Hintergrund der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen von
Mikroorganismen, das beispielsweise für die Qualitätsüberwachung von
Waschwasser bei Halbleiter, für Diagnosen von infektiösen Erkrankungen, für
den Nachweis von Mikroorganismen aus der Umwelt, für die Prüfung auf
Mikroorganismen in Lebensmitteln, usw. eingesetzt werden.
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Mikroorganismen werden für verschiedene Aufgaben nachgewiesen, wie
beispielsweise für die Qualitätsüberwachung von Waschwasser bei Halbleitern,
für die Diagnosen infektiöser Erkrankungen, für den Nachweis von
Mikroorganismen aus der Umwelt und für die Prüfung auf Mikroorganismen in
Lebensmitteln.
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Als ein Verfahren zum Nachweisen von Mikroorganismen können
exemplifiziert werden: (1) Methode des Anlegens einer Kultur mit dem direkten
Zusetzen einer Probe zu einem Medium und Auszählen der so gebildeten
Kolonien; (2) Methode des Auszählens der Gesamtzellenzahl mit dem
Aufnehmen von Zellen in einer Probe auf einem Filter durch Filtern der Probe,
gefolgt von einem Fixieren, Fluorochromierung und Auszählen von Zellen durch
mikroskopische Untersuchung; (3) Methode der Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) mit dem Untersuchen des Vorhandenseins einer Charakteristik einer
Nucleinsäure-Kette (Polynucleotid) eines Stammes; (4) Methode der
Durchflusszytometrie mit Fluoreszenzmarkierung von Zellen, gefolgt von einem
Nachweis; (5) ATP-Nachweismethode mit dem Zählen von Zellen durch Nachweisen
von Adenosin-5'-triphosphat (ATP) in den Zellen. Diese Methoden haben alle
irgendein Problem und können keine Methoden darstellen, die einen leichten
und schnellen Nachweis erlauben.
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Beispielsweise ist die Methode des Anlegens einer Kultur insofern von
Nachteil, dass sie keinen schnellen Nachweis erlaubt, da das Anlegen einer
Kultur in der Regel 24 Stunden oder mehr erfordert (in einigen Fällen 1 Woche
oder mehr für den Nachweis von Eumyceten). Sie ist außerdem insofern von
Nachteil, dass, da einige Bakterien mit einer konventionellen Methode nicht in
Kultur genommen werden können, in einigen Fällen Mikroorganismen in einer
Probe übersehen werden. Die Methode des Auszählens der Gesamtzellenzahl
ist insofern von Nachteil, dass für das Zählen der Zellen aufwendige Geräte
benötigt werden, wie beispielsweise ein Fluoreszenzmikroskop, Bildanalyzer,
usw. Die PCR-Methode ist insofern von Nachteil, dass es schwierig ist, die
Gesamtzahl von Mikroorganismenzellen zu zählen. Die Methode der
Durchflusszlusszytometrie ist beispielsweise insofern von Nachteil, dass die
Nachweisgrenze von Mikroorganismen gering ist und dass die Genauigkeit der
Messung durch Störungen herabgesetzt wird, die auf ein Reagenz zum Fixieren
(z. B. Formalin) zurückzuführen sind. Die ATP-Nachweismethode ist insofern
von Nachteil, dass für den Nachweis ein aufwendiger Messapparat benötigt
wird.
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Zum Lösen dieser Probleme wurde eine Methode untersucht, welche
umfasst: Mischen einer Probe, die auf Mikroorganismen geprüft werden soll, mit
einer Insektenkörperflüssigkeit, die Faktoren vom inaktiven Typ der
Pro-Phenoloxidase-Kaskade enthält (die Insektenkörperflüssigkeit wird nachfolgend
abgekürzt als "PPO-Reagenz"), um diese zur Reaktion zu bringen; Untersuchen
beispielsweise des Grades der Verfärbung, die auf mindestens eine
Mikroorganismen-Zellwandkomponente zurückzuführen ist, wie beispielsweise (1→3)-
beta-D-Glucan (nachfolgend abgekürzt als "beta-Glucan") oder Peptidoglykan;
und Nachweisen der Mikroorganismen auf der Grundlage des
Untersuchungsergebnisses (siehe beispielsweise die WO 8302123). Diese Methode wird
jedoch nicht bevorzugt, da bei ihr beispielsweise die folgenden Probleme
auftreten. Da bei dieser Methode die Probe direkt mit dem PPO-Reagenz
gemischt wird, kann der Nachweis z. B. durch die Salz-Konzentration in der
Probe beeinträchtigt werden. Genauer gesagt, wird die
Nachweisempfindlichkeit, wenn die Salzkonzentration hoch ist, herabgesetzt, so dass zum
Festlegen der Nachweisbedingungen viel Arbeit erforderlich ist. Beim
Nahweisen von Mikroorganismen in einer Probe, die eine hohe Salz-Konzentration
aufweist, ist es in der Regel unvermeidbar, dass die Prüfung auf die
Mikroorganismen an der geeignet verdünnten Probe vorgenommen wird. Damit
werden Nachweisempfindlichkeit und Genauigkeit der Messung herabgesetzt.
Für den Fall einer Probe, die mit beta-Glucan kontaminiert ist, das nicht von
Mikroorganismen deriviert ist, kann das Nachweisergebnis unecht-positiv sein.
Zusammenfassung der Erfindung
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Angesichts derartiger Umstände besteht das durch die vorliegende
Erfindung zu lösende Problem in der Bereitstellung eines Verfahrens, das einen
leichten, schnellen und hochpräzisen Nachweis von Mikroorganismen in
verschiedenen Proben ermöglicht.
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Die vorliegende Erfindung gewährt ein Verfahren zum Nachweisen von
Mikroorganismen, welches Verfahren umfasst: Filtern einer Mikroorganismen
enthaltenden Probe durch ein Filter; Waschen des Filters; Umsetzen des
Rückstandes auf dem Filter mit einer Inskekten-Hämolymphe, die Faktoren vom
inaktiven Typ der Pro-Phenoloxidase-Kaskade enthält; sowie Nachweisen der
Mikroorganismen in der Probe auf der Grundlage der so hervorgerufenen
Farbänderung.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Es zeigen:
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Fig. 1 die Ergebnisse des Nachweises eines Lactobacillus delbrueckii,
die in Beispiel 1 erhalten wurden;
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Fig. 2 die Ergebnisse des Nachweises von Escherichia coli, die in
Beispiel 1 erhalten wurden;
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Fig. 3 die Ergebnisse des Nachweises von Escherichia coli, die in
Beispiel 2 erhalten wurden;
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Fig. 4 eine graphische Darstellung der Ergebnisse, erhalten in Beispiel 3
mit Proben, die Bacillus subtilis enthalten;
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Fig. 5 eine graphische Darstellung der Ergebnisse, erhalten in Beispiel 3
mit Proben, die Lactobacillus delbrueckii enthalten;
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Fig. 6 eine graphische Darstellung der Ergebnisse, erhalten in Beispiel 3
unter Verwendung verschiedener Arten von Bakterien;
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Fig. 7 eine graphische Darstellung der Ergebnisse, erhalten in Beispiel
4;
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Fig. 8 eine graphische Darstellung der Ergebnisse, erhalten in
Vergleichsbeispiel 3.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
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Das Verfahren zum Nachweisen von Mikroorganismen der vorliegenden
Erfindung umfasst: Filtern einer Probe durch ein Filter; Waschen des Filters;
Umsetzen des Rückstandes auf dem Filter mit einem PPO-Reagenz; sowie
Nachweisen von Mikroorganismen in der Probe auf der Grundlage der so
hervorgerufenen Farbänderung.
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Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage beispielsweise der
folgenden Ergebnisse erzielt, die von den Anmeldern der vorliegenden
Erfindung im Verlaufe eingehender Bemühungen zum Auffinden eines
Verfahrens erhalten wurden, das einen leichten, schnellen und hochpräzisen
Nachweis von Mikroorganismen in verschiedenen Proben unter Anwendung einer
PPO-Reagenz erlaubt. Wenn eine Probe durch ein Filter mit einer geeigneten
Porengröße gefiltert wird und das Filter gewaschen wird und danach einer
Reaktion mit einem PPO-Reagenz unterzogen wird, lassen sich die
nachfolgend beschriebenen Vorteile erlangen. (1) Es lassen sich ein oder mehrere
Ziel-Mikroorganismen leicht und schnell mit hoher Präzision ohne die folgenden
Probleme beim Einsatz eines PPO-Reagenz nachweisen: Der Nachweis wird in
der Regel durch die Salz-Konzentration einer Probe beeinflusst und die
Nachweisempfindlichkeit gesenkt, wenn die Salz-Konzentration hoch ist, so
dass beim Festlegen der Nachweisbedingungen sehr viel Aufwand erforderlich
ist; in einem solchen Fall, wo es unvermeidbar ist, dass die Prüfung auf
Mikroorganismen an einer geeignet verdünnten Probe ausgeführt wird, werden
die Nachweisempfindlichkeit und die Genauigkeit einer Messung herabgesetzt;
in dem Fall einer mit beta-Glucan kontaminierten Probe, die nicht von
Mikroorganismen herkommt, kann das Ergebnis des Nachweises unecht-positiv sein.
(2) Die Probe wird durch die Filtration durch das Filter angereichert, so dass die
Nachweisempfindlichkeit erhöht wird.
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Ein Probe, auf die das Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung
angewendet werden kann, ist so lange nicht speziell beschränkt, wie der
Nachweis der Anwesenheit von Mikroorganismen in der Probe erforderlich ist. Die
Probe schließt beispielsweise ein Waschwasser für Halbleiter,
Körperflüssigkeiten (z. B. Blut, Plasma, Serum und Cerebrospinal-Flüssigkeit), Urin,
Leitungswasser, Werksabgänge, Lebensmittel, Getränke, Lösungen nach dem
Waschen eines Instrumentes, wie beispielsweise einem Hämodialysator, einem
medizinischen Instrument, usw.
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Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Filter ist dennoch nicht
speziell beschränkt, solange er über eine geeignete Porengröße verfügt und
nicht mit dem PPO-Reagenz reagiert (oder mit diesem lediglich in einem
solchen Umfang reagiert, dass der Nachweis der Mikroorganismen nicht
behindert wird). Bevorzugte spezielle Beispiele des Filters sind
schichtenähnliche (folienähnliche) Filter, die aus einem Material hergestellt werden, wie
beispielsweise Poly(vinylidenfluorid), Polysulfon, Polytetrafluorethylen (PTFE),
Poly(vinylpyrrolidon) (PVP), Polyamid, Nylon oder ein Cellulose-Derivat (z. B.
Celluloseacetat, Cellulosenitrat oder eine Mischung davon), und der eine leichte
Bewertung einer durch die Reaktion von beta-Glucan und/oder Peptidoglykan
mit dem PPO-Reagenz hervorgerufenen Verfärbung ermöglicht. Ein aus dem
Cellulose-Derivat erzeugter Filter neigt in der Regel dazu, mit beta-Glucan
kontaminiert zu sein und muss daher, wenn ein solcher Filter wie vorgenannt
eingesetzt wird, überprüft werden, ob er kontaminiert ist oder nicht. Sofern er
kontaminiert ist, ist es wünschenswert, eine konventionelle Maßnahme zum
Beseitigen der Kontamination anzuwenden.
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Als der in der vorliegenden Erfindung verwendete Filter kann ein
kommerziell verfügbarer Filter in der vorliegenden Form verwendet werden.
Spezielle Beispiele des kommerziell verfügbaren Filters sind Durapore (ein
Poly(vinylidenfluorid)-Filter, hergestellt von der Japan Millipore Ltd.), HT-Tuffryn
(ein Polysulfon-Filter, hergestellt von der Gelman Sciences Inc.), Millex (ein
Polytetrafluorethylen-Filter, hergestellt von der Japan Millipore Ltd.), Isopore
(ein Poly(vinylpyrrolidon)-Filter, hergestellt von der Japan Millipore Ltd.), ein
Polyamid-Filter (verfügbar bei der Sartorius AG), ein Nylon-Filter (verfügbar bei
der Corning Inc.), Celluloseacetat-Filter und ein Cellulosenitrat-Filter (verfügbar
bei der Iwaki Glass Co., Ltd.) und MF-Millipore, ein Cellulose-Filter (verfügbar
bei der Japan Millipore Ltd.).
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In der vorliegenden Erfindung können die Arten der zu messenden
Mikroorganismen bis zu einem gewissen Maß durch geeignete Wahl der
Porengröße des verwendeten Filters festgelegt werden. Beispielsweise ist ein
Filter mit einer Porengröße von 0,2 Mikrometer oder 0,45 Mikrometer bevorzugt,
wenn der Nachweis von Bakterien und Eumyceten angestrebt wird. Wenn
der Nachweis von Eumyceten, wie beispielsweise Hefen und Schimmelpilze
angestrebt wird, wird ein Filter mit einer Porengröße von 1,2 Mikrometer bis 3
Mikrometer bevorzugt. Wenn der Nachweis von Schimmelpilzen angestrebt
wird, so wird ein Filter mit einer Porengröße von 5 Mikrometer oder mehr
bevorzugt. In einem Fall, bei dem eine Probe viele Arten von Mikroorganismen
enthält, einschließlich Bakterien, wird die Probe beispielsweise durch ein Filter
mit einer Porengröße von 1,2 Mikrometer bis 3 Mikrometer gefiltert, das Filtrat
durch ein Filter mit einer Porengröße von 0,2 Mikrometer oder 0,45 Mikrometer
gefiltert und der letztere Filter danach dem Nachweis nach der vorliegenden
Erfindung unterworfen, wobei lediglich die Bakterien unter den
Mikroorganismen nachgewiesen werden können.
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Als den Filter, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann
jeder der folgenden Typen verwendet werden: (1) Ein Produkt, das aus einem
schichtähnlichen Filter und einem Halter besteht, die voneinander getrennt sind
und so einzeln sterilisiert werden können; und (2) ein selbsttragender Typ, bei
dem es sich um ein wegwerfbares und sterilisiertes Produkt handelt. Es kann
auch eine mit einem Filter ausgestattete Mikrotiterplatte verwendet werden (z. B.
Multiscreen GV Filter Plate, hergestellt von der Japan Millipore Ltd.).
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Wenn ein derartiger Filter mit Peptidoglykan oder beta-Glucan
kontaminiert ist, ist es wünschenswert, eine konventionelle Maßnahme zur
Entfernung der Kontamination anzuwenden.
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Als das in der vorliegenden Erfindung verwendete PPO-Reagenz kann
jedes beliebige PPO-Reagenz verwendet werden, solange es aus der
Körperflüssigkeit eines Insektes erhalten wird, Faktoren vom inaktiven Typ der Pro-
Phenoloxidase-Kaskade enthält und mindestens einem der beta-Glucan und
Peptidoglykan reagieren kann, die in den Zellwänden von Mikroorganismen
vorhanden sind, um Phenoloxidase zu aktivieren. Da das PPO-Reagenz durch
die Reaktion mit beta-Glucan und/oder Peptidoglykan überdeckt ist, die in den
Zellwänden von Mikroorganismen vorhanden sein können, wird es für die
Aufgaben der vorliegenden Erfindung so verwendet, wie es vorliegt, obgleich es
eingesetzt werden kann, nachdem es in ein sogenanntes synthetisches
Substrat eingebaut worden ist, d. h. eine Substanz, die für ein Enzym ein
Substrat ist, das durch die Reaktion des PPO-Reagenz mit beta-Glucan
und/oder Peptidoglykan aktivierbar ist und aufgrund der Wirkung des Enzyms
eine geeignete, färbende Substanz o. dgl., einschließlich
Fluoreszens-Substanzen erzeugt.
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Das PPO-Reagenz wird in der Regel aus der Körperflüssigkeit eines
Insektes nach einem konventionellen Verfahren hergestellt, wobei das Reagenz
durch geeignete Kombination von Faktoren des inaktiven Typs der Pro-
Phenoloxidase-Kaskade hergestellt werden kann, die durch genetische
Rekombination erzeugt wird.
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Obgleich es in Bezug auf des Insekt, von dem die Körperflüssigkeit
gesammelt wird, keine spezielle Beschränkung gibt, ist es vorzugsweise so
groß wie möglich und kann mit Hilfe eines bewährten Verfahrens gezüchtet
werden. Als das Insekt sind beispielsweise einbezogen: Lepidoptera-Ordnung,
wie beispielsweise Manduca serta, Gelleria melonella, Hyalphoma ceropia,
Bombyx mori (Seidenspinnerraupe), usw.; Diptera-Ordnung, wie beispielsweise
Sarcophaga peregria, Musca, usw.; Orthoptera-Ordnung, wie beispielsweise
Locusta, Migratoria Teleogryllus, usw.; und Coleoptera-Ordnung, wie
beispielsweise Cerambyx, usw. Das Insekt ist auf diese nicht beschränkt. Als die
Körperflüssigkeit ist Hämolymphe am leichtesten verfügbar, die aus der
Körperhöhle aufgenommen wird und damit in der Regel verwendet werden kann.
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Als ein Verfahren zum Aufnehmen der Körperflüssigkeit aus dem
vorstehend exemplifizierten Insekt, läßt sich ein Verfahren als beispielhaft
nennen, bei dem das Insekt auf Eis gesetzt wird, um dessen Bewegung zu
stoppen, Injizieren des Körperhohlraums mit physiologischer Kochsalzlösung,
die Saccharose enthält, die einen Zuckerrohr-Faktor enthält, einschließend eine
hochmolekulare Substanz, die Glucose, Aminosäure und andere Komponenten
aufweist, die aus Zuckerrohr erhalten werden, und zwar als eine
Verunreinigung, oder physiologische Kochsalzlösung, die den Zuckerrohr-Faktor
selbst enthält, was dem Insekt ermöglicht, eine Zeit lang zu überdauern, wobei
danach Hämolymphe aus dem Körperhohlraum aufgenommen wird. Die so
erhaltene Hämolymphe wird zentrifugiert, um von den Hämocyten befreit zu
werden, und wird danach dialysiert, wodurch Plasma erhalten wird, das
erfindungsgemäß als das PPO-Reagenz verwendet werden kann. In diesem
Plasma gibt es eine Koexistenz mit einer Substanz, die spezifisch mit beta-
Glucan reagieren kann, um eine Enzymaktivität zu exhibieren oder die
Exhibition einzuleiten, sowie eine Substanz, die spezifisch mit Peptidoglykan
reagieren kann, um eine Enzymaktivität zu exhibieren oder diese Exhibition
einzuleiten. Wenn das Plasma daher als das PPO-Reagenz verwendet wird,
wird der Nachweis aller Mikroorganismen möglich, die beta-Glucan oder
Peptidoglykan als eine Zellwandkomponente enthalten. Als ein derartiges
Reagenz, kann ein kommerziell verfügbares Reagenz verwendet werden (z. B.
ein SLPTM-Reagenzkit, das bei der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.,
verfügbar ist).
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Durch geeignetes Behandeln des vorgenannten Insektenplasmas läßt
sich auch ein PPO-Reagenz erhalten, das mit beta-Glucan reagiert, nicht
jedoch mit Peptidoglykan; sowie ein PPO-Reagenz, das mit Peptidoglykan
reagiert, nicht jedoch mit beta-Glucan. Ein Beispiel für ein Verfahren zum
Herstellen des PPO-Reagenz, das einen spezifischen Nachweis von beta-
Glucan ermöglicht, wurde in der JP-A-63-141598 (US-P-4 970 152) offenbart,
und ein Beispiel für ein Verfahren zum Herstellen des PPO-Reagenz, das einen
spezifischen Nachweis von Peptidoglykan ermöglicht, wurde in der JP-A-63-
141599 (US-P-4 970 152) offenbart.
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Nachfolgend wird eine weitere Erläuterung dieser Verfahren gegeben.
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In dem in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltenen Plasma
besteht eine Koexistenz einer Substanz, die nicht mit Endotoxin reagiert, die
jedoch spezifisch mit beta-Glucan reagiert, um eine Enzymaktivität zu
exhibieren ohne die Exhibition einzuleiten; sowie einer Substanz, die spezifisch
mit Peptidoglykan reagiert, um eine Enzymaktivität zu exhibieren oder diese
Exhibition einzuleiten. Um das PPO-Reagenz zu erhalten, das den spezifischen
Nachweis von beta-Glucan erlaubt, reicht es aus, dass die Substanz, die mit
Peptidoglykan zur Exhibition einer Enzymaktivität oder zur Einleitung der
Exhibition reagieren kann, aus dem vorgenannten Plasma entfernt wird. Um
das PPO-Reagenz zu erhalten, das einen spezifischen Nachweis von
Peptidoglykan erlaubt, reicht es aus, dass die Substanz, die mit beta-Glucan zur
Exhibition einer Enzymaktivität oder zur Einleitung der Exhibition reagieren
kann, aus dem vorgenannten Plasma entfernt wird. Als ein Verfahren zum
Entfernen der Substanz aus dem vorgenannten Plasma, die zum reagieren mit
Peptidoglykan zur Exhibition einer Enzymaktivität oder zur Einleitung der
Exhibition in der Lage ist, oder der Substanz, die zum Reagieren mit beta-
Glucan zur Exhibition einer Enzymaktivität oder Einleitung dieser Exhibition in
der Lage ist, können alle Trennungs- und Reinigungsverfahren exemplifiziert
werden, die allgemein auf dem Gebiet der Biochemie eingesetzt werden. Die
Substanz, die mit Peptidoglykan reagieren kann, um eine Enzymaktivität zu
exhibieren oder die Exhibition einzuleiten, kann sehr leicht und wirksam mit
Hilfe einer Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Trägers entfernt
werden, der daran Peptidoglykan gebunden aufweist. Die Substanz, die mit
beta-Glucan reagieren kann, um eine Enzymaktivität zu exhibieren oder diese
Exhibition einzuleiten, kann sehr leicht und wirksam mit Hilfe einer
Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Trägers entfernt werden, der beta-
Glucan daran gebunden aufweist.
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Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird derzeit beispielsweise
folgendermaßen ausgeführt.
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Zunächst wird eine geeignete Menge einer Probe durch ein solches
geeignetes Filter filtriert, wie vorstehend beschrieben wurde, um
Mikroorganismen, einschließend Bakterien und Eumyceten (z. B. Hefe und
Schimmelpilze) auf dem Filter abzufangen. Danach wird das Filter mit einer geeigneten
Waschlösung gewaschen, um in der Probe vorhandene Substanzen mit
Ausnahme der Mikroorganismen zu entfernen. Es wird ein geeignetes Volumen
des vorstehend beschriebenen PPO-Reagenz auf das so behandelte Filter
getropft, damit die Reaktion unter festgelegten Bedingungen ablaufen kann,
z. B. bei 0ºC bis 50ºC und vorzugsweise 20ºC bis 40ºC, wonach die
Farbänderung des Filters bei dem Ablauf der Zeit untersucht wird. Es kann das
Vorhandensein von Mikroorganismen in der Probe nachgewiesen oder deren
Konzentration in der Probe auf der Grundlage der Differenz zwischen der
Farbänderung bestimmt werden, die in diesem Fall hervorgerufen wird und die
in einem jeweiligen Test mit negativem Kontrollserum hervorgerufen wird, der
mit dem gleichen Reagenz und der gleichen Prozedur wie vorstehend mit der
Ausnahme ausgeführt wird, dass als eine Probe Wasser, eine Pufferlösung
o. dgl. verwendet werden, die frei ist von beta-Glucan und Peptidoglykan; sowie
einem Test mit positivem Kontrollserum, der mit dem gleichen Reagenz und
nach der gleichen Prozedur wir vorstehend mit der Ausnahme ausgeführt wird,
dass eine Probelösung verwendet wird, die eine geeignete Konzentration von
Mikroorganismen enthält. In der vorgenannten Messung kann der
halbquantitative Nachweis der Mikroorganismen-Konzentration dadurch ermöglicht werden,
dass der Test mit positivem Kontrollserum variiert wird.
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In der vorstehenden Prozedur ist auch das Folgende möglich: Es wird
eine große Zahl von Proben filtriert, indem als ein Filter eine mit einem Filter
ausgestattete Mikrotiterplatte verwendet wird (z. B. Multiscreen GV Filter Plate,
hergestellt von der Japan Millipore Ltd.) und das Filter gewaschen wird und
danach einer Reaktion mit einem PPO-Reagenz unterzogen wird, wonach die
Farbänderung des Filters mit Hilfe einer Ablesevorrichtung für Mikrotiterplatten
untersucht wird und die Gegenwart von Mikroorganismen in der jeweiligen
Probe nachgewiesen oder deren Konzentration in der jeweiligen Probe auf der
Grundlage der Untersuchungsergebnisse bestimmt wird. Wenn die
Mikroorganismen mit Hilfe eines solchen Verfahrens nachgewiesen werden, läßt sich
ein objektiver Nachweis rasch in einer großen Zahl von Proben ausführen.
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Da darüber hinaus der vorgenannte Nachweis ausgeführt wird, indem
eine Probe durch ein Filter filtriert wird, das Filter gewaschen wird und das Filter
eine Reaktion mit einem PPO-Reagenz unterzogen wird, besteht zumeist keine
Möglichkeit dafür, dass Salze, wasserlösliches beta-Glucan u. dgl. in der Probe
den Nachweis beeinträchtigen können.
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Die in der vorgenannten Prozedur verwendete Waschlösung ist so lange
nicht speziell beschränkt, wie sie nicht mit beta-Glucan und Peptidoglykan
kontaminiert ist und die Funktionsmerkmale des Filters nicht beeinträchtigt.
Bevorzugte Beispiele für die Waschlösung sind Wasser und Lösungen mit
einem pH-Wert zwischen 6 und 8 und einem Gehalt von 10 bis 150 mMol und
vorzugsweise 20 bis 40 mMol eines Puffers (z. B. Good's-Puffer oder Phosphat-
Puffer) oder eines Salzes (z. B. NaCl).
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Ebenfalls ist es möglich, wasserunlösliches beta-Glucan auszuwaschen,
indem eine Alkalilösung (10 mMol bis 4 Mol und vorzugsweise 50 mMol bis 1
Mol) als die Waschlösung verwendet wird. Daher kann in einer Probe, von der
erwartet wird, dass sie wasserunlösliches beta-Glucan enthält, Peptidoglykan
aus Bakterien, das darin enthalten ist, spezifisch unter Anwendung eines
Verfahrens zum Waschen des Filters mit einer solchen Waschlösung und
nachfolgend wahlweise einer solchen üblichen Waschlösung nachgewiesen
werden, wie sie vorstehend beschrieben wurde.
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Bei dem Nachweis von Bakterien oder Eumyceten in einer Probe, die ein
Lipid enthält (z. B. kosmetische Creme, Creme für Nahrungsmittel, usw.), oder
einer Probe, die ein organisches Lösemittel enthält, kann der Einfluß dieser in
den Proben vorhandenen Substanzen beseitigt werden, indem das Filter unter
Verwendung eines geeigneten organischen Lösemittels als eine Waschlösung
gewaschen wird und danach das Filter mit einer solchen üblichen Waschlösung
gewaschen wird, wie sie vorstehend beschrieben wurde.
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Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend im weiteren Detail unter
Heranziehung von "Beispielen und Vergleichsbeispielen" veranschaulicht, die in
keiner Weise einschränkend sind, sondern lediglich der Veranschaulichung
dienen.
Beispiel 1
(1) Reagenzien und Instrument
· PPO-Reagenz
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Es wurde eine Lösung verwendet, die durch Auflösen eines kommerziell
verfügbaren PPO-Reagenz hergestellt wurde, das von
Seidenraupen-Hämolymphe (SLPTM-Reagenz, verfügbar bei der Wako Pure Chemical Industries,
Ltd.; für 3 ml) in 6 ml eines Lösemittels hergeleitet wurde, das dem Reagenz-
Zubehör beigefügt war (verfügbar bei der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
· Filter
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Es wurde Millex 4 mm GV (hergestellt von der Japan Millipore Ltd.)
verwendet.
· Wasser und Waschlösung
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Es wurde für die Injektion Wasser verwendet, das von Otsuka
Pharmaceutical Co., Ltd., erzeugt wurde.
· 3-prozentige wässrige Natriumchlorid-Lösung
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Es wurde eine Lösung verwendet, die durch Auflösen von Natriumchlorid
(hergestellt von der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; spezieller Reinheitsgrad)
und durch Wärmebehandlung bei 250ºC für 2 Stunden in Wasser zur
Injektion mit einer Konzentration von 3 Prozent hergestellt wurde.
(2) Proben
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Als Proben wurden Suspensionen verwendet, die durch Suspendieren
eines Milchsäure-Bakteriums (Lactobacillus delbrueckii) oder E. coli in einer
Menge von 10³, 10&sup4; oder 10&sup5; Zellen/ml in Wasser zur Injektion oder einer 3-
prozentigen wässrigen Natriumchlorid-Lösung hergestellt wurden.
(3) Nachweisverfahren
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Das Filter wurde mit 2 ml Waschlösung gewaschen und danach 1 ml der
jeweiligen vorbestimmten Proben durch das gewaschene Filter filtriert. Dieses
Filter wurde mit 2 ml Waschlösung gewaschen, wonach 0,01 ml des PPO-
Reagenz aufgetropft und der Grad der Färbung des Filters visuell untersucht
wurde.
(4) Ergebnisse
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Fig. 1 zeigt die erhaltenen Ergebnisse unter Verwendung der L.
delbrueckii-Suspensionen mit verschiedenen Konzentrationen, die unter
Verwendung von Wasser als Proben hergestellt wurden. Fig. 2 zeigt die
erhaltenen Ergebnisse unter Verwendung der E. coli-Suspensionen mit
verschiedenen Konzentrationen, die durch Verwendung von Wasser zur Injektion als
Proben hergestellt wurden. Fig. 1 und Fig. 2 zeigen jeweils auch Ergebnisse
eines Tests mit negativem Kontrollserum (NC), der zum Vergleich unter
Verwendung des gleichen Wassers als Probe ausgeführt wurde, das zur
Herstellung der verschiedenen Proben verwendet wurde.
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Aus Fig. 1 und Fig. 2 ist ersichtlich, dass das Filter mit darauf durch die
Filtration zurückgehaltenen Zellen eine eindeutig raschere Färbung zeigt, als
das bei dem Filter der Fall ist, das mit dem Test mit negativem Kontrollserum
(NC) behandelt wurde, wodurch es möglich wird, einzuschätzen, ob die
Reaktion 10 bis 20 Minuten nach der Einleitung der Reaktion positiv oder
negativ ist. Ebenfalls ist ersichtlich, dass L. delbrueckii selbst bei einer Dichte
von 10³ Zellen/ml und E. coli sogar bei einer Dichte von 10&sup4; Zellen/ml
nachgewiesen werden können.
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Bei Verwendung der Proben, die unter Verwendung einer 3-prozentigen
wässrigen Natriumchlorid-Lösung hergestellt wurden, wurden die gleichen
Ergebnisse wie vorstehend erhalten.
Vergleichsbeispiel 1
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Nachweis von Mikroorganismen nach einem bekannten Verfahren
(1) Reagenzien und Instrument
PPO-Reagenz
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Es wurde das Gleiche wie in Beispiel 1 verwendet.
· Wasser
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Es wurde das gleiche wie in Beispiel 1 verwendet.
· 3-prozentige wässrige Natriumchlorid-Lösung
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Es wurde das gleiche wie in Beispiel 1 verwendet.
· Messapparat
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Es wurde das Toxinometer "ET-301" (hergestellt von der Wako Pure
Chemical Industries, Ltd.) verwendet.
(2) Proben
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Es wurden die Gleichen wie in Beispiel 1 verwendet.
(3) Nachweisverfahren
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Nach dem Mischen und Rühren von 0,1 ml des PPO-Reagenz und 0,1
ml einer Probe, die L. delbrueckii oder E. coli mit einer Dichte von 104 Zellen/ml
enthielt, wurde mit Hilfe des Toxinometers "ET-301" ein Tg-Wert gemessen (die
für die durchgelassene Lichtmenge zum Erreichen eines vorbestimmten,
festgelegten Wertes erforderliche Zeit).
(4) Ergebnisse
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Wurden als eine Probe eine jeweilige L. delbrueckii-Suspension und eine
E. coli-Suspension verwendet, die unter Verwendung von Wasser hergestellt
wurden, so betrug der Tg-Wert für L. delbrueckii 32,4 Minuten und der Tg-Wert
für E. coli 59,4 Minuten. Daraus ist ersichtlich, dass im Fall dieser Proben die
Reaktion innerhalb der Messzeit von 90 Minuten als positiv bewertet werden
kann. Wenn andererseits als Probe die jeweilige L. delbrueckii-Suspension und
E. coli-Suspension verwendet wurden, die unter Verwendung einer 3-
prozentigen wässrigen Natriumchlorid-Lösung hergestellt wurden, so ließ sich
weder für L. delbrueckii noch für E. coli innerhalb einer Messzeit von 90
Minuten ein Tg-Wert erhalten. Daher wurde in dem Fall dieser Proben die
Reaktion nicht als positiv bewertet.
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Wenn die gleiche Messung wie vorstehend als ein Test mit negativem
Kontrollserum ausgeführt wurde, indem als eine Probe jeweils das gleiche
Wasser zur Injektion und 3-prozentige wässrige Natriumchlorid-Lösung
verwendet wurden, wie sie zur Herstellung der Proben verwendet wurden,
konnte kein Tg-Wert erhalten werden, so dass in keinem der Fälle die Reaktion
nicht als positiv bewertet wurde.
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Aus den Ergebnissen von Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1 ist
ersichtlich, dass die Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung den
Nachweis von Mikroorganismen in einer Lösung mit einer hohen Salz-
Konzentration ermöglicht, die mit Hilfe eines konventionellen Verfahrens nicht
nachgewiesen werden können.
Beispiel 2
(1) Reagenzien und Instrument
· PPO-Reagenz
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Als ein PPO-Reagenz wurde eine Lösung verwendet, die durch Auflösen
eines kommerziell verfügbaren PPO-Reagenz hergestellt wurde, das von
Seidenraupen-Hämolymphe (SLPTM-Reagenz, verfügbar bei der Wako Pure
Chemical Industries, Ltd.; für 3 ml) in 6 ml eines Lösemittels abgenommen
wurde, das dem Reagenz-Zubehör beigefügt war (verfügbar bei der Wako Pure
Chemical Industries, Ltd.).
· Filter
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Es wurden sterile Einweg-Spritzenfilter 3 ml verwendet (eine Nylonfolie,
hergestellt von der Corning Inc.).
· Wasser und Waschlösung
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Es wurde Wasser zur Injektion verwendet, hergestellt von der Otsuka
Pharmaceutical Co., Ltd.
· Lösung nach Waschen eines Hämodialysators
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Es wurde ein Hämodialysator, der "Acetate Hollow Fiber" (FB-70A,
hergestellt von Nipro Corp.) aufwies, mit Wasser für Injektion gefüllt und bei
Raumtemperatur für 1 Stunde stehengelassen, wonach das eingefüllte Wasser
als eine Lösung nach Waschen des Hämodyalisators herausgenommen würde.
(2) Proben
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Als Proben wurden mit einer Dichte von 10&sup4; Zellen/ml Suspensionen
verwendet, die durch Suspendieren von E. coli in Wasser oder einer Lösung
nach Waschen des Hämodialysators hergestellt wurden.
(3) Nachweisverfahren
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Das Filter wurde mit 2 ml der Waschlösung gewaschen und danach 0,5
ml jeder Probe durch das gewaschene Filter filtriert. Dieses Filter wurde mit 2
ml der Waschlösung gewaschen, wonach 0,01 ml des PPO-Reagenz
aufgetropft wurden und der Färbungsgrad des Filters visuell untersucht wurde.
(4) Ergebnisse
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Fig. 3 zeigt die Ergebnisse des Nachweises, die unter Verwendung der
E. coli-Suspension erhalten wurden (hergestellt unter Verwendung von
Wasser). Fig. 3 zeigt außerdem Ergebnisse eines Tests mit negativem
Kontrollserum (NC) der zum Vergleich unter Verwendung des gleichen Wassers als
eine Probe verwendet wurde, wie es zur Herstellung der vorgenannten Probe
verwendet wurde.
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Aus Fig. 3 ist ersichtlich, dass das Filter mit darauf durch Filtration
zurückgehaltenen Zellen eine eindeutig schnellere Färbung zeigt, als dies bei
dem nach dem Test mit negativem Kontrollserum (NC) behandelten Filter der
Fall ist, wodurch es möglich wird, das Vorhandensein von E. coli bei einer
Dichte von 10&sup4; Zellen/ml zu bewerten und zu bewerten, ob die Reaktion 20
Minuten nach der Einleitung der Reaktion positiv oder negativ ist.
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Bei Verwendung der Probe, die unter Verwendung der Lösung nach
Waschen des Hämodialysators hergestellt wurde, wurden die gleichen
Ergebnisse wie vorstehend erhalten.
Vergleichsbeispiel 2
Nachweis von Mikroorganismen nach einem bekannten Verfahren
(1) Reagenzien und Instrument
· PPO-Reagenz
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Es wurde das Gleiche verwendet wie in Beispiel 2.
· Wasser
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Es wurde das Gleiche verwendet wie in Beispiel 2.
· Lösung nach Waschen eines Hämodialysators
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Es wurde die Gleiche verwendet wie in Beispiel 2.
· Messapparat
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Es wurde das Toxinometer "ET-301" (hergestellt von der Wako Pure
Chemical Industries, Ltd.) verwendet.
(2) Proben
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Es wurden die Gleichen wie in Beispiel 2 verwendet.
(3) Nachweisverfahren
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Nachdem 0,1 ml des PPO-Reagenz und 0,1 ml der jeweiligen Probe
gemischt und gerührt wurden, wurde mit Hilfe des Toxinometers "ET-301" ein
Tg-Wert gemessen (die für die durchgelassene Lichtmenge zum Erreichen
eines vorbestimmten, festgelegten Wertes erforderliche Zeit)
(4) Ergebnisse
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Wenn als eine Probe eine E. coli-Suspension verwendet wurde, die unter
Verwendung von Wasser hergestellt wurde, wurde ein Tg-Wert von 59,4
Minuten erhalten. Wenn das gleiche Wasser zum Herstellen der E. coli-
Suspension als eine Probe für eine negative Kontrolle verwendet wurde, konnte
innerhalb einer Messzeit von 90 Minuten kein Tg-Wert erhalten werden. Aus
diesen Tatsachen ist ersichtlich, dass im Fall der E. coli-Suspension, die unter
Verwendung von Wasser hergestellt wurde, die Möglichkeit zur Bewertung
besteht, ob die Reaktion innerhalb einer Messzeit von 90 Minuten positiv oder
negativ ist.
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Andererseits wurde sowohl ein Tg-Wert von etwa 6 Minuten erhalten,
wenn eine E. coli-Suspension als eine Probe verwendet wurde, die unter
Verwendung der Lösung nach dem Waschen des Hämodialysators hergestellt
wurde, als auch dann, wenn die gleiche Lösung nach dem Waschen des
Hämodialysators, wie sie zur Herstellung der E. coli-Suspension verwendet
wurde, als eine Probe für eine negative Kontrolle verwendet wurde. Damit ist
festgestellt worden, dass die Anwesenheit von Mikroorganismen in der Probe
(die E. coli-Suspension) nicht nachgewiesen werden kann. Man kann vermuten,
dass dieses Ergebnis eine Folge der Auflösung von beta-Glucan in der Lösung
nach dem Waschen des Hämodialysators ist.
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Aus den Ergebnissen von Beispiel 2 und Vergleichsbeispiel 2 ist
ersichtlich, dass die Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung
den Nachweis von Mikroorganismen in der Lösung nach dem Waschen des
Hämodialysators ermöglicht, die mit Hilfe eines konventionellen Verfahrens
nicht nachgewiesen werden können.
Beispiel 3
(1) Reagenzien und Instrument
· PPO-Reagenz
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Es wurde eine Lösung verwendet, die durch Auflösen eines kommerziell
verfügbaren PPO-Reagenz hergestellt wurde, das von
Seidenraupen-Hämolymphe abgenommen wurde (SLPTM-Reagenz, verfügbar bei der Wako Pure
Chemical Industries, Ltd.; für 3 ml), und zwar in 6 ml eines Lösemittels, das
einem SLPTM-Reagenz-Zubehör beigefügt war (verfügbar bei der Wako Pure
Chemical Industries, Ltd.).
· Filter
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Es wurde eine "Multiscreen GV-Filterplatte" verwendet (verfügbar bei der
Japan Millipore Ltd.).
· Wasser und Waschlösung
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Es wurde Wasser zur Injektion verwendet, hergestellt von der Otsuka
Pharmaceutical Co., Ltd.
(2) Proben
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Als Proben wurden Suspensionen verwendet, die durch Suspendieren
vorbestimmter Bakterien in Wasser zur Injektion hergestellt wurden, um so
vorbestimmte Konzentrationen (Zellen/ml) zu erhalten.
(3) Nachweisverfahren
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Zum Filtrieren von 0,2 ml einer Probe wurde eine "Multiscreen GV-
Filterplatte" verwendet, die mit 0,2 ml Waschlösung gewaschen wurde. Nach
dem Filtrieren von 0,2 ml Waschwasser wurde ein Folienblatt auf dem Boden
der Filterplatte adhäriert. Danach wurden 0,1 ml der PPO-Reagenz in eine
Mulde aufgetropft und einer Messung der Änderungen des
Absorptionsvermögens bei 650 nm unterzogen, indem eine Mikroplatten-Ablesevorrichtang
("Spectra Max 250", eine Handelsbezeichnung, hergestellt von der Molecular
Devices Co.) bei 30ºC verwendet wurde, um die Einsetzzeit zu erhalten (eine
erforderliche Reaktionsdauer für das Erreichen des vorbestimmten OD
(dekadisches Absorptionsmaß)-Wertes von 0,2 bei 650 nm.
(4) Ergebnisse
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Fig. 4 zeigt die Ergebnisse von Proben, die Bacillus subtilis enthalten.
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Fig. 5 zeigt die Ergebnisse von Proben, die Lactobacillus delbrueckii enthalten.
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Fig. 6 zeigt die Ergebnisse von Proben, die verschiedene Bakterien enthalten.
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In Fig. 6 zeigt die Kurve - - die Ergebnisse von Proben, die
Streptococcus mutans enthalten, die zu Gram-positive Bakterien gehören; die
Kurve - - zeigt die Ergebnisse von Proben, die Staphylococcus aureus
enthalten, die zu Gram-positiven Bakterien gehören; die Kurve - - zeigt die
Ergebnisse von Proben, die Aeromonas hydrophila enthalten, die zu Gram-
negativen Bakterien gehören; und die Kurve -Δ- zeigt die Ergebnisse von
Proben, die Vibrio parahämomolyticus enthalten, die zu Gramnegativen
Bakterien gehören.
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Wie aus den Ergebnissen von Fig. 4 bis Fig. 6 ersichtlich, ist es möglich,
Konzentrationen (Zellen/ml) von verschiedenen Bakterien in Proben
entsprechend der vorliegenden Erfindung nachzuweisen.
Beispiel 4
(1) Reagenz und Instrument
· PPO-Reagenz
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Es wurde das Gleiche verwendet wie in Beispiel 3.
· Filter
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Es wurde das Gleiche verwendet wie in Beispiel 3.
· Wasser und Waschlösung
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Es wurden die Gleichen verwendet wie in Beispiel 3.
(2) Proben
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Es wurden Proben hergestellt, indem vorbestimmte Bakterien in Wasser
zur Injektion suspendiert wurden, die eine vorbestimmte Konzentration von
NaCl enthielten, so dass eine vorbestimmte Konzentration (Zellen/ml) erhalten
wurde.
(3) Nachweisverfahren
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Zum Filtrieren von 0,2 ml einer Probe wurde eine "Multiscreen GV-
Filterplatte" verwendet, die mit 0,2 ml einer Waschlösung gewaschen wurde.
Nach dem Filtrieren von 0,2 ml eines Waschwassers wurde ein Folienblatt an
dem Boden der Filterplatte adhäriert. Danach wurden 0,1 ml der PPO-Reagenz
in einer Mulde aufgetropft und einer Messung der Änderungen des
Absorptionsvermögens bei 650 nm unterzogen, indem eine Mikroplatten-Ablesevorrichtung
(Spectra Max 250, eine Handelsbezeichnung, hergestellt von Molecular
Devices Co.) bei 30ºC verwendet wurde, um die Einsetzzeit zu erhalten
(erforderliche Reaktionsdauer für das Erreichen der vorbestimmten OD-Werte
von 0,2 bei 650 nm).
(4) Ergebnisse
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Die Ergebnisse sind in Fig. 7 gezeigt. In Fig. 7 zeigt die Kurve -O- die
erhaltenen Ergebnisse, indem Proben verwendet wurden, die kein NaCl
enthielten; die Kurve - - zeigt die Ergebnisse, die unter Verwendung von
Proben erhalten wurden, die 100 mMol NaCl enthielten; und die Kurve -Δ- zeigt
die Ergebnisse, die unter Verwendung von Proben erhalten wurden, die 200 ml
NaCl enthielten.
Vergleichsbeispiel 3
Nachweis von Mikroorganismen nach einem bekannten Verfahren
(1) Reagenzien und Instrument
· PPO-Reagenz
-
Es wurde das Gleiche verwendet wie in Beispiel 4.
· Wasser
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Es wurde das Gleiche verwendet wie in Beispiel 4.
· Mikroplatte
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Es wurde die "Microplate 96 Well" mit Deckel (3860-096) verwendet
(hergestellt von der Iwaki Glass Co., Ltd.).
(2) Proben
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Die Proben wurden in der gleichen Weise hergestellt wie in Beispiel 4
beschrieben wurden, mit der Ausnahme der Änderung der Konzentrationen von
NaCl.
(3) Nachweisverfahren
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Nach dem Mischen von 0,1 ml des PPO-Reagenz und von 0,1 ml einer
Probe wurden die Änderungen des Absorptionsvermögens bei 650 nm unter
Verwendung einer Mikroplatten-Ablesevorrichtung (Spectra Max 250, eine
Handelsbezeichnung, hergestellt von der Molecular Devices Co.) bei 30ºC
gemessen, um die Einsetzzeit zu erhalten (eine erforderliche Reaktionsdauer
für das Erreichen des vorbestimmten OD-Wertes von 0,2 bei 650 nm).
(4) Ergebnisse
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Die Ergebnisse sind in Fig. 8 gezeigt. In Fig. 8 zeigt die Kurve -O- die
Ergebnisse, die unter Verwendung von Proben erhalten wurden, die kein NaCl
enthielten; die Kurve - - zeigt die Ergebnisse, die unter Verwendung von
Proben erhalten wurden, die 25 mMol NaCl enthielten; die Kurve - - zeigt die
Ergebnisse, die unter Verwendung von Proben erhalten wurde, die 50 mMol
NaCl enthielten; und die Kurve - - zeigt die Ergebnisse, die unter Verwendung
von Proben erhalten wurden, die 100 mMol NaCl enthielten.
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Aus dem Vergleich der Ergebnisse, die in Fig. 7 und 8 gezeigt werden,
ist ersichtlich, dass es nach der vorliegenden Erfindung möglich ist,
Mikroorganismen in Proben nachzuweisen, die hohe Salz-Konzentrationen enthalten,
und zwar im Gegensatz zu dem bekannten Verfahren, bei dem der Nachweis
unmöglich ist.
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Wie vorstehend beschrieben, gewährt die vorliegenden Erfindung ein
Verfahren, das den leichten, schnellen und hochpräzisen Nachweis von
Mikroorganismen in verschiedenen Proben ermöglicht. Der Nachweis von
Mikroorganismen in verschiedenen Proben durch das Nachweisverfahren der
vorliegenden Erfindung führt zu den gekennzeichneten Auswirkungen, die
nachfolgend beschrieben werden und die nicht mit Hilfe eines konventionellen
Verfahren zu Stande gebracht werden. Die vorliegende Erfindung leistet daher
einen wesentlichen Beitrag auf diesem Fachgebiet.
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(1) Mikroorganismen können schnell nachgewiesen werden.
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Der Nachweis kann innerhalb mehrerer Stunden beendet werden.
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(2) Der Nachweis wird nicht durch Substanzen beeinflusst, die in einer
Probe gemeinsam mit Mikroorganismen vorhanden sind.
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In der Regel wird ein PPO-Reagenz von der Salz-Konzentration und
freiem beta-Glucan in der Probe beeinflusst, was zu einer verminderten
Messempfindlichkeit führt. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann
jedoch diesen Einfluss beseitigen, da es einen Waschprozess mit einbezieht.
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(3) Mikroorganismen in einer Probe können durch Filtration angereichert
werden.
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Da die Probe durch ein Filter filtriert wird, werden die Mikroorganismen in
der Probe angereichert, so dass die Nachweisempfindlichkeit erhöht werden
kann.
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(4) Es können ebenfalls eine quantitative Bestimmung und ein qualitativer
Test (Grenzwertprüfung) durch geeignete Erhöhung der Zahl der positiven
Kontrolle ausgeführt werden.
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(5) Es können sowohl Lebendzellen als auch Totzellen nachgewiesen
werden.
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(6) Ebenfalls können Gram-positive Bakterien nachgewiesen werden.
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(7) Der Nachweis wird nicht durch ein Lösemittel beeinflusst, das zur
Herstellung der Proben verwendet wird.
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Selbst in einem Fall einer Probe, die lediglich in einem organischen
Lösemittel löslich ist, kann ein objektiver Nachweis ohne irgend ein Einfluss auf
das organische Lösemittel ausgeführt werden, indem zuvor eine Filtration durch
ein Filter und ein Waschen mit einer Waschlösung ausgeführt werden.
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(8) Bakterien oder Eumyceten oder beide können durch Änderung der Art
eines PPO-Reagenz gemessen werden. Beispielsweise können Bakterien und
Eumyceten unter Verwendung eines PPO-Reagenz gemessen werden, das mit
beta-Glucan und Peptidoglykan reaktionsfähig ist.
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Unter Verwendung eines PPO-Reagenz, das mit beta-Glucan
reaktionsfähig ist, nicht jedoch mit Peptidoglykan, können Eumiceten gemessen werden.
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Unter Verwendung eines PPO-Reagenz, das mit Peptidoglykan
reaktionsfähig ist, nicht jedoch mit beta-Glucan, können Bakterien gemessen
werden.
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(9) Die nachzuweisenden Mikroorganismen können durch Änderung der
Porengröße eines Filters gewählt werden.
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Wenn beispielsweise der Nachweis von Bakterien und Eumyceten
angestrebt wird, wird ein Filter mit einer Porengröße von 0,2 Mikrometer oder
0,45 Mikrometer bevorzugt. Wenn der Nachweis von Eumyceten angestrebt
wird, wie beispielsweise von Hefen und Schimmelpilzen, wird ein Filter mit einer
Porengröße von 1,2 Mikrometer bis 3 Mikrometer bevorzugt. Wenn der
Nachweis von Schimmelpilzen angestrebt wird, wird ein Filter mit einer
Porengröße von 5 Mikrometer oder mehr bevorzugt. Ausschließlich Bakterien
können auf einer Probe nachgewiesen werden, die eine Vielzahl von Vertretern
von Mikroorganismen, einschließlich Bakterien, enthält, indem beispielsweise
eine Probe durch ein Filter mit einer Porengröße von 1,2 Mikrometer bis 3
Mikrometer filtriert wird, das Filtrat durch ein Filter mit einer Porengröße von 0,2
Mikrometer oder 0,45 Mikrometer filtriert wird und danach die Mikroorganismen
unter Verwendung des letzteren Filters nachgewiesen werden.