PT97826B - Processo para a preparacao de purificacao de uma proteina a partir de uma planta com um efeito inibidor num patogenio ou peste e de composicoes anti-fungos que as contem - Google Patents

Description

Descrição referente â Patente de In.....

venção de MOGEM INTERNACIONAL N..V.. ., h o 1 a ri desa, i n d u s t r ± a 1 e c o rn er c i a 1, com sede em Einsteinweg 97, 2300 CB

I.... ΕIDEN, Η o 1 anda, (inventores: C h a r 1 e s Peter WaloshuK, L.eo Sjoerd Melehers,

Bernardas Johannes Cornelissen, Eli.....

s a b e t h J o s i n e S o p h i. e 1*1 e u 1 e n h o f f, Marianne Beatrix SelaBuurlage e petrus Josephus Maria Van Den Elzen, residentes na Holanda), para PROCES.....

S0 PARA A PREPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE OMA PROTEÍNA A PARTIR DE UMA PLANTA COM ELEITO INIBIDOR NUM PAT0GÉN10 00 PESTE E DE OOMPOSICOES ΑΝΤΙ.....FUNGOS QUE AS CONTEM..

D......E......S......C......R......I.......Ç......Ã......Q

ÂMBITO......TÉCNICO

A invenção refere-se à inibição do cres.....

cimenta de fungos utilizando proteínas que sao isoladas de plantas.. A invenção refere processos para a preparação destas proteínas numa forma activa, bem corno de composições fun.....

cionais que as con têm ..

A invenção também refere plantas com uma susceptibilidade inferior aos fungos, caracterizadas por um gene ou genes que codificam essa proteína serem expressos em constituição ou numa forma especif icarnente regulada numa ou mais partes da planta, referindo ainda processos para obter essas plantas.

ANTECEDENTES......DA.......INVENÇÃO

Sao conhecidas proteínas de plantas com activi.dade antifungos.. Urna chitinase purificada de feijcíes

provoca a inibição do crescimento do fungo Tr::i..clioderma......vir ide (Schlumbaun e col... , (1986) Nature 324365--367),.

É descrita uma chitinase de ervilhas com o efeito · inibidor no crescimento em 1 r 1. c fci o d e r rn ei v ::i.. r :i. d e ^ern ensaios de placa de ágar por Maucfci e col.., (1968, Plant Physiol. 88, 936-942).. Esta enzima tem, apenas, contudo, um efeito limitado por exemplo no ascorniceta Cladosporiurn cucumerlnurn, e nao tem efeito no crescimento de, entre ou.....

tros, Une Oorniceta Phytophthora cactorurn, Pythiuin aphanl.....

der maturo, e Pythlurn ultirnurn.. Assirn, uma desvantagem importante desta enzima é a sua gama de serviço limitada.. Num ensaio semelhante foi estabelecido que a |3~1, 3.....glucanase tem u rn e f e i t o i n i b i d o r η o cr es c i rn en t o e m Fusarium solani f.. s p.. J£i§i ·

È descrita uma preparação com um efeito hidrolítico em paredes de células isoladas de Verticilllurn alboatrurn, c o rn p r e e n d e n d o u rn a c o rn fc) i n a ç ã o d e u rn a en d o |3 ·· 1,3 glucanase purificada de tomate e uma exa-|3-l, 3-glucanase de origem em fungos por Young & Pegg (1982, Physiol.. Plant Pathol.. 21, 411-423).. Qualquer destas enzirnas nao tem efeito por si. própria..

Sao descritas por Bohlrnann, H„ e col.., (1988, EMBO J.. 7, 1559-1565) várias tioninas, entre outras de folhas de cevada, milho, trigo, arroz e várias plantas dicotiledónias, que revelam um efeito antifungo significativo ern ensaios in vitro..

Alérn disso, sao descritas proteínas de plantas corn urn efeito potenoiador da actívidade inibidora de fungos no Pedido de Patente Internacional PCT/US88/03420.. Estas proteínas de plantas são geralmente designadas como Proteínas Sinérgicas Antifungos (SAFP) .. As sao utilizadas ern combinação com polioxinas e nioornicinas, sao activas por si.

próprias contra fungos fitopatogénicos, ern combinação corn aperfeiçoamentos em SAFP podem ser conseguidos aumentos da eficácia da ordem de 10 a 100.. As SAFP nao têm efeito antifungo por si próprias.

Nas plantas, a sintese de chitinases e glucanases, bem como de grande numero de proteínas relacionadas com a patogenese (PR), é acompanhada corn um fenómeno conhecido como resposta hipersensível, que é também des.....

poletada, entre outros, por um patogenia de planta incompatível.. Esta resposta hipersensível resulta eventualmente na resistência da planta contra uma grande gama de patogénios.. De forma semelhante, a síntese das proteínas PF? pode ser induzida por vários factores bióticos e ahióticos, tais como fragmentos de paredes de cálulas de fungos, indutores químicos, como por exemplo salicilato e produtos semelhantes, que também resulta num largo espectro de resistência patogénica da planta.. Esta resistência obtida através de indução quer por um patogénio incompatível quer por um factor biótico ou abiôtico, ou substância química, é designado por resistência induzida.. Embora se tenha de aprender muito acerca da substância induzida e do papel destas proteínas PR, já foi feita alguma classificação.. No tabaco, parece que pelo menos 5 classes de Proteínas PF? são induzidas após tratamento com o vírus do mosaico do tabaco (TMV) .. Esta classificação é baseada ern características como por exemplo peso molecular, relação sorolõgioa, homologia de sequência de amino-àcidos, e a sua função conhecida, ou então actividade enzimatica, Dentro destas classes, pode ser feita uma divisão em proteínas intracelulares e extracelulares, que oom excepção da sua localização celular na planta, correspondem uma à outra em relação ás características acima mencionadas (ver corno revisão. Boi J.F. e col.. , 1990, Annu.. Rev. Phytopathol.. 23, 113.....138)..

Dado que estas proteínas parecem estar urn pouco envolvidas na resistência patogenica, é feito um grande esforço na identificação das proteínas fortemente anti.....

patogénicas dentro da família das proteínas PR,.

Até agora, urna técnica típica para o escrutínio e isolamento de proteínas anti-fungos é o es.....

crutinio de proteínas PR com actividade© enzimâticas conhecidas.. Isto é válido especialmente para as chitinases e β.....1,3.....glucanases, cujos substratos ocorrem nas paredes células ou integumentos da maior parte dos patogenias e/ou pestes. Contudo, em rnuitos casos parece não existir ou existir pouca correeçao entre a actividade enzimática (isto é chitinase e glucanase) e o efeito antifungos, embora a sua ocorrência seja fortemente correlacionada corn a resistência induzida das p1an ta s,.

Assim, existe uma necessidade de um processo mais eficaz e fiável para se obterem proteínas com um efeito antipatogênico significativo contra um patogénio seleccionado..

Constitui um objecto da presente invenção bem corno obter em-06 novas como par.....

proporcionar esses processos, proteínas antipatogénicas, que podem ser utilizadas subs t áη oias ac t i vas nas composiçoes an t ipa t ogén ic as ticularrnente antif ungos.. Constitui também um objecto da presente invenção proporcionar processos para a protecção de plantas contra patogénios de fungos, bem como de plantas que revelam uma reduzida susceptibilidade aos fungos..

DESCRI, ÇAO.....-PORMENORIZADA......DA.......INVENÇÃO

A presente invenção proporciona novos processos para a identificação e putificação de proteínas de plantas com um efeito inibidor em patogénios e/ou peste, como por exemplo, insectos, nematodos, fungos, e bactérias, uti4

lizando urna combinação de técnicas de fraccinação de 'proteínas não desnaturantes em extractos de folhas de plantas que forarn tratadas para desenvolver resistência induzida, e um ensaio antipatogénico, em que a purificação da proteína activa é efectuada por ensaio das fracções obtidas para a determinação do efeito inibidor num patogénio de escolha. Esses ensaio compreende a administração das fracções obtidas ao meio de crescimento, em circunstâncias que conduzem ao crescimento e/ou desenvolvimento do patogenia, ou adicionar ao alimenta oferecido ao patogénio, e avaliar o efeito antipatogénico devido â presença da referida fracção. P o s t e r ::i. o r m e n t e , p o d em ser a n a 1 i z a d as a 1 ::i. qu o tas d e f r a c ções antipatogénicas para determinar o seu teor em proteínas, e se necessário, podem ser efeotuadas outras fases de purificação em condições nao desnatur antesAs fases de purificação e ensaio podem ser repetidas até ser obtida purificação suf::i.ciente da proteína antipatogénica..

Mais em particular, a invenção propor.....

ciona novos processos para a identificação e purificação de proteínas antifungos de plantas, compreendendo as seguintes fases r.

1. tratar-se uma planta com um patogénio incompatível, um factor biõtico ou abiõtico que provoca resistência induzida na referída planta

2. Preparar.....se um extracto de folhas da referida planta;

3. desalificar.....se o extracto de folhas, e incubar.....se o extracto de folhas a baixa tempera.....

tura durante várias horas;

4. centrifugar-se o extracto de folhas incubado,

5. ensaiar uma aliquota do sobrenadante do extracto de folhas obtido após centrifugação na fase 4 para determinar a presença de activida.....

des anti fungos, por incubação do referido so5 •ο =>'-

brenadante na na presença do fungo contra o qual se piro cura a proteína antifungo, em condições que sao adequadas para o crescimento e/ou germinação do referido fungo, e compararse o crescimento e/ou germinação do fungo corn a incubação sem a actividade antifungo;

8.. fraccionar.....se o referido sobrenadante utili.....

zando um ou mais processos de fraccionaçao de proteina desnaturente, e escolher as fracções ontendo actividades anti.....

fungos por ensaio de uma aliquota das fracções tal como descrita para o sobrenadante na fase 5.

8.. purificar-se ainda mais as referidas fracções escolhidas utilizando urna ou rnais dos processos de fraccionaçao de proteína não desnaturantes

9.. repetirern-se, se necessário, as fases ?„ e 8„, até a proteína antifungo estar essencialmente isenta de outras proteínas.,

fungos pode aquecirnento semelhantes

ISO.....

pro.....

Durante a purificação, a actividade anti ser avaliada pela sua natureza proteica por e/ou tratamento com protease, e produtos Se possível, apõs purificação suficiente da actividade antifungo e após o estabelecimento de que se trata de uma proteína, podem ser determinados aolguns dos seus parâmetros fisioos, tais corno peso molecular, ponto e 1 e c t r ico , hi d r o f o b ici d a d e, ac t i vi dade en zi rn ã t i ca e priedades semelhantes, para rnais selectivamente escolher a próxima técnica de fraccionaçao ou purificação nao desnaturam te, de forma a obter o melhor resultado de purificação.. A escolha óptirna das técnicas de purificação das proteínas (combinação) , corn base nos parâmetros físicos tal corno acima mencionados, está dentro da capacidade do especialista da purificaçaodas proteínas.. Resumidamente, \> 3- X

dependendo do caso do material de planta utilizado e da proteína antifungo afectivamente purificada, o estabelecirnento das condições óptimas pode necessitar de algumas experiências e alguns erros preliminares, o que não deve ser encarado como urna experimentação· inadequada..

Logo que se considere que a proteína antifungo esta razoavelmente pura, a processamento pode ser ensaiada ern outros fungas, que podem ser outros fungos patogénicos de plantas, fungos patogénicos de animais ou humanos, bactérias, nerna todos e espécies semelhantes.. Em cada um e para cada caso individual, pode ser determinada a concentração, pH, e força ionica que são optirnos para a sua estabilidade e/ou efeito antifungo..

Se não for detectada proteína antifungo, o processo pode ser repetido utilizando um material de planta diferente na fase 1„ Pode ser util escolher uma linha variada, ou espécie de plantas, que se sabe ou parece ser resistente após indução contra o fungo para o qual se pretende desenvolver a proteína antifungo.,.

Quando essencialmente isenta de sua gama de a proteína o u t r a s p r o t e i n a s substancias, a sequência de amino ácidos antifungo . é e/ou outras (parcial) das proteínas antifungos pode também ser determinada.. Por translação inversa de sequência de aminoácidos para a sequência de nucleótidos, podem ser quimicamente sintetizadas várias sondas para isolar cADN ou clones genórnicos, codificando (parte) da proteína antifungos, que pode em principio ser utilizada para produzir plantascorn uma susceptibilidade reduzida aos fungos.. Para este objeotivo está adequadamente associado um quadro de leitura aberto, como por exempla o fragmento de cADN- ou ADN (parte) codificando a proteína antifungo com elementos necessários para a expressão numa célula de plantas.. Se a proteína

..... 7 .....

antifungos for urna proteína intracelular, o quadro de leitura aberto pode ser modificado para proporcionarapôs expressão, a deslocação da proteína para o espaço extracelular..

Como ilustração, o principio da invenção é apresentado com maior pormenor em seguida, tornando o isolamento e a identificação de urna proteína do tipo da osrnotina, bem corno a clonaçao posterior de um cADM codificando esta proteína ou corno exemplo típico. Além disso, este exemplo típico tarnbérn mostra urn processo para se obter urna planta transgénica corn urna susceptibilidade reduzida a fungos, em virtuda de um elevado nível de expressão de um quadro de leitura aberto, codificando uma proteína semelhante â referida osrnotina na referida planta.. Numa realização especialmente referida da invenção, é mostrado conto esta proteína de tipo osmatina normalmernte intracelular é deslocada para o espaço extracelular, provocando assim um maior efeito antifungos na planta em que ela é produzida..

Deve ser entendido que quando esta proteína de tipo osrnotina sao esplicitarnente mencionadas, elas servem apenas para ilustrar o principio do processo de acordo com a invenção e o seu resultado, e não pretendem limitar o âmbito da invenção a proteínas do tipo da osrnotina tal e qual., Assim, outras proteínas antifungos que podern ser obtidas de acordo corn este processo são consideradas corno compreendidas tarnbérn na presente invenção..

Vreificou.....se que quando as plantas sao 'tratadas corn urn patogénio incompatível que provoca urna resposta hipersensivel, passados alguns dias apôs a inoculação podern ser obtidos, extractos de folhas das fracçoes que apresentam um forte efeito antifungo. Foi verificado que as várias fracçoes obtidas de tabaco e tomate o efeito inibidor no crescimento dos fungos nao podia ser atribuído a |3.....1,3-glucanases ou chitinases, tal corno nas fracções purificadas corn actividade antifungos tambérn nao podia ser detectada actividade de glucanase e/ou chitinase. A actividade antifungos parece ser terrnicarnente Xãbil,, 0 componete activo do tabaco foi identificado como sendo uma proteína hidrofóbica corn urn peso molecular de cerca de 24 KD e com urn ponto isoelectrico básico (pi) e foi designada por AP20 (tambérn referida corno AP24) .. Após purificação e determinação da sequência de aminoácidos do terminal M de AP20, esta parte parecia idêntica â parte correspondente de osmotina que é urna proteina que se sabe ocorrer no tabaco (Singh, N.. i<.. e......col. , (1987) Plant Physiol... 85, 529-538; Sing,

N„l<„ e............co]...... (1989), PlantPhysiol. _90, 1®96.....1101) e que pertence a um grupo de proteínas designadas como osrnotinas, ou alternativamente corno proteínas do tipo da osmotina» As proteínas do tipo da osmotina devern o seu nome ao facto de se verificar que elas sao sintetizadas tambérn durante a adaptação osrnótica das células das plantas nurn meio contendo concentrações de cloreto de sódio, cloreto de potássio ou polietileno glicol; contudo, a acumulação de proteínas do tipo da osmotina parece ser dependente da presença continua de agentes os rn óticos., Sob a influência de (alguns) agentes não o srn óticos, corno por exemplo o cloreto de cádmio, não ocorre a acumulação (King e col.., (1986), Plant Mol.. Biol... 7, 441.....449) ..

Mo tabaco foram descritas duas osrnotinas, osmotina-1 que é uma forma solúvel em água, e osrnotina-11, solúvel em detergente, que é uma forma relativamente resistente à protease» Ambas as osrnotinas do tabaco têrn urn peso molecular de cerca de 24 KD, revelam uma grande Identidade mútua de sequência de aminoácidos bem corno semelhanças corn urna proteina do tipo de osmotina corn 24 KD de torna te (Lycopersicon....... esculenturn) , e corn outras proteínas, incluindo a taumatina de thaumatococcus............daníellli„ proteina relacionada corn a patogénese S (PR-S) do tabaco, e urn inibidor da tripsina/oj-arnilase bifuncional de milho.. As »

proteínas do tipo das osmotinas, que estão todas relacionadas do ponto de vista ©oro lógico e têm um peso molecular correspondente ao das osmotinas do tabaco e do tomate sao descritas entre outras para o painço, soja, cenoura (Dauous car o ta) , algodão, batata (Solanurn...........tuberosum) (Sing e col..

(1987), P..N..A..S.. USA 84, 789-743), luzerna (Nedicago......satlva) e feijão (Phaseolus) (King e col.., (1986), supra) ,.

Até agora nao e conhecido qualquer efeito da osmotina. Foi geralmente admitido que as osmotinas têm a função de proporcionar à planta urna tolerância osmótica apôs exposição a um potencial inferior de água (ver exemplo Grossete e col., (1990) Plant Phys. 92, 520-527)..

Com base na semelhança de parâmetros físicos, isto é urn peso molecular quase idêntica, uma sequência de aminoácidos adêntica à da osmotina.....II do tabaco e quase idêntica â osmotina.....I do tabaco e osmotina do tornate (NP24), bem como um valor correspondente pi, foi concluido que a proteína antifungos AP20 era ef ectivarnerrte urna osmotina. Para avaliar a hipótese cie urn efeito antifungo ser urna car ac ter is t ica geral das proteínas do tipo das osmotinas, foi ensaiada a proteína do tipo osmotina do tornate, conhecida como NP24, para a sua capacidade para inibir P .. infestans.. Parece que a NP24 possui também urn efeito antifungo..

Por razoes as osmotinas ou proteínas do

Assim, foi concluído que as proteínas do tipo do osmotina do tabaco e do tornate possuem actividade antifungos e sao assirn adequadas para utilização numa composição antifungos. Considerando a grande h o rn elogia entre as proteínas do tipo da osmotina no reino da© plantas, foram previstas outras osmotinas diferentes do tabaco e do tornate que possuern tambérn actividade antifungo., d e de f in i ç a o, con sidera-se que tipo da osmotina oornpreeendern r

proteínas corn urna hontologia na sequência de aminoácidos nao superior a 70% quando comparada com a õsrnotina de tabaco, de preferência mais que 80% e um valor de pi básico, cuja sintese está correlacionada com a adaptação osrnótica das células das plantas para meios com elevada concentração de NaCl, o que tem um efeito antifungos em pelo menos uri) fungo.. Um antífungo é aqui definido como qualquer acção inibidora na germinação, crescimento e/ou diferenciação dum fungo, ou qualquer outra acção que provoque uma redução da viabilidade e/ou infecciosidade do fungo..

Para o isolamento de osmotinas utiliza.....

* se, de preferência, a possibilidade de induzir a sintese desta proteína, por exemplo por inoculação da planta com um patogénio incompatível do grupo consistindo em vírus, bactérias ou fungos.. Contudo, nao é necessária inocular plantas com patogénios. Outras vias de induzir a sintese de osmotina podern ser aplicadas, como por exemplo a exposição cie plantas ou células de plantas cultivadas a NaCl e/ou polietileno glicol.. Isto conduz a elevadas concentrações de osmotina na célula; foram referidos niveis de acumulação até 12% de proteína total solúvel (Singh e col.., (1987) Plant Physiol, supra) .. A sintese da osmotina pode· também ser induzida por tratamento das plantas ou células das plantas com ABA (Ácido Abscisico) (Singh e col.., (1987) P.N.A.S„, supra) ..

As plantas de que podern ser isoladas as osrno tinas são de entre outras o painço , soja, algodão, to.....

ina te e a batata, descritos por Singh e col.., (1987), P.. N.. A.. S„ USA 84, 739-743; e King e col.., (1988), Plant,. Mol.. Biol.. 10, 401-· 412) , mas também osrno tinas (proteínas do tipo das osrno tinas) de outras plantas diferentes das acirna mencionadas satisfarão se ti ver ern urna hornologia suficiente com a osmotina do tabaco, ou terem parâmetros físicos que sejarn compatíveis corn os da osmotina do tabaco. Numa realização preferida da :1..::1..

ΐ Ί»

invenção faz-se uso de proteínas do tipo da csmotina isoladas de material (incluindo culturas de células) de uma planta do tabaco que é exposta a um factor de tensão, como por exemplo um agente osmótico,' séca, ou um patogénio, de preferência o vírus do mosaico do tabaco (TMV) ou de uma planta de tomate inoculada com o -Fungo Ptytophtbora infestansou com ácido araquidónico..

Para o isolamento de proteínas do tipo da osrnotina faz.....se uso de combinações de técnicas de frac.....

cionaçao de proteínas geralmente conhecidoas, como por exem......

p 1 o c e n t r i f u g aça o c r o rn a to g r a f i a, e 1 c c t r o f o r e s e e té c n i c a s semelhantes.. Para os objectivos de preparação utilizar-se.....ao de preferência técnicas que sejam baseadas em condições não desnaturantes. Numa realização preferida sao utilizadas a cromatografia em gel e a cromatografia de permuta iónica em combinação com a cromatografia de intercepçao hidrofõbica, onde a eluição é controlada corn espectroscopia de UV. As fracções obtidas podem ser analisadas para a determinação da presença do efeito inibidor no crescimento de esporos pré.....

germinados ou não pré-germinados de fungos que sao sus.....

ceptiveis âs proteínas do tipo da osrnotina, corno por exemplo os fungos do género Phytophthora, de preferência Phytophthora infestans.. Os esporos (entre 1 e 100 esporos por j.il, de preferência entre 5 a 20 esporos por j.rl) podem ser ensaiados nurna camada de alimentação adequada, como por exemplo ágar de dextrose de batata (PTA) e produtos semelhantes.. 0 desenvolvimento e o crescimento dos fungos podem ser facilmente determinados após revelação do rnicélio ern tempos particulares após a adição da fracção por comparação de incubações de esporos de fungos com uma composição de pode ser determinada a presença de factor As fracções que apresentam urna actividade antifungo termo-lábil podem ser analizadas na presença de proteínas do tipo da osrnotina na base do peso molecular utilizando electroforase e/ou técnicas de imunorrevelaçao controla, antifunges.

li t i 1 i z a n d o a n t i c o r ρ o s d i r i g i d os contra, ρ o r e x e m ρ 1 ο, o o rn o t i n a de tabaco ou proteínas S relacionada com a patogéneses (PRS) .. As fracções contendo osmotina podem ser fraccionadas ainda mais utilizando por exemplo cromatografia de interacção hidrofóbica (HIC) ou Cromatografia Liquida de ALto Rendimento (HPLC); com estas técnicas pode ser obtida uma pureza quase total.. De acordo com o processo descrito aqui é possivel isolar proteínas do tipo da osmotina de qualquer material de plantas.

Para os objectivos de inibição de crescimento de fungos podem ser aplicadas por exemplo osrnotinas para a conservação de produtos alimentares, como cosméticos, ou corno produtos farmacêuticos ou medicamentos, em agua para pulverização de plantas domésticas e culturas agriculas, e ser usado para conservação de frutos, vegetais e outras culturas que podern ser armazenadas durante um período limitado de tempo e em todos os casos em que se pretende inibir o crescimento de fungos, em circunstâncias que conduzem a osrnotinas.. Assim, pode ser adicionada osmotina tal e qual ou em combinação com um veiculo adequado, ou se d e s e j ad o, e rn o o rn b i n aça o c o rn o u t r as su b s t â n c i as a n t i f u n g o s, sob a forma de pós, granulados, aerossois, soluções, geis ou outros solventes ou materiais veiculas..

Para a aplicação em composições, por exemplo para alargar a gama de aplicação, pode ser também utilizada uma combinação de osmotina e de outros agentes inibidores de fungos, oorno por exemplo os antibióticos de fungos, clássicos, SAFP e fungicidas quirnieos, corno· por e x e rn ρ 1 ο ρ o 1 i o x i nas, n i c o m i c i nas, o a r b o x i rn i d a s, c a v b o h i d r a t o s aromáticos, carboxinas, rnorfolinas, inibidores da sintese do es ter o 1, o o rn ρ o s t o s org an o f o sf or osos, e n z i mas o o rn o por e x e rn p 1. o giucanases, chitinases, lisozirnas e produtos semelhantes,. Quer tal e qual, quer em combinação com outros constituintes activos, a osmotina deve ser aplicada em concentrações que

sejam eficazes para o objectivo final, em geral entre 1 jjg/ml e 100 mg/ml, de preferência entre 5 pg/ml e 5 mg/ml, com lirnites de pH de 3,0 e 9,0.. Em geral é desejável utilizar composições tamponadas, por exemplo tampões de fosfato entre 1 rnM e 1 M, de preferência entre 10 rnM e 100 mM, ern particular entre 15 e 50 rnM, e no caso cie concentrações de baixo teor de tampão ê desejável adicionar sal para aumentar a força iónica e, de preferência, NaCl em concentrações entre 1 rnM e 1 M, de preferência entre 10 rnM e 100 rnM,.

Numa realização especial da invenção são obtidas plantas transgênicas gue têrn uma susceptibilidade reduzida aos fungos, ern virtude da expressão constitutiva numa ou mais partes da planta, de urn ou mais genes que codificam para uma proteína esrnetica (ou do tipo da osmotina) , ou ern virtude de urna expressão constitutiva simultânea de urna combinação de urn gene de osmotina e, por exemplo, urn gene cie glucanase e/ou de cbitinase ou produtos semelhantes, nurna ou rnais partes da planta.. Para além dos genes que ocorrem no tabaco, descritos por Singh e col., (1987, Plant Physiol., supra) e torna te, i.. e.. o gene que codifica para NP24, descrito por King e col.., (1988, Plant Mol.. Biol.., supra) Também os genes da osmotina que ocorrem entre outras plantas em painço, soja, batata, tabaco, cenoura, algodão e produtos semelhantes podem ser utilizados para estes ob jectivos.. Utilizando técnicas conhecidas, é do conhecimento geral o modo de se obter ern genes ou o ADN que codifiquem para as proteínas do tipo da osmotina de espécies de plantas diferentes, corn o auxilia de uma sonda de polinucleétidos corno por exemplo urn fragmento de gene de urn gene da osmotina do tabaco, ou uma sonda de oligonucleótido sintética corn base numa sequência conhecida de urn gene da osmotina.. Utilizando técnicas vulgarmente conhecidas o especialista é capaz de amplificar o fragmento obtido do gene da osmotina, determinar a sequência de nuoleõtidos do fragmento de ADN, e clonar o fragmento do gene ou cADN na %

orientação adequada num cevtor contendo sequências que sao necessárias para a expressão desejada do fragmento do gene numa ou mais partes da planta.. Se essa construção de espressao for adequadamente administrada a um material de pplanta esta resultará num material de plantas transformado, que por sua vez pode ser utilizado para regenerar plantas transformadas totais,, que expressam o gene ou fragmento do gene que codifica (parte) da proteina de osmotina em algumas ou todas as partes das plantas

Um processo prefrido de isolar um fragmento de ADM compreende (parte) da região de codificação de urn gene de osmotina que utiliza a tecnologia da reacção em cadeia de polimerase (PCR), que é descrita por Maniatis e col „ , (1999, em: Molecular.....£lonin.g..;........A_JLaboí^ory......Manual, 2a..

edição, Col d Spring Harbor Laboratory Press).. Partindo das sequências de nucleótidos publicadas de um gene da osmotina, ou da sequência de nucleótidos deduzida de uma sequência de aminoácidos conhecida de uma osrnotina purificada, pode ser obtido qualquer fragmento de gene desejado por exemplo por p ro d u çao de o1igo n u cleõtido s sin téticos qu e são complementares das regiões terminais 5’ e 3’ do fragmento pretendido.. Permitindo que estes oligonucleótidos, oomo primários de polimerização, se hibridizern in________vitro com o ADIM ou biblioteca de ADM de plantas (de preferência obtidas de células de plantas que foram expostas a pressão osmótica ou de patogénios) e conduzindo alguns ciclos de polimerização, pode ser selectivamente amplificado o fragmento pretendido.. Os primários podem ser sintetizados para conterem sítios internos de restrição que correspondem aos terminais de veiculas de clonação linearizados, de modo a proporcionarem a fãcil ligação dos fragmentas amplificados no veiculo.. 0 fragmento isolado pode ser posteriorrnente clonado e ainda manipulado.. Assim, mesmo as combinações dos fragmentos de genes derivadas de genes diferentes de proteínas do tipo da osmotina, incluindo os fragmentos totalmente sintéticos

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desses genes, podem ser ligadas de forma a constituírem um quadro de leitura aberto simples que codificam uma proteína q u i rn é r i o a d o t ::L p o da o s rn o t i na..

Adicionalrnente, para expressar a nova proteína introduzida na planta tern gue ser inclui do urn promotor de transcrição na construção da expressão; pode ser utilizado, entre outros, o promotor Cal^vIV 3SS, designados por p r o rn o t o r e s d e Τ -A D N, o u p r o rn o t o r e s d e ρ 1 a n t a s i η c 1 u i n d o opeionalmente urn ou rnais fragmentos potenciadores. Ern geral utilizar.....se-ã urn promotor forternente oontitutivo que ê funcional em todas ou nurn grande número de partes de plantas, ernbora promotores específicos de tecidos ou regulados por desenvolvimento ou controlados de outra forma ou indutores também possarn ser utilizados.. Podem ser vantajosos neste caso p r o rn o t o res e s p e c i f i c o s d e te c i do, r eg u 1 a d o s, se o f u n g o patogénico por exemplo afectar apenas partes particulares da planta ou produtos semelhantes.. Para alérn de urn promotor que é funcional ern plantas e da sequência de codificação, podern ser incluídos ainda outras elementos reguladores na construção da expressão, corno por exernplo potenciadores da transcrição, potenciadores da transiacção, tal oomo a sequência líder do genoma de ARN de TMV (Gallie, D.R. e col„,

(.1988) , N u c I e i c à c i d s R e s e a r o h 16, 883.....893) , sequências líder estabilizantes de rnARIM, tal corno o vírus do mosaico de alfalfa (ALMV) líder de ARN4, in troes, urn terminador de transcrição e urn sinal de poliadenillaçao, tal corno, por exernplo, o terminador da sintetase de nopalina (Tnos) , e produtos semelhantes.. Ê sabido corno se podern utilizar estes elementos na construção da expressão, de rnodo a influenciar o nível da expressão de gene nurna forma pretendida. Para se obter ern outras optimizaçoes da expressão de gene pode ser desejável utilizar urn clone genôrnico ern vez de urn clone de cADN. Alternativarnente, se for considerado desejável, pode ser inserido urn intrao sintético na sequência de cADN.

⁴·

Para se obter o efeito inibidor de fungo é ern principio suficiente conseguir-se uma elevada expressão constitutiva ou especificamente regulada de um gene de proteína do tipo da osmotina em todas ou algumas partes da planta transgénica,, A proteína do tipo da osrnotina de ocorrência natural deve acurnular-se nos vacúolos de uma célula de planta.. Verificou.....se que quando o gene da proteina do tipo da osrnotina de ocorrência natural é expressa, pode ser observado um efeito anti-fungo®,,

Muma realização preferida da invenção é deslocada urna proteina intracelular (do tipo da osrnotina) para o espaço extracelular como consequência da modificação genética do gene que a codifica.. LJrna forma possível de conseguir isto é a rernoçao de aproxirnadamente 20 aminoácidos no terminal C do produto de translação primário de ocorrência n a tu r a 1. c o d i f i c a d o p e 1 o rn A R M d a o s rn o t i n a, q u e p arece ser responsável pela localização intracelular „ A rernoçao da parte do terminal C da proteina pode ser conseguida por exemplo pela introdução de um codão de paragem translaccional no gene para evitar que os codoes que estão localizados rnais perto do terminal 3'^J sejam deslocados para aminoácidos.. Corno alternativa a sequência de aminoácidos do terminal c da proteina do tipo da osrnotina pode ser alterada ern relação à de ocorrência natural para inibir o seu funcionamento adequado.. 0 processo pelo qual a proteina é deslocada para fora da célula é ele próprio não crítico para a invenção, desde que a alteração da proteina nao anule completamente o seu efeito antifungo..

Foi verificado por exernplo que ern discos de folhas de tabaco, quando se desloca a proteina do tipo da osrnotina isso resulta nurna potenciação considerável do efeito anti-fungo no fungo P.. nicotianae var nicotianae,.

Pode ser desejável em alguns casos obter pintas que expressam um gene que codifica uma proteína do tipo osmotina intracelular de ocorrência natural e um gene que codifica a proteína do tipo da osmotina intracelular deslocada extracelularmente, para aumentar ainda mais o efeito antifungo..

Os níveis de expressão das novas construções introduzidas podem ser determinados por analise das proteínas celulares totais ou proteínas no fluido extracelularutilizando a técnica de revelação de Western, combinada com a reacçâo e revelação de anticorpos,. Ê tarnbérn conhecida a forma corno uma quantidade (relativa)de rnARN pode ser determinada utilizando a técnica de revelação de Northern, hibridizando o conjunto oom uma sonda dirigida para o mARM da osmotina.. As plantas transf armadas com um nível de expressão aparentemente bom de urna construção de gene codificando quer a proteína do tipo da osmotina de ocorrência natural quer a deslocada pode ser posteriorrnente ensaiada para a determinação da resistência aos fungos por ±noeulaç:ão da planta corn um fungo patogénico, em que a taxa e severidade do desenvolvimento de sintomas pode ser comparada corn a das plantas não transformadas. Numa realização ligeiramente modificada da invenção a resistência aos fungos é ensaiada em discos de folhas de plantas trangénioas ern vez de serern plantas inteiras.. Urna vantagem deste processo é a facilidade relativa para avaliar o desenvolvimento de sintomas numa forma mais ou menos quantitativa.

Outras realizações da invenção cornpreen dern rnieroorganisrnos transgénicos transfor rnados corn urn fragmento de gene que codifica (parte) de urna proteína do tipo da osmotina, que produz a proteína do tipo da osmotina, opcionalmente numa forma segregada.. Esses microorganismos podem ser utilizados para a produção de proteínas do tipo da osmotina para utilização em composições antifungos, ou

-- 18 1»

utilizadas para a protecção de plantas no caso de micro.....

organismos colonizadores de plantas simbióticas.. A expressão de urn fragmento AP2.0 de cADN ern E.. o o li já foi obtida pelos inventores

A rnai or parte das realizações da invenção ern que as plantas são transformadas corn urna construção de genes de proteínas de tipo da osrnotina que é expressa na planta exige a utilização de várias técnicas mierobiolõgicas, d e b i o 1 o g i a rn o 1 e c u 1 ar, A D N r e c o rn b i nate, t r a n s f o r rn aça o d e plantas e cultura de tecidos de plantas, que sao conhecidas dos especialistas.. As técnicas convencionais para o isolamento, manipulação e amplificação de ADN bern corno os vectores adequados para a replicação de ADN recombinante, e estirpes de bactérias adequadas, marcadores de selecção, rneios e produtos semelhantes são descritas ern Man latis e col. , molecular.........cloning :: A............Laboratory............Manual 2a.. edição (1883) Cold Spring Harbor Laboratory Press:; DMA Cloning: Volurnes I e II (D„ N„ Glover ed„ 1985):; e ern :: Frorn Genes To C1 ones ( E.......L... Wiηnacker ed.. 1987).

Gs vectores conhecidos que podern ser utilizados para a clonaçao ern bactérias sao por exemplo pUCIS (ver em geral Frorn Genes to Clanes, supra) e plasrnidios de pEMBL (Dente I....., Nucleic Acids Research 1.1, 1645--1655) .. Os ultirnos plasrnidios têrn a vantagem de conter urna origern de replicação para baoteriofagos de ADN de banda única particulares, e assim esses plasrnidios que sao aqui propagados podern ser utilizados directamente para a sequência de ADN de acordo corn o processo de Sanger e col., (1980) J.. Mol.. Biol.. 14, 161.....178..

Para a introduçãi de genes modificados no genorna das plantas existern várias técnicas, corno por exemplo a transformação corn Agrobacteriurn , bombardeamento de tecidos de plantas corn partículas revestidas, com ADN, absorção *

directa de ADN ou rnicroin jecção de ADN em protoplastos.. Para uma revisão geral das técnicas de transformaçao de plantas ver por exemplo Lichtenstein e col., ern:: Genetic

Engineering Vol.. 6, 104.....182; Rigby, editor, 1987).. Ern duas realizações preferidas da invenção faz.....se uso de vectores binários.. 0' principio do sistema de vectores binários é descrito por Hoekerna e col.., (1983), Nature 303, 179-180; Bevan e col.., 1984, Nucleic Acids Research 12, 8711-8721). 0 processo real de introdução nao é critico em relaçao à invenção..

Após introdução do material genético pode ser regenerada uma nova planta inteira a partir da célula modificada (pr òtoplasto) ou tecido modificado.. Alternativamente, podem ser transformadas células de pólen e utilizadas para polinização de urna planta aceitante.. A escolha das plantas modificadas actual mente trasnf orrnadas pode por-exemplo ser efectuada se no mesmo fragmento de ADN eni que o gene se pretende introduzir também contiver um gene marcador.. Os genes marcadores podem por exemplo codificar herbicidas ou resistência aos antibióticos, ou enzimas que sao susceptíveis de catalizarern uma reacção de revelação, ou codificarem um sistema facilmente perceptivel (por exemplo directamente visível) ,. As plantas que expressam o gene marcador também devem possuir introduzido o gene de proteína semelhante à osrnotina.. As plantas escolhidas podem ser analisadas para a expressão do gene de protéina semelhante à osrnotina utilizando as técnicas de Western ou Northern conhecidas dos investigadores especialistas.. As plantas resistentes a fungos podem ser escolhidas a partir de bons expressores, por exposição das plantas a qualquer fungo que provoque um efeito patogénico ou plantas nao transf orrnadas da mesma v a r i e d a d e ..

Utilizando acima mencionadas não existern as técnicas de transformação em principio limitações para a

Λ * I

prática da invenção em relação â planta hospedeiro escolhido.. Quer as plantas dicotiledóneas (como par exemplo tomate, feijão, soja, rábano, algodão e semelhantes) quer as plantas

rn ο η o c o t i 1 e d õ n e a s (rn i 1 h o, t r i g o ,	ceveda,	espargo, arroz e
semelhantes) podern ser	t r a n sf o r rn a d a s c o rn	s u c e ss o u 111. iz a n d o
A D M recombinante, e	ser ern	regeneradas para sementes
totalrnente madura® que	produzem	plantas	que expressam o ADN

recombinante..

As realizações preferidas são o tabaco, batata e tomate transformadas com um gene da osmotina do tabaco.. Contudo, é obvio que a invenção pode ser aplicada a qualquer planta de cultura que seja susceptível a fungos em relação aos quais a osmotina revela urn efeito de inibidor..

A s f i g u r a s i 1 u s t r a rn rn e 1 h o r a i n v e n ç 3 o..

A figura 1 mostra a semelhança que existe entre a sequência de aminoácidos de AP20 corn a sequência de osmotina II de tabaco (corno publicado por Singh e col.., 1.989, supra) ., osmotina I de tabaco (Singh e col.., 1987, supra) e osmotina de tornate (King e col.., 1988, supra) ..

A figura 2 vector de expressão pM (..10180..

rn ostra esquematicamente o pMOG404

A figura

L..I3 = limite esquerdo, mostra o vector binário PB = lirnite direito do T--ADM..

Os exemplos dados a seguir sao apenas apresentados com o objectivo de permitir ilustrar a invenção sern limitar de qualquer forma o âmbito da invenção.

Λ Ί'

Λ. ,

EXEMPLO......1

Isolamento......de AP20 de plantas de......tabaco.......induzidas.....corn......TMV

Foram inoculadas folhas de tabaco (Ni-cot lana tabacurn cv. Sarnsun NN) com plantes de 7 a 8 sernanas de idade corn vírus do mosaico te tabaco (TMV), utilizando uma técnica convencinal conhecida dos especialistas.. Passados 7 dias de inoculação fora colhidas 400 g de falhas e foram homogeneizadas a 4C em 600 ml de NaOAc 0,5 M, 2--15rnM rnercapto-etanol, e 4 gramas de carvão activo, utilizando urn misturador de Waring.. 0 homogeneizado foi filtrado ern panos de queijo e posteriorrnente, o filtrado foi oentrifugado a 5000 g„ 0 sobrenadante foi oentrifugado durante 50 minutos a 22000 g e dessalinizado numa coluna Sephadex G25 (Pharmacia), corn o comprimento de 60 crn, diâmetro de 11,5 ern, e equilibrada em NaOAc 20 rnM ph 5,2., A fracção contendo as proteínas foi guardada durante a noite a 4°C e posteriorrnente foi centrifugada durante 45 minutos a 22000 g.. 0 sobrenadante foi feito passar através de uma coluna de S-sepharose Caudal rápido (Pharmacia) corn o comprimento de 5 cm, diâmetro de 5 crn, que foi equilibrada corn NaOAc 2.0 rnM ph 5,2, a um caudal de aproximadamente 15 rnl por minuto.. Foram recolhidas as proteínas nao ligadas.. As proteínas ligadas foram eluídas corn um gradiente crescente linear de NaCl (0 a 500 rnM) no tampão acirna mencionado, e corn um caudal de 3 ml por rninuto; foram recolhidas fracções de 4,2 rnl.. Cada segunda fracção foi analisada por electroforese utilizando um gel poliacrilamida a 12,5% na presença de dodecil sulfato de sódio (DOS), utilizando marcadores de peso molecular (20 a 66 KD) como referência. Foi ensaiada para o efeito antifungos uma segunda parte das rnesrnas fracções..

Para o ensaia da actividade antifungo foi desenvolvido um ensaia de disco de miorotitulação. Foram utilizados discos de miorotitulação corn 24 furos e 96 furos.. Posteriorrnente, foram intriduzidos por meio de uma pipeta em.

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cada furo 250 j.il (discos de 24 furos) ou 50 jil (discos de 96 furos) de agar de dextrose de batata (PDA).. foram suspensos em água esporangios de P.. inf estans e adicionados aos furos:: 500--700 esporangios (ern 50 j.il) aos pratos de 24 furos, e 100 a 200 esporangios (em 25 jil) aos pratos de 96 furos.. As partes das fracções a ensaiar foram dialisadas contra K2HPO4/KH2PO4 de 15 mM pll 6,0, NaCl 20 mM, esterilizadas ern filtro (filtro de 0,22 jirn) e adicionadas â suspensão de esporangios (respectivamente 100 e 50 j.il para os pratos de 24 furos e de 96 furos) .. Pareceu necessária urna concentração baixa de fosfato dado que P.. inf estans parecia ser sensível a altas concentrações; fosfato de potássio 15 mM nao pareceu ter efeito no crescimento de P.. inf estans.. A adição de NaCl é desejável para a estabilização da actividade antifungos a baixas concentrações de fosfato.. Corno controlo foram sujeitas a ebulição partes das rnesrnas fracções após di alise durante 10 minutos., Posteriormente, os pratos forarn incubados no escuro a 20^OC durante 4 a 5 dias.. Os primeiros sinais de actividade inibidora de fungo podiam já ser observados no microscópio após cerca de 20 horas,. 0 efeito inibidor do fungo é observado corno lise dos esporangios gerrninantes e dos tubos germinais de crescimento ou pontas de bifa.. Numa fase posterior tarnbérn pode ser observada a inibição do crescimento de rnicélios..

Para a purificação adicional do componente activo as fracções antifungo activa foram combinadas, dialisadas contra ( NH 4) ₂S0 4 1 Μ, K2HPO4/KH2PO4. 50 mM pH 7,0 e posteriormente filtradas num filtro de 0,22 j.irn.. Posteriormente o filtrado foi carregado numa coluna de 1. n t e r a c ç ã o h i d r o f ó b i ca ((ΗIC) (P h e n y 1 s u p e r o s o H R 5/5 d a Pharmacia) que tinha sido previamente equilibrada com tampão de diálise.. Todas as fases anteriores foram conduzidas a 4°C..

As proteínas ligadas foram eluidas com urn g r a d 1. e n t e d e c r e s c e n t e d e (N1-14) ₂S 0 4 (1M a 0 M) e rn l< ₂H P 0 4/

/KHçjPO^i. 50 mM pl-l 7,0, com um caudal de 0,5 ml per minuta a temperatura ambiente,. 0 programa de eluição foi efectuado da forma seguinte..

em 5 minutos de 100 a 30% da con.....

centraç3o in icia 1 de (Μ114) 2 S0_v4

-· durante 7,5 minutos de eluição com 30% d a con cen traçao in icia1 de (NI-I4 ) 2 S O4 em 10 minutos de 30% a 0% da concentração inicial de (NH4)

A proteína antifunges elui da coluna cerca de 5,5 minutas (aproximadamente 2,7 ml) a 0% da concentração inicial cie. (MH4) 2SO4; a proteína antifungo na fracção de pico é 95% pura.. Todas estas fases foram conduzidas à temperatura ambiente.. Para se obter a proteína antifungo com uma pureza de 99%, estas fracções foram dialisadas centra (NI I4 )2^4 1 M > K2HPO4/KH2PO4 50 mM, pl-l 7 de tampão a após filtração sobre um filtro de 0,22 j.im, eles foram separados uma vez mais utilizando a coluna HIC com o s e g u in t e p r o g r a rn a d e e 1 u i ç ão:

..... em 7,5 minutos de 100% a 15%

- durante 12,5 minutos a 15%

..... em 10 minutos de 15% a 0%

A . proteína antifungo sofre aluição da coluna passados 13 minutos (aproximadamente 2,7 rnl); este eluato contém proteína 99% pura. A partir de 400 g de materiais de folhas podem ser isolados 400 j.ig de proteínas antifungo (95% pura) ou 200jig de proteínas antifungos 99% puras..

Á proteína antifungo com um avlor de peso molecular estimado de 24 KD foi designada por AP20..

EXEMPLO.....2

Elucidação.......S!.S.......sequência......de......aminoácidos......cie......AP20

A sequência de aminoácidos da parte do terminal N de AP20 foi determinada utilizando técnicas conhecidas dos especialistas (ver por exemplo Matsudai.ro, P.. © col.., (1987), J.. Biol. Chern. 262, 10035-10088) .. É apresentada na Figura 1 uma comparaçao das sequências parciais de aminoácidos de AP20 e osrnotinas de tabaco e tomate,. A Figura mostra a identidade completa da sequência de 40 aminoácidos N-terrninal de AP20 corn a do terminal N da o sino tina II de tabaco e uma homologia muito grande corn a osrnotina I de tabaco e a proteína do tipo da osrnotina NP 24 de torna te.

Foi efectuado uma determinação precisa dopesc molecular de AP20 com auxilio da electroforese em gel de ID.....poliacrilamida (1D-PAGE) utilizando, referências de pesos moleculares de 66 a 20 kD.. De acordo corn este processo o peso molecular foi determinado oomo 24 l<D, o que está em bom acordo com a mobilidade electroforética de outras osrnotinas..

ponto isoeléctrico foi determinado corn auxilio de cromatografia de focagern isol elect rica entre pi 4,3 e 9,5,. A mobilidade de AP20 no sistema utilizado de gel/tarnpao não permitia uma determinação exacta do pi, dado que a AP20 parecia possuir um valor de pi mais elevado do que a maior parte dos marcadores básicos (pH=9,5); foi concluído que o pi de AP20 é superior a 9,5,. Apartir de unia comparação dos parâmetros físicos de AP20 corn os das osrnotinas ern tabaco e tomate (peso molecular idêntico) pi muito básico, e sequências idênticas de aminoácidos dos 40 resíduos mais próximos do terrnina N) , parece que a AP é urna osrnotina., A partir do estabelecimento do efeito antifungo da osrnotina isolada (AP20) isolada pelos presentes inventores, e do elevado nivel da conservação da sequência de aminoácidos

entre AP20 e as outras osmotinas, bem como entre a osmotina. Sao previstas mais proteínas semelhantes à osmotina no reino das plantas que possuem um efeito antigénico semelhante..

EXEMPLO3

Isolamento da osmotina......de......tomate e......análise do......efeito antifui2gcL..ern......P.._:;........infestans

Ométodo que é utilizado para a inoculação de plantas de tomate é descrito em Heller & Glesser (J. Pathology, 1986, .116, 323--328),.

Foram inoculadas plantas de tomate com 2 meses de idade (Lycopersicon.......esoulenturn cv.. Moneymaker) com zoosporos de P„infestans.. Os zoosporos foram formados numa suspensão de 1x10^ esporângios por cada mililitro de meio de incubação,. Foi colocada em folhas por meio de uma pipeta uma quantidade de 6 go ti cu las de 10 j.il desta suspensão.. As plantas foram incubadas a 15°C, a uma humidade ambiente de 95 a 100%, com baixa intensidade da luz até que o desenvolvimento de lesões se tornou visível (após cerca de 5 dias).. Posteriorrnente, foi aumentada a temperatura para 22°0, a humidade do ar foi reduzida para 75% e a intensidade da luz foi aumentada para o valor normal.. Passados mais três dias, foram recolhidas as folhas oom lesões necróticas e guardaram.....

-se a -80°C..

procedimento de isolamento da osmotina das folhas de tomate (incluindo o ensaio em P„ infestans) é semelhante ao isolamento de AP20 de tabaco, corno é descrito no Exemplo 1.

A osmotina de tabaco tinha clararnente um efeito inibidor no crescimento de P.. infestans. Nas experiências de controlo oom osmotina que foi aquecida a 100°C ou com tampão, nao podia ser observada a lise..

EXEMPLO 4

Construção......de pl^vIOG180

Para se obter uma elevada expressão constitutiva de genes de osmotina em plantas transgénicas foi feita uma construção de expressão contendo um forte promotor.. Para este fim, foi clonado o conjunto de pROKl (Baulcornbe e col.., (1988), Nature - 321, 448.....449) num fragmento de EcoRI.....

-HindiII ern pUC18.. Este bloco contém o promotor CaNV 35S num fragmento de restrição EcoRI.....BarnHI e a nopalina sintase (nos) como terminador de transcrição num fragmenta BamHl'·HindiII.. 0 fragmenta promotor consiste na sequência de .....800 a +1 do genoma de CaMV em que a posição +1 é o ponto de iniciação de transcrição (Guilley e col.., (1982), Cell .30, 763--773). Sabe.....

.....se da literatura que a -duplicação da sequência entre --343 e

-90 aumenta a actívidade do promotor CaNV 35S (Kay e col.., (1987), Sience 236., 1299.....1302).. Para se obter urn promotor contendo urn fragmento de aumento da expressão” duplo (poten.....

ciador) foram efectuadas as seguintes fases de clonação. Ern primeiro lugar, a sequência a montante do ponto de re.....

conhecimento Ncol na posição .....512 foi removida e o próprio ponto de reconhecimento foi alterado para o ponto de reconhecimento de EcoRI. Para este fim, o bloco de expressão em plJC18 foi cortado com Ncol, e os terminais obtidos foram preenchidos com polímerase de Klenow e ligadores de EcoRI f o r a rn ligadas aos t e r rn i n a i s., plasmídeo obtido foi cortado com EcoRI, resultando na eliminação do fragmento de EcoRI, e os terminais foram preenchidos com polímerase de Klenow. Posteriorrnente o fragmento promotor AccI-EcoRV preenchido (entre .....338 e .....90) foi clonado no plasmídeo linear, tendo sido criado um nove ponto EcoRI na transição do EcoRI preenchido e o ponto Ac cl preenchido.. 0 novo plasmídeo obtido pMOG'181 contém o promotor CaMV 358, agora corn o potenoiador duplo, num bloco de expressão que ainda está num fragmento de EcoRI-H::i..nd111.. Posteriorrnente foi obtido de pM0G181 o

derivado pMOG180. Para isto, o vector foi cortada com BarnHI, e os terminais assim obtidos foram introduzidos com polimerase de Klenow e foi clonado um fragmento de ADN sintético de dupla hélice na sequência de protocolo indicada como SEQ. ID. 1, contendo a sequência de nucleótidos do vírus do mosaico de luzerna ARN4 líder no plasmidio linear. Após selecção para determinação da presença de um ponto de reconhecimento de BarnHI reoentemente foi eliminado o pentanucleõtido 5’-GGATC3’ em torno de um ponto de iniciação de transcrição por meio de mutagénese in vibro. 0 plasmidio assim obtido é o pMOG180..

EXEMPLO 5

Clonação de......cADN......correspondente â osmotina.....e preparação.....do vector bináriopMOG404

Foi preparada uma biblioteca oADN de tabaco utilizando um dispositivo de sintese ZAP.....cADN ($tratagene Cat tt200400,200401) A partir de fo 1 has de tabaco Sarnsun NN infectadas com TMV, foi isolado o ARN poliadenilado e foi utilizado para a sintese de cADN, utilizando técnicas convencionais conhecidas dos investigadores especialistas.. Após tratamento com Ec:oRI e Xhol, os fragmentos de cADN foram ligados aos terminais compatíveis dos braços lambda de ZAP,

A biblioteca de cADN de tabaco lambda ZAP acima descrita foi escrotinada com uma sonda de ADN para a determinação das sequências que são homólogas com o gene NP24 de tomate (King e col. , (1988), Plant.. Mol.. Biol.. .10, 401--402)., Com a ajuda da técnica de hibridizaçao de placas de Benton e Davis (1977, Scien ce 199, 180-182) foram identificados aproximadamente 7 fagos reeornbin antes.. As inserções no ADN destes fagos foram subclonadas num plasmidio p Bluesoript (SK ), utilizando o processo de ex cisão in vivo.. A sequência de nucleótidos dos diferentes clones oADN foi determinada utilizando o método de sequências M13. Estas análises em combinação com as comparações da sequência parcial de aminoácidos da proteína AP2.0 revelaram que apenas 3 clones continham uma sequência quase completa de cADM.. Um dos clones de oADM contêrn a sequência completa de codificação para a osmotina, com excepção do dinuccleótido Adenina-Tirnidina do codão de iniciação de translação (Singh e col.., 1989, supra) .. Este clone é ainda designado como clone de osmotina cADM. A sequência de aminoácidos M-terminai da proteina caracterizada AP20 coincide exactarnente corn a sequência correspondente da osmotina deduzida do clone do cADM de osmotina..

3; (ver Protocolo de A sequência de oADM

Corn a utilização de PCR (reacçao em cadeia de polirnerase) é introduzido um ponto de reconhecimento BamHI e urn dinucleótido de Adenina.....Tirnidina na parte da frente da cADM de osmotina, criando assim urn codão de iniciação de translação; para alem do gene foi introduzzido um ponto de reconhecimento BamHI.. Para estas reacções de PCR foraarn utilizados corno primárias os oligonueleeôtidos SEQ.. ID.. 2 e SEQ.. ID..

Sequências) SEQ.. ID.. 2 e SEQ,. ID.. 3..

modificada é verificada para determinar rnutaçoes indesejáveis que podem acorrer como consequência do processo de PCR.. A sequência é apresentada no Protocolo de Sequências, corno SEQ., ID.. 4.. 0 gene da osmotina foi clonado corno fragmento BarnHI no vector linearizado com 13 a mH I p MO Cl. 80 (ver Exemplo VIII para a s

construção ; Figura 2) .. A construção de expressão obtida contêrn urn fragmento de SstI—-Hindi II do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) ern frente do gene da osmotina que por sua vez é seguido pelo terrninador de transcrição da nopalina sintase (nos). A construção de expressão foi clonada no vector binário pMDG23 (depositado no Centraal Bureau voor S c h i rn rn e 1 c u 11 u r e s te B a a r η , Η o 1 a n d a, N o.. CBS 102.90), após linearização corn as enzimas de restrição SstI e HindiII.. 0 plasrnidio obtido pMOG404 (Figura 3) contêrn agora quer o gene da osmotina, quer o gene de MPTII localizado entre as sequências limites esquerda e direita de T-ADM. Corn o auxilio do plasrnidio pRI<2013, este vector binário foi mobilizado de

DH5o! para o Agrobac ter:i.urn turnef exciens estirpe LBA4404 0 t r a n s c o n j u g a n t e L13 A4404 (p l^vl 0 G404) f o i i s o 1 a cl o d e s t e cruzamento no meio de selacção contendo 20 rng/1 de rinfampinicina e 100 mg/1 de canamicina.

EXEMPLO......6

Construção de......p M 0 G405 co d i f i c ando......uma......osmotina extracelular

Foi referido que a osmotina de tipo natural ocorria intracelularmente, preduminaternente em vacuolos de células de plantas (Singh e col.., 1987, supra) .. Para proporcionar a secreção da osmotina para o espaço extracelular, é introduzido um codao de paragem translacoional no cADM da osmotina de ocorrência natural presente em pMOG404, entre os codoes 20 e 21 numerados a partir da extremidade do terminal C da proteína codificada pelo cADM., Utilizando a técnica PCR conhecida dos especialistas ê criado o codao de paragem por inserção de um resíduo de tirnidina (ϊ) entre os nucleótidos 694 e 695 em relação â sequência representada oomo SEQ.. ID. 4 no protocolo de sequências.. A sequência de osmotina assim modificada é verificada para as rnutaçoes indesejáveis que podem ocorrer como consequência dos processos de PGR.. 0 cADM que sofreu a mutação codificada uma osmottina em que faltam 20 aminoácidos no 'terminal. C do produto primário de transi acção do rnARM de osmotina de ocorrência natural.. 0 vector binário assim obtido foi designada por pMOG405 e transconjugante de Agrobacter 1 urn correspondente por LBA 4404 (pl^vIOG405). Como se mostra no EXEMPLO 8 a osmotina codificada por pMOG 405 é de facto d e s 1 o c a d a extra c e 1 u 1 a r m e n t e..

EXEMPLO 7

Preparação......de.....plantas......transgéniças

A transfarmação de batata ( S o 1 a ri u rn t u b e r o su rn cv.. Bintje) com Agrobaoterium estirpes LBA4404 (pMOG404) e LBA4404 (pMOG405) é efectuada de acordo com o procedimento descrito por HoeKema e col.., (1989), Bio/Technology 7, 273--278..

Para a transfarmação cie tabaco foi utilizado o processo de imersão de discas de folhas (Horsch e col., (1985), Science 227, 1229 1231).. Os discos de folhas foram co-cultivados com Agrobacterium estirpes I.....BA4404 (pMOG404) ou I.J3A4404 (pl^vIOG405) e posteriormente crescidos num meio de selecção contende 100 mg/ml de canarnicina, utilizando processos convencionais. Os pés transgénicos foram regenerados para se obterem plantas inteiras e foram analisadas para a expressão de gene de osmotina.. Para esta análise foi utilizada a técnica de revelação designada por Western, utilizando anticorpos criados contra a proteína relacionada com a patogénese PR.....S, e a técnica de revelação de Northern utilizando um fragmento de cADN de osmotina como sonda.. A análise de revelação de Western nao revelou diferenças no tamanho entre a osmotina codificada por pMOG404 e a osmotina codificada por pMOG405, embora as regiões de codificação da osmotina nas duas construções diferissem de vinte códãos de comprimento,. Este resultado sugere que na planta a osmotina de tipo natural é processada no terminal C.

EXEMPLO 8

Análise de......plantas......de......tabaco......transgênicas......com.......pMOG404......e pMOG405.....paradeslocação do produto transgénico

Para mostrar a deslocação extracelular da osmotina em plantas de tabaco transgênicas com pMOG405, foi efectuada a seguinte experiência.. Foram utilizadas folhas de plantas F1 de linhas de plantas transgênicas com pMOG404 e de plantas transgênicas com pMOG405 expressando o gene de osrno.....

tina recentemente introduzido, e folhas de plantas não trans.....

genicas para extracçao das proteínas totais e de proteínas extracelulares.. para a extracçao de proteínas extracelulares foi recolhido o fluido extracelular de acordo com o procedi.....

mento descrito por De Wit e Spikman (1982, Physiol.. Plant

Pathol. 20, 1.....11).. Após o isolamento do fluido extracelular, as proteínas foram extraídas bem como a parte restante do

material das folhas. Para a análise das proteínas nos extractos totais (Total), no fluído extracelular (EF) e nos extractos de folhas das quais foi removido o fluido e xt ra celu1ar (.....EF), foi uti1izada a técn ioa d e reve1açao designada por Western, utilizando anticorpos específicos AP20, ou anticorpos criados contra a proteina relacionada com a patogénese PR-TL. Os resultados apresentados na Tabela 1 indicam que com as plantas transgénicas com pl^vIOG405 a osrnotina é de facto adequadamente deslocada para o espaço extracelular..

TABELA......1

Deslocação da osrnotina para o espaço extracelular ern plantas de tabaco transgénicas corn pMOG405..

Amostra__.de......proteina

Planta	Total	EF -EF
N ã o t r a n s g é n i o a	....	...
PMOG404		-I-I-I-I-
PMOG405		-1..-1--1- -|-
- : sern AP20; + até	-1-1--1--1- :: quantidade	crescente de osrnotin,

EXEMPLO 9

Análise para......a......determinação da resistência a fungos ern plantas......Οθ tabaco fungo Phytophthora...........nicotianae variante nicotianae (Pnn) é urn Oorniceta.. Ê urn patogénio da raiz corn, entre outros, o tabaco corno hospedeiro.. A inf ecção da planta resulta na degradação das folhas e/ou raízes da base, do caule (escurecimento do pedúnculo).. Eventualrnente, a planta do tabaco morre como resultado da inf ecção..

um

Forarn obtidas disco® de folhas corn diâmetro de cerca de urn a dois centímetros a partir de plantas de tabaco tornadas transgénicas corn pMOG404, com vectores e nao transgénicas.. Os discos das folhas forarn feitas flutuar ao avesso ern prettos de Petri contendo água esterilizada.. Ern cada urn dos pratos forarn colocados por meio de uma pipeta 10 j.rl de urna suspensão de zoosporos (500 esp/rnl) .. Ern cada urna das expperiências foram utilizados 3 vezes 10 pratas, isto é um total de 20 pratos de controlo por cada experiência.. Após aproximadamente urn dia, erarn visíveis os primeiros sinais de uma infecçao inicial nos discos de controlo,. Passados três dias os discos das folhas de controlo estavam inteiramente afeotados (imersão ern água).. Os discos de folha derivados de plantas transgénicas corn pMOG404 nao revelavam sintomas passados três dias.. Os resultados obtidos na experiência podiarn ser reproduzidos por várias vezes..

Este exernplo sugere gue as plantas de taabaco exprimem constitutivarnente um gene da osmotina intracelular que revela suseeptibilidade ao fungo Phyto phtbora nicotianae (Pnn), que é urn patogénio natural da p1a n ta do ta ba co.

Para avaliar a resistência aos fungos de

P.......niootianae var niootianae de plantas inteiras de tabaco, podem ser efectuadas as seguintes experiências.. Sao inoculadas dez plantas transgénicas transformadas oom LBA4404 (pMOG404) escolhidos corno bons expressores do gene da osmotina) , dez plantas transgénicas transforrnadas corn o vector que nao contém o gene da osmotina (designadas corno plantas transgénicas corn vector) e dez plantas nao transf orrnadas que sao inoculadas corn uma suspensão contendo 2x10^ Pnn de zoosporos em água.. Esta suspensão é vazada por meio de urna pipeta na base do caule no solo,. Ern seguida são deitados 100 rnl de água na base do caule.. Posteriorrnente, é monitorado em função do tempo o desenvolvimento dos sintomas

de doença.. Passadas dois a três dias as plantas de controlo (plantas nao transgénicas corn vectores) revelam os primeiros sintomas de doença; isto é urn degradação.. De entre as plantas transgénicas corn pMOG404 algumas revelarn urn ligeiro atraso no desenvolvimento dos sintomas de doença., Contudo, é desejável uma protecção melhor.. Será avaliado na seguinte experiência o efeito da localização da osrnotina na planta.

EXEMPLO......10

Análise......para a.....determinação......da resistência.....aos......fungos......ern .Elâritas_...tran.sgéniças de tabaco..,..gu^^ urna osrnotina desloca^

Corn o auxilio de Agrobaoteriurn turnef aciens I.... 13 A4404 ( ρ M 0 G405) f o r a rn o b t idas ρ 1 a n t a s d e tabaco transgénicas que exprimem o gene rnodof içado da osrnotina, resultando eventuaimente nurna deslocação do apoplasto da osrnotina produzida.. Foraarn analisados os bons expressores do gene que codificam a osrnotina deslocada extracelularrnente, para análise corno seguido no EXEMPLO 8, para a determinação da resistência a Phytppl-ithora............nicotianae var.. nicotianae (Pnn)..

As experiências foram efectuadas ern 10 discos de folhas obtidos de urna linhagem de tabaco transgénica de pMOG404, duas linhas transgénicas com pMOG 405 e urna linhagem nao transgénica.. Passados três dias sao analizados os resultados da planta nao transgénica (linha #2), urn bom expressor de pMOG404 linha #1, e dois bons, expressores de pMOG405 (linhas #6 e #9) .. Os resultados sao apresentadas na Tabela 2..

TABELA 2

Ensaio de resistência aos fungos ern discos de folhas obtidos de linhas de tabaco transgénicas e nao transgénicas ensaiados ern

Phytophthoranicotianae

Linha de	plantas	Area infectada
# 2		8	discas	100%
		2	discos	60%
PMOG404	#1.	7	discos	100%
		3	discos	< 25%
PMOG405	#6	1	disco	100%
		2	discos	60%
		7	discos	< 25%
PMOG405	#9	3	discos	100%
		2.	discos	60%
		5	discos	< 25%
	As	percentagens	da© areas

afectuadas pela infecçao com P.. nicotianae após três dias..

0© resultados da Tabela 2 evidenciam claramente esse efeito superior antifungo em discos de folhas se a osrnotina for deslocada para o espaço extracelular, quando comparado© com a osrnotina localizada intracelularmente.. é previsível que a resistência aos fungos, tal como aqui evidenciado em discos de folhas, seja reflectida nas planatas inteiras do mesmo modo..

Para avaliar a resistência aos fungos em plantas as linhagens acima mencionadas podem ser ensaidas para a resistência oas fungos da forma descrita no EXEMPLO anterior.. È previsível que as plantas de tabaco transgénicas com pMGG405 revelem uma resistência consideravelmente superior quando comparadas com as linhagens obtidas após transf orrnaçáo com pMOG404..

A partir das observações do ©fito antifungo das proteínas do tipo da osrnotina, conclui.....se que pode ser obtido um efeito· antifungo se for expressa uma

proteína antífungo numa planta a urn eelevado nível eomo por exemplo o aqui ilustrado sob o controle de CaMV 35S, isto é urn promotor constitutivo..

Além disso, verifica-se que quando a sintese de uma proteína antífungo intracelular é acompanhada por deslocação extracelular, e obtido um aumento significativo do efeito antífungo.. Resultadas recentes obtidos de ensaios semelhantes com ohitinases e β-1,3.....glu.....canases conf irmam totalrnente esta decoberta. Mais importante, a descoberta que as proteínas do tipo da osmotina, que sao proteínas intracelulares, revelarn um efeito antífungo, completa urn quadro que se esta a tornar cada vez rnais óbvio, tal corno é a seguir explicado..

Ê sabido já bá algurn tempo que algumas ohitinases e glucanases revelarn urn efeito antífungo de pelo menos algumas ohitinases e glucanases em plantas (isto é plantas transformadas) tem sido difícil de estabelecer. A razão· para isto é agora evidente, porque descobertas muitorecentes sugerem corn firmeza que apenas os espêcirnens das referidas enzirnas que ocorrem intracelularmente têrn o referido efeito antífungo. Isto é agora confirmado por urn terceiro grupo de proteínas antifungos, isto é, proteínas do tipo da osmotina, que sao proteínas intracelulares, enquanto que a PR-S, que ê muito b orno Ioga âs proteínas do tipo da osmotina e produzidas após indução da resistência, mas que é urna proteína extracelular, nao tem qualquer efeito antífungo. Urna quarta categoria das designadas proteínas relacionadas corn a patogénese (sendo as outras três ohitinases, glucanases e proteínas do tipo da osmotina), as proteínas PR.....1, também c a e rn d en t r o d e s t e q u a d r o..

Contudo, expressão dos genes que intracelulares nas plantas se nao forern tornadas medidas, a c o d i f i ca rn p r o t e í n as a n t i f u n g o s transf ormadas corn os referidos

genes, causa provavelmente apenas um efeito antifungo muito modesto, dado gue estas proteínas nao atingem o seu local preferido de acção..

A partir destas observações pode concluir-—se o seguinte:

1) De todas as proteínas que sao produzidas após indução da resistência, incluindo pelo menos as chitinases, as glucanases e as proteínas do tipo da osrnotina, as formas intracelulares revelarão um efeito antifungo muito superior do das alternativas extracelulares.. De forma semelhante a formas extracelulares de quase todas senão todas as pr ot ei nas····· PR apresentarão urn pequeno ou nulo efeito antifungo..

2) Como as experiências com as plantas pMOG405 revelaram, o local preferido de acção de urna proteína antifungo, seja qual for a sua localização autêntica na planta, é o espaço extracelular..

3) Para combater com eficiência o ataque por fungos é muito recomendável utilizar proteínas intracelulares que sao produzidas após indução da resistência numa composição antifungos..

4) Para se obterem plantas corn susceptibilidade reduzida aos fungos, as referidas plantas devem ser transformadas corn um quadro de leitura aberta codificando uma proteína antifungos intracelular que após produção é deslocada para o seu local preferido de acção, que é o espaço extracelular ..

Contudo, a partir do que é acima referido nao deve ser entendido que literalmente que todas as proteinas intracelulares que são produzidas após indução da resposta hipersensivel têrn de facto urn efeito antifungo.. Por esta razão, a “técnica invertida'', isto é partindo de urn efeito antifungo em vez de um efeito enzimãtico, é muito útil para separar apenas as proteinas (intracelulares) que têrn efectivamente um efeito antifungo.. Em seguida, deve ser ensaiado nas plantas o efeito na resistência do fungo destas proteínas, por transformação de uma planta susoeptivel com um quadro de leitura aberto, codificando a referida proteína antifungos, de preferência após modificação do quadro de leitura aberto para proporcionar uma deslocação extracelular.,

EXEMPLO 11

Analise.....da......resistenoia...aos......fungos......em......glantas......trari©gén.:igas....f!.e batata

Para determinar a susceptibilidade de plantas de batata transf orrnadas corn pMOG404 e pl^vIOG405, ©ao pulverizadas vinte dos melhores expressores transgénicos da osrnotina corn urna suspensão de 1 x IO'·’ esporos de fungo

Phytophthorainfestans até se humedecer'.. 0 P „.......inf estans é um patogénio formidável da planta da batata.. Ele causa urna queda completa das folhas, afectação do caule e eventualmente a rnorte da planta.. Como controlo ©ao pulverizada© corn uma quantidade igual de esporos 20 plantas nao transf orrnadas e 20 plantas transf orrnadas corn o vector sern o gene da osrnotina (transgénicas corn vectores).. A© plantas ©ao cultivada© numa sala de cultura a 18 °C e corn uma humidade atmosférica de 95 a 100%.. A progressão da doença é avaliada no dia sete e no dia catorze após pulverização, por determinação da área da folha que é afectada pelo fungo.. A quantidade de área de folha afectada é expressa corno percentagem da área total da folha de todas as folhas contadas.. São contadas por plantas oito a dez folhas (inferiores) ; é calculada urna média dos resultados de todas as falhas cantadas de cada planta.. Na Tabela seguinte são dadas estimativas dos resultados obtidos.(+0-25% da área total da folha afectada; ++ 25--50% afectada; +++ 50.....

.....75% afectada; ++++ 75.....100% afectada) ..

Tabela 3

Resultados estimados da susceptibilidade da.planta de batata contra o fungo P...infestans

Pia......7

+	++	-1-1-1-	++-I-+
n a o.....transgênica		....	-...	15%+10%	85%+10%
transgênica	com	vector	....	....	15%+10%	35%+10%
transgênica	com	PMCG404	25%.+10%	25%.+10%	20%+10%	30%.+10%
transgênica	com	PMCG405	2.5%+10%	30%+10%	30%+10%	15%+10%

Dia.....Μ

	-1-	++	+++
nao......transgéniea			10%+10%	90%.+10%
transgênica com vector			10%+10%	90%.+10%
transgênica com pMOG404	20%+10%	10%+10%	10%.+10%	60%.+1.0%
transgênica corn plvIOG405	20%+.10%	25%+10%	30%,+10%	25%+10%

Com os inoculantes aqui utilizados, as plantas nao transformadas e transformadas com vectores sao quase completamente afectadas no dia 7.. A partir das plantas pMOG404 no dia 7, apenas cerca de 30% das plantas serão severamente afectadas; cerca de 70% das plantas pMOG404 revelarão claramente um desenvolvimento de doença atrasada ( + a ++-1-) quando comparadas com as plantas de controlo.. Pensa-se que no dia 14 aproximadamente 10 a 50% das plantas pMOG404 apresentarão apenas uns sintomas ligeiros a moderados (+ a ++) de infecçao, enquanto que apenas 10 a 30% serão ligeiramente afectadas ou não afectadas ( + ).. A csmotina deslocada extracelularmente (isto é as plantas pMOG405) revelarão ainda um desenvolvimento mais atrasado da doença do que as linhas transgênicas de pMOG404.

PROTOCOLO.....DE.....SEQUÊNCIAS

SEQ ID NO; 1

- 39 Oc *·

TIPO DE SEQUENCIA:: NUCLEOTIDOS

COMPRIMENTO DA SEQUENCIA: 34

NUMERO DE BANDAS:: DUPLA

TOPOLOGIA: LINEAR

TIPO DE MOLÉCULA:: SINTÉTICA

ORIGEM

ORGANISMO:: VIROS DO MOSAICO DE LUZERNA

CLONE:: .....

PROPRIEDADES:: RNA4 DO VIROS DE MOSAICO DE LUZERNO _{ΤΪΤΤΤΑΤΤΤΤ TAATTTTC;TT TCAAATACTT CCAG} 34

SEQ ID NO:: 2

TIPO DE SEQUENCIA:: NUCLEOTIDOS

COMPRIMENTO DA SEQUENCIA:: 32

NUMERO DE BANDAS: UNICA

TOPOLOGIA:: LINEAR

TIPO DE MOLÉCULA:: SINTÉTICA

ORIGEM

ORGANISMO:: CLONE:: PROPRIEDADES:: PRIMÁRIO - POR COMO HOMOLOGIA A cDNA

DE OSMOTINA

GCCGGATCCA ATTCGGCACA TGGGCAACTT GA 32

SEQ ID NO: 3

TIPO DE SEQUENCIA: NUCLEOTIDOS

COMPRIMENTO DA SEQUENCIA: 26

NUMERO DE BANDAS: UNICA

TOPOLOGIA: LINEAR

ΠΡΟ DE MOLÉCULA:: SINTÉTICA

ORIGEM

ORGANISMO:: CLONE:: ·PROPRIEDADES:: PRIMÁRIO PCR COMO HOMOLOGIA A cDNA DE OSMOTINA

GTTTATTACA GCAAGGATCC TGACTT 26

SEQ ID NO:: 4

TIPO DE SEQUENCIA:: NUCLEÓTIDOS

COMPRIMENTO DA SEQUENCIA:; 883

NUMERO DE BANDAS:: DUPLA

TOPOLOGIA:: LINEAR

TIPO DE MOLÉCULA:: cDNA

ORIGEM

O R G ΑΝ IS Μ O:: N i c o t i a n a ta b a c um

CLONE:: pMOG404

	PROPRIEDADES::	CODIFICANDO A 1-	’ROTElNA	DO
		TIPO DA OSMOTINA
bbA 1 bUAí ATG GGC	AAC TTG AGA TCT	TCT TTT GTT, TTG	TTG CTC	ib CTT GCC 58
Met Gly	Asn Leu Arg Ser	Ser Pbe Vai Pine	Phe Leu	Leu Ala
TTG GTG	ACT TAT ACT TAT	GCT' GCC ACT ATO	GAG GTG	CGA AAC 100
Leu Vai	Thr Tyr Tbr Tyr	Ala Ala Thr Ile	Glu Vai	Arg Asn
AAC TGT	CCG TAC ACC GTT	TGG GCG GCG TCG	ACA GCG	ATA GGC 142
Asn Cys	Pra Tyr Tbr Vai	Trp Ala Ala Ser	Thr Pra	Ile Gly
GGT GGC	CGG CGT CTC GAT	CGA GGC CAA ACT	TGG GTG	ATC AAi 1.84
Gly Gly	Arg Arg Leu Asp	Arg Gly Gin Thr	Trp Vai	Ile Asn

4.1 u >

GCG Ala

CCA Pro

CG A Arg

GGT Gly

ACT Thr

AAA Lys

ATG Met

GCA Ala

CGT Arg

GTA Vai

TGG Trp

GGC Gly

CGT Arg

ACT 226 Thr

A AT

TGT

AAC

'TTC

AAT

GCT

GCT

GGT

AGG

GGT

ACG

TGC

CAA

ACC

268

Asn

Cys

Asn

Phe

Asn

Ala

A ..I., ci

Gly

Arg

Gly

Thr

Cys

GIn

Thr

GGT

GAC

TGT

GGT

GGA

GTC

CTA

CAG

TGC

ACC

GGG

TGG

GGT

AAA

310

Gly

Asp

Cys

Gly

Gly

Vai

Leu

Gin

Cys

Thr

(11. y

Trp

Gly

Lys

CCA

CCA

AAC

AAC

'TTG

GCT

GAA

TAC

GCT

TTG

GAC

CAA

ttc;

AGT

362

Pr o

Pro

Asn

Thr

Leu

Ala

Glu

Tyr

Ala

Leu

Asp

Gin

Phe

Ser

GGT

TTA

GAT

TTC

TGG

GAC

ATT

tct

TTA

GTT

GAT

GGA

11 c

AAC

394

Gly

Leu

Asp

Phe

Trp

Asp

Ile

Ser

Leu

Vai

Asp

Gly

Phe

Asn

ATT

CCG

ATG

ACT

ΤΊΌ

GCC

CCG

ACT

AAC

CCT

AGT

GGA

GGG

AAA

436

Ile

Pro

Met

Thr

Phe

Ala

Pro

Thr

Asn

Pro

Ser

Gly

Gly

Lys

TGC

CAT

GCA

ATT

CAT

TGT

ACG

GCT

AAT

ATA

AAC

GGC

GAA

TGT

479

Cys

His

Ala

Ile

His

Cys

Thr

Ala

Asn

Ile

Asn

Gly

Glu

Cys

CCC

CGC

GAA

CTT

AGG

GTT

CCC

GGA

GGA

TGT

AAT

AAC

CCT

TGT

520

Pr o

Arg

Glu

Leu

Arg

Vai

Pro

Gly

Gly

Cys

Asn

Asn

Pro

Cys

ACT

AC A

'PTC

GCA

GGA

CAA

CAA

TAT

TGT

TGC

AC A

CAA

GGA

CC T

562

Thr

Thr

Phe

Gly

Gly

Gin

Gin

Tyr

Cys

Cys

Thr

Gin

Gly

Pro

TGT

GGT

CCT

AC A

TTT

TTC

TCA

AAA

TTT

TTC

AAA

CAA

AG A

TGC

604

Cys

Gly

Pro

Thr

Phe

Phe

Ser

Lys

Phe

Phe

Lys

Gin

Arg

Cys

CGT

GAT

GCC

TAT

ABC

TAC

CCA

CAA

GAT

GAT

CCT

ACT

AGC

ACT

646

Pro

Asp

Ala

Tyr

Ser

Tyr

Pro

Gin

Asp

Asp

Pro

Thr

Ser

Thr

TTT

ACT

TGC

CCT

GGT

GGT

AGT

AC A

AAT

TAT

AGG

GTT

ATC

TTT

688

Phe

Thr

Cys

Pro

Gly

Gly

Ser

Thr

Asn

Tyr

Arg

Vai

Ile

Phe

- 42

TGT CCT AAT GGT CAA GCT CAC CCA AAT TTT CCC TTG GAA ATG 730

Cys Pro Asn Gly Gin Ala His Pro Asn Phe Pro Leu Glu Met

CCT GGA AGT GAT GAA GTG GCT AAG TAG AGTGGCTATT 767

Pro Gly Ser Asp Glu Vai Ala Lys

TCTGTAATAA GATCACCTTT TGGTCAAATT ATTCTATCGA CACGTTAGTG 817

TAAGACAATC TAíTTGACTC GTTTTTATAG TTACGTACTT TGTTTGAAGT 867

GATCAAGTCA GGATCC 883

SEQ ID NO:; 5

TIPO DE SEQUENCIA:: NUCLEOTIDO

COMPRIMENTO DA SEQUENCIA:: 884

NUMERO DE BANDAS:: DUPLA

TOPOLOGIA:: LINEAR

TIPO DE MOLÉCULA:: oADN

ORIGEM:

O R G ΑΝ IS M 0:: N iço t la na......tabaourn

CLONE:: pMOG404

PROPRIEDADES:: Codificando urna proteína do tipo osmotina sern 20 aminoácidos terminai C

GGATCCAATT CGGCAC 16

ATG GGC AAC TTG AGA TCT TCT 'I TT GTT TTC T'T'C CI C CTT GCC 58

Met Gly Asn Leu Arg Ser Ser Phe Vai Phe Phe Leu Leu Ala

TTG GTG ACT TAT ACT TAT GCT GC(C ACT ATC GAG GTC CGA AAC ::1..00

Leu Vai Thr Tyr Thr Tyr Ala Ala Thr Ile Glu Vai Arg Asn

Asn Cys Pro Tyr Thr Vai Trp Ala Ala Ser Thr Pro Ile Gly

GGT GGG CGG CGT CIC GAT CGA GGC CAA ACT TGG GTG ATC AAT 184

Gly Gly Arg Arg Leu Asp Arg Gly Gin Thr Trp Vai Ile Asn

GCG CCA CGA GGT ACT AAA ATG GCA CGT GTA TGG GGC CGT ACT 226

Ala Pro Arg Gly Thr Lys Met Ala Arg Vai Trp Gly Arg Thr

AAT TGT AAC TTC AAT GCT GCT GGT AGG GGT ACG TGC CAA ACC 268

Asn Cys Asn Phe Asn Ala Ala Gly Arg Gly Thr Cys Gin Thr

GGT GAC TGT GGT GGA GTC CTA CAG TGC ACC GGG TGG GGT AAA 310

Gly Asp Cys Gly Gly Vai Leu Gin Cys Thr Gly Trp Gly Lys

CCA CCA AAC AAC TTG GCT GAA TAC GCT TTG GAC CAA TTC AGT 352

Pro Pro Asn Thr Leu Ala Glu Tyr Ala Leu Asp Gin Phe Ser

GGT TTA GAT TTC TGG GAC ATT TCT TTA GTT GAT’ GGA TTC AAC 394

Gly Leu Asp Phe Trp Asp Ile Ser Leu Vai Asp Gly Phe Asn

ATT GCG ATG ACT TTC GCC CCG ACT AAC CCT AGT GGA GGG AAA 436

Ile Pro Met Thr Phe Ala Pro Thr Asn Pro Ser Gly Gly Lys

TGC CAT GCA ATT CAT TGT ACG GCT AAT ATA AAC GGC GAA TGT 478

Cys His Ala Ile Hls Cys Thr Ala Asn Ile Asn Gly Glu Cys

CCC CGC GAA ClT AGG GTT CCC GGA GGA TGT AAT AAC CCT TGT 520

Pro Arg Glu Leu Arg Vai Pro Gly Gly Cys Asn Asn Pro Cys

ACT ACA TTC GGA GGA CAA CAA TAT TGT TGC ACA CAA GGA CCT 562

Thr Thr Phe Gly Gly Gin Gin Tyr Cys Cys Thr Gin Gly Pro

TGT GGT CCT ACA ITT TTC TCA AAA ITT TTC AAA CAA AGA TGC 604

Gys

Gly

Pro

Thr

Phe

Phe

Ser

Lys

Phe

the

Lys

Gln

Arg

Gys

COT

GAT

GCG

i AT

AGC

['AG

CCA

CAA

GAT

GAT

GGT

AC!

AGC

ACT

649

Pro

Asp

Ala

Ty γ-

Ser

Tyr

Pro

Gin

Asp

Asp

Pro

Th r

Ser

Thr

TTT'

ACT

ICC

ΟΟΤ

GGT

GGT

AGT

ACA

AAT

TAT

AGG

GTT

ATC

Ί Ί T

688

Pine

Tlnr

Gys

Pro

Gly

Gly

Ser

Thr

Asn

Tyr

Arg

Vai

Tle

Pine

TGT CO! 69/1 Gys Pro

TAATGGTGAA GCTCACCCAA ATTTTCCCTT' GGAAATGCCT GGAAGTGATG 744 AAGTGGCTAA GIAGAGTGGC TATTTCTGTA ATAAGATCAC CTTTTGGTCA 794 AAÍTATTCIA TGGACACGTT AGTGTAAGAC AATCT'ATTTG ACTCGTTT 11 844 ATAGTTACGT ACTTTGTTTG AAGTGAACAA GTCAGGTCC 884

Claims (4)

1. R Ε I V I M D I 0 A C □ E S

   ..... .....

   Processo para a preparação de uma proteína antipatogénica a partir de uma planta caracterizado por compreender as fases seguintes::

   1) preparar-se urn extracto de urna planta g u e r e v e 1 a res :i s t e η c i a i n d u z i d a,
2. 2) ensaiar.....se o extracto na presença de urna actividade antipatogénica nurn ensaio antipatogénico,
3. 3) purificar.....se a actividade antipatogé.....

   nica por fraccionamento do extracto utilizando urn processo de purificação de proteínas e urn ensaio antipatogénico,
4. 4) confirmar.....se a natureza proteica da a o t ::L v i d a d e a n t i p a t o g é n i c a..

   Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a proteina antipatogénica ser uma proteina anti-fungos e o ensaio antipatogénico compreender a administração de uma fracção do extracto a um fungo.

   ..... 33 .....

   Processo de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por o fungo ser um Oorniceta..

   ..... 43 .....

   Processo de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por o fungo ser do género Phytophtora..

   - 53 .....

   Processo de acordo reivindicações 1 a 4 caracterizado por proteina do tipo osrnotina..

   corn qualquer das a proteina ser uma

   ..... 63 .....

   Processo de acordo corn qualquer das reivindicações 1 a 5 caracterizado por a proteina antifungos ser urna proteina do tipo osrnotina de luzerna, feijão, cenoura, algodão, painço, batata, soja, tabaco ou tomate.,

   ..... 73 .....

   Processo de acordo corn a reivindicação 1 caracterizado por se obter uma proteina antifungos que possui a sequência de aminoácidos designada por SEQ ID NO 4, ou uma parte sua eficaz,

   SEQ ID NO :: 4TIPO DE SEQUÊNCIA .. NUCLEÕTIDO COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA :: 883 NUMERO DE BANDAS :: DUPLA TOPOLOGIA :: LINEAR • TIPO DE MOLÉCULA :: cADN

   GGA CCAATJ CGGCAC 16 ATG GGC AAC 11G AGA TCT' TCT ΤΓΤ GTT TTC í rc CTC CTT GCC 58 Met Gly Asn ! eu Arg Ser Ser Phe Vai ΡΙίο Phe Leu Leu Ala T !G GTG ACT JAT ACT TAI GCT GCC ACJ ATC GAG GTC CGA AAC 100 Leu Vai Thr Tyr ÍTir· Tyr Ala Ala Thr Ile Glu VaJ.. Arg Asn AAC TGJ' CCG TAC ACC GTT TGG GCG GCG TCG ACA CCC ATA GGC 142 Asn Cys Pro Tyr Thr Vai Trp Ala Ala Ser Thr Pro Ile Gly GGT GGC GGG CGJ” CJ C GAT CGA GGC CAA ACT TGG GTG ATC AAT 184 Gly Gly Arg Arg Leu Asp Arg Gly Gin Thr Trp Vai Ile Asn GCG CCA CGA GGJ ACT AAA ATG GCA CGJ” GTA TGG GGC CGT ACJ 226 Ala Pr o Arg Gly Thr Lys Met AJ.a Arg Vai Trp Gly Arg Thr AAT TGJ AAC TTC AAT GCI GCT GGT AGG GGJ ACG TGC CAA ACC 268 Asn Cys Asn Phe Asn Ala Ala Gly Arg Gly Thr Cys Gin Thr GGT GAC TGT GGJ” GGA GTC CTA CAG TGC ACC GGG TGG GGJ AAA 310 Gly Asp Cys Gly Gly Vai Leu Gin Cys Thr Gly Tr p Gly Lys CCA CCA AAC AAC TTG GCI GAA TAC GCT 1 TG GAC CAA ITC AGT 352 Pro Pro Asn Thr Leu Ala Glu Tyr Ala Leu Asp Gin Phe Ser GGT JTA GAT J TC TGG GAC ATT TCT TTA CTT GAT GGA TJC AAG 394 RJ. y Leu Asp Phe Trp Asp Ile Ser Leu Vai Asp Gly Pine Asn ATT CCG ATG ACT TJC GCC CCG ACT AAC CCT AGT GGA GGG AAA 436 n.fe Pro Met Ih:- Phe Ala Pro Thr Asn Pro Ser G1 y Gly Lys 1 ÊjíEJ CAT GCA ATT CAI TGT ACG GCT AAT ATA AAC GGC GAA TGT 478 Cys His Ala !Te His Cys Thr Ala Asn Ile Asn Gly Glu Cys

   COO Pro CCC Arg GAA Glu OIT Leu AGG Arg Gί T Vai COC Pro GGA Gly GGA Gly TGT Cys A AT Asn A AC Asn GCT Pro TGT Cys 520 ACT ACA i'TC GGA GGA CAA CAA TAT TGl TGC ACA CAA GGA CCT 562 Ihr Thr Pine Gly Gly Gin Gin Tyr Cys Cys Thr Gin Gly Pro IGT CCT 00! ACA ΊΠ Π'Ό TOA AAA TTT TTC AAA CAA AGA TGC 604 Cys Gly Pro Ί hr Phe Phe Ser Lys Phe Phe Lys Gin Arg Cys COT GAT OCO TAT AGC TAC CCA CAA GAT GAT CCI' ACT AGC ACT 646 Pro Asp Ala Tyr Ser Tyr Pro Gin Asp Asp Pro Thr Ser Thr τι r AC¹ TGC CCI GGT GíTi AGT ACA ΑΑΊ TAT AGG G1 Ί ATC TTT 688 Phe Thr Cys Pro Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Arg Vai lie Pine TGl CCT ΑΛΤ GGT CAA GCT CAC CCA ΑΑΊ TTT ccc TTG GAA Λ'1'G 730 Cys Pro Asn Gly Gin Ala His Pro Asn Pine Pro Leu Glu Met 001' GGA ACT GAT GAA GTG GCT AAG TAG AGTGGCTATT 767 Pro G iy Ser Asp Glu Vai Ala Lys

   TCTGTAATAA GATCACCTTT TGGTCAAATT ATTCTATCGA CACGTTAGTG 8:17

   TAAGACAATG TATTTGACTC GTTTTTATAG TTACG lACTT IGTTTGAAGI 867

   GATCAAGTCA GGATCC 883

   ..... 8â Processo de acordo corn a reivindicação 1 caracterizado por se obter uma proteína antifungos que possui a sequência de aminoácidos designada por SEQ ID NO 5, ou uma parte sua eficaz.

   SEQ ID NO :: 5

   TIPO DE SEQUÊNCIA :: MUCLEÕTIDO COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA 884 • NÚMERO DE BANDAS :: DUPLA

   ..... 4-8 ··

   TOPOLOGIA :: ILE NE AR

   TIPO DE MOLÉCULA :: cADN

   ORIGEM::

   ORGANISMO :: N i c o ti a n a......ta bacu in

   PROPRIEDADES :: Codificando urna pro te ina do tipo osmotina sem 20 amino.....a o i dos c.....t e r rn i n a 1

   GGATCCAATT CGGCAC 16

   ATG Met GGC Gly AAC Asn ÍTO Leu AGA Arg TCT Ser TCI Ser TTT Phe GTT Vai TTC Phe TTC Pine CTC Leu CTT Leu GCC AI. a 58 1 ΊΊ1 GÍG ACT TAT ACT TAT GCT GCC ACT ATC GAG GTC CGA AAC 100 Leu Vai Thr Tyr Thr Tyr Ala Ala Thr Ile Glu Vai Arg Asn AAC TGT CCG TAC ACC GTT TGG GCG GCG TCG ACA CCC ATA GGC 142 Asn Cys Pro Tyr Thr Vai Trp Ala Ala Ser Thr Pro Ile Gly GGT GGC CGG CGT CTC GAT CGA GGC CAA ACT TGG GTG ATC AAT 184 Gly Gly Arg Arg Leu Asp Arg Gly Gin Thr Trp Vai Ile Asn GCG CCA CGA GGT ACT AAA ATG GCA CGT' GTA TGG GGC CGT ACT 226 Ala Pro Arg Gly Thr Lys Met Ala Arg Vai Trp Gly Arg Thr AAT LGI AAC rrc AAT GCT GCT GGT AGG GGT ACG TGC CAA ACC 268 Asn Cys Asn Phe Asn Ala Ala Gly Arg Gly Thr Cys Gin ΤΊ u-

   GGT GAC TGT GGT GGA GTC CTA CAG TGC ACC GGG TGG GGT AAA 310

   Gly Asp Cys Gly Gly Vai Leu Gin Cys Thr Gly Trp Gly Lys

   CCA CCA AAC AAC TTG GCT GAA TAC GCT TTG GAC CAA TTC AGT 352

   Pro Pro Asn Thr Leu Ala Glu Tyr Ala Leu Asp Gin Phe Ser

   GGT TTA GAT TTC TGG GAC ATT TC Γ TTA GTT GAT GGA TTC AAC 394

   Gly Leu Asp Phe Trp Asp Ile Ser Leu Vai Asp Gly Phe Asn

   ATI CCG ATG ACT TTC GCC CCG ACT AAC CCT ACT GGA GGG AAA 436 Ile Pr o Met Thr Phe Ala Pr o Thr Asn Pro Ser Gly Gly Lys TGC CAÍ GCA ATT CAI TGT ACG GCT AAT ATA AAC GGC GAA TGl 478 Cys His Ala Ile 1 Ti..© Cys Tl-ir Ala Asn Ile Asn Gly Glu Cys CCC CGC GAA CTT AGG GIT CCC GGA GGA TGT' AAT AAC CCs TGl' 520 Pr o Arg Glu Leu Arg Vai Pro Gly Gly Cys Asn Asn Pro Cys Asn Cys Pi-o 1 yr Thr Vai Trp Ala Ala Ser Thr Pro Ile Gly GGT GGC CGC CGT CTC GAT CGA GGC CA A ACT TGG GTG ATC AAT 184 Gly Gly Arg Arg Leu Asp Arg Gly Gin Thr Trp Vai Ile Asn GGG CCA CGA GGT ACT AAA A ÍG GCA GGT GTA TGG GGC CGT ACT 226 AIIa Pr o Arg G Ly Thr Lys Met Ala Arg Vai Trp Gly Arg Thr- AAT TGT' AAC TTC AAT GCT GCT GGT AGG GGT ACG IGC CA A ACC 268 Asn Cys Asn Phe Asn Ala Ala Gly Arg Gly Thr Cys Gin Thr GGT GAC TGT GGT GGA CTC CTA CAG TGC ACC GGG TGG GG Ί AAA 310 Gly Asp Cys G Ly Gly Vai Leu Gin Cys Thr Gly Trp Gly Lys CCA CCA AAC AAC Ί ΊΤ..Τ GCT GAA TAC GCT TTC GAC CA A TLC AGT 352 Pr o Pr o Asn Thr Leu Ala Glu Tyr Ala Leu Asp (TL n Phe Ser GGT TTA GAT '! TC TGG GAC ATI l'GT TTA GTT GAT GGA TTC AAC 394 Gly Leu Asp Phe Trp Asp Ile Ser Leu Vai Asp Gly Phe Asn ATT CCG ATG A Cl TTC GCC CCG ACT AAC GGT AGI GGA GGG AAA 436 Ile Pr o Met Thr Phe Ala Pro Thr Asn Pro Ser Gly Gly Lys TGC CAT GCA A l'T CAT TGT ACG GGT AAT ATA AAC GGC GAA Th τ 478 Cys His Ala Ile His Cys Thr Ala Asn Ile Asn Gly Glu Cys CCC CGC GAA f CTT AGG G ΤΊ CCC GGA GGA TGT AAT AAC CCT 'TGT' 520 Pr o Arg Glu Leu Arg Vai Pro Gly Gly Cys Awn Asn Pro Cys

   ..... 99 .....

   Processo para a preparação de urna campo.....

   siçao antipatogénica caracterizado por se incorporar uma ou mais substancias activas e um veiculo adequado, compreendendo pelo menos uma quantidade eficaz de uma proteína antipato.....

   gênica quando preparada de acordo com a reivindicação 1..

   ..... 1.09 .....

   Processo para a preparação de uma rompo.....

   sição antifungos caracterizado por se incorporar uma ou mais s u bs t ân c i as a o t i vas e u rn v eí c u 1 o a d e qu a d o , co rn pr ee n d e n d o pe 1 o menos urna quantidade eficaz de urna proteína antifungos quando preparada de acordo corn qualquer das reivindicações 7 a 8.

   119 .....

   Processo para a preparação de urna composição antifungos caracterizado por se incorporar urna ou mais substâncias activas e urn veiculo adequado, compreendendo 1 jjg/rnl a 100 rng/rnl de uma proteína de tipo osrnotina..

   ..... 1.29 -·

   Processo de acordo corn as reivindi caçoes 9 a 11 caracterizado por se incorporar ainda urna ou rnais s u b s t â n c i as e s c o 1. h 1. d a s η o g r u p o c o n s i s 11. n d o e rn c h i t i n asses, glucanases, tioninas, lisozimas, SAFP (Proteínas Anti.....

   I· u n g o s S i n é r g i c as), p o 1 i o x i n a s, n i c o rn i c i nas, c a r b o x 1. rn i d a s, carbohidratos aromáticos, carboxinas, rnorfolinas, inibidores da síntese do esterol e compostos organofosforosos..

   ..... 139 .....

   Processo para a preparação de urn medica.....

   mento para o tratamento de urna doença causada por fungos o a.....

   racterizado por se incorporar 1 j.rg/rnl a 100 rng/rnl de urna proteína de tipo osrnotina., td..

   14â

   Processo para a preparação de uni poli nu.....

   c 1 e o t i d ο κ e c o rn b i n a n t e o o rn p r e e n d e n d o essen o i a 1 rn e n t e u rn q u a d r o de leitura aberto, codificando urna proteína preparada de acordo corn qualquer das reivindicações 7 a 8, caracterizado por

   ..... determinar.....se parte da sequência de aminoácidos da proteína isolada, preparar.....se urna sonda, ou urna mistura de sondas, de n u cl e ó t i d o co d i f i o a n d o (parte da) sequência de arninoãcidos determinada,

   ..... hidridizar.....se a referida sonda, ou mistura de sondas, para urna biblioteca de eADN de urna planta após indução de resistência, ou urna biblioteca genôrnica,

   ..... clonar.....se urn fragmenta de urn clone positivo, e, opcional.....

   rnente,

   ..... determinar.....se a sequência de nucleótidos para confirmar a cor resp o n d ê n c i a c o rn a p r o t e i n a isolada.

   ..... 156 .....

   Processo de acordo com a reivindicação 14 caracterizado por se obter um polinucleótido recombinante compreendendo essencialrnente urna sequência de nucleótidos possuindo urn quadro de leitura codificando uma proteína quando preparada de acordo corn qualquer das reivindicações 7 a 8„

   ..... 165 .....

   Processo de acordo corn a reivindicação 14 caracterizado por se obter um polinucleótido recombinante compreendendo urna sequência do tipo das designadas por SEQ ID NO 4 ou SEQ ID NO 5, ou urna parte sua.

   ..... 176 .....

   Processo de acordo corn qualquer das rei.....

   vindicaçoes 15 ou 16 caracterizado por se obter um polinu.....

   cleótido recombinante em que o quadro de leitura é modificado de forma a proporcionar uma deslocação extracelular da proteína codificada, após expressão adequada do quadro de leitura aberto na célula da planta..

   - 183 .....

   Processo de acordo com qualquer das rei vindicações 15 ou 17 caracterizado por se obter um poiinu.....

   cleótido recombinante possuindo o referido quadro de leitura aberto operativamente ligado a um promotor que seja funcionai, numa planta, e que nao esteja naturalmente associado com o quadro de leitura aberta..

   ..... 193 .....

   Processo de acordo com a reivindicação 18 caracterizado por se obter um polinucleótido recombinante em que o quadro de leitura foi alterado de forma a proporcionar uma deslocação extracelular da proteína codificada por ele..

   ..... 203 .....

   Processo de acordo com a reivindicação 19 caracterizado por se obter um polinucleótido recombinante ern que a alteração compreende o encurtamento do quadro de leitu.....

   ra aberto por introdução de um codao de paragem na parte do

   3’.....terminal do quadro de leitura aberto, evitando assim a translação de urn certo numero de aminoãeidos C.....terminal da proteína intracelular para proporcionar deslocação extra.....

   celular..

   ..... 213 .....

   Processo para a preparação de urna célula caracterizado por se incorporar um polinucleótido recombinante quando preparado de acordo com qualquer das κ e i. v i n d :.i c ações 14 a 20..

   222 .....

   caracterizado antifunges.

   Processe de acordo por se obter urna célula corn a reivindicação 21 que produz uma proteína

   Processo de acordo caracterizado por se obter urna célula p r o t e i n a a n t i f u n g o s i n t r a c e 1 u 1 a r ..

   242 .....

   Processo de acordo caracterizado por se obter urna célula proteína do tipo da osmotina.

   com a reivindicação 22 em que a proteína é urna com a reivindicação 22 ern que a proteína é uma

   - 252 .....

   Processo de acordo com a reivindicação 22 caracterizada par se obter urna célula em que a proteína é uma proteína do tipo da osmotina de luzerna, feijão, cenoura, a 1 g o d ã o, p a i n ç o, b abata, ta b a c o o u t o m a t e..

   ..... 262 .....

   Processo de acordo reivindicações 21 a 25 caracterizado por que é uma célula de bactéria, uma célula célula animal...

   com qualquer das se obter urna célula de levedura, ou uma

   ..... 272 .....

   Processa de acorda com qualquer das reivindicações 21 a 25 caracterizado por se obter urna célula que é uma célula de planta ou um seu protoplasto.

   ..... 282 .....

   Processo de acordo com a reivindicação 27 caracterizado por se obter uma célula que é uma célula de pólen..

   ..... 54 ·

   ..... 29ã .....

   Processo para a preparação cio urna planta caracterizado por se regenerar urna célula ou protoplasto quando preparado de acordo corn a reivindicação 2?..

   ..... 30ã .....

   Processo para a preparação de urna planta caracterizado por se efectuar a polinização corn urna célula de pólen quando preparada de acordo corn a reivindicação 28.,

   ..... 3lã Processo de acordo com as reivindicações 29 ou 30 caracterizado por se obter uma planta que revela uma susceptibilidade reduzida a um patogénio ou peste escolhidos no grupo consistindo em insectos, nematodos, fungos e bactérias..

   ..... 32ã -Processo de acordo corn a reivindicação 31 caracterizado por se obter uma planta ern que o patogénio é um fungo..

   ..... 33ã .....

   Processo de acordo corn a reivindicação 32 caracterizado por se obter uma planta em que o fungo c um Oorniceta..

   ..... 34ã .....

   Processo de acordo corn a reivindicação 32 caracterizado por se obter uma planta em que o fungo pertence ao género Phytophthora..

   ..... 35ã .....

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 29 a 34 caracterizado por se obter uma planta que pertence â família de Solanacease..

   ..... 369 .....

   Processo para deslocar urna proteina intracelular de urna planta para o espaço extracelular de urna planta ou célula de plantas.

   ..... 379 .....

   Processo de acordo com a reivindicação 36 caracterizado por compreender a modificação da extremidade do C-Terminal de um quadro de leitura aberto que codifica a referida proteina intracelular..

   ..... 38 9.....

   Processo de aeordo corn as reivindicações 36 ou 37 caracterizado por a proteina intracelular ser uma proteina antlpatogénica ou antifungos..

   399 .....

   Processo para potenciar o efeito antipatogénico de uma proteína intracelular antlpatogénica de uma planta, caracterizado por se deslocar a proteina intracelular de planta para o espaço extracelular.

   ..... 409 .....

   Processo de acordo com a reivindicação 39 caracterizado por essa deslocação ser conseguida por a alteração da exterrnidade do 3.....terminal do quadro de leitura aberto que codifica a proteina intracelular..

   A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente holandês apresentado em 7 de Julho de 1990,