を調べることが
できる。各々が全ての場合に、その安定性および、また
は抗菌効果に関する至適な濃度、ｐＨおよびイオン強度
を測定し得る。根や茎などの部分も含めてステップ１）
の種々の植物原料、および種々の植物変異体または植物
種を用いて本方法を行ない得る。誘導耐性を示す植物系
列、変異体または植物種を選ぶことが好ましい。実質的
に抗菌たんぱく質を他のたんぱく質および、または他の
物質から精製したならば該抗菌たんぱく質の（部分）ア
ミノ酸配列を決定する。このアミノ酸配列をヌクレオチ
ド配列に逆翻訳して一連のプローブを化学合成し、菌類
感受性が低減した植物を作製するのに使用し得る抗菌た
んぱく質（の一部分）をコードするｃＤＮＡまたはゲノ
ムクローンを単離し得る。おわりに、抗菌たんぱく質
（の一部分）をコードするｃＤＮＡ一またはＤＮＡフラ
グメントなどのオープンリーディングフレームは植物細
胞中での発現に必要な要素とうまく会合している。もし
この抗菌たんぱく質が細胞内たんぱく質であるなら、こ
のオープンリーディングフレームは発現の際、細胞外空
隙に該たんぱく質を移行させるよう変化させる。
【０００７】説明のため、オスモチン様たんぱく質の単
離および同定および引きつづく本たんぱく質をコードす
るｃＤＮＡのクローニングを例として以下に詳細に本発
明の原則を示す。さらに、この典型的例はトランスジェ
ニック植物中での該オスモチン様たんぱく質をコードす
るオープンリーディングフレームの高レベル発現により
菌類感受性が低減したトランスジェニック植物の作成法
を示している。本発明の特に好ましい態様では、この細
胞内オスモチン様たんぱく質がどのように細胞外空隙に
移行し、それが生産される植物の抗菌性を増加させるか
が示されている。オスモチン様たんぱく質が明白に述べ
られている場合、それらは単に本発明の方法の原則およ
びその結果を説明するのに使用したもので、そのような
オスモチン様たんぱく質に本発明を限定するものではな
い。従って、本方法で得られる他の抗菌たんぱく質も本
発明に含まれる。過敏性応答を起こす不適合病原体で植
物を処理した時、数日後、強い抗菌効果を示す画分を含
む接種葉抽出物が得られることが分った。また、抗菌活
性を含むさらに精製した画分にグルカナーゼ活性または
キチナーゼ活性が全く検出されなかったことから、タバ
コおよびトマト由来の多くの画分における菌類増殖の阻
害効果をβ−１，３−グルカナーゼまたはキチナーゼに
寄因させることができないことが分った。この抗菌活性
体は易熱性であるようである。タバコ由来の活性成分は
分子量約２４ｋＤで塩基性等電点を有するＡＰ２０（ま
たはＡＰ２４）と呼ばれる疎水性たんぱく質であると同
定された。ＡＰ２０のＮ末端のアミノ酸配列の精製およ
び決定後、この部分はタバコ内に生成することが知られ
ているたんぱく質で（サイン（Singh）,N. K.等、（198
7）Plant Physiol. 85, 529-536; シング（Sing）, N.
K.等、（1989）,Plant Physiol. 90, 1096-1101）、オ
スモチンまたはオスモチン様たんぱく質と呼ばれる一群
のたんぱく質の対応する部分と同じようだ。とりわけ高
濃度塩化ナトリウム、塩化カリウムまたはポリエチレン
グリコールを含む培地における植物細胞の浸透圧適応の
際に合成されることからこのたんぱく質にはオスモチン
様たんぱく質という名称が与えられた。しかし、オスモ
チン様たんぱく質の蓄積は浸透圧試薬の継続的存在に依
存すると思われる。塩化カドミウムなど非浸透圧試薬が
影響下ではその蓄積は起こらない（キング（King）等、
（1986）Plant Mol. Biol. 7, 441-449）。
離および同定および引きつづく本たんぱく質をコードす
るｃＤＮＡのクローニングを例として以下に詳細に本発
明の原則を示す。さらに、この典型的例はトランスジェ
ニック植物中での該オスモチン様たんぱく質をコードす
るオープンリーディングフレームの高レベル発現により
菌類感受性が低減したトランスジェニック植物の作成法
を示している。本発明の特に好ましい態様では、この細
胞内オスモチン様たんぱく質がどのように細胞外空隙に
移行し、それが生産される植物の抗菌性を増加させるか
が示されている。オスモチン様たんぱく質が明白に述べ
られている場合、それらは単に本発明の方法の原則およ
びその結果を説明するのに使用したもので、そのような
オスモチン様たんぱく質に本発明を限定するものではな
い。従って、本方法で得られる他の抗菌たんぱく質も本
発明に含まれる。過敏性応答を起こす不適合病原体で植
物を処理した時、数日後、強い抗菌効果を示す画分を含
む接種葉抽出物が得られることが分った。また、抗菌活
性を含むさらに精製した画分にグルカナーゼ活性または
キチナーゼ活性が全く検出されなかったことから、タバ
コおよびトマト由来の多くの画分における菌類増殖の阻
害効果をβ−１，３−グルカナーゼまたはキチナーゼに
寄因させることができないことが分った。この抗菌活性
体は易熱性であるようである。タバコ由来の活性成分は
分子量約２４ｋＤで塩基性等電点を有するＡＰ２０（ま
たはＡＰ２４）と呼ばれる疎水性たんぱく質であると同
定された。ＡＰ２０のＮ末端のアミノ酸配列の精製およ
び決定後、この部分はタバコ内に生成することが知られ
ているたんぱく質で（サイン（Singh）,N. K.等、（198
7）Plant Physiol. 85, 529-536; シング（Sing）, N.
K.等、（1989）,Plant Physiol. 90, 1096-1101）、オ
スモチンまたはオスモチン様たんぱく質と呼ばれる一群
のたんぱく質の対応する部分と同じようだ。とりわけ高
濃度塩化ナトリウム、塩化カリウムまたはポリエチレン
グリコールを含む培地における植物細胞の浸透圧適応の
際に合成されることからこのたんぱく質にはオスモチン
様たんぱく質という名称が与えられた。しかし、オスモ
チン様たんぱく質の蓄積は浸透圧試薬の継続的存在に依
存すると思われる。塩化カドミウムなど非浸透圧試薬が
影響下ではその蓄積は起こらない（キング（King）等、
（1986）Plant Mol. Biol. 7, 441-449）。
【０００８】タバコでは、水溶性型のオスモチン−Iお
よび相対的にプロテアーセ耐性で界面活性剤可溶型のオ
スモチン−IIの２つのオスモチンが報告されている。タ
バコの２つのオスモチンは約２４ｋＤの分子量で、大き
なアミノ酸配列の一致を示し、かつトマト（リコペルシ
コンエスリレンタム（Lycopersicon escu1entum））の
２４ｋＤオスモチン様たんぱく質や、サウマトコッカス
ダニエリ（Thaumatococcus daniellii）のサウマチン、
タバコの病原関連たんぱく質Ｓ（ＰＲ−Ｓ）および二機
能性とうもろこしトリプシン/α−アミラーゼインヒビ
ターを含むその他のたんぱく質に対する類似性を示す。
全てが血清学的に関連し、かつタバコおよびトマトのオ
スモチンに相当する分子量を有するオスモチン様たんぱ
く質で、とりわけキビ、大豆、ニンジン（ドーカスカロ
タ（Daucus carota））、綿、ポテト（ソラナムツベロ
サム（So1anum tuberosum））（サイン（Singh）等、
（1987）、P.N.A.S. USA 84, 739-743）、アルファルフ
ァ（メジカゴサチバ（Medicago sativa））およびソラ
豆（ファセラス（Phaseolus））（キング（king）等、
（1986）、上述）由来のものが報告されている。今日ま
で、オスモチンの効果は知られていなかった。一般にオ
スモチンは低水ポテンシャルに露した後に植物に浸透圧
耐性を与える機能を有すると考えられていた（たとえ
ば、グロセット（Grosset）等（1990）Plant Phys, 92,
520-527）。物理的パラメーター、すなわち、ほとんど
同じ分子量、タバコのオスモチン‐IIと同一でかつタバ
コのオスモチン‐Iおよびトマト（ＮＰ２４）のオスモ
チンとほとんど一致するアミノ酸配列および対応するｐ
Ｉ値が類似していることに基づき、実質的に抗菌たんぱ
く質ＡＰ２０は一種のオスモチンと結論づけた。抗菌効
果がオスモチン様たんぱく質の一般的特性であるという
仮定を確めるため、ＮＰ２４として知られているトマト
のオスモチン様たんぱく質のＰ．インフェスタンス（P.
infestans）への阻害能を調べた。ＮＰ２４は同様に抗
菌効果があると考えられた。
よび相対的にプロテアーセ耐性で界面活性剤可溶型のオ
スモチン−IIの２つのオスモチンが報告されている。タ
バコの２つのオスモチンは約２４ｋＤの分子量で、大き
なアミノ酸配列の一致を示し、かつトマト（リコペルシ
コンエスリレンタム（Lycopersicon escu1entum））の
２４ｋＤオスモチン様たんぱく質や、サウマトコッカス
ダニエリ（Thaumatococcus daniellii）のサウマチン、
タバコの病原関連たんぱく質Ｓ（ＰＲ−Ｓ）および二機
能性とうもろこしトリプシン/α−アミラーゼインヒビ
ターを含むその他のたんぱく質に対する類似性を示す。
全てが血清学的に関連し、かつタバコおよびトマトのオ
スモチンに相当する分子量を有するオスモチン様たんぱ
く質で、とりわけキビ、大豆、ニンジン（ドーカスカロ
タ（Daucus carota））、綿、ポテト（ソラナムツベロ
サム（So1anum tuberosum））（サイン（Singh）等、
（1987）、P.N.A.S. USA 84, 739-743）、アルファルフ
ァ（メジカゴサチバ（Medicago sativa））およびソラ
豆（ファセラス（Phaseolus））（キング（king）等、
（1986）、上述）由来のものが報告されている。今日ま
で、オスモチンの効果は知られていなかった。一般にオ
スモチンは低水ポテンシャルに露した後に植物に浸透圧
耐性を与える機能を有すると考えられていた（たとえ
ば、グロセット（Grosset）等（1990）Plant Phys, 92,
520-527）。物理的パラメーター、すなわち、ほとんど
同じ分子量、タバコのオスモチン‐IIと同一でかつタバ
コのオスモチン‐Iおよびトマト（ＮＰ２４）のオスモ
チンとほとんど一致するアミノ酸配列および対応するｐ
Ｉ値が類似していることに基づき、実質的に抗菌たんぱ
く質ＡＰ２０は一種のオスモチンと結論づけた。抗菌効
果がオスモチン様たんぱく質の一般的特性であるという
仮定を確めるため、ＮＰ２４として知られているトマト
のオスモチン様たんぱく質のＰ．インフェスタンス（P.
infestans）への阻害能を調べた。ＮＰ２４は同様に抗
菌効果があると考えられた。
【０００９】従って、タバコおよびトマトのオスモチン
様たんぱく質は抗菌活性を有し、それゆえ抗菌調製物に
使用するのに適していると結論した。植物界のオスモチ
ン様たんぱく質間の高いホモロジーから同様の抗菌活性
を有するタバコおよびトマトのオスモチン以外のオスモ
チンを予想できる。オスモチンまたはオスモチン様たん
ぱく質はタバコのオスモチンと比べて７０％以上、好ま
しくは８０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列お
よび塩基性ｐＩを有するたんぱく質で、少なくとも１種
の菌類に対する抗菌効果を有し、高ＮａＣｌ含有培地へ
の植物細胞の浸透圧的適応がその合成と相関しているた
んぱく質である。抗菌効果とは菌類の発芽、増殖およ
び、または分化の阻害効果または菌類の生存力および、
または感染性の低下を起こす他の作用を定義する。オス
モチンの単離には、たとえばウィルス、バクテリアまた
は菌類からなる群由来の非適合性病原体を植物に接種す
ることによりこのたんぱく質を誘導することが好まし
い。しかし、必しも植物に病原体を接種する必要はな
い。ＮａＣｌおよび、またはポリエチレングリコールで
植物または培養植物細胞を処理するなど他のオスモチン
合成の誘導法も使用し得る。このことで細胞中のオスモ
チン濃度を高くすることができる。全可溶性たんぱく質
の１２％までの蓄積レベルが報告されている（サイン
（Singh）等、（1987）Plant Physiol., 上述）。また
植物または植物細胞をＡＢＡ（アブシジン酸）で処理す
ることによりオスモチンの合成を誘導することができる
（サイン（Singh）等、（1987）P.N.A.S. 上述）。オス
モチンを単離できる植物としては（サイン（Singh）等
およびキング（King）等により、キビ、大豆、綿、トマ
トおよびポテトが報告されているが（サイン（Singh）
等、P.N.A.S. USA 84, 739-743；およびキング（King）
等、（1988）, Plant Mol. Biol. 10, 401-412）、タバ
コのオスモチンと十分なホモロジーがあるか、またはタ
バコのオスモチンに等しい物理的パラメーターを有する
場合はその他の植物由来のオスモチン（オスモチン様た
んぱく質）も十分な効果を有する。本発明の好ましい態
様では浸透圧試薬、乾燥、病原体、好ましくはタバコモ
ザイクウィルス（ＴＭＶ）などストレス因子で処理した
タバコ植物原料（培養細胞を含む）から、または菌類フ
ィトフソラインフェスタンス（Phytophthora infestan
s）またはアラキド酸で処理したトマト植物から単離し
たオスモチン様たんぱく質を利用している。
様たんぱく質は抗菌活性を有し、それゆえ抗菌調製物に
使用するのに適していると結論した。植物界のオスモチ
ン様たんぱく質間の高いホモロジーから同様の抗菌活性
を有するタバコおよびトマトのオスモチン以外のオスモ
チンを予想できる。オスモチンまたはオスモチン様たん
ぱく質はタバコのオスモチンと比べて７０％以上、好ま
しくは８０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列お
よび塩基性ｐＩを有するたんぱく質で、少なくとも１種
の菌類に対する抗菌効果を有し、高ＮａＣｌ含有培地へ
の植物細胞の浸透圧的適応がその合成と相関しているた
んぱく質である。抗菌効果とは菌類の発芽、増殖およ
び、または分化の阻害効果または菌類の生存力および、
または感染性の低下を起こす他の作用を定義する。オス
モチンの単離には、たとえばウィルス、バクテリアまた
は菌類からなる群由来の非適合性病原体を植物に接種す
ることによりこのたんぱく質を誘導することが好まし
い。しかし、必しも植物に病原体を接種する必要はな
い。ＮａＣｌおよび、またはポリエチレングリコールで
植物または培養植物細胞を処理するなど他のオスモチン
合成の誘導法も使用し得る。このことで細胞中のオスモ
チン濃度を高くすることができる。全可溶性たんぱく質
の１２％までの蓄積レベルが報告されている（サイン
（Singh）等、（1987）Plant Physiol., 上述）。また
植物または植物細胞をＡＢＡ（アブシジン酸）で処理す
ることによりオスモチンの合成を誘導することができる
（サイン（Singh）等、（1987）P.N.A.S. 上述）。オス
モチンを単離できる植物としては（サイン（Singh）等
およびキング（King）等により、キビ、大豆、綿、トマ
トおよびポテトが報告されているが（サイン（Singh）
等、P.N.A.S. USA 84, 739-743；およびキング（King）
等、（1988）, Plant Mol. Biol. 10, 401-412）、タバ
コのオスモチンと十分なホモロジーがあるか、またはタ
バコのオスモチンに等しい物理的パラメーターを有する
場合はその他の植物由来のオスモチン（オスモチン様た
んぱく質）も十分な効果を有する。本発明の好ましい態
様では浸透圧試薬、乾燥、病原体、好ましくはタバコモ
ザイクウィルス（ＴＭＶ）などストレス因子で処理した
タバコ植物原料（培養細胞を含む）から、または菌類フ
ィトフソラインフェスタンス（Phytophthora infestan
s）またはアラキド酸で処理したトマト植物から単離し
たオスモチン様たんぱく質を利用している。
【００１０】オスモチン様たんぱく質の単離のためには
遠心、クロマトグラフィー、電気泳動など一般に知られ
ているたんぱく質分画法を利用できる。調製には非変性
条件に基づく方法を用いることが好ましい。好ましい態
様ではゲルクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマ
トグラフィーを疎水相互作用クロマトグラフィーと組合
せて用いる。その溶出はＵＶスペクトルでモニターす
る。得た画分をフィトフソラ（Phytophthora）属の菌
類、好ましくはフィトフソラインフェスタンス（Phytop
hthora infestans）などオスモチン様たんぱく質に感受
性のある菌類の発芽処理した、または発芽処理していな
い胞子の増殖への阻害効果について分析する。その胞子
（μｌ当り１〜１００個、好ましくは５〜２０個の胞
子）はポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）など適当な
生育層でテストする。その菌類の発生および増殖は該画
分の添加後の特定の時間にその菌糸体を染色して容易に
測定できる。コントロール調製物と菌類胞子のインキュ
ベーションを比較して、その画分中の抗菌因子の存在を
決定する。易熱性抗菌活性を示す画分中のオスモチン様
たんぱく質の存在を電気泳動および、または、たとえば
タバコのオスモチンまたは病原関連たんぱく質Ｓ（ＰＲ
−Ｓ）に対する抗体を用いたイムノブロットで分析でき
る。オスモチンを含む画分をさらにたとえば疎水相互作
用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）または高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分画する。これらの
方法でほぼ純粋なたんぱく質が得られる。ここで述べた
方法に従がい植物からオスモチン様たんぱく質を単離す
ることができる。菌類増殖の阻害を目的としてオスモチ
ンは食料、化粧品、薬品の保存用に使用できるし、また
室内植物や農業作物への噴霧水中、およびフルーツ、野
菜やその他の穀物を一定期間保存する場合などオスモチ
ン誘導条件下菌類増殖を阻害したいあらゆる場合に使用
される。オスモチンは単独または適当なキャリヤーと共
に、また好ましい場合は、他の抗菌物質と組合せて、粉
末、顆粒、エアロゾル、溶液、ゲルまたは他の溶剤また
はキャリヤ物質の形で添加する。
遠心、クロマトグラフィー、電気泳動など一般に知られ
ているたんぱく質分画法を利用できる。調製には非変性
条件に基づく方法を用いることが好ましい。好ましい態
様ではゲルクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマ
トグラフィーを疎水相互作用クロマトグラフィーと組合
せて用いる。その溶出はＵＶスペクトルでモニターす
る。得た画分をフィトフソラ（Phytophthora）属の菌
類、好ましくはフィトフソラインフェスタンス（Phytop
hthora infestans）などオスモチン様たんぱく質に感受
性のある菌類の発芽処理した、または発芽処理していな
い胞子の増殖への阻害効果について分析する。その胞子
（μｌ当り１〜１００個、好ましくは５〜２０個の胞
子）はポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）など適当な
生育層でテストする。その菌類の発生および増殖は該画
分の添加後の特定の時間にその菌糸体を染色して容易に
測定できる。コントロール調製物と菌類胞子のインキュ
ベーションを比較して、その画分中の抗菌因子の存在を
決定する。易熱性抗菌活性を示す画分中のオスモチン様
たんぱく質の存在を電気泳動および、または、たとえば
タバコのオスモチンまたは病原関連たんぱく質Ｓ（ＰＲ
−Ｓ）に対する抗体を用いたイムノブロットで分析でき
る。オスモチンを含む画分をさらにたとえば疎水相互作
用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）または高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分画する。これらの
方法でほぼ純粋なたんぱく質が得られる。ここで述べた
方法に従がい植物からオスモチン様たんぱく質を単離す
ることができる。菌類増殖の阻害を目的としてオスモチ
ンは食料、化粧品、薬品の保存用に使用できるし、また
室内植物や農業作物への噴霧水中、およびフルーツ、野
菜やその他の穀物を一定期間保存する場合などオスモチ
ン誘導条件下菌類増殖を阻害したいあらゆる場合に使用
される。オスモチンは単独または適当なキャリヤーと共
に、また好ましい場合は、他の抗菌物質と組合せて、粉
末、顆粒、エアロゾル、溶液、ゲルまたは他の溶剤また
はキャリヤ物質の形で添加する。
【００１１】たとえば作用範囲を拡げるため調製物を製
造するときにオスモチンと組合せて、従来の菌類抗生物
質、ＳＡＦＰおよびポリオキシン、ニコマイシン、カル
ボキシミド、芳香族炭水化物、カルボキシン、モルホリ
ン、ステロール生合成インヒビター、有機リン化合物な
ど化学殺菌剤、グルカナーゼ、キチナーゼ、リゾチーム
などの酵素などその他の菌類阻害剤を使用する。単独ま
たは他の活性構成物と組合せたオスモチンは一般には１
μｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５μｇ／ｍ
ｌ〜５ｍｇ／ｍｌの最終目標を達成するのに効果的な濃
度でｐＨ３．０〜９．０の条件で使用すべきである。一
般に、緩衝液、たとえば１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは１０
ｍＭ〜１００ｍＭ、特に好ましくは１５〜５０ｍＭのリ
ン酸バッファを使用すること望ましく、もし低いバッフ
ァ濃度を使用する場合はイオン強度を高めるため１ｍＭ
〜１Ｍ1、好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度のＮ
ａＣｌを添加すること望ましい。本発明の特定の態様で
は１つ以上の植物部分でオスモチン（様）たんぱく質を
コードする１つ以上の遺伝子の構成的な発現、または、
植物の１つ以上部分でオスモチン遺伝子およびたとえば
グルカナーゼおよび、またはキチナーゼ遺伝子などを組
合せて同時に構成的に発現させることにより菌類に対す
る感受性を軽減したトランスジェニック植物が得られ
る。サイン（Singh）等により報告されている（1987, P
lant Physiol. 上述）タバコおよびトマト中の遺伝子、
すなわちキング（King）等（1988, Plant Mol. Biol.,
上述）により報告されているＮＰ２４をコードする遺伝
子に加えて、この目的のため、とりわけキビ、大豆、ポ
テト、トマト、ニンジン、綿などで生じるオスモチン遺
伝子が使用される。従来技術を使用し、タバコのオスモ
チン遺伝子の遺伝子フラグメントなどのポリスクレオチ
ドプローブまたはオスモチン遺伝子の既知配列に基づい
て合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて種々の
植物種由来のオスモチン様たんぱく質をコードする遺伝
子またはｃＤＮＡをいかに入手するかは分っている。一
般的従来技術で入手したオスモチン遺伝子フラグメント
を増殖し、そのＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列
を決定し、かつ１つ以上の植物部分でその遺伝子フラグ
メントの発現に必要な配列を含むベクターに適当な向き
にその遺伝子フラグメントまたはｃＤＮＡをクローニン
グすることができる。もしこの発現構築物を植物原料に
うまく投与すると、あらゆるまたは一部の植物部分でオ
スモチンたんぱく質（の一部）をコードする遺伝子また
は遺伝子フラグメントを発現するトランスホーム植物を
再生するのに使用し得るトランスホーム植物原料が得ら
れる。
造するときにオスモチンと組合せて、従来の菌類抗生物
質、ＳＡＦＰおよびポリオキシン、ニコマイシン、カル
ボキシミド、芳香族炭水化物、カルボキシン、モルホリ
ン、ステロール生合成インヒビター、有機リン化合物な
ど化学殺菌剤、グルカナーゼ、キチナーゼ、リゾチーム
などの酵素などその他の菌類阻害剤を使用する。単独ま
たは他の活性構成物と組合せたオスモチンは一般には１
μｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５μｇ／ｍ
ｌ〜５ｍｇ／ｍｌの最終目標を達成するのに効果的な濃
度でｐＨ３．０〜９．０の条件で使用すべきである。一
般に、緩衝液、たとえば１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは１０
ｍＭ〜１００ｍＭ、特に好ましくは１５〜５０ｍＭのリ
ン酸バッファを使用すること望ましく、もし低いバッフ
ァ濃度を使用する場合はイオン強度を高めるため１ｍＭ
〜１Ｍ1、好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度のＮ
ａＣｌを添加すること望ましい。本発明の特定の態様で
は１つ以上の植物部分でオスモチン（様）たんぱく質を
コードする１つ以上の遺伝子の構成的な発現、または、
植物の１つ以上部分でオスモチン遺伝子およびたとえば
グルカナーゼおよび、またはキチナーゼ遺伝子などを組
合せて同時に構成的に発現させることにより菌類に対す
る感受性を軽減したトランスジェニック植物が得られ
る。サイン（Singh）等により報告されている（1987, P
lant Physiol. 上述）タバコおよびトマト中の遺伝子、
すなわちキング（King）等（1988, Plant Mol. Biol.,
上述）により報告されているＮＰ２４をコードする遺伝
子に加えて、この目的のため、とりわけキビ、大豆、ポ
テト、トマト、ニンジン、綿などで生じるオスモチン遺
伝子が使用される。従来技術を使用し、タバコのオスモ
チン遺伝子の遺伝子フラグメントなどのポリスクレオチ
ドプローブまたはオスモチン遺伝子の既知配列に基づい
て合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて種々の
植物種由来のオスモチン様たんぱく質をコードする遺伝
子またはｃＤＮＡをいかに入手するかは分っている。一
般的従来技術で入手したオスモチン遺伝子フラグメント
を増殖し、そのＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列
を決定し、かつ１つ以上の植物部分でその遺伝子フラグ
メントの発現に必要な配列を含むベクターに適当な向き
にその遺伝子フラグメントまたはｃＤＮＡをクローニン
グすることができる。もしこの発現構築物を植物原料に
うまく投与すると、あらゆるまたは一部の植物部分でオ
スモチンたんぱく質（の一部）をコードする遺伝子また
は遺伝子フラグメントを発現するトランスホーム植物を
再生するのに使用し得るトランスホーム植物原料が得ら
れる。
【００１２】オスモチン遺伝子のコード領域（の一部）
を含むＤＮＡフラグメントの好ましい単離法はマニアチ
ス（Maniatis）等（1989、モレキュラークローニング;
ラボラトリーマニュアル、第２編、コールドスプリング
ハーバーラボラトリープレス）によって報告されている
ポリメレースチェーンリアクション（ＰＣＲ）法を利用
する、オスモチン遺伝子のヌクレオチド配列または精製
オスモチンの既知アミノ酸配列から誘導したヌクレオチ
ド配列を利用し、目的フラグメントの末端５’および
３’領域に相補的な合成オリゴヌクレオチドを作製する
ことで目的遺伝子フラグメントを得る。これらのオリゴ
ヌクレオチドをポリメリゼーションプライマーとして用
いて植物ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリー（好ましく
は浸透圧または病原体ストレスで刺激した植物細胞から
得たもの）にインビトロでハイブリダイズさせ、ポリメ
リゼーションサイクルを何回か行うことにより、目的の
フラグメントが選択的に増巾される。プライマーは増巾
フラグメントをベクターに容易にライゲーションできる
ように、線状化したクローニングベクターの末端に対応
する制限部位を内部に含めるよう合成する。つづいて単
離したフラグメントをクローン化し、さらに操作を行
う。このような遺伝子の全合成フラグメントを含む種々
のオスモチン様たんぱく質遺伝子から誘導される遺伝子
フラグメントの組合せ物を結合してキメラオスモチン様
たんぱく質をコードする単一のオープンリーディングフ
レームを生成することができる。
を含むＤＮＡフラグメントの好ましい単離法はマニアチ
ス（Maniatis）等（1989、モレキュラークローニング;
ラボラトリーマニュアル、第２編、コールドスプリング
ハーバーラボラトリープレス）によって報告されている
ポリメレースチェーンリアクション（ＰＣＲ）法を利用
する、オスモチン遺伝子のヌクレオチド配列または精製
オスモチンの既知アミノ酸配列から誘導したヌクレオチ
ド配列を利用し、目的フラグメントの末端５’および
３’領域に相補的な合成オリゴヌクレオチドを作製する
ことで目的遺伝子フラグメントを得る。これらのオリゴ
ヌクレオチドをポリメリゼーションプライマーとして用
いて植物ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリー（好ましく
は浸透圧または病原体ストレスで刺激した植物細胞から
得たもの）にインビトロでハイブリダイズさせ、ポリメ
リゼーションサイクルを何回か行うことにより、目的の
フラグメントが選択的に増巾される。プライマーは増巾
フラグメントをベクターに容易にライゲーションできる
ように、線状化したクローニングベクターの末端に対応
する制限部位を内部に含めるよう合成する。つづいて単
離したフラグメントをクローン化し、さらに操作を行
う。このような遺伝子の全合成フラグメントを含む種々
のオスモチン様たんぱく質遺伝子から誘導される遺伝子
フラグメントの組合せ物を結合してキメラオスモチン様
たんぱく質をコードする単一のオープンリーディングフ
レームを生成することができる。
【００１３】新しく誘導したたんぱく質を植物中で発現
させるため、発現構築物に転写プロモーターを含める必
要がある。場合によっては１つ以上のエンハンサーフラ
グメントを含めて、とりわけＣａＭＶ３５Ｓプロモータ
ー、いわゆるＴ−ＤＮＡプロモーター、または植物プロ
モーターが使用できる。組織特異的な、または発生的に
調節可能な、または他の調節可能な、または誘導可能な
プロモーターが使用できるが、一般には全ての、または
大部分の植物部分で機能を示す強カな構成的プロモータ
ーが使用される。たとえばもし植物病原性菌類が植物の
特定部分にのみ影響するが、または特定の植物部分を介
して侵入するなら調節可能な、たとえば組織特異的プロ
モーターカ有利である。植物内で機能するプロモーター
およびコード配列に加えて、発現構築物の中に転写エン
ハンサー、ＴＭＶのＲＮＡゲノムのリーダー配列のよう
な翻訳エンハンサー（ガリー（Gallie）, D.R.等（198
8）Nucl, Acids Res. 16, 883-893）、アルファルファ
モザイクウィルス（ＡＬＭＶ）ＲＮＡ４リーダーなどの
ｍＲＮＡ安定化リーダー配列、イントロン、ノパリンシ
ンテースターミネーター（Ｔｎｏｓ）など転写ターミネ
ーターおよびポリアデニレーションシグナルなどその他
の調節要素が含められる。望ましい様式で遺伝子発現レ
ベルに影響するようにこれらの要素を発現構築物にどの
ように使用するかはよく知られている。さらに遺伝子発
現を至適化するためにはｃＤＮＡクローンの代りにゲノ
ムクローンを使用することが望ましい。それとは別に、
もし望まれるなら合成イントロンをｃＤＮＡ配列に挿入
する。菌類阻害効果を得るには原則的にトランスジェニ
ック植物の全部たは一部の部分で高度の構成的または特
異的に調節されたオスモチン様たんぱく質の発現が起こ
ることで十分である。生成した野生型オスモチン様たん
ぱく質は植物細胞の空胞内に蓄積すると考えられてい
る。野生型オスモチン様たんぱく質遺伝子が発現すると
き抗菌効果が観察されることが分った。
させるため、発現構築物に転写プロモーターを含める必
要がある。場合によっては１つ以上のエンハンサーフラ
グメントを含めて、とりわけＣａＭＶ３５Ｓプロモータ
ー、いわゆるＴ−ＤＮＡプロモーター、または植物プロ
モーターが使用できる。組織特異的な、または発生的に
調節可能な、または他の調節可能な、または誘導可能な
プロモーターが使用できるが、一般には全ての、または
大部分の植物部分で機能を示す強カな構成的プロモータ
ーが使用される。たとえばもし植物病原性菌類が植物の
特定部分にのみ影響するが、または特定の植物部分を介
して侵入するなら調節可能な、たとえば組織特異的プロ
モーターカ有利である。植物内で機能するプロモーター
およびコード配列に加えて、発現構築物の中に転写エン
ハンサー、ＴＭＶのＲＮＡゲノムのリーダー配列のよう
な翻訳エンハンサー（ガリー（Gallie）, D.R.等（198
8）Nucl, Acids Res. 16, 883-893）、アルファルファ
モザイクウィルス（ＡＬＭＶ）ＲＮＡ４リーダーなどの
ｍＲＮＡ安定化リーダー配列、イントロン、ノパリンシ
ンテースターミネーター（Ｔｎｏｓ）など転写ターミネ
ーターおよびポリアデニレーションシグナルなどその他
の調節要素が含められる。望ましい様式で遺伝子発現レ
ベルに影響するようにこれらの要素を発現構築物にどの
ように使用するかはよく知られている。さらに遺伝子発
現を至適化するためにはｃＤＮＡクローンの代りにゲノ
ムクローンを使用することが望ましい。それとは別に、
もし望まれるなら合成イントロンをｃＤＮＡ配列に挿入
する。菌類阻害効果を得るには原則的にトランスジェニ
ック植物の全部たは一部の部分で高度の構成的または特
異的に調節されたオスモチン様たんぱく質の発現が起こ
ることで十分である。生成した野生型オスモチン様たん
ぱく質は植物細胞の空胞内に蓄積すると考えられてい
る。野生型オスモチン様たんぱく質遺伝子が発現すると
き抗菌効果が観察されることが分った。
【００１４】本発明の好ましい態様では細胞内オスモチ
ン（様）たんぱく質はそれをコードする遺伝子を修正す
ることで細胞外空隙に移行する。これを行うための１つ
の方法にはオスモチンｍＲＮＡにコードされている野生
型一次翻訳産物の約２０個のＣ末端アミノ酸の除去があ
る。これらが細胞内局在化を担っていると考えられてい
る。たんぱく質のＣ末端部分の除去は、たとえばその遺
伝子に翻訳停止コドンを導入し、その３’側に存在する
コドンをアミノ酸に翻訳されるのを妨ぐことによって行
うことができる。別法としては、オスモチン様たんぱく
質のＣ末端部分のアミノ酸配列をその機能を阻害するよ
う修正する。また、オープンリーディングフレームを野
生型オスモチンのＣ末端にさらにアミノ酸を付加するよ
うに延長してＣ末端の適当な機能を妨げ細胞外に移行さ
せることもできる。このたんぱく質を細胞外に指向させ
る方法それ自体はそのたんぱく質の修正がその抗菌効果
を完全に消失させない限り本発明にとって本質的なもの
ではない。たとえばタバコの葉ディスクにおいてオスモ
チン様たんぱく質の指向化で菌類Ｐ．ニコチアナ ヴァ
ル ニコチアナ（Nicotianae var nicotianae）への抗
菌効果の増加が見られた。特定の環境下で野生型細胞内
オスモチン様たんぱく質をコードする遺伝子および細胞
外指向型細胞内オスモチン様たんぱく質をコードする遺
伝子の両方を発現する植物を作製してより大きい抗菌効
果を得ること望ましい。新しく導入した遺伝子構築物の
発現レベルはウェスタンブロット法を用いて細胞外液中
のたんぱく質または全細胞たんぱく質を分析することに
より測定する。また、オスモチンｍＲＮＡに対するプロ
ーブをブロットにハイブリダイズさせるノーザンブロッ
ト分析でｍＲＮＡ量を測定できる。野生型または指向型
オスモチン様たんぱく質のいずれかをコードする適当な
発現レベルの遺伝子構築物でトランスホームした植物に
病原性菌類を接種することによりその耐性をテストす
る。このテストでは症状進行の速度および重度を野生型
植物と比較する。菌類耐性をテストする別の方法として
は植物全体ではなくトランスジェニック植物の葉ディス
クヘの菌類の影響を試験するものがある。この方法の利
点はいくぶん定量的に症状進行を検定することが比較的
に容易であることである。
ン（様）たんぱく質はそれをコードする遺伝子を修正す
ることで細胞外空隙に移行する。これを行うための１つ
の方法にはオスモチンｍＲＮＡにコードされている野生
型一次翻訳産物の約２０個のＣ末端アミノ酸の除去があ
る。これらが細胞内局在化を担っていると考えられてい
る。たんぱく質のＣ末端部分の除去は、たとえばその遺
伝子に翻訳停止コドンを導入し、その３’側に存在する
コドンをアミノ酸に翻訳されるのを妨ぐことによって行
うことができる。別法としては、オスモチン様たんぱく
質のＣ末端部分のアミノ酸配列をその機能を阻害するよ
う修正する。また、オープンリーディングフレームを野
生型オスモチンのＣ末端にさらにアミノ酸を付加するよ
うに延長してＣ末端の適当な機能を妨げ細胞外に移行さ
せることもできる。このたんぱく質を細胞外に指向させ
る方法それ自体はそのたんぱく質の修正がその抗菌効果
を完全に消失させない限り本発明にとって本質的なもの
ではない。たとえばタバコの葉ディスクにおいてオスモ
チン様たんぱく質の指向化で菌類Ｐ．ニコチアナ ヴァ
ル ニコチアナ（Nicotianae var nicotianae）への抗
菌効果の増加が見られた。特定の環境下で野生型細胞内
オスモチン様たんぱく質をコードする遺伝子および細胞
外指向型細胞内オスモチン様たんぱく質をコードする遺
伝子の両方を発現する植物を作製してより大きい抗菌効
果を得ること望ましい。新しく導入した遺伝子構築物の
発現レベルはウェスタンブロット法を用いて細胞外液中
のたんぱく質または全細胞たんぱく質を分析することに
より測定する。また、オスモチンｍＲＮＡに対するプロ
ーブをブロットにハイブリダイズさせるノーザンブロッ
ト分析でｍＲＮＡ量を測定できる。野生型または指向型
オスモチン様たんぱく質のいずれかをコードする適当な
発現レベルの遺伝子構築物でトランスホームした植物に
病原性菌類を接種することによりその耐性をテストす
る。このテストでは症状進行の速度および重度を野生型
植物と比較する。菌類耐性をテストする別の方法として
は植物全体ではなくトランスジェニック植物の葉ディス
クヘの菌類の影響を試験するものがある。この方法の利
点はいくぶん定量的に症状進行を検定することが比較的
に容易であることである。
【００１５】また本発明は抗菌調製物に使用するオスモ
チン様たんぱく質を得る目的で、オスモチン様たんぱく
質をコードする遺伝子でトランスホームした微生物を含
む。好ましい微生物にはたとえばバチルス（Bacillus）
種などのバクテリヤやイーストがある。また、オスモチ
ン様たんぱく質をコードする遺伝子でトランスホーム
し、オスモチン様たんぱく質を生産する微生物はそれら
が植物中またはその存在下で生育することが可能ならば
それらの植物の予防に使用できる。たとえば好ましい微
生物にはシュードモナス（Pseudomonas）またはリゾビ
ウム（Rhizobium）種がある。大腸菌におけるオスモチ
ン様たんぱく質ｃＤＮＡフラグメントの発現はすでに我
々が成功している。植物中で発現させるオスモチン様た
んぱく質遺伝子構築物で植物をトランスホームする本発
明のほとんどの態様は、全てルーチンに行なわれている
微生物学的、分子生物学的、組換えＤＮＡ、植物トラン
スホーメーションおよび植物組織培養の各技術を必要と
する。ＤＮＡの単離、操作および増殖のための標準的技
術および組換えＤＮＡ複製用の適当なベクター、適用な
バクテリア株、選択マーカー、培地等は、たとえばマニ
アチス（Maniatis）等、“モレキュラークローニング：
ラボラトリーマニュアル”、第２編、（1989）コールド
スプリングハーバーラボラトリープレス；ＤＮＡクロー
ニング：Vol. IおよびII（D.N. グローバー（Glover）
編、1985）および“遺伝子からクローンヘ”（E.L. ウ
ィナカー（Winnacker）編1987）に示されている。バク
テリアにおけるクローニングに使用し得る公知のベクタ
ーにはＰＵＣ１８（一般的には“遺伝子からクローン
ヘ”参照、上述）やｐＥＭＢＬ（デント（Dente）L., N
ucleic Acids Res. 11, 1645-1655）がある。後者のプ
ラスミドは特定の一本鎖ＤＮＡバクテリオファージの複
製オリジンを有する利点があり、その結果増殖したプラ
スミドをサンガー（Sanger）等（1980）J. Mol. Biol.
14, 161-178に報告されているＤＮＡシーケンシングに
直接使用できる。
チン様たんぱく質を得る目的で、オスモチン様たんぱく
質をコードする遺伝子でトランスホームした微生物を含
む。好ましい微生物にはたとえばバチルス（Bacillus）
種などのバクテリヤやイーストがある。また、オスモチ
ン様たんぱく質をコードする遺伝子でトランスホーム
し、オスモチン様たんぱく質を生産する微生物はそれら
が植物中またはその存在下で生育することが可能ならば
それらの植物の予防に使用できる。たとえば好ましい微
生物にはシュードモナス（Pseudomonas）またはリゾビ
ウム（Rhizobium）種がある。大腸菌におけるオスモチ
ン様たんぱく質ｃＤＮＡフラグメントの発現はすでに我
々が成功している。植物中で発現させるオスモチン様た
んぱく質遺伝子構築物で植物をトランスホームする本発
明のほとんどの態様は、全てルーチンに行なわれている
微生物学的、分子生物学的、組換えＤＮＡ、植物トラン
スホーメーションおよび植物組織培養の各技術を必要と
する。ＤＮＡの単離、操作および増殖のための標準的技
術および組換えＤＮＡ複製用の適当なベクター、適用な
バクテリア株、選択マーカー、培地等は、たとえばマニ
アチス（Maniatis）等、“モレキュラークローニング：
ラボラトリーマニュアル”、第２編、（1989）コールド
スプリングハーバーラボラトリープレス；ＤＮＡクロー
ニング：Vol. IおよびII（D.N. グローバー（Glover）
編、1985）および“遺伝子からクローンヘ”（E.L. ウ
ィナカー（Winnacker）編1987）に示されている。バク
テリアにおけるクローニングに使用し得る公知のベクタ
ーにはＰＵＣ１８（一般的には“遺伝子からクローン
ヘ”参照、上述）やｐＥＭＢＬ（デント（Dente）L., N
ucleic Acids Res. 11, 1645-1655）がある。後者のプ
ラスミドは特定の一本鎖ＤＮＡバクテリオファージの複
製オリジンを有する利点があり、その結果増殖したプラ
スミドをサンガー（Sanger）等（1980）J. Mol. Biol.
14, 161-178に報告されているＤＮＡシーケンシングに
直接使用できる。
【００１６】植物ゲノムに組換え遺伝子を導入するに
は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を用いたト
ランスホーメーション、植物組織のＤＮＡコート化粒子
の衝突（クレイン（Klein）等、1987, Nature, 32F, 70
-73）,カルシウム／ＰＥＧ法を用いた直接的ＤＮＡ取り
込み（クレンズ（Krens）F.A.等、1982, Nature, 296.,
72-74）またはプロトプラストヘのＤＮＡのマイクロイ
ンジェクション（クロスウェイ（Crossway）A.等、198
6, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185）などの方法が使用
できる。植物トランスホーメーション技術の概説として
はたとえばリチェンシュタイン（Lichtenstein）等、
“遺伝子工学”Vo1.6, 104-182；リグビー（Rigby）
編、1987）を参照せよ。本発明の２つの好ましい態様で
はアグロバクテリウム（Agrobacterium）バイナリーベ
クターシステムを利用している。バイナリーベクターシ
ステムについてはホーケマ（Hoekema）等（1983）Natur
e 303, 179-180；ビーバン（Bevan）等、1984, Nucl, A
cids Res, 12, 8711-8721）による報告がある。遺伝物
質の導入後、トランスホームした細胞（プロトプラス
ト）またはトランスホームした組織かつ新しい植物体を
再生し得る。それとは、別に、花粉細胞をトランスホー
ムし、受容植物の授粉に使用できる。実際にトランスホ
ームした植物の選択は、たとえば導入する遺伝子が存在
する同じＤＮＡフラグメント上にマーカー遺伝子が存在
するなら行うことができる。マーカー遺伝子にはたとえ
ば除草剤や抗生物質耐性または染色反応を触媒し得る酵
素または容易に認識できる特性（たとえば目視）をコー
ドし得る。マーカー遺伝子を発現する植物は同時に導入
したオスモチン様たんぱく質遺伝子を所有していると考
えられる。選択した植物は当分野でよく知られているウ
ェスタンまたはノーザンブロット法を用いてオスモチン
様たんぱく質遺伝子の発現について分析できる。菌類耐
性植物は同じ種類のトランスホームしていない植物には
病気を起こす菌類で植物を処理することにより高発現体
から選択し得る。先に述べたトランスホーメーション技
術を用いると基本的に選択する宿主植物に関して本発明
を実施するための制限はない。組換えＤＮＡを用いて双
子葉植物（トマト、ポテト、ソラ豆、大豆、ナタネ、綿
など）および単子葉植物（とうもろこし、小麦、大麦、
アスパラガス、米など）のいずれもうまくトランスホー
ムでき、かつ組換えＤＮＡを発現する完全成熟種子産生
植物に再生できる。好ましい態様にタバコのオスモチン
遺伝子でトランスホームしたタバコ、ポテトおよびトマ
ト植物がある。しかし、本発明はオスモチンが阻害効果
を示す菌類に感受性を有する全ての穀物に応用できるこ
とは明らかである。本発明で引用している全ての参考文
献は本発明が関係する分野の技術レベルを示している。
本明細書中の特許またはその他の全ての参考文献は各々
参考として引用している。以下に示す実施例は説明のた
め提供されたもので本発明を制限するものではない。
は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を用いたト
ランスホーメーション、植物組織のＤＮＡコート化粒子
の衝突（クレイン（Klein）等、1987, Nature, 32F, 70
-73）,カルシウム／ＰＥＧ法を用いた直接的ＤＮＡ取り
込み（クレンズ（Krens）F.A.等、1982, Nature, 296.,
72-74）またはプロトプラストヘのＤＮＡのマイクロイ
ンジェクション（クロスウェイ（Crossway）A.等、198
6, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185）などの方法が使用
できる。植物トランスホーメーション技術の概説として
はたとえばリチェンシュタイン（Lichtenstein）等、
“遺伝子工学”Vo1.6, 104-182；リグビー（Rigby）
編、1987）を参照せよ。本発明の２つの好ましい態様で
はアグロバクテリウム（Agrobacterium）バイナリーベ
クターシステムを利用している。バイナリーベクターシ
ステムについてはホーケマ（Hoekema）等（1983）Natur
e 303, 179-180；ビーバン（Bevan）等、1984, Nucl, A
cids Res, 12, 8711-8721）による報告がある。遺伝物
質の導入後、トランスホームした細胞（プロトプラス
ト）またはトランスホームした組織かつ新しい植物体を
再生し得る。それとは、別に、花粉細胞をトランスホー
ムし、受容植物の授粉に使用できる。実際にトランスホ
ームした植物の選択は、たとえば導入する遺伝子が存在
する同じＤＮＡフラグメント上にマーカー遺伝子が存在
するなら行うことができる。マーカー遺伝子にはたとえ
ば除草剤や抗生物質耐性または染色反応を触媒し得る酵
素または容易に認識できる特性（たとえば目視）をコー
ドし得る。マーカー遺伝子を発現する植物は同時に導入
したオスモチン様たんぱく質遺伝子を所有していると考
えられる。選択した植物は当分野でよく知られているウ
ェスタンまたはノーザンブロット法を用いてオスモチン
様たんぱく質遺伝子の発現について分析できる。菌類耐
性植物は同じ種類のトランスホームしていない植物には
病気を起こす菌類で植物を処理することにより高発現体
から選択し得る。先に述べたトランスホーメーション技
術を用いると基本的に選択する宿主植物に関して本発明
を実施するための制限はない。組換えＤＮＡを用いて双
子葉植物（トマト、ポテト、ソラ豆、大豆、ナタネ、綿
など）および単子葉植物（とうもろこし、小麦、大麦、
アスパラガス、米など）のいずれもうまくトランスホー
ムでき、かつ組換えＤＮＡを発現する完全成熟種子産生
植物に再生できる。好ましい態様にタバコのオスモチン
遺伝子でトランスホームしたタバコ、ポテトおよびトマ
ト植物がある。しかし、本発明はオスモチンが阻害効果
を示す菌類に感受性を有する全ての穀物に応用できるこ
とは明らかである。本発明で引用している全ての参考文
献は本発明が関係する分野の技術レベルを示している。
本明細書中の特許またはその他の全ての参考文献は各々
参考として引用している。以下に示す実施例は説明のた
め提供されたもので本発明を制限するものではない。
【００１７】
【実施例】（実施例１）
（ＴＭＶ誘導タバコ植物からのＡＰ２０の単離）週令７
〜８才のタバコ（ニコチアナ タバカム cv. サムサ
ン NN（Nicotiana tabacum cv. Samsun NN）の葉に標
準的方法でタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）を感染さ
せる。７日後４００グラムの葉を採取し、４℃でウェア
リングブレンダーを用いて６００ｍｌの０．５Ｍ Ｎａ
ＯＡｃ、１５ｍＭ ２−メルカプトエタノール溶液中、
４グラム活性炭とともにホモジナイズする。このホモジ
ネートをチーズクロスで濾過し、つづいてこの濾液を５
０００ｇで遠心する。さらにこの上清を２２，０００ｇ
で５０分間遠心した後、長さ６０ｃｍ、径１１．５ｃ
ｍ、２０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ５．２で平衡化したセ
ファデックスＧ２５カラム（ファルマシア）で脱塩し
た。たんぱく質を含むフラクションを４℃で一晩保存し
た後、２２，０００gで４５分間遠心した。この上清を
長さ５ｃｍ、径５ｃｍ、２０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ
５．２で平衡化したＳ−セファローズファーストフロ
ー”（ファルマシァ）カラムに毎分約１５ｍｌの流速で
流す。未結合するたんぱく質を回収する。結合したたん
ぱく質は上述バッファ中ＮａＣｌの直線濃度勾配（０〜
５００ｍＭ）、毎分３ｍｌの流速で溶出した。各４．２
ｍｌのフラクションを回収した。レファレンスとして分
子量マーカー（２０〜６６ｋＤ）を用いたＳＤＳポリア
クリルアミドゲル（１２．５％）電気泳動で各第２フラ
クションを分析した。同フラクションの一部は抗菌効果
の検定に用いた。抗菌活性検定のためマイクロプレート
検定法を開発した。２４穴および９６穴のマイクロプレ
ートを使用する。各ウェルに２５０μｌ（２４穴）また
は５０μｌ（９６穴）のポテトデキストロース寒天を入
れる。Ｐ．インフェスタンス（infectans）の胞子嚢を
水に懸濁し、ウェルに入れる（２４穴プレートには５０
０〜７００個の胞子嚢（５０μｌ）、９６穴プレートに
は１００〜２００個の胞子嚢（２５μｌ））。テストす
るフラクションの一部を１５ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4／ＫＨ2
ＰＯ4 ｐＨ６．０、２０ｍＭ ＮａＣｌに対して透析
し、濾過滅菌した後（０.２２μｍフィルター）胞子嚢
懸濁液（２４穴、９６穴プレートに各々１００μｌおよ
び５０μｌ）を添加した。Ｐ．インフェスタンス（infe
stans）は高リン酸濃度に感受性があるようなので低リ
ン酸濃度で行うことが必要である。１５ｍＭリン酸カリ
ウムはＰ．インフェクタンス（infectans）の増殖に影
響を与えないと思われる。低リン酸濃度での抗菌活性の
安定化にはＮａＣｌの添加が望ましい。コントロールと
して同フラクション（の一部）を透析後１０分間煮沸し
た。つづいて、プレートを２０℃、暗所で４〜５日間イ
ンキュベートした。約２０時間後菌類阻害活性の最初の
徴候が顕微鏡で観察できる。菌類阻害効果は発芽する胞
子嚢の分解および成長するジャームチューブまたは菌子
片の分解として観察される。後の段階でも菌子体増殖阻
止が観察できる。
〜８才のタバコ（ニコチアナ タバカム cv. サムサ
ン NN（Nicotiana tabacum cv. Samsun NN）の葉に標
準的方法でタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）を感染さ
せる。７日後４００グラムの葉を採取し、４℃でウェア
リングブレンダーを用いて６００ｍｌの０．５Ｍ Ｎａ
ＯＡｃ、１５ｍＭ ２−メルカプトエタノール溶液中、
４グラム活性炭とともにホモジナイズする。このホモジ
ネートをチーズクロスで濾過し、つづいてこの濾液を５
０００ｇで遠心する。さらにこの上清を２２，０００ｇ
で５０分間遠心した後、長さ６０ｃｍ、径１１．５ｃ
ｍ、２０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ５．２で平衡化したセ
ファデックスＧ２５カラム（ファルマシア）で脱塩し
た。たんぱく質を含むフラクションを４℃で一晩保存し
た後、２２，０００gで４５分間遠心した。この上清を
長さ５ｃｍ、径５ｃｍ、２０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ
５．２で平衡化したＳ−セファローズファーストフロ
ー”（ファルマシァ）カラムに毎分約１５ｍｌの流速で
流す。未結合するたんぱく質を回収する。結合したたん
ぱく質は上述バッファ中ＮａＣｌの直線濃度勾配（０〜
５００ｍＭ）、毎分３ｍｌの流速で溶出した。各４．２
ｍｌのフラクションを回収した。レファレンスとして分
子量マーカー（２０〜６６ｋＤ）を用いたＳＤＳポリア
クリルアミドゲル（１２．５％）電気泳動で各第２フラ
クションを分析した。同フラクションの一部は抗菌効果
の検定に用いた。抗菌活性検定のためマイクロプレート
検定法を開発した。２４穴および９６穴のマイクロプレ
ートを使用する。各ウェルに２５０μｌ（２４穴）また
は５０μｌ（９６穴）のポテトデキストロース寒天を入
れる。Ｐ．インフェスタンス（infectans）の胞子嚢を
水に懸濁し、ウェルに入れる（２４穴プレートには５０
０〜７００個の胞子嚢（５０μｌ）、９６穴プレートに
は１００〜２００個の胞子嚢（２５μｌ））。テストす
るフラクションの一部を１５ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4／ＫＨ2
ＰＯ4 ｐＨ６．０、２０ｍＭ ＮａＣｌに対して透析
し、濾過滅菌した後（０.２２μｍフィルター）胞子嚢
懸濁液（２４穴、９６穴プレートに各々１００μｌおよ
び５０μｌ）を添加した。Ｐ．インフェスタンス（infe
stans）は高リン酸濃度に感受性があるようなので低リ
ン酸濃度で行うことが必要である。１５ｍＭリン酸カリ
ウムはＰ．インフェクタンス（infectans）の増殖に影
響を与えないと思われる。低リン酸濃度での抗菌活性の
安定化にはＮａＣｌの添加が望ましい。コントロールと
して同フラクション（の一部）を透析後１０分間煮沸し
た。つづいて、プレートを２０℃、暗所で４〜５日間イ
ンキュベートした。約２０時間後菌類阻害活性の最初の
徴候が顕微鏡で観察できる。菌類阻害効果は発芽する胞
子嚢の分解および成長するジャームチューブまたは菌子
片の分解として観察される。後の段階でも菌子体増殖阻
止が観察できる。
【００１８】さらに活性成分を精製するため、活性抗菌
フラクションを採取し、１Ｍ （ＮＨ4）2ＳＯ4、５０
ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4 ｐＨ７．０に対して透
析後０.２２μｍフィルターで濾過した。この濾液を予
め透析バッファで平衡化した疎水性相互作用カラム（Ｈ
ＩＣ）（フェニルスパロース ＨＲ５／５、ファルマシ
ア）で分画した。これまでの操作は全て４℃で行った。
結合たんぱく質は室温、毎分０.５ｍｌで５０ｍＭ Ｋ2
ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4ｐＨ７．０中（ＮＨ4）2ＳＯ4の減
少勾配（１Ｍ−０Ｍ）を用いて溶出した。溶出プログラ
ムを以下に示す。 −５分間かけて初期（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度１００％から
３０％へ、 −７．５分間、初期（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度の３０％一
定、 −１０分間かけて初期（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度の３０％か
ら０％へ。 抗菌たんぱく質は初期（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度の０％の時
から約５．５分後にカラムから溶出してくる（約２.７
ｍｌ）。ピークフラクション中の抗菌たんぱく質は９５
％の純度である。これら全てのステップは室温で行っ
た。純度９９％の抗菌たんぱく質を得るため１Ｍ （Ｎ
Ｈ4）2ＳＯ4、５０ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4 ｐ
Ｈ７．０のバッファに対して透析し、０.２２μｍフィ
ルターで濾過後、もう１度以下に示す溶出プログラムの
ＨＩＣカラムでそれを分画した、 −７.５分間かけて１００％から１５％へ −１２.５分間１５％一定 −１０分間かけて１５％から０％へ。 抗菌たんぱく質は１３分後にカラムから溶出する（約
２.７ｍｌ）。この溶出物は純度９９％のたんぱく質を
含んでいる。４００gの葉から純度９５％の抗菌たんぱ
く質、４００μｇ、または純度９９％の抗菌たんぱく質
２００μｇが単離できる。分子量２４ｋＤと見積られる
抗菌たんぱく質をＡＰ２０と呼ぶ。
フラクションを採取し、１Ｍ （ＮＨ4）2ＳＯ4、５０
ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4 ｐＨ７．０に対して透
析後０.２２μｍフィルターで濾過した。この濾液を予
め透析バッファで平衡化した疎水性相互作用カラム（Ｈ
ＩＣ）（フェニルスパロース ＨＲ５／５、ファルマシ
ア）で分画した。これまでの操作は全て４℃で行った。
結合たんぱく質は室温、毎分０.５ｍｌで５０ｍＭ Ｋ2
ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4ｐＨ７．０中（ＮＨ4）2ＳＯ4の減
少勾配（１Ｍ−０Ｍ）を用いて溶出した。溶出プログラ
ムを以下に示す。 −５分間かけて初期（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度１００％から
３０％へ、 −７．５分間、初期（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度の３０％一
定、 −１０分間かけて初期（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度の３０％か
ら０％へ。 抗菌たんぱく質は初期（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度の０％の時
から約５．５分後にカラムから溶出してくる（約２.７
ｍｌ）。ピークフラクション中の抗菌たんぱく質は９５
％の純度である。これら全てのステップは室温で行っ
た。純度９９％の抗菌たんぱく質を得るため１Ｍ （Ｎ
Ｈ4）2ＳＯ4、５０ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4 ｐ
Ｈ７．０のバッファに対して透析し、０.２２μｍフィ
ルターで濾過後、もう１度以下に示す溶出プログラムの
ＨＩＣカラムでそれを分画した、 −７.５分間かけて１００％から１５％へ −１２.５分間１５％一定 −１０分間かけて１５％から０％へ。 抗菌たんぱく質は１３分後にカラムから溶出する（約
２.７ｍｌ）。この溶出物は純度９９％のたんぱく質を
含んでいる。４００gの葉から純度９５％の抗菌たんぱ
く質、４００μｇ、または純度９９％の抗菌たんぱく質
２００μｇが単離できる。分子量２４ｋＤと見積られる
抗菌たんぱく質をＡＰ２０と呼ぶ。
【００１９】（実施例２）
（ＡＰ２０のアミノ酸配列の解明）従来法を用いてＡＰ
２０のＮ末端部分のアミノ酸配列を決定した（たとえば
マツダイロ（Matsudairo）、P.等（1987）J. Biol. Che
m. 262, 10035-10038）。ＡＰ２０およびタバコおよび
トマト由来のオスモチンの部分的アミノ酸配列の比較を
図１に示す。この図は、ＡＰ２０の４０個のＮ末端アミ
ノ酸配列とタバコのオスモチンIIのＮ末端のアミノ酸配
列との完全な一致およびタバコのオスモチンIおよびト
マトのオスモチン様たんぱく質ＮＰ２４との高いホモロ
ジーを示している。ＡＰ２０の分子量の精密な測定は、
分子量標準６６〜２０ｋＤを用いた１Ｄポリアクリルア
ミド電気泳動（１Ｄ−ＰＡＧＥ）で行った。この方法に
より分子量は２４ｋＤと見積られ、この値は他のオスモ
チンの電気泳動移動度と良く一致している。ｐＩ４．３
と９．５の等電点フォーカシングクロマトグラフィーで
等電点を測定した。使用したゲルノバッファ系中のＡＰ
２０の移動度はＡＰ２０が大部分の塩基性マーカー（ｐ
Ｈ９．５）よりも高いｐＩを有していると考えられるこ
とからｐＩの正確な測定はできなかった。ＡＰ２０のｐ
Ｉ値は９．５よりも大きいと結論した。ＡＰ２０とタバ
コおよびトマトのオスモチン（同じ分子量、高塩基性ｐ
Ｉおよび４０個のＮ末端残基のアミノ酸配列の一致）と
の物理パラメーターの比較でＡＰ２０はオスモチンであ
ると考えられる。単離したオスモチン（ＡＰ２０）の抗
菌効果の確認、およびＡＰ２０と他のオスモチンおよび
オスモチン同士のアミノ酸配列の高い保存性から植物界
のオスモチン様たんぱく質も同様の抗菌効果を有すると
予測する。
２０のＮ末端部分のアミノ酸配列を決定した（たとえば
マツダイロ（Matsudairo）、P.等（1987）J. Biol. Che
m. 262, 10035-10038）。ＡＰ２０およびタバコおよび
トマト由来のオスモチンの部分的アミノ酸配列の比較を
図１に示す。この図は、ＡＰ２０の４０個のＮ末端アミ
ノ酸配列とタバコのオスモチンIIのＮ末端のアミノ酸配
列との完全な一致およびタバコのオスモチンIおよびト
マトのオスモチン様たんぱく質ＮＰ２４との高いホモロ
ジーを示している。ＡＰ２０の分子量の精密な測定は、
分子量標準６６〜２０ｋＤを用いた１Ｄポリアクリルア
ミド電気泳動（１Ｄ−ＰＡＧＥ）で行った。この方法に
より分子量は２４ｋＤと見積られ、この値は他のオスモ
チンの電気泳動移動度と良く一致している。ｐＩ４．３
と９．５の等電点フォーカシングクロマトグラフィーで
等電点を測定した。使用したゲルノバッファ系中のＡＰ
２０の移動度はＡＰ２０が大部分の塩基性マーカー（ｐ
Ｈ９．５）よりも高いｐＩを有していると考えられるこ
とからｐＩの正確な測定はできなかった。ＡＰ２０のｐ
Ｉ値は９．５よりも大きいと結論した。ＡＰ２０とタバ
コおよびトマトのオスモチン（同じ分子量、高塩基性ｐ
Ｉおよび４０個のＮ末端残基のアミノ酸配列の一致）と
の物理パラメーターの比較でＡＰ２０はオスモチンであ
ると考えられる。単離したオスモチン（ＡＰ２０）の抗
菌効果の確認、およびＡＰ２０と他のオスモチンおよび
オスモチン同士のアミノ酸配列の高い保存性から植物界
のオスモチン様たんぱく質も同様の抗菌効果を有すると
予測する。
【００２０】（実施例３）
（トマトからのオスモチンの単離およびＰ．インフェス
タンスヘの抗菌効果）トマトヘの接種法はヘラー（Hell
er）およびゲスラー（Gessler）（J. Pathology, 1986,
116, 323-328）によって報告されている。月令２才の
トマト植物（リコペルシコン エスクレンタム cv.
マニーメーカー（Lycopersicon esculentum cv. Moneym
aker）にＰ．インフェスタンス（infestans）の遊走子
を接種した。遊走子はインキュベーション培地１ｍｌ中
１×１０5胞子嚢の懸濁液中で形成させた。葉上にこの
懸濁液１０μｌの液滴６個を滴下した。この植物を１５
℃、湿度９５〜１００％、空気および低光量下、障害の
発生が確認できるまで（約５日間）インキュベートし
た。つづいて、温度を２２℃に上げ、湿度を７５％に下
げ、かつ光強度を通常値にまで上げた。３日後、壊死障
害を有する葉を収穫し、−８０℃で保存した。トマトの
葉由来のオスモチンの単離操作（Ｐ．インフェスタンス
（infestans）へのテストも含む）は実施例１で述べた
タバコからのＡＰ２０の単離操作と同じである。トマト
のオスモチンはＰ．インフェスタンス（infestans）の
増殖に対して明らかな阻害効果を有する。１００℃で加
熱したオスモチンまたはバッファを用いたコントロール
実験では分解は観察されなかった。
タンスヘの抗菌効果）トマトヘの接種法はヘラー（Hell
er）およびゲスラー（Gessler）（J. Pathology, 1986,
116, 323-328）によって報告されている。月令２才の
トマト植物（リコペルシコン エスクレンタム cv.
マニーメーカー（Lycopersicon esculentum cv. Moneym
aker）にＰ．インフェスタンス（infestans）の遊走子
を接種した。遊走子はインキュベーション培地１ｍｌ中
１×１０5胞子嚢の懸濁液中で形成させた。葉上にこの
懸濁液１０μｌの液滴６個を滴下した。この植物を１５
℃、湿度９５〜１００％、空気および低光量下、障害の
発生が確認できるまで（約５日間）インキュベートし
た。つづいて、温度を２２℃に上げ、湿度を７５％に下
げ、かつ光強度を通常値にまで上げた。３日後、壊死障
害を有する葉を収穫し、−８０℃で保存した。トマトの
葉由来のオスモチンの単離操作（Ｐ．インフェスタンス
（infestans）へのテストも含む）は実施例１で述べた
タバコからのＡＰ２０の単離操作と同じである。トマト
のオスモチンはＰ．インフェスタンス（infestans）の
増殖に対して明らかな阻害効果を有する。１００℃で加
熱したオスモチンまたはバッファを用いたコントロール
実験では分解は観察されなかった。
【００２１】（実施例４）
（ｐＭＯＧ１８０の構築）トランスジェニック植物にお
けるオスモチン遺伝子の高度の構成的発現を得るため強
カなプロモーターを含む発現構築物を作製した。最後
に、ｐＲＯＫＩ由来の発現カセット（ボールコンベ（Bo
ulcombe）等、（1986）Nature 321, 446-449）をＥｃｏ
ＲＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントとしてｐＵＣ１８にク
ローン化した。このカセットはＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ
制限フラグメント上にＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよ
びＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメント上にノパリン
シンテース（ｎｏｓ）転写ターミネーターを含んでい
る。このプロモーターフラグメントはＣａＨＶゲノムの
−８００〜＋１の配列を含んでいる（ここで＋１は転写
開始部位を示す）（ギリー（Guilley）等、（1982）Cel
l 30, 763-773）。この文献から−３４３と−９０の間
の配列の重複はＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの活性を増
加することが知られている（ケイ（Kay）等、（1987）
Science 236, 1299-1302）。二重の“発現促進フラグメ
ント”（エンハンサー）を含むプロモーターを得るた
め、以下のクローニング操作を行った。最初に、部位−
５１２のＮｃｏＩ認識部位の上流の配列を除去し、その
制限部位をＥｃｏＲＩ認識部位に変化させた。終りに、
ｐＵＣ１８中の発現カセットをＮｃｏＩで切断し、得ら
れる末端をクレノーポリメラーゼで充填し、その末端に
ＥｃｏＲＩ−リンカーをライゲーションした。このブラ
スミドをＥｃｏＲＩで切断し、ＥｃｏＲＩフラグメント
を除いてその末端をクレノーポリメラーゼで充填した。
つづいて充填したＡｃｃＩ−ＥｃｏＲＶプロモーターフ
ラグメント（−３８８〜−９０）を線状化したプラスミ
ドにクローン化し、それで充填したＥｃｏＲＩおよびＡ
ｃｃＩ部位の継ぎ目に新しくＥｃｏＲＩ部位が生成す
る。この新しいプラスミドｐＭＯＧ１８にはＥｃｏＲＩ
−ＨｉｎｄIIIフラグメント上になお存在する発現カセ
ット中に２重のエンハンサーを伴うＣａＭＶ３５Ｓプロ
モーターが含まれる。つづいてｐＭＯＧ１８１から誘導
体ｐＭＯＧ１８０を作製した。さらにこのベクターをＢ
ａｍＨＩで切断し、生成した末端をクレノーポリメラー
ゼで充填した後、この線状ベクターに、アルファルファ
モザイクウィルス ＲＮＡ４リーダーのヌクレオチド配
列を含むＳＥＱＩＤ１で指示される配列プロトコール中
の合成二本鎖、ＤＮＡフラグメントをクローン化した。
新しく生成するＢａｍＨＩ認識部位の存在で選択した
後、インビトロ突然変異誘発で転写開始部位付近のペン
タヌクレオチド５’−ＧＧＡＴＣ３’を除去した。この
ようにして得たプラスミドをｐＭＯＧ１８０とする。
けるオスモチン遺伝子の高度の構成的発現を得るため強
カなプロモーターを含む発現構築物を作製した。最後
に、ｐＲＯＫＩ由来の発現カセット（ボールコンベ（Bo
ulcombe）等、（1986）Nature 321, 446-449）をＥｃｏ
ＲＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントとしてｐＵＣ１８にク
ローン化した。このカセットはＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ
制限フラグメント上にＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよ
びＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメント上にノパリン
シンテース（ｎｏｓ）転写ターミネーターを含んでい
る。このプロモーターフラグメントはＣａＨＶゲノムの
−８００〜＋１の配列を含んでいる（ここで＋１は転写
開始部位を示す）（ギリー（Guilley）等、（1982）Cel
l 30, 763-773）。この文献から−３４３と−９０の間
の配列の重複はＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの活性を増
加することが知られている（ケイ（Kay）等、（1987）
Science 236, 1299-1302）。二重の“発現促進フラグメ
ント”（エンハンサー）を含むプロモーターを得るた
め、以下のクローニング操作を行った。最初に、部位−
５１２のＮｃｏＩ認識部位の上流の配列を除去し、その
制限部位をＥｃｏＲＩ認識部位に変化させた。終りに、
ｐＵＣ１８中の発現カセットをＮｃｏＩで切断し、得ら
れる末端をクレノーポリメラーゼで充填し、その末端に
ＥｃｏＲＩ−リンカーをライゲーションした。このブラ
スミドをＥｃｏＲＩで切断し、ＥｃｏＲＩフラグメント
を除いてその末端をクレノーポリメラーゼで充填した。
つづいて充填したＡｃｃＩ−ＥｃｏＲＶプロモーターフ
ラグメント（−３８８〜−９０）を線状化したプラスミ
ドにクローン化し、それで充填したＥｃｏＲＩおよびＡ
ｃｃＩ部位の継ぎ目に新しくＥｃｏＲＩ部位が生成す
る。この新しいプラスミドｐＭＯＧ１８にはＥｃｏＲＩ
−ＨｉｎｄIIIフラグメント上になお存在する発現カセ
ット中に２重のエンハンサーを伴うＣａＭＶ３５Ｓプロ
モーターが含まれる。つづいてｐＭＯＧ１８１から誘導
体ｐＭＯＧ１８０を作製した。さらにこのベクターをＢ
ａｍＨＩで切断し、生成した末端をクレノーポリメラー
ゼで充填した後、この線状ベクターに、アルファルファ
モザイクウィルス ＲＮＡ４リーダーのヌクレオチド配
列を含むＳＥＱＩＤ１で指示される配列プロトコール中
の合成二本鎖、ＤＮＡフラグメントをクローン化した。
新しく生成するＢａｍＨＩ認識部位の存在で選択した
後、インビトロ突然変異誘発で転写開始部位付近のペン
タヌクレオチド５’−ＧＧＡＴＣ３’を除去した。この
ようにして得たプラスミドをｐＭＯＧ１８０とする。
【００２２】（実施例５）
（オスモチンに対応するｃＤＮＡのクローニングおよび
バイナリーベクターｐＭＯＧ４０４の調製）ＺＡＰ−ｃ
ＤＮＡ合成キット（ストラタジーン、Ｃａｔ＃２００４
００，２００４０１）を用いてタバコｃＤＮＡライブラ
リーを作製した。ＴＭＶ感染させたサムサンＮＮタバコ
（Samsun NN tabacco）の葉から標準的方法を用いてポ
リアデニル化ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡの合成に使用し
た。ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩによる処理後、このｃＤ
ＮＡフラグメントをラムダＺＡＰアームの適合末端にラ
イゲーションした。上述のラムダタバコｃＤＮＡライブ
ラリーをトマトのＮＰ２４遺伝子に相同的な配列に対す
るＤＮＡプローブを用いてスクリーニングした（キング
（King）等、（1988）Plant, Mol, Biol, 10, 401-41
2）。ベントン（Benton）およびデービス（Davis）（19
77, Science, 196, 180-182）のプラークハイブリダイ
ゼーション法によりおよそ７個の組換えファージを同定
した。インビボ切断法を用い、これらのファージのＤＮ
Ａ中の挿入物をpBlueScript（ＳＫ−）プラスミドにサ
ブクローニングした。種々のｃＤＮＡクローンのヌクレ
オチド配列はＭ１３配列決定法を用いて決定した。ＡＰ
２０たんぱく質の部分アミノ酸配列との比較と組合せて
これらの分析結果はわずか３個のクローンがほぼ完全な
ｃＤＮＡ配列を含んでいることを示している。１つのク
ローンは翻訳開始コドンのアデニン−チミジンジヌクレ
オチド以外完全なオスモチンコード配列を含んでいる
（サイン（Singh）等、1989、上述）。このクローンを
オスモチンｃＤＮＡクローンと命名した。調べたＡＰ２
０たんぱく質のＮ末端アミノ酸配列はオスモチンｃＤＮ
Ａクローンから誘導されたオスモチンの配列と全く一致
した。ＰＣＲを用いオスモチンｃＤＮＡの前にＢａｍＨ
Ｉ認識部位およびアデニン・チミジンジヌクレオチドを
導入し、これにより翻訳開始コドンが生成した。この遺
伝子の後にはＢａｍＨＩ認識部位が導入された。これら
のＰＣＲ反応にはプライマーとしてオリゴヌクレオチド
ＳＥＱＩＤ２およびＳＥＱＩＤ３を使用した。ＰＣＲ法
の結果として生じ得る不都合な変異に関してｃＤＮＡ配
列の変化を確認した。その配列を配列プロトコール中の
ＳＥＱＩＤ４に示す。このオスモチン遺伝子をＢａｍＨ
ＩフラグメントとしてＢａｍＨＩで線状化したベクター
ｐＭＯＧ１８０にクローン化した（構築については実施
例ＶIII参照、図２）。得られた発現ベクターはＳｓｔ
Ｉ−ＨｉｎｄIIIフラグメント上のノパリンシテース
（ｎｏｓ）転写ターミネーターの前のオスモチン遺伝子
のさらに前にカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭ
Ｖ）３５Ｓプロモーターを含んでいる。この発現構築物
を制限酵素ＳｓｔＩおよびＨｉｎｄIIIで線状化した後
バイナリーベクターｐＭＯＧ２３（オランダ、バーンの
セントラルブリューボアシメルカルチャーにＮｏ．ＣＢ
Ｓ１０２．９０として登録されている）にクローン化し
た。このプラスミドｐＭＯＧ４０４（図３）は左右のＴ
−ＤＮＡ境界配列の間にオスモチン遺伝子およびＮＰＴ
II遺伝子の両方を含んでいる。プラスミドｐＲＫ２０１
３の助けをかりて、このバイナリーベクターを大腸菌Ｄ
Ｈ５αからアグロバクテリウムツメファシェンス（Agro
bacterium tumefaciens）ＬＢＡ４４０４株に移した。
２０ｍｇ／ｌ リファンピシンおよび１００ｍｇ／ｌ
カナマイシンを含む選択培地上でのこの交叉からトラン
スコンジガントＬＢＡ４４０４（ｐＭＯＧ４４０４）を
単離した。
バイナリーベクターｐＭＯＧ４０４の調製）ＺＡＰ−ｃ
ＤＮＡ合成キット（ストラタジーン、Ｃａｔ＃２００４
００，２００４０１）を用いてタバコｃＤＮＡライブラ
リーを作製した。ＴＭＶ感染させたサムサンＮＮタバコ
（Samsun NN tabacco）の葉から標準的方法を用いてポ
リアデニル化ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡの合成に使用し
た。ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩによる処理後、このｃＤ
ＮＡフラグメントをラムダＺＡＰアームの適合末端にラ
イゲーションした。上述のラムダタバコｃＤＮＡライブ
ラリーをトマトのＮＰ２４遺伝子に相同的な配列に対す
るＤＮＡプローブを用いてスクリーニングした（キング
（King）等、（1988）Plant, Mol, Biol, 10, 401-41
2）。ベントン（Benton）およびデービス（Davis）（19
77, Science, 196, 180-182）のプラークハイブリダイ
ゼーション法によりおよそ７個の組換えファージを同定
した。インビボ切断法を用い、これらのファージのＤＮ
Ａ中の挿入物をpBlueScript（ＳＫ−）プラスミドにサ
ブクローニングした。種々のｃＤＮＡクローンのヌクレ
オチド配列はＭ１３配列決定法を用いて決定した。ＡＰ
２０たんぱく質の部分アミノ酸配列との比較と組合せて
これらの分析結果はわずか３個のクローンがほぼ完全な
ｃＤＮＡ配列を含んでいることを示している。１つのク
ローンは翻訳開始コドンのアデニン−チミジンジヌクレ
オチド以外完全なオスモチンコード配列を含んでいる
（サイン（Singh）等、1989、上述）。このクローンを
オスモチンｃＤＮＡクローンと命名した。調べたＡＰ２
０たんぱく質のＮ末端アミノ酸配列はオスモチンｃＤＮ
Ａクローンから誘導されたオスモチンの配列と全く一致
した。ＰＣＲを用いオスモチンｃＤＮＡの前にＢａｍＨ
Ｉ認識部位およびアデニン・チミジンジヌクレオチドを
導入し、これにより翻訳開始コドンが生成した。この遺
伝子の後にはＢａｍＨＩ認識部位が導入された。これら
のＰＣＲ反応にはプライマーとしてオリゴヌクレオチド
ＳＥＱＩＤ２およびＳＥＱＩＤ３を使用した。ＰＣＲ法
の結果として生じ得る不都合な変異に関してｃＤＮＡ配
列の変化を確認した。その配列を配列プロトコール中の
ＳＥＱＩＤ４に示す。このオスモチン遺伝子をＢａｍＨ
ＩフラグメントとしてＢａｍＨＩで線状化したベクター
ｐＭＯＧ１８０にクローン化した（構築については実施
例ＶIII参照、図２）。得られた発現ベクターはＳｓｔ
Ｉ−ＨｉｎｄIIIフラグメント上のノパリンシテース
（ｎｏｓ）転写ターミネーターの前のオスモチン遺伝子
のさらに前にカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭ
Ｖ）３５Ｓプロモーターを含んでいる。この発現構築物
を制限酵素ＳｓｔＩおよびＨｉｎｄIIIで線状化した後
バイナリーベクターｐＭＯＧ２３（オランダ、バーンの
セントラルブリューボアシメルカルチャーにＮｏ．ＣＢ
Ｓ１０２．９０として登録されている）にクローン化し
た。このプラスミドｐＭＯＧ４０４（図３）は左右のＴ
−ＤＮＡ境界配列の間にオスモチン遺伝子およびＮＰＴ
II遺伝子の両方を含んでいる。プラスミドｐＲＫ２０１
３の助けをかりて、このバイナリーベクターを大腸菌Ｄ
Ｈ５αからアグロバクテリウムツメファシェンス（Agro
bacterium tumefaciens）ＬＢＡ４４０４株に移した。
２０ｍｇ／ｌ リファンピシンおよび１００ｍｇ／ｌ
カナマイシンを含む選択培地上でのこの交叉からトラン
スコンジガントＬＢＡ４４０４（ｐＭＯＧ４４０４）を
単離した。
【００２３】（実施例６）
（細胞外オスモチンをコードするｐＭＯＧ４０４の構
築）野生型オスモチンは細胞内、ほとんどが植物細胞の
液胞内に存在すると報告されている。（サイン（Sing
h）等、1987、上述）。オスモチンを細胞外空隙に分泌
させるため、ｐＭＯＧ４０４に存在する野生型オスモチ
ンｃＤＮＡ中、このｃＤＮＡにコードされるたんぱく質
のＣ末端からの番号付けでコドン２０と２１の間に翻訳
停止コドンを導入した。当分野でよく知られているＰＣ
Ｒを用い、配列プロトコール中のＳＥＱＩＤ４の配列の
ヌクレオチド６９４と６９５の間にチミジン残基を導入
することで停止コドンが生じる。この修正オスモチン配
列にＰＣＲ法で生じ得る不都合な突然変異が入っていな
いことをチェックした。この変異ｃＤＮＡは野生型オス
モチンｍＲＮＡの一次翻訳産物の２０個のＣ末端アミノ
酸を欠くオスモチンをコードしている。このようにして
得たバイナリーベクターをｐＭＯＧ４０５と命名し、こ
れに対応するアグロバクテリウム（Agrobacterium）ト
ランスコンジガントをＬＢＡ４４０４（ｐＭＯＧ４０
５）と呼ぶ。実施例８に示したように、ｐＭＯＧ４０５
にコードされているオスモチンは実際に細胞外に向う。
築）野生型オスモチンは細胞内、ほとんどが植物細胞の
液胞内に存在すると報告されている。（サイン（Sing
h）等、1987、上述）。オスモチンを細胞外空隙に分泌
させるため、ｐＭＯＧ４０４に存在する野生型オスモチ
ンｃＤＮＡ中、このｃＤＮＡにコードされるたんぱく質
のＣ末端からの番号付けでコドン２０と２１の間に翻訳
停止コドンを導入した。当分野でよく知られているＰＣ
Ｒを用い、配列プロトコール中のＳＥＱＩＤ４の配列の
ヌクレオチド６９４と６９５の間にチミジン残基を導入
することで停止コドンが生じる。この修正オスモチン配
列にＰＣＲ法で生じ得る不都合な突然変異が入っていな
いことをチェックした。この変異ｃＤＮＡは野生型オス
モチンｍＲＮＡの一次翻訳産物の２０個のＣ末端アミノ
酸を欠くオスモチンをコードしている。このようにして
得たバイナリーベクターをｐＭＯＧ４０５と命名し、こ
れに対応するアグロバクテリウム（Agrobacterium）ト
ランスコンジガントをＬＢＡ４４０４（ｐＭＯＧ４０
５）と呼ぶ。実施例８に示したように、ｐＭＯＧ４０５
にコードされているオスモチンは実際に細胞外に向う。
【００２４】（実施例７）
（トランスジェニック植物の調製）アグロバクテリウム
（Agrobacterium）ＬＢＡ４４０４（ｐＭＯＧ４０４）
およびＬＢＡ４４０４（ｐＭＯＧ４０５）株によるポテ
ト（ソラナムツベロサムcv. ビンテ（Solanum tuberos
um cv. Bintje）のトランスホーメーションはホーケマ
（Hoekema）等、（1989）Bio/Technology 7, 273-278の
方法に従った。タバコのトランスホーメーションには葉
ディスクディップ法を利用した（ホーシュ（Horsch）等
（1985）、Science 227, 1229-1231）。葉ディスクをア
グロバクテリウム（Agrobacterium）ＬＢＡ４４０４
（ｐＭＯＧ４０４）またはＬＢＡ４４０４（ｐＭＯＧ４
０４）株と共培養し、つづいて標準法を用いて１００ｍ
ｌ／ｍｌカナマイシンを含む選択培地で生育させた。ト
ランスジェニック新芽を植物に再生し、オスモチン遺伝
子の発現を分析した。この分析には病原関連たんぱく質
ＰＲ−Ｓに対する抗体を用いたいわゆるウエスタンブロ
ッティング法およびプローブとしてオスモチンｃＤＮＡ
フラグメントを用いるノーザンブロッテイング法を利用
した。オスモチンコード領域は長さで２０コドン違うけ
れどもｐＭＯＧ４０４とｐＭＯＧ４０５でコードされて
いるオスモチンのサイズの差はウェスタンブロッティン
グ分析では見られなかった。このことは植物中の野生型
オスモチンはＣ末端がプロセシングを受けていることを
示している。
（Agrobacterium）ＬＢＡ４４０４（ｐＭＯＧ４０４）
およびＬＢＡ４４０４（ｐＭＯＧ４０５）株によるポテ
ト（ソラナムツベロサムcv. ビンテ（Solanum tuberos
um cv. Bintje）のトランスホーメーションはホーケマ
（Hoekema）等、（1989）Bio/Technology 7, 273-278の
方法に従った。タバコのトランスホーメーションには葉
ディスクディップ法を利用した（ホーシュ（Horsch）等
（1985）、Science 227, 1229-1231）。葉ディスクをア
グロバクテリウム（Agrobacterium）ＬＢＡ４４０４
（ｐＭＯＧ４０４）またはＬＢＡ４４０４（ｐＭＯＧ４
０４）株と共培養し、つづいて標準法を用いて１００ｍ
ｌ／ｍｌカナマイシンを含む選択培地で生育させた。ト
ランスジェニック新芽を植物に再生し、オスモチン遺伝
子の発現を分析した。この分析には病原関連たんぱく質
ＰＲ−Ｓに対する抗体を用いたいわゆるウエスタンブロ
ッティング法およびプローブとしてオスモチンｃＤＮＡ
フラグメントを用いるノーザンブロッテイング法を利用
した。オスモチンコード領域は長さで２０コドン違うけ
れどもｐＭＯＧ４０４とｐＭＯＧ４０５でコードされて
いるオスモチンのサイズの差はウェスタンブロッティン
グ分析では見られなかった。このことは植物中の野生型
オスモチンはＣ末端がプロセシングを受けていることを
示している。
【００２５】（実施例８）
（トランスジーン産物の指向性に関するｐＭＯＧ４０４
およびｐＭＯＧ４０５トランスジェニックタバコ植物の
分析）ｐＭＯＧ４０５−トランスジェニックタバコ植物
におけるオスモチンの細胞外指向性を示すため、以下の
実験を行った。新しく導入したオスモチン遺伝子を発現
するｐＭＯＧ４０４−トランスジェニック植物系列およ
びｐＭＯＧ４０５−トランスジェニック植物系列のＦ１
植物の葉および非トランスジェニック植物の葉の全たん
ぱく質および細胞外たんぱく質を抽出した。細胞外たん
ぱく質の抽出のためにはデウィット（Dewit）およびス
パイクマン（Spikman）（1982, Physiol.Plant Pathol.
20, 1-11）の操作に従って細胞外液を採取した。細胞
外液単離後、他の葉物質と同様にたんぱく質を抽出し
た。総抽出物（トータル）、細胞外液（ＥＦ）および細
胞外液除去後の葉抽出物（−ＥＦ）中のたんぱく質の分
析にはＡＰ２０特異的抗体、または病原関連たんぱく質
ＰＲ−Ｓに対する抗体を用いたいわゆるウェスタンブロ
ッティング法を用いる。第１表に示した結果はｐＭＯＧ
４０５−トランスジェニック植物中のオスモチンは実際
に細胞外空隙を指向することを示している。第１表 ｐＭＯＧ４０５−トランスジェニックタバコ植物におけるオスモチンの細胞外空 隙への指向性 たんぱく質サンプル 植物 トータル ＥＦ −ＥＦ 非トランスジェニック − − − ｐＭＯＧ４０４ ＋＋＋＋ − ＋＋＋＋ｐＭＯＧ４０５ ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋ −：ＡＰ２０なし、＋→＋＋＋＋：オスモチン量の増加
およびｐＭＯＧ４０５トランスジェニックタバコ植物の
分析）ｐＭＯＧ４０５−トランスジェニックタバコ植物
におけるオスモチンの細胞外指向性を示すため、以下の
実験を行った。新しく導入したオスモチン遺伝子を発現
するｐＭＯＧ４０４−トランスジェニック植物系列およ
びｐＭＯＧ４０５−トランスジェニック植物系列のＦ１
植物の葉および非トランスジェニック植物の葉の全たん
ぱく質および細胞外たんぱく質を抽出した。細胞外たん
ぱく質の抽出のためにはデウィット（Dewit）およびス
パイクマン（Spikman）（1982, Physiol.Plant Pathol.
20, 1-11）の操作に従って細胞外液を採取した。細胞
外液単離後、他の葉物質と同様にたんぱく質を抽出し
た。総抽出物（トータル）、細胞外液（ＥＦ）および細
胞外液除去後の葉抽出物（−ＥＦ）中のたんぱく質の分
析にはＡＰ２０特異的抗体、または病原関連たんぱく質
ＰＲ−Ｓに対する抗体を用いたいわゆるウェスタンブロ
ッティング法を用いる。第１表に示した結果はｐＭＯＧ
４０５−トランスジェニック植物中のオスモチンは実際
に細胞外空隙を指向することを示している。第１表 ｐＭＯＧ４０５−トランスジェニックタバコ植物におけるオスモチンの細胞外空 隙への指向性 たんぱく質サンプル 植物 トータル ＥＦ −ＥＦ 非トランスジェニック − − − ｐＭＯＧ４０４ ＋＋＋＋ − ＋＋＋＋ｐＭＯＧ４０５ ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋ −：ＡＰ２０なし、＋→＋＋＋＋：オスモチン量の増加
【００２６】（実施例９）
（トランスジェニックタバコ植物における菌類耐性の分
析）菌類フィトフソラ ニコチアナ バル ニコチアナ
（Phytophthora nicotianae var. nicotiana）（Pnn）
は卵菌類である。これはとりわけタバコを宿主とする根
の病原体である。植物への感染は葉の枯れおよび、また
は茎の下部の腐敗（ブラックシャンク）を起こす。結果
的に感染によりタバコ植物は死ぬ。直径約１〜２センチ
メートルの葉ディスクをｐＭＯＧ４０４−トランスジェ
ニック、ベクタートランスジェニック、および非トラン
スジェニックタバコ植物から作る。この葉ディスクを滅
菌水を入れたシャーレに逆さに浮かす。各ディスク上に
遊走子懸濁液（５０００ｓｐ／ｍｌ）１Oμｌを滴下す
る。各実験で１０個のディスクを３回使用した。すなわ
ち、実験当り、全部で２０個のコントロールディスクを
使用した。約１日後コントロールディスクに感染の最初
の微候が表われた。３日後コントロール葉ディスクの全
てに影響が表われた（水漏れ）。ｐＭＯＧ４０４−トラ
ンスジェニック植物由来の葉ディスクは３日後でも病状
は少なかった。この実験結果は数回の実験で再現した。
この実施例は、細胞内オスモチン遺伝子を構成的に発現
するタバコ植物はタバコ植物の天然の病原体である菌類
フィトフソラニコチアナバルニコチアナ（Phytophthora
nicotianae var. nicotianae（Pnn）に対する感受性が
低いことを示している。全タバコ植物のP. nicotiane v
ar. vicotianaeに対する菌耐性を調べるため以下の実験
を行うことができるＬＢＡ４４０４（ｐＭＯＧ４０４）
でトランスホームした１０個のトランスジェニック植物
（オスモチン遺伝子の高発現体を選択した）、オスモチ
ン遺伝子を含まないベクターでトランスホームした１０
個のトランスジェニック植物（ベクタートランスジェニ
ック植物と呼ぶ）、および１０個の非トランスジェニッ
ク植物に２×１０5個Ｐｎｎ遊走子懸濁液で接種した。
この懸濁液を土壌の上の茎の下部に滴下した。それから
１００ｍｌの水を茎の根元に注いだ。つづいて、病状の
発現を経時的にモニターした。２〜３日後、コントロー
ル植物（非トランスジェニックおよびベクタートランス
ジェニック植物）は最初の病状、すなわち枯れを示し
た。ｐＭＯＧ４０４−トランスジェニック植物の場合、
病状の発現はわずかに遅れた。しかし、より良い予防が
望まれる。植物中のオスモチンの存在位置の効果は以下
の実施例で調べる。
析）菌類フィトフソラ ニコチアナ バル ニコチアナ
（Phytophthora nicotianae var. nicotiana）（Pnn）
は卵菌類である。これはとりわけタバコを宿主とする根
の病原体である。植物への感染は葉の枯れおよび、また
は茎の下部の腐敗（ブラックシャンク）を起こす。結果
的に感染によりタバコ植物は死ぬ。直径約１〜２センチ
メートルの葉ディスクをｐＭＯＧ４０４−トランスジェ
ニック、ベクタートランスジェニック、および非トラン
スジェニックタバコ植物から作る。この葉ディスクを滅
菌水を入れたシャーレに逆さに浮かす。各ディスク上に
遊走子懸濁液（５０００ｓｐ／ｍｌ）１Oμｌを滴下す
る。各実験で１０個のディスクを３回使用した。すなわ
ち、実験当り、全部で２０個のコントロールディスクを
使用した。約１日後コントロールディスクに感染の最初
の微候が表われた。３日後コントロール葉ディスクの全
てに影響が表われた（水漏れ）。ｐＭＯＧ４０４−トラ
ンスジェニック植物由来の葉ディスクは３日後でも病状
は少なかった。この実験結果は数回の実験で再現した。
この実施例は、細胞内オスモチン遺伝子を構成的に発現
するタバコ植物はタバコ植物の天然の病原体である菌類
フィトフソラニコチアナバルニコチアナ（Phytophthora
nicotianae var. nicotianae（Pnn）に対する感受性が
低いことを示している。全タバコ植物のP. nicotiane v
ar. vicotianaeに対する菌耐性を調べるため以下の実験
を行うことができるＬＢＡ４４０４（ｐＭＯＧ４０４）
でトランスホームした１０個のトランスジェニック植物
（オスモチン遺伝子の高発現体を選択した）、オスモチ
ン遺伝子を含まないベクターでトランスホームした１０
個のトランスジェニック植物（ベクタートランスジェニ
ック植物と呼ぶ）、および１０個の非トランスジェニッ
ク植物に２×１０5個Ｐｎｎ遊走子懸濁液で接種した。
この懸濁液を土壌の上の茎の下部に滴下した。それから
１００ｍｌの水を茎の根元に注いだ。つづいて、病状の
発現を経時的にモニターした。２〜３日後、コントロー
ル植物（非トランスジェニックおよびベクタートランス
ジェニック植物）は最初の病状、すなわち枯れを示し
た。ｐＭＯＧ４０４−トランスジェニック植物の場合、
病状の発現はわずかに遅れた。しかし、より良い予防が
望まれる。植物中のオスモチンの存在位置の効果は以下
の実施例で調べる。
【００２７】（実施例１０）
（細胞外指向型オスモチンを発現するトランスジェニッ
クタバコ植物の菌類耐性の分析）アグロバクテリウム
ツメファシェンス（Agrobacterium tumefaciens）ＬＢ
Ａ４４０４（ｐＭＯＧ４０５）を利用して、実際に修正
型のオスモチン遺伝子を発現し、実際にアポプラスト指
向性のオスモチンを生産するトランスジェニックタバコ
植物を得た。分析法については実施例８に示したよう
に、細胞外指向型オスモチンをコードする遺伝子の発現
体についてフィトフソラニコチアナバルニコチアナ（Ph
ytophthora nicotianae var. nicotianae）に対する耐
性を分析した。この実験は１つのｐＭＯＧ４０４−トラ
ンスジェニック系列、２つのｐＭＯＧ４０５・トランス
ジェニック系列および１つの非トランスジェニックタバ
コ系列由来の１０枚の葉ディスクで行った。３日後非ト
ランスジェニック植物（系列＃２）、ｐＭＯＧ４０４の
高発現体（系列＃１）およびｐＭＯＧ４０５の２つの高
発現体（系列＃６および＃９）を分析した。この結果を
第２表に示す。第２表 トランスジェニックおよび非トランスジェニックタバコ系列由来の葉ディスクの フィトフソラニコチアナ(Phytophthora nicotianae)に関する菌類耐性検定植物系列 感染領域 ＃２ ８ディスク １００％ ２ディスク ６０％ ｐＭＯＧ４０４ ＃１ ７ディスク １００％ ３ディスク ＜２５％ ｐＭＯＧ４０５ ＃６ １ディスク １００％ ２ディスク ６０％ ７ディスク ＜２５％ ｐＭＯＧ４０５ ＃９ ３ディスク １００％ ２ディスク ６０％ ５ディスク ＜２５％ パーセンテージは３日後Ｐ．ニコチアナ（nicotianae）
感染で影響を受けた面積を表わしている。第２表の結果
は、細胞内局在オスモチンに比べて、オスモチンが細胞
外空隙を指向する場合の葉ディスクの抗菌効果の増加を
明確に示している。我々はここに示されている葉ディス
クの菌類耐性が植物全体にも反映されていると予想して
いる。
クタバコ植物の菌類耐性の分析）アグロバクテリウム
ツメファシェンス（Agrobacterium tumefaciens）ＬＢ
Ａ４４０４（ｐＭＯＧ４０５）を利用して、実際に修正
型のオスモチン遺伝子を発現し、実際にアポプラスト指
向性のオスモチンを生産するトランスジェニックタバコ
植物を得た。分析法については実施例８に示したよう
に、細胞外指向型オスモチンをコードする遺伝子の発現
体についてフィトフソラニコチアナバルニコチアナ（Ph
ytophthora nicotianae var. nicotianae）に対する耐
性を分析した。この実験は１つのｐＭＯＧ４０４−トラ
ンスジェニック系列、２つのｐＭＯＧ４０５・トランス
ジェニック系列および１つの非トランスジェニックタバ
コ系列由来の１０枚の葉ディスクで行った。３日後非ト
ランスジェニック植物（系列＃２）、ｐＭＯＧ４０４の
高発現体（系列＃１）およびｐＭＯＧ４０５の２つの高
発現体（系列＃６および＃９）を分析した。この結果を
第２表に示す。第２表 トランスジェニックおよび非トランスジェニックタバコ系列由来の葉ディスクの フィトフソラニコチアナ(Phytophthora nicotianae)に関する菌類耐性検定植物系列 感染領域 ＃２ ８ディスク １００％ ２ディスク ６０％ ｐＭＯＧ４０４ ＃１ ７ディスク １００％ ３ディスク ＜２５％ ｐＭＯＧ４０５ ＃６ １ディスク １００％ ２ディスク ６０％ ７ディスク ＜２５％ ｐＭＯＧ４０５ ＃９ ３ディスク １００％ ２ディスク ６０％ ５ディスク ＜２５％ パーセンテージは３日後Ｐ．ニコチアナ（nicotianae）
感染で影響を受けた面積を表わしている。第２表の結果
は、細胞内局在オスモチンに比べて、オスモチンが細胞
外空隙を指向する場合の葉ディスクの抗菌効果の増加を
明確に示している。我々はここに示されている葉ディス
クの菌類耐性が植物全体にも反映されていると予想して
いる。
【００２８】植物体の菌類耐性検定の目的で上述の系列
を先の実施例で説明した方法で検定し得る。我々はｐＭ
Ｏ４０５トランスジェニックタバコ植物がｐＭＯＧ４０
４でトランスホームした系列に比べてかなり高い耐性を
示すと予想する。オスモチン様たんぱく質の抗菌効果に
関する観察から、抗菌たんぱく質がＣａＭＶ３５Ｓ、す
なわち構成的プロモーターのコントロール下の場合につ
いて示したように高レベルで植物体内に発現されるとき
に得られると結論する。さらに細胞内抗菌たんぱく質が
細胞外指向性を伴う時、抗菌効果の有意な増加が得られ
ることが分る。キチナーゼおよびβ−１，３−グルカナ
ーゼを用いた同様のテストから得られる最近の結果でこ
の知見が確認された。細胞内たんぱく質であるオスモチ
ン様たんぱく質が抗菌効果を示すという知見が以下に説
明するように増々明確になってきている情況を完全なも
のにしていることが最も重要である。あるキチナーゼお
よびグルカナーゼはしばしば抗菌効果を示すことが知ら
れてきている。植物体内で少なくともいくつかの植物キ
チナーゼおよびグルカナーゼに抗菌効果を期待すること
は難しい。この理由は明白である。というのは最近得ら
れた知見は、細胞内で生じる上記酵素検体のみが抗菌効
果を有していることを強く指示しているからである。こ
のことは細胞内たんぱく質である３グループの抗菌たん
ぱく質、すなわちオスモチン様たんぱく質によって確認
されるが、一方オスモチン様たんぱく質とホモロージが
高く、かつ耐性を誘導するが細胞外たんぱく質であるＰ
Ｒ−Ｓは全く抗菌効果を示さない。いわゆる病原関連た
んぱく質の第４のグループ（キチナーゼ、グルカナーゼ
およびオスモチン様たんぱく質の３グループ以外のグル
ープ）、ＰＲ−１たんぱく質もこの情況に当てはまる。
しかし、もし方策を講じないならば、前記遺伝子でトラ
ンスホームした植物体中での細胞内抗菌たんぱく質をコ
ードする遺伝子の発現はそれらのたんぱく質が好ましい
作用部位に到達しないため非常に小さい抗菌効果しか示
さない。
を先の実施例で説明した方法で検定し得る。我々はｐＭ
Ｏ４０５トランスジェニックタバコ植物がｐＭＯＧ４０
４でトランスホームした系列に比べてかなり高い耐性を
示すと予想する。オスモチン様たんぱく質の抗菌効果に
関する観察から、抗菌たんぱく質がＣａＭＶ３５Ｓ、す
なわち構成的プロモーターのコントロール下の場合につ
いて示したように高レベルで植物体内に発現されるとき
に得られると結論する。さらに細胞内抗菌たんぱく質が
細胞外指向性を伴う時、抗菌効果の有意な増加が得られ
ることが分る。キチナーゼおよびβ−１，３−グルカナ
ーゼを用いた同様のテストから得られる最近の結果でこ
の知見が確認された。細胞内たんぱく質であるオスモチ
ン様たんぱく質が抗菌効果を示すという知見が以下に説
明するように増々明確になってきている情況を完全なも
のにしていることが最も重要である。あるキチナーゼお
よびグルカナーゼはしばしば抗菌効果を示すことが知ら
れてきている。植物体内で少なくともいくつかの植物キ
チナーゼおよびグルカナーゼに抗菌効果を期待すること
は難しい。この理由は明白である。というのは最近得ら
れた知見は、細胞内で生じる上記酵素検体のみが抗菌効
果を有していることを強く指示しているからである。こ
のことは細胞内たんぱく質である３グループの抗菌たん
ぱく質、すなわちオスモチン様たんぱく質によって確認
されるが、一方オスモチン様たんぱく質とホモロージが
高く、かつ耐性を誘導するが細胞外たんぱく質であるＰ
Ｒ−Ｓは全く抗菌効果を示さない。いわゆる病原関連た
んぱく質の第４のグループ（キチナーゼ、グルカナーゼ
およびオスモチン様たんぱく質の３グループ以外のグル
ープ）、ＰＲ−１たんぱく質もこの情況に当てはまる。
しかし、もし方策を講じないならば、前記遺伝子でトラ
ンスホームした植物体中での細胞内抗菌たんぱく質をコ
ードする遺伝子の発現はそれらのたんぱく質が好ましい
作用部位に到達しないため非常に小さい抗菌効果しか示
さない。
【００２９】これらの観察から、我々は以下にように結
論した。 １）少なくともキチナーゼ、グルカナーゼおよびオスモ
チン様たんぱく質を含む耐性の誘導で生産される全ての
たんぱく質の細胞内型のものはそれらの細胞外型に比べ
て有意に高い抗菌効果を有する。全部ではないにしろほ
とんどのＰＲ−たんぱく質はほとんどまたは全く抗菌効
果を示さないであろう。 ２）ｐＭＯＧ４０５植物を用いた実験で指摘されるよう
に、植物体中の存在位置とは無関係に抗菌たんぱく質の
好ましい作用部位は細胞外空隙である。 ３）菌類の攻撃と効果的に戦うために、抗菌調製物の耐
性誘導で生産される細胞内たんぱく質の使用が非常に好
ましい。 ４）菌類感受性が低下した植物を得るには好ましい作用
部位である細胞外空隙を指向する細胞内抗菌たんぱく質
をコードするオープンリーディングフレームで植物をト
ランスホームする。しかし、先に述べたことから過敏性
応答の誘導で生産される文字どおり全ての細胞内たんぱ
く質は実際に抗菌効果を有すると考えるべきではない。
この理由で酵素効果よりもむしろ抗菌効果から始める
“逆療法”が実験に抗菌効果を有するこれらの（細胞
内）たんぱく質のみを分別するのにたいへん有用であ
る。このように好ましくは細胞外指向型となるようにオ
ープンリーディングフレームの修正した後、抗菌たんぱ
く質をコードするオープンリーディングフレームで感受
性植物をトランスホームすることによりこれらのたんぱ
く質の植物体内での菌類耐性効果をテストする。
論した。 １）少なくともキチナーゼ、グルカナーゼおよびオスモ
チン様たんぱく質を含む耐性の誘導で生産される全ての
たんぱく質の細胞内型のものはそれらの細胞外型に比べ
て有意に高い抗菌効果を有する。全部ではないにしろほ
とんどのＰＲ−たんぱく質はほとんどまたは全く抗菌効
果を示さないであろう。 ２）ｐＭＯＧ４０５植物を用いた実験で指摘されるよう
に、植物体中の存在位置とは無関係に抗菌たんぱく質の
好ましい作用部位は細胞外空隙である。 ３）菌類の攻撃と効果的に戦うために、抗菌調製物の耐
性誘導で生産される細胞内たんぱく質の使用が非常に好
ましい。 ４）菌類感受性が低下した植物を得るには好ましい作用
部位である細胞外空隙を指向する細胞内抗菌たんぱく質
をコードするオープンリーディングフレームで植物をト
ランスホームする。しかし、先に述べたことから過敏性
応答の誘導で生産される文字どおり全ての細胞内たんぱ
く質は実際に抗菌効果を有すると考えるべきではない。
この理由で酵素効果よりもむしろ抗菌効果から始める
“逆療法”が実験に抗菌効果を有するこれらの（細胞
内）たんぱく質のみを分別するのにたいへん有用であ
る。このように好ましくは細胞外指向型となるようにオ
ープンリーディングフレームの修正した後、抗菌たんぱ
く質をコードするオープンリーディングフレームで感受
性植物をトランスホームすることによりこれらのたんぱ
く質の植物体内での菌類耐性効果をテストする。
【００３０】（実施例１１）
（トランスジェニックポテト植物における菌類耐性の分
析）ｐＭＯＧ４０４およびｐＭＯＧ４０５でトランスホ
ームしたポテト植物の感受性を調べるため、最良のトラ
ンスジェニック発現体２０個に菌類フィトフソラインフ
ェスタンス（Phytophthora infestans）の１×１０5個
の胞子懸濁液をスプレーする。Ｐ．インフェスタンス
（infestans）はポテト植物の手ごわい病原体である。
これは葉を完全に枯らし、茎を腐らせ最終的にその植物
を殺してしまう。コントロールとして非トランスホーム
植物２０個およびオスモチン遺伝子を含まないベクター
でトランスホームした（ベクタートランスジェニック）
植物２０個に同量の胞子をスプレーする。この植物を１
８℃、湿度９５〜１００％の雰囲気の生育室で生育させ
る。菌類の影響を受けた菌の面積を測定することにより
病気の進行情況をスプレー後７日および１４日目に測定
した。葉の障害面積の定量は計数した全葉の総面積に対
する割合で表わした。植物当り８〜１０枚の（下部）葉
を計数した。各植物の全ての計数した葉の結果の平均を
計算する。以下の表はその見積り結果を示している。第３表 （菌類Ｐ．インフェスタンス（infestans）に対するポテト植物の感受性の見積 り結果） （７日目） ＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋＋ 非トランスジェニック − − 15±10％ 85±10％ ベクタートランスジェニック − − 15±10％ 85±10％ pMOG404-トランスジェニック 25±10％ 25±10％ 20±10％ 30±10％ pMOG405-トランスジェニック 25±10％ 30±10％ 30±10％ 15±10％ （１４日目） ＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋＋ 非トランスジェニック 10±10％ 90±10％ ベクタートランスジェニック 10±10％ 90±10％ pMOG404-トランスジェニック 20±10％ 10±10％ 10±10％ 60±10％ pMOG405-トランスジェニック 20±10％ 25±10％ 30±10％ 25±10％ ここで用いた接種物で非トランスホームおよびベクター
トランスホーム植物は７日目に全んど全てが障害を受け
た。７日目のｐＭＯＧ４０４植物のうちそのわずかに３
０％のみが重大な影響を受け、ｐＭＯＧ４０４の約７０
％はコントロール植物と比べて明らかに病気の発生の遅
れを示している。１４日目ではｐＭＯＧ４０４植物の約
１０〜５０％は感染症状軽度から中度（＋〜＋＋）を示
している一方、なお１０〜３０％がほとんどまたは全く
影響を受けていない（＋）。細胞外指向型オスモチン
（すなわちｐＭＯＧ４０５植物）はｐＭＯＧ４０４トラ
ンスジェニック植物系列よりも病状の発生を遅らせてい
る。
析）ｐＭＯＧ４０４およびｐＭＯＧ４０５でトランスホ
ームしたポテト植物の感受性を調べるため、最良のトラ
ンスジェニック発現体２０個に菌類フィトフソラインフ
ェスタンス（Phytophthora infestans）の１×１０5個
の胞子懸濁液をスプレーする。Ｐ．インフェスタンス
（infestans）はポテト植物の手ごわい病原体である。
これは葉を完全に枯らし、茎を腐らせ最終的にその植物
を殺してしまう。コントロールとして非トランスホーム
植物２０個およびオスモチン遺伝子を含まないベクター
でトランスホームした（ベクタートランスジェニック）
植物２０個に同量の胞子をスプレーする。この植物を１
８℃、湿度９５〜１００％の雰囲気の生育室で生育させ
る。菌類の影響を受けた菌の面積を測定することにより
病気の進行情況をスプレー後７日および１４日目に測定
した。葉の障害面積の定量は計数した全葉の総面積に対
する割合で表わした。植物当り８〜１０枚の（下部）葉
を計数した。各植物の全ての計数した葉の結果の平均を
計算する。以下の表はその見積り結果を示している。第３表 （菌類Ｐ．インフェスタンス（infestans）に対するポテト植物の感受性の見積 り結果） （７日目） ＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋＋ 非トランスジェニック − − 15±10％ 85±10％ ベクタートランスジェニック − − 15±10％ 85±10％ pMOG404-トランスジェニック 25±10％ 25±10％ 20±10％ 30±10％ pMOG405-トランスジェニック 25±10％ 30±10％ 30±10％ 15±10％ （１４日目） ＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋＋ 非トランスジェニック 10±10％ 90±10％ ベクタートランスジェニック 10±10％ 90±10％ pMOG404-トランスジェニック 20±10％ 10±10％ 10±10％ 60±10％ pMOG405-トランスジェニック 20±10％ 25±10％ 30±10％ 25±10％ ここで用いた接種物で非トランスホームおよびベクター
トランスホーム植物は７日目に全んど全てが障害を受け
た。７日目のｐＭＯＧ４０４植物のうちそのわずかに３
０％のみが重大な影響を受け、ｐＭＯＧ４０４の約７０
％はコントロール植物と比べて明らかに病気の発生の遅
れを示している。１４日目ではｐＭＯＧ４０４植物の約
１０〜５０％は感染症状軽度から中度（＋〜＋＋）を示
している一方、なお１０〜３０％がほとんどまたは全く
影響を受けていない（＋）。細胞外指向型オスモチン
（すなわちｐＭＯＧ４０５植物）はｐＭＯＧ４０４トラ
ンスジェニック植物系列よりも病状の発生を遅らせてい
る。
【００３１】
【配列表】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
配列型：ヌクレオチド
配列長さ：３４
ストランドネス：二本鎖
トポロジー：線状
分子型：合成
起源
生物：アルファルファモザイクウイルス
クローン：−
性質：アルファルファモザイクウイルス ＰＮＡ４
TTTTTATTTT TAATTTTCTT TCAAATACTT CCAG 34
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
配列型：ヌクレオチド
配列長さ：３２
ストランドネス：一本鎖
トポロジー：線状
分子型：合成
起源
生物：−
クローン：−
性質：オスモチン−ｃＤＮＡに相同的なＰＣＲプライマー
GCCGGATCCA ATTCGGCACA TGGGCAACTT GA 32
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
配列型：ヌクレオチド
配列長さ：２６
ストランドネス：一本鎖
トポロジー：線状
分子型：合成
起源
生物：−
クローン：−
性質：オスモチン−ｃＤＮＡに相同的なＰＣＲプライマー
GTTTATTACA GCAAGGATCC TGACTT 26
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
配列型：ヌクレオチド
配列長さ：８８３
ストランドネス：二本鎖
トポロジー：線状
分子型：ｃＤＮＡ
起源
生物：ニコチアナ タバカム（Nicotianae tabacum）
クローン：ｐＭＯＧ４０４
性質：オスモチン様たんぱく質のコーディング
GGATCCAATT CGGCAC 16
ATG GGC AAC TTG AGA TCT TCT TTT GTT TTC TTC CTC CTT GCC 58
Met Gly Asn Leu Arg Ser Ser Phe Val Phe Phe Leu Leu Ala
TTG GTG ACT TAT ACT TAT GCT GCC ACT ATC GAG GTC CGA AAC 100
Leu Val Thr Tyr Thr Tyr Ala Ala Thr Ile Glu Val Arg Asn
AAC TGT CCG TAC ACC GTT TGG GCG GCG TCG ACA CCC ATA GGC 142
Asn Cys Pro Tyr Thr Val Trp Ala Ala Ser Thr Pro Ile Gly
GGT GGC CGG CGT CTC GAT CGA GGC CAA ACT TGG GTG ATC AAT 184
Gly Gly Arg Arg Leu Asp Arg Gly Gln Thr Trp Val Ile Asn
GCG CCA CGA GGT ACT AAA ATG GCA CGT GTA TGG GGC CGT ACT 226
Ala Pro Arg Gly Thr Lys Met Ala Arg Val Trp Gly Arg Thr
AAT TGT AAC TTC AAT GCT GCT GGT AGG GGT ACG TGC CAA ACC 268
Asn Cys Asn Phe Asn Ala Ala Gly Arg Gly Thr Cys Gln Thr
GGT GAC TGT GGT GGA GTC CTA CAG TGC ACC GGG TGG GGT AAA 310
Gly Asp Cys Gly Gly Val Leu Gln Cys Thr Gly Trp Gly Lys
CCA CCA AAC ACC TTG GCT GAA TAC GCT TTG GAC CAA TTC AGT 352
Pro Pro Asn Thr Leu Ala Glu Tyr Ala Leu Asp Gln Phe Ser
GGT TTA GAT TTC TGG GAC ATT TCT TTA GTT GAT GGA TTC AAC 394
Gly Leu Asp Phe Trp Asp Ile Ser Leu Val Asp Gly Phe Asn
ATT CCG ATG ACT TTC GCC CCG ACT AAC CCT AGT GGA GGG AAA 436
Ile Pro Met Thr Phe Ala Pro Thr Asn Pro Ser Gly Gly Lys
TGC CAT GCA ATT CAT TGT ACG GCT AAT ATA AAC GGC GAA TGT 478
Cys His Ala Ile His Cys Thr Ala Asn Ile Asn Gly Glu Cys
CCC CGC GAA CTT AGG GTT CCC GGA GGA TGT AAT AAC CCT TGT 520
Pro Arg Glu Leu Arg Val Pro Gly Gly Cys Asn Asn Pro Cys
ACT ACA TTC GGA GGA CAA CAA TAT TGT TGC ACA CAA GGA CCT 562
Thr Thr Phe Gly Gly Gln Gln Tyr Cys Cys Thr Gln Gly Pro
TGT GGT CCT ACA TTT TTC TCA AAA TTT TTC AAA CAA AGA TGC 604
Cys Gly Pro Thr Phe Phe Ser Lys Phe Phe Lys Gln Arg Cys
CCT GAT GCC TAT AGC TAC CCA CAA GAT GAT CCT ACT AGC ACT 646
Pro Asp Ala Tyr Ser Tyr Pro Gln Asp Asp Pro Thr Ser Thr
TTT ACT TGC CCT GGT GGT AGT ACA AAT TAT AGG GTT ATC TTT 688
Phe Thr Cys Pro Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Arg Val Ile Phe
TGT CCT AAT GGT CAA GCT CAC CCA AAT TTT CCC TTG GAA ATG 730
Cys Pro Asn Gly Gln Ala His Pro Asn Phe Pro Leu Glu Met
CCT GGA AGT GAT GAA GTG GCT AAG TAG AGTGGCTATT 767
Pro Gly Ser Asp Glu Val Ala Lys
TCTGTAATAA GATCACCTTT TGGTCAAATT ATTCTATCGA CACGTTAGTG 817
TAAGACAATC TATTTGACTC GTTTTTATAG TTACGTACTT TGTTTGAAGT 867
GATCAAGTCA GGATCC 883
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
配列型：ヌクレオチド
配列長さ：８８４
ストランドネス：二本鎖
トポロジー：線状
分子型：ｃＤＮＡ
起源
生物：ニコチアナ タバカム（Nicotianae tabacum）
クローン：ｐＭＯＧ４０４
性質：２０個のＣ末端アミノ酸を欠くオスモチン様たんぱく質のコーディング
GGATCCAATT CGGCAC 16
ATG GGC AAC TTG AGA TCT TCT TTT GTT TTC TTC CTC CTT GCC 58
Met Gly Asn Leu Arg Ser Ser Phe Val Phe Phe Leu Leu Ala
TTG GTG ACT TAT ACT TAT GCT GCC ACT ATC GAG GTC CGA AAC 100
Leu Val Thr Tyr Thr Tyr Ala Ala Thr Ile Glu Val Arg Asn
AAC TGT CCG TAC ACC GTT TGG GCG GCG TCG ACA CCC ATA GGC 142
Asn Cys Pro Tyr Thr Val Trp Ala Ala Ser Thr Pro Ile Gly
GGT GGC CGG CGT CTC GAT CGA GGC CAA ACT TGG GTG ATC AAT 184
Gly Gly Arg Arg Leu Asp Arg Gly Gln Thr Trp Val Ile Asn
GCG CCA CGA GGT ACT AAA ATG GCA CGT GTA TGG GGC CGT ACT 226
Ala Pro Arg Gly Thr Lys Met Ala Arg Val Trp Gly Arg Thr
AAT TGT AAC TTC AAT GCT GCT GGT AGG GGT ACG TGC CAA ACC 268
Asn Cys Asn Phe Asn Ala Ala Gly Arg Gly Thr Cys Gln Thr
GGT GAC TGT GGT GGA GTC CTA CAG TGC ACC GGG TGG GGT AAA 310
Gly Asp Cys Gly Gly Val Leu Gln Cys Thr Gly Trp Gly Lys
CCA CCA AAC ACC TTG GCT GAA TAC GCT TTG GAC CAA TTC AGT 352
Pro Pro Asn Thr Leu Ala Glu Tyr Ala Leu Asp Gln Phe Ser
GGT TTA GAT TTC TGG GAC ATT TCT TTA GTT GAT GGA TTC AAC 394
Gly Leu Asp Phe Trp Asp Ile Ser Leu Val Asp Gly Phe Asn
ATT CCG ATG ACT TTC GCC CCG ACT AAC CCT AGT GGA GGG AAA 436
Ile Pro Met Thr Phe Ala Pro Thr Asn Pro Ser Gly Gly Lys
TGC CAT GCA ATT CAT TGT ACG GCT AAT ATA AAC GGC GAA TGT 478
Cys His Ala Ile His Cys Thr Ala Asn Ile Asn Gly Glu Cys
CCC CGC GAA CTT AGG GTT CCC GGA GGA TGT AAT AAC CCT TGT 520
Pro Arg Glu Leu Arg Val Pro Gly Gly Cys Asn Asn Pro Cys
ACT ACA TTC GGA GGA CAA CAA TAT TGT TGC ACA CAA GGA CCT 562
Thr Thr Phe Gly Gly Gln Gln Tyr Cys Cys Thr Gln Gly Pro
TGT GGT CCT ACA TTT TTC TCA AAA TTT TTC AAA CAA AGA TGC 604
Cys Gly Pro Thr Phe Phe Ser Lys Phe Phe Lys Gln Arg Cys
CCT GAT GCC TAT AGC TAC CCA CAA GAT GAT CCT ACT AGC ACT 646
Pro Asp Ala Tyr Ser Tyr Pro Gln Asp Asp Pro Thr Ser Thr
TTT ACT TGC CCT GGT GGT AGT ACA AAT TAT AGG GTT ATC TTT 688
Phe Thr Cys Pro Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Arg Val Ile Phe
TGT CCT 694
Cys Pro
TAATGGTCAA GCTCACCCAA ATTTTCCCTT GGAAATGCCT GGAAGTGATG 744
AAGTGGCTAA GTAGAGTGGC TATTTCTGTA ATAAGATCAC CTTTTGGTCA 794
AATTATTCTA TCGACACGTT AGTGTAAGAC AATCTATTTG ACTCGTTTTT 844
ATAGTTACGT ACTTTGTTTG AAGTGATCAA GTCAGGATCC 884
【図１】図１はタバコ由来のオスモチンII（サイン（Si
ngh）等、1989、上述）、タバコ由来のオスモチンI（サ
イン（Singh）等、1987、上述）およびトマト由来のオ
スモチン（キング（king）等、1988、上述）の配列とＡ
Ｐ２０のアミノ酸配列との類似性を示している。
ngh）等、1989、上述）、タバコ由来のオスモチンI（サ
イン（Singh）等、1987、上述）およびトマト由来のオ
スモチン（キング（king）等、1988、上述）の配列とＡ
Ｐ２０のアミノ酸配列との類似性を示している。
【図２】図２は発現ベクターｐＭＯＧ１８０を模式的に
示したものである。
示したものである。
【図３】図３はバイナリーベクターｐＭＯＧ４０４を示
している。ＬＢ＝Ｔ−ＤＮＡの左境界、ＲＢ＝Ｔ−ＤＮ
Ａの右境界。
している。ＬＢ＝Ｔ−ＤＮＡの左境界、ＲＢ＝Ｔ−ＤＮ
Ａの右境界。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 メルヘルス レオ シュールト
オランダ エヌエル2334 エーアー レイ
デン ファン スウィーテンストラート
47
(72)発明者 コルネリセン ベルナルデュス ヨハネス
クレメンス
オランダ エヌエル2316 エーベー ワル
モント ヘレンウェッヒ 29
(72)発明者 ミューレンホフ エリザベス ヨシーヌ
ソフィー
オランダ エヌエル1052 アーエー アム
ステルダム オルテリュースカーデ 31イ
ー
(72)発明者 セラ ビュールラーヘ マリアンヌ ベア
トリクス
オランダ エヌエル3877 ヴェーペー ア
メルスフォールト エディソンストラート
58
(72)発明者 ファン デン エルゼン ペトルス ヨゼ
フス マリア
オランダ エヌエル2215 ベーハー フォ
ールハウト セイエンホフ 26
Ｆターム(参考） 4H011 AA01 BA01 BB21 DD03
4H045 AA10 AA20 BA10 CA30 EA60
FA71 FA74 GA01 GA10 GA15
GA21 GA22 GA23 GA31
Claims (4)
- 【請求項１】 卵菌類（Oomycete）に対する活性を有す
る抗菌たんぱく質を得る方法であって、 （１）植物中で耐性の誘導を引き起こす植物病原体で植
物を処理する工程、 （２）前記植物の抽出物を調製する工程、 （３）前記抽出物を、卵菌類に対する活性を有する抗菌
たんぱく質の存在について、抗菌検定法を用いて検定す
る工程、 （４）前記抽出物を分画し、抗菌検定法を用いて前記た
んぱく質分画を検定する工程、及び、 （５）前記抗菌活性を有する分画を精製する工程、を含
み、前記抗菌性たんぱく質を得るための前記植物病原体
が卵菌類であることを特徴とする方法。 - 【請求項２】 前記卵菌類がフィトフソラ（Phytophtho
ra）属である、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記工程（２）の前に抽出物を脱塩し、
４℃でインキュベートしてから遠心した後、得られた上
清を工程（２）及び（３）で抽出物に施した操作と同様
の操作で処理する、請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項４】 得られる抗菌たんぱく質がオスモチンた
んぱく質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の
方法。
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