DD265639A1

DD265639A1 - Verfahren zur testung antifungaler verbindungen

Info

Publication number: DD265639A1
Application number: DD30853387A
Authority: DD
Inventors: Bernd Oertel; Eckardt Jelke; Eberhard Unger
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1987-11-02
Filing date: 1987-11-02
Publication date: 1989-03-08

Abstract

Es wird ein einfaches, materialoekonomisch guenstiges Verfahren (Mikrokultur) zur breit angelegten Testung antifungaler Mittel gegen verschiedene Entwicklungsstadien (Mycel, Sporangium, Zoospore) von Pilzen, insbesondere des Oomyceten Phytophthora infestans, beschrieben. In ihm wird der Testorganismus, z. B. Phytophthora infestans, auf einem einzelnen, gequollenen, sterilen, feuchten Roggenkorn in der Boettcherkammer oder auf einer Mikrotestplatte unter Standardbedingungen mit und ohne Zusatz der zu untersuchenden Testsubstanz kultiviert. Mittels Durchlicht- bzw. Stereomikroskop werden nach entsprechender Kulturzeit Mycelwachstum und Sporangiogenese semiquantitativ beurteilt. Die Applikation des zu untersuchenden Wirkstoffes an Sporangien, die an unbehandeltem Mycel gebildet wurden (direkte Sporangienkeimung), erlaubt Rueckschluesse auf den Einfluss der Testsubstanz auf die Keimfaehigkeit der Sporangien und auf die Zoosporogenese (indirekte Sporangienkeimung). Die Applikation der Testsubstanz an freigesetzte Zoosporen gibt Hinweise auf Moeglichkeiten zur Beeinflussung der Zoosporenmotilitaet und somit zur Beeinflussung der Ausbreitung des Parasiten auf der Wirtspflanze mittels dieser beweglichen Propagationszellen.

Description

Anwendungsgebiet dar Erfindung

Die Erfindung betrifft ein effektives Verfahren zur breiton s:miq:'antitativen und qualitativen Tostung potentieller Fungizide, vorzugsweise gegen Oomyceten wie z.B. Phytophthora infestans.

Daneben kann dieses Verfahren auch bei der entsprechenden Testung potentieller Wirkstoffe gegen andere, ökonomisch relevante parasitische oder sapophytische Pilze verwendet werden.

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt in der Forschung wie in der chemischen Industrie bei dec Sucho nach neuen Pflanzenschutzmitteln.

-2- 265 Charakteristik des bekannten Stande· der Technik

Für die Suche nach fungiziden Mitteln und für die Untersuchung des Einflusses fungizider Mittel auf verschiedene Arten von Pilzen werden in der Regel die in der Mikrobiologie üblichen Techniken eingesetzt, z.B. die aus der Antibiotikaforschung bekannten Agarblöckchenmethoden, Lochplattenteste oder Schrägagarkulturen. Auf diesen Prinzipien basieren auch viele im Großmaßstab genutzte halb- oder vollautomatische screoning-Systeme.

Für Untersuchungen im Labor rentieren sich diese automatisierten Systeme nicht; man greift auf o.g. Methodiken zurück und adaption sie auf das jeweilige Untersuchungsziel. Beispiele für derartige allgemeine mikrobiologische Untersuchungsmethoden ;ind in der Standardliteratur ausführlich beschrieben, u.a. in: Booth, C. (ed.) .Methods in Microbiology" vol.4, Academic Press London, New York 1971; Norris, J. R. and Ribbons, D.W. (ede.) .Methods in Microbiology", vol. 1, Academic Press London, New York 1969; Kreisel, H. und Schauer. F. .Methoden des mykologischen Laboratoriums", VEB Gustav Fischer Verlag, Jena 1987. Besonders schwierig gestalten sich Untersuchungen, bei denen Mittel gegen niedere, Zoospoian-bildende Pilze gefunden werden sollen, z. B. gegen don ökonomisch bedeutf amen Parasiten an Kartoffel, Tomate und vielen anderen Kulturpflanzen, den Oomyceten Phytophthora infestans. Für die Kultur und Erhaltung dieser (fakultativen nder obligaten) Pflanzenparasiten müssen spezifische Bedingungen eingehalten werden, was z. B. durch Kultur in Flüssigkeitströpfchen, auf Pflanzenteilen, an der Wirtspflanze) o.a. zu erreichnn it. Methoden hierzu sind dargestellt in: Lange, L., Olson, W. .Some Methods for studying Zoosporic Plant Pathogenesic Fungi", Buczacki, S.T. (ed.) "Zoosporic Plant Pathogens — A modern Perspektive", Academic Press London, New York, Paris, Sand Diego, San Francisco, Sao Paulo, Sydney, Tokyo, Toronto 1983.

Für die Kultivierung von Phytophthora infestans, speziell zur Gewinnung größerer Mengen der asexuellen Vermehrungsstadien (Sporangien, Zoosporen), hnt sich die Verwendung eines Roggen-Nährbodens nach Tverskoij et al. (Tverskoij, J., Filippova G.G. und Bobkova, Z. S. .Substrate for culturing conidia of Phytophthora infestans (MONT.) DE BARY, Mikol.Fitopatol., 15,1981, 247-250) und Jelke et al. (Jelke, E.Oortel, B., Böhm, K.J., Unger, E., J. Basic Mikrobiol., 27,1987 [1], 11-21) bwährt. Für eine breit angelegte Testung bzw. Suche von bzw. nach antifungalen Verbindungen erweisen sich die genannten Kultivierungsmethoden jedoch als zu material- und arbeitsintensiv. Weiterhin ist der Platzbedarf für die Inkubation der Kulturen zu groß.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, eine zeit- und materialsparende Methode zur Testung potentieller Fungizide gegen verschiedene Lebenszyklusstadien von Oomyceten, insbesondere Phytophthora infestans, bereitzustellen.

Darlegung de· Wesen» der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein semiquantitativea mikrobiologisches Verfahren zur Testung von potentiellen Fungiziden gegen verschiedene Lebenszyklusstadien von Oomyceten, insbesondere des schwierig tu kultivierenden Pilzes Phytophthora infestans, zu beschreiben, das bei geringstem Material- und Zeitaufwand einen hohen Probendurchsatz erlaubt und ein broites Wirkungsspektrum erfaßt.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe wie folgt gelöst:

Aus einer Vorkultur des pilzlichen Testorganismus wird zunächst in an sich bekannter Weise ein Inokulum bereitgestellt, indem erstere zunächst mit 10ml bis 30ml sterilem Aqua bidest. versetzt wird, wobei Mycelstücke und Sporangien durch Rühren in Suspension gebracht werdun. Als pilzlicher Testorganismus kann biespielsweise ein Oumycet wie Phytophthora infestans herangezogen werden. Portionierte Teilmengen dieses Ansatzes, d. h. der Mycel-Sporangien-Suspension, sind daraufhin mit definierten Mengen einer Lösung bzw. Suspension der jeweiligen Tostsubstanz zu versetzen (Ansatz); wenigstens eine Portion des Ansatzes ist daboi für die Konotrolluntersuchung ohne Testsubstanz-Zusatz vorzusehen.

Je eine Teilmenge der so vorbereiteten Ansatz-Portionen wird anschließend auf eine Mikrokultur übertragen. Als Mikrokultur wird jeweils ein einzelnes steriles, feuchtes, ungeheiztes Getreidekorn, vorzugsweise ein vorgequollenes Roggen- oder Gerstenkorn, eingeiotzt, welches in einer feuchten, eine subjektive Beobachtung mittels Auflichtmikroskop zulassenden Böttcherkammer bzw. in den Probekammern einer Mikrotestplatte, angeordnet ist.

Eine andere Variante des Testverfahrens wird so ausgeführt, daß die Mikrokultur unmittelbar mit dem reinen Inokulum (ohne Testsubstanz) beimpft und erst nach der Mycel-Bildung, d.h. nach 3 Tagen bis 5 Tagen Inkubation, die Lösung bzw. Suspension dor Testsubstanz zufuhrt und weiter inkubiert wird.

Die so präparierte Mikrokultur, in der das Getreidekorn als qualitativ und quantitativ gut standardisiertes Nährsubstrat fungiert, wird bei einer Temperatur von 16°C bis 20X, vorzugsweise 19°C, für die Gesamtdauer von 6 Tagen bis 12 Tagen, inkubie t (Erst-Inkubaticn).

Nach Beendigung der Erst-Inkubation wird die Mikrokultur, gegebenenfalls noch in der Böttcherkammer beziehungsweise in oer Mikrotestplatte, zunächst nach Kriterien wie Mycelwachstum und Vorhandensein von Sporangien bewertet.

Anschließend werden Mycelflöckchen mit Sporangion aus den Testsubstanz-behandelten Mikrokulturen

— einerseits nach Kurzzgit-Inkubation (etwa 2 Stunden) bei Temperaturen von 3°C bis 10°C, bei Phytophthora infestans vorzugsweise bsi einer Temperatur von 5*C, gefolgt von einer weiteren Kurzzeit-Inkubation (etwa 15 Minuten) bei Temperaturen von 20°C bis 28°C, vorzugsweise von 25°C, auf Zoosporen-Lildung und Beweglichkeit der Zoosporen (Prüfschrit: mit Zweitinkubation) sowie

— andererseits nach Einbringen in steriles Aqua bidest. und erneuter Inkubation (etwa 24 Stunden) bei einer Temperatur von 2O⁰C bis 28⁰C, voizug- weise von 25⁰C, auf Keimschlauch-Bildung (gleichfalls Prüfschritt mit Zweitinkubation)

untersucht.

Parallel dazu werden auf gleiche Weise Mycelflöckchen aus den Kontrollkulturen (ohne Testsubstanz) behandelt und untersucht. Jedoch wird hierbei die jeweilige Zweit-Inkubation der an unbehandeltem Mycel gebildeter. Sporangien in einer Lösung bzw. Suspension der Testsubstenz vorgenommen. Auf diese Weise wird der Einfluß der Testsubstanz auf die Zoosporon- bzw. Keimschlauch-Bildung von Sporangien untersucht, die an ungebandeltem Mycel gebildet wurde. Weiterhin wird hierbei der Einfluß der Testsubstanz auf die Beweglichkeit der aus den mit Testsubstanz behandelten Sporangien freigesetzten Zoosporen analysiert. Für die Beurteilung des Mycelwachstums wird eine Lupe oder ein Stereoauflichtmikroskop, für die Untersuchung der Zoosporen hinsagen ein Durchlichtmikroskop mit 100- bis 400facher Vergrößerung eingesetzt. Mit der Anwendung dieses Testverfahrens sind folgende Vorteile verbunden: Erstens entsteht nur noch ein sehr geringer Material- und Personalaufwand.

Zweitens kann der Einfluß der Testsubstanzen auf die unterschiedlichsten Differenzierungsstadien im gleichon Untersuchungsansatz untersucht werden (Mycelwachstum, Keimung wirkstoffbehandelte Sporangien nach Beseitigung des Wirkstoffs, Keimung unbehandelter Sporangien in Anwesenheit des Wirkstoffs, Zoosporemnotilität und -morphologie). Drittens erfordert das Verfahren nur noch minimale Aufwandmengen bei den Testsubstanzen (pg-Mengen).

Ausfuhrungsbelsplel

Die Effektivität des beschriebenen Verfahrens soll an Hand des Ablaufschemas dreier bevorzugter Ausführungsformon belegt werden.

Beispiel 1

1.1. Vorkulur

Phytophtho'a infestans als Testorganismus wird 14 Tage bei 19⁰C in Eprouvetten auf 17 ml Schrägagar folgender Zusammensetzung kultiviert: 17g Bohnenmehl, 34g Hafermehl, 8g Saccharose, 20g Agar, 11 destilliertes Wasser (nach ZOLLFRANK).

1.2. Herstellung des Ansatzes für die Beimpfung der Mikrokultu'

Die Vorkultur (14 Tage gewachsen) des Pilzes wird mit 30ml sterilem Aqua bidest. versetzt. Mycolstücke und Sporangien werden durch kräftiges Rühren des Aqua bidest. mit einem Glasstab auf der Oberfläche der Myceldecke der Vorkultur in Suspension gebracht (steril). Diese Suspension ist entsprechend der Anzahl der zu untersuchenden Substanzen zu portionieren; die entsprechenden Portionen sind mit der Suspension bzw. Lösung der Teitsubstanzen zu versetzen. Als Testsubstanz können Alkaloide, andere Naturstoffe oder synthetische Stoffe eingesetzt werden. Die Testsubstanzon werden in einer solchen Konzentration dem Inokulum zugesetzt, daß im Ansatz (Inokulum und Testsubstanz) die Testsubstanz in 10"^Jmol bis 10"'mol Verdünnung vorliegt. Ein Teil der Mycel-Sporangien-Suspension ist für die Beimpfung von Mikrokulturen ohne Zusatz der Testsubstanzen vorzusehen.

1.3. Mikrokultur

Je ein steriles, feuchtes Roggenkorn (Sterilisation 20min im Autoklavon) ist in einer Böttcherkammer folgenden Aufbaus zu

inkubieren:

Auf einen Objektträger werden (nebeneinander) 2 Scheiben Filterpapier (feucht, steril, Durchmesser 1 cm) gelegt. Über diese Filterpapierscheiben wird je ein 1 cm hoher Glashohlzylinder mit einem Innendurchmesser von 1 cm gestellt. Der obere Rand

eines jeden Glashohlzylindors wird mit einem Filterpapierring (Abmessungen entsprechend der Wandstärke des

Glashohlzylinders) versehen und mit einem Deckgläschen 18mm χ 18mm abgedeckt. Auf jedes der in diesen Kammern befindliche Roggenkorn wird 0,05 ml Mycel-Sporengien-Testsubstanz-Suspension

aufgetragen und ist einer Kultivierung von 10 Tagen bei 19°C in einer Kammer zu unterziehen.

1.4. Auewertung und Folgeuntersuchungen

1.4.1. Die Mikrokultur ist zunächst nach folgenden Kriterien zu beurteilen (mittels Stereomikroskop):

• Mycelwachstum entspricht unbehinderter Kontrolle + + +

gut, + +

sehr wenig Mycel +

kein Mycel —

• Vorhandensein von Sporengien (ja/nein)

1.4.2. Anschließend iM aus den mit Testsubstanz behandelten Mikrokulturen ein Mycelflöckchen mit Sporangien zu entnehmen, 2 Stunden in 0,1 ml Aqua bidest. bei 5°C und 1S Minuten bei 25⁰C zu inkubieren. Nach Auftragen eines Tropfens der Inkubationsflüssigkeit auf einem Objektträger ist mittels Lichtmikroskop bei 100- bis 400facher Vergrößerung zu prüfon, ob die an mit Testsubstanz behandelten Mycel gebildeten Sporangien in Abwesenheit der Testsubstanz Zoosporen entließen. Die Morphologie dieser Zoosporen ist im Vergleich zur Kontrolle zu beurteilen (Veränderungen der Form usw.). Auch die Zoosporen-Beweglichkeit ist zu beurtoilen.

1.4.3. Ein weiteres Mycelflöckchen mit Sporangien aus diesen mit Testsubstanz behandelten Kulturen ist in 0,1 ml Aqua bidest. 24 Stunden bei 25*C zu inkubieren:

Es ist mittels Licht/ Mikroskop bei 100- bis 400facher Vergrößerung zu prüfen, ob diese an wirkstoffbehandoltem Mycel gebildeten Sporai gien in der Lage sind, nach Entfernung der Testsubstanz mit Keimschlauch auszukeimen.

1.4.4. Mit Mycelflöckchen aus den nicht mit Tostsubstanz versehenen Mikrokulturen ist zu verfahren wie unter 1.4.2. bzw. 1.4.3. beschrieben. Jedoch erfolgt die Zweit-Inkubation der an unbehandeltem Mycel gebildeten Sporangien in Suspension bzw. Lösung der entsprechenden Testsubstanz.

Beispiel 2

Es ist zu verfahren wie im Beispiel 1, jedoch ist die Mikrokultur mit Mycel-Sporangiensuspension ohne Testsubstanz-Zusatz zu beimpfen und 3 bis 5 Tage bis zum gut erkennbaren Mycelwachstum vorzukultivieren (19⁰C). Anschließend sind 0,05ml der Testsubstanz-Lösung bzw. -suspension auf jedes Roggenkorn aufzutropfen. Die weitere Kultivierung erfolgt wie im Beispiel 1 beschrieben.

Beispiel 3

Ec ist zu verfahren wie im Beispiel 1, jedoch ist als Inokulum eine mit Testsubstanz versehene Sporangiensusponsion zu verwenden.

Claims

1. Verfahren zur Testung antifungaler Verbindungen in Mikrokultur und unter Rückgriff auf einen pilzlichen Testorganismus, gekennzeichnet dadurch, daß man

— auf ein einzelnes, steriles, feuchtes, ungeoeiztes Getreidekorn als Substrat der Mikrokultur eine Portion eines Inokulums, bestehend aus einer mit einer definierten Menge der jeweiligen Testsubstanz versetzten Mycel- Sporangien- oder Sporangien-Suspensionen des verwendeten pilzlichen Testorganismus, überträgt und die so präparierte Mikrokultur, wie auch mindestens eine Kontroll-Mikrokultur ohne Testsubstanz anschließend inkubiert (Erst-Inkubation) oder eine Portion eines Inokuiums, bestehend aus Mycel-Spo^rangien- oder Sporangien-Suspension des verwendeten pilzlichen Testorganismus, überträgt, die so präparierte Mikrokultur in einer ersten Phase inkubiert, nach der Bildung von Mycel eine Applikation der Testsubstanz vornimmt und die Inkubation in einer zweiten Phase der Erstinkubation fortsetzt, wobei auch mindenstens eine Kontroll-Mikrokultur ohne Testsubstanz verbleibt,

— aus jeder inkubierten Mikrokultur entnommene Mycelflöckchen mit Sporangien abschließend hinsichtlich Bildung sowie Beweglichkeit von Zoosporen sowie hinsichtlich Keimschlauch-Bildung untersucht.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man das Getreidekorn in einer feuchten, eine subjektive Beobachtung mittels Auflichtmikroskop zulassenden Böttcherkammer anordnet

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man das Getreidekorn in einer feuchten, eine subjektive Beobachtung mittels Auflichtmikroskop zulassenden Probonkammer einer Mikrotestplatte anordnet.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß man als Substrat der Mikrokultur jeweils ein vorgequollenes Roggenkorn einsetzt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß man als Substrat der Mikrokultur jeweils ein vorgequollenes Gerstenkorn einsetzt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß man die Erst-Inkubation bei einer Temperatur von 16°C bis 2O⁰C für die Dauer von 6 Tagen bis 12 Tagen durchführt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, daß man die Erst-Inkubation im Falle des Testorganismus Phytophthora infestans bei einerTemperaturvon 19°C fürdie Dauervon 10 Tagen durchfuhrt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, daß man in der zweiphasigen Erst-Inkubation für jede der beiden Phasen eine Dauer von 3 Tagen bis 6 Tagen vorsieht.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 8, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Untersuchung der aus der inkubierten Mikrokultur entnommenen Mycelflöckchen mit Sporangien hinsichtlich Bildung und Beweglichkeit der Zoosporen eine etwa 2stündige Kurzzeit-Inkubation bei Temperaturen von 3⁰C bis 10⁰C, gefolgt von einer etwa 15minütigen Kurzzeit-Inkubation bei Temperaturen von 20⁰C bis 28 ⁰C durchführt (ZweiMnkubation).

10. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 8, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Untersuchung der aus der inkubierten Mikrokultur entnommenen Mycelflöckchen mit Sporangien hinsichtlich Keimschlauch-Bildung eine etwa 24stündige Inkubation bei Temperaturen von 20⁰C bis 28°C durchfuhrt (Zweit-Inkubation).

11. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 10, gekennzeichnet dadurch, daß man

— der inkubiorten Kontroll-Mikrokultur entnommene Mycelflöckchen mit Sporangien im Nachhinein mit Testsubstanz-Lösung bzw. -Suspensionen versetzt und

— gleichfalls die Untersuchungen hinsichtlich Bildung und Beweglichkeit von Zoosporen sowie hinsichtlich Keimschlauch-Bildung durchführt.