DE2829316A1 - Verfahren zum nachweis und zur untersuchung von zellulaerer aktivitaet und mittel zur durchfuehrung des verfahrens - Google Patents

Verfahren zum nachweis und zur untersuchung von zellulaerer aktivitaet und mittel zur durchfuehrung des verfahrens

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DE2829316A1
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DE19782829316
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Guy-Alain Junter
Jean-Francois Lemeland
Eric Selegny
Jean-Claude Vincent
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    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Description

"Verfahren zum Nachweis und zur Untersuchung von zellulärer Aktivität und Mittel zur Durchführung des Verfahrens"
Die Erfindung betrifft die Untersuchung einer gegebenenfalls vorhandenen Zellaktivität in einem Medium. Insbesondere betrifft die Erfindung ein potentiometriscb.es Verfahren zur Untersuchung der Zellaktivität, insbesondere von bakterieller Aktivität, in unterschiedlichen flüssigen Medien.
Zur Untersuchung von bakteriellen Verunreinigungen in verschiedenen Medien, wie Wasser, beispielsweise Flusswasser oder Leitungswasser, biologischen Flüssigkeiten, beispielsweise Blut oder Urin, und Genussmitteln, beispielsweise Getränken und Nahrungsmitteln, gibt es Nachweisverfahren, die häufig schwierig durchführbar sind und nicht immer die gewünschte Zuverlässigkeit aufweisen.
Beispielsweise besteht ein gegenwärtig angewendetes Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung einer eventu-
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eilen Verunreinigung in Wasser oder biologischen Flüssigkeiten darin, dass man aus dem vermutlich verunreinigten Medium eine Probe entnimmt, eine "bestimmte Menge davon auf ein festes Nährmedium bringt und die Anzahl der Kolonien nach 2Pt- oder 4-8-stündiger Inkubation bei 37°C zählt. Nach Feststellung einer Verunreinigung ist es dann möglich,im Fall von biologischen Flüssigkeiten den gleichen Versuch auf Nährmedien zu wiederholen, die verschiedene Antibiotika enthalten. Durch Feststellung der Medien, in denen sich keine Kolonien von Mikroorganismen entwickeln,wird ein Antibiogramm erstellt.
Diese Verfahren sind jedoch kompliziert und zeitaufwendig.
Es dauert bis zu 24- Stunden und darüber, bis die Untersuchungs ergebnisse zur Verfügung stehen. Dies stellt insbesondere bei Routineuntersuchungen eine Schwierigkeit dar, beispielsweise bei einer laufenden systematischen Überwachung von Trinkwasser oder Nahrungsmitteln auf eine bakterielle Verschmutzung.
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Aus diesem Grund wurde versucht, Verfahren zum Nachweis und sogar zur Identifizierung von in den verschiedensten Medien eventuell enthaltenen Bakterien zur Verfügung zu stellen, die einfach und rasch ablaufen und das gewünschte Mass an Zuverlässigkeit bieten.
Zu diesen Verfahren gehören auch die potentiometrischen Messmethoden. Beispielsweise wurde vorgeschlagen,die Fähigkeit bestimmter Bakterien, wie Escherichia coli oder Proteus,zur Bildung von Wasserstoff in Nährmedien während bestimmter Entwicklungsstadien zu einer potentiometrischen Bestimmung auszunutzen und dabei die Potentialänderung zwischen einer mit dem Medium in Kontakt stehenden Messelektrode und einer Bezugselektrode zu bestimmen. Es wurde insbesondere festgestellt, dass es eine logarithmische Beziehung zwischen der Menge des
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1 Inokulums einerseits und der Zeitspanne, bis
nach der Inokulation ein potentiometrisch.es Signal erscheint (Latenzzeit), andererseits "besteht.
Dieses Signal tritt aber nur in seltenen Fällen klar auf,
so dass sich Ungenauigkexten ergeben, die der Entwicklung
eines derartigen Verfahrens entgegenstehen. Ausserdem. ist
dieses Verfahren nur auf Bakterien anwendbar, die zur Bildung von Wasserstoff befähigt sind.
10
Andere, kaum über das Versuchsstadium hinausgekommene Verfahren stützen sich auf den potentiometrischen Nachweis
von Redoxreaktionen, die in den Mikroorganismen ablaufen und die durch in der Umgebung vorhandenen Sauerstoff perfekt
beeinflusst werden können.
Die Bestimmung entsprechender Redoxpotenfciale gilt bis heute als äusserst schwierig, was unter anderem darauf zurückzuführen sein dürfte, dass die verschiedenen Bestandteile, die in den Bakterien-Nährlösungen (zahlreiche Proteine, Mineralsalze und Wachstumsfaktoren) verwendet werden, keine präzise Aussage darüber erlauben, worauf die zu beobachtenden Potentialverschiebungen zurückzuführen sind. Ein derartiges Verfahren wird beispielsweise in einer Veröffentlichung der NASA beschrieben; vgl. NASA TECH BRIEF, Goddard Space Flight
Center, B-73-1004-5, Februar 1973· Ziel dieses Verfahrens ist es, die Anwesenheit von Bakterien in einem Medium, das sich
bei etwa 37°C in einem geschlossenen Raum befindet , nachzuweisen. Dabei bedient man sich der Änderung der Potentialdifferenz, die zwischen zwei eingetauchten Elektroden aufgrund des Verbrauchs von ursprünglich im Medium vorhandenem
Sauerstoff entsteht. Die Autoren führen jedoch in dieser
Veröffentlichung aus, dass die erforderliche Vorrichtung.zum „
sein muß
Nachweis der PotentialVeränderungen äusserst empfindlich/und insbesondere zum Nachweis einer Änderung von 1 mV in der
Lage sein muss . '
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Es ist klar,: dass eine derart hohe Empfindlichkeit der Einführung dieses Verfahrens in die Praxis, wo kein hochspezialisiertes Personal zur Verfugung steht, entgegensteht.
Die Erfindung "beruht auf dem Befund, dass bestimmte Stoffwechselvorgänge auf chemischem Wege "beträchtlich verstärkt werden können, so -dass die Vorgänge mit gebräuchlichen Vorrichtungen leicht erkennbar werden. Somit wird breiten Kreisen ein Verfahren zur Verfügung gestellt, mit dem eine ϊ° Untersuchung des Verhaltens von Mikroorganismen, die sich in einem Medium vermehren lassen, ermöglicht wird.
Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen
definiert. 15
Als Beispiele für entsprechende Zellen werden Bakterien genannt. Das erfindungsgemässe Verfahren kann aber auch für andere Zellformen, einschliesslich Eukaryoten, verwendet werden. Das erfindungsgemässe Verfahren lässt sich auch mit Vorteil auf die Untersuchung von sämtlichen zellähnlichen Gebilden oderZellfraktionen anwenden, die eine Stoffwechselaktivität aufweisen und insbesondere in der Lage sind, ein Substrat in Gegenwart eines Bestandteils, der ebenfalls im Medium vorhanden ist oder in diesem freigesetzt werden kann und der in einer oxidierten und in einer reduzierten Form auftreten kann, umzuwandeln oder zu verbrauchen. Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht somit auch die Untersuchung einer derartigen Umwandlung oder eines derartigen Verbrauchs eines Substrats, da damit eine mögliche Veränderung der relativen Verhältnisse von oxidierter und reduzierter Form.dieses Bestandteils verbunden ist.
Unter zellartigen Produkten sind beispielsweise Viren zu
verstehen. Beispiele für Zellfraktionen sind Mitochondrien. 35
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Γ - 12 - -ι
Vorzugsweise wird das Verfahren in Gegenwart eines Redoxindikators durchgeführt, wenn die Elektronentransportverbindung selbst nicht über die notwendigen Eigenschaften verfügt, dass die Redoxvorgänge, denen sie unterworfen ist,
5 direkt nachgewiesen werden können.
Im Fall von Zellen, die Sauerstoff verbrauchen können, besteht einer der für die Entwicklung der Mikroorganismen wesentlichen Stoff wechsel vorgänge, insbesondere bei unbedingt oder fakultativ aeroben Organismen, in der oxidativen Decarboxylierung von oc-Ketocarbonsäuren, beispielsweise von Brenztraubensäure-
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bedient man sich mindestens einer Elektronentransportverbindung, die an dieser Stelle eingreift. Beispiele dafür sind Flavin-adenin-dinucleotid (FAD), Hikotinamid-adenin-dinucleotid (RAD) und Liponsäure.
Zum Nachweis und zur Messung einer eventuellen Veränderung der relativen Verhältnisse der oxidierten und reduzierten Form der Elektronentransportverbindung bedient man sich vorzugsweise eines potentiometrischen Verfahrens unter. Aus- ' nutzung der Potential änderungen, die mit den genannten Veränderungen der relativen Verhältnisse einhergehen. Dabei bedient man sich einer Messelektrode, die im Kontakt mit dem zu untersuchenden Medium steht, und einer Bezugselektrode.
Liponsäure der Formel 30
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stellt die bevorzugte Elektronentransportverbindung dar, da sie gleichzeitig eine einwandfreie Elektronentransportfunktion und eine Redoxindikatorfunktion ausübt.
5" Es ist festzustellen, dass Insbesondere bei Befolgung der nachstehend angegebenen bevorzugten Bedingungen die Reduktion der oxidierten Form der Elektronentransportverbindung mit einer Potentialveränderung, die 300 mV betragen kann, verbunden ist.
10
Die beiden anderen vorerwähnten Elektronentransportverbindungen ergeben grundsätzlich die gleichen Erscheinungen, wenn auch weniger ausgeprägt und mit zeitlicher Verzögerung, zumindest, wenn man sich des genannten potentiometrischen Verfahrens bedient. Die Potentialänderungen reichen immer noch leicht aus ,.um mit üblicherweise in elektrochemischen Laboratorien verwendeten Vorrichtungen nachgewiesen zu werden, insbesondere wenn man die nachstehend erläuterten bevorzugten Reaktionsbedingungen einhält.
Gegebenenfalls kann die Reaktion verstärkt werden, wenn man diese anderen Elektronentransportverbindungen mit einer bestimmten Menge Liponsäure als Redoxindikator versetzt,, wobei in diesem Fall die Verbindung in bestimmtem Umfang auch an der Reaktion teilnimmt.
Vorzugsweise liegend die genannten ELektronentransportverbindungen in oxidierter Form oder zumindest zum grossen Teil in oxidierter Form vor, insbesondere wenn das Medium in dem die Keime nachzuweisen sind, mit Sauerstoff versetzt ist.
Es konnte festgestellt werden, dass die wichtigen Potentialveränderungen auf die Wirkung des Zellstoffwechsels auf die Liponsäure selbst zurückzuführen sind. Diese Umwandlungen gehen mit einer merklichen Verminderung des Sauer-
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stoffgehalts des Mediums einher. Es wurde festgestellt, insbesondere "bei Arbeiten mit E. coli, einem fakultativ aeroben Mikroorganismus, dass eine hochgradig signifikante Potential veränderung eintritt, wenn die Reduktion der Liponsäure durch den Einfluss von Zellen bzw. in diesem Beispiel von Bakterien, nicht durch eine Reoxidation der Transportverbindung ausgeglichen wird. Die festzustellenden Potentialveränderungen hängen in bestimmtem Umfang von den verwendeten Elektroden ab. Im allgemeinen, verwendet man als Elektrode, die mit dem Medium in Kontakt steht, eine nicht polarisierbare und gegenüber dem Medium inerte Indikatorelektrode, insbesondere eine Platin- oder Goldelektrode, wobei das letztgenannte Metall aufgrund der Stabilität der gebildeten Ausschläge unabhängig von der Vorbehandlung der Elektrode bevorzugt ist.
Als Bezugselektrode kann eine Elektrode mit einer Flüssig-
yerwßndet werdeil·
keitsDrucke/,beispxelsweise eine Kalomel-Elektrode (Ag/
AgCl/ECl), die im Laboratorium bequem einzusetzen ist, aber eine starke Impedanz aufweist. Bei der industriellen Anwendung verwendet man vorzugsweise eine Metallelektrode, die stärker polarisierbar ist, aber eine geringere Impedanz aufweist, beispielsweise aus Molybdän, Wolfram oder nicht oxidierbarem Stahl.
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Die erfindungsgemäss ausgenutzten Vorgänge treten besonders klar hervor, wenn die Untersuchung in einem vorstehend definierten Medium durchgeführt wird, das als Nährstoff bzw. energiereiches Substrat solche Bestandteile enthält, die zur Entwicklung der zu untersuchenden Bakterienkultur entsprechend den gewählten Stoffwechselvorgängen erforderlich sind. Die genannten Grundbestandteile werden dabei so gewählt, dass sie soweit wie möglich keine anderen Stoffwechselvorgänge erlauben, die gegebenenfalls, wenn auch in vermindertem Umfang, die zu untersuchenden potentiometri-
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seilen Vorgänge stören könnten. Eür die Herstellung des Grundmediums sind die im nachstehenden Beispiel 1 angegebenen Mineralsalze "besonders zweckmässig, da sie in "besonders hohem Masse der Bildung von Wasserstoff als bakterielleni Stoffwechselprodukt entgegentreten, insbesondere wenn E. coli untersucht wird.
Pig. 1 zeigt typische Kurven für den Potentialabfall (in mV) der sich in Abhängigkeit von der Zeit (in Stunden) in einem am Versuchsbeginn mit Sauerstoff gesättigtem Medium feststellen lässt. Dabei werden die vorgenannten Grundbestandteile verwendet und mit E. coli-Keimen in einer Grössenordnung von 4 χ 10 Keimen versetzt. Das Medium enthält 3 mg/ ml Glucose und wird mit jeweils 10 nguaponsäure (AL).',HAD oder FAD versetzt. Die vierte Kurve (Kurve T) stellt eine Kontrollkurve dar, die ohne Zusatz einer Elektronentransportverbindung erhalten wird.
Es lässt sich feststellen, dass die Potentialänderung beim Kontrollversuch am schwächsten ist und mit der grössten Verzögerung eintritt. Bei den mit einer Elektronentransportverbindung versetzten Proben lässt sich eine sich rascher entwickelnde Potentialveränderung beobachten, wobei grössere Steigungen in den Kurven auftreten. Am ausgeprägtesten sind diese Vorgänge bei Verwendung von Liponsäure.
Es wurde festgestellt, dass bei einem !Festliegen sämtlicher physiko-chemi scher Parameter, insbesondere der anfänglichen Konzentrationen an Sauerstoff, Elektronentransportverbindung und aller anderen Bestandteile, die zur Ernährung oder zum Wachstum der Bakterien erforderlich sind, ein reziprokes Verhältnis zwischen der Latenzzeit (Zeit, die vom Zusatz aller genannten Reaktionsteilnehmer,einschliesslich. der Keime, zum Medium bis zum Auftreten der Potentialwelle verstreicht) und dem Umfang des Inokulums zu Beginn besteht. Diese Be-
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Ziehung lässt sich sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen beobachten. Die Existenz dieser Beziehung ist für zahlreiche Anwendungszwecke der Erfindung
besonders wichtig. 5
Diese Beziehung wird durch die Kurve von Pig. 2 erläutert. Diese Kurve gibt die Ergebnisse von Versuchen wieder, die unter ähnlichen Bedingungen, wie sie vorstehend beschrieben sind, erhalten worden sind, mit der Ausnahme, dass die Menge des E. coli-Inokulums variiert wird. Aus Fig. 2 ergibt sich die Veränderung der beobachteten Latenzzeit (ausgedrückt in Stunden auf der Ordinate) in Abhängigkeit von der Grosse des Inokulums (in ml Flüssigkeit, aufgetragen auf der Abszisse von Fig. 2, wobei die Flüssigkeit bei 54£ nm eine Optische Dichte von 0,8 aufweist). Diese Beziehung der Latenzzeit ist- an die Anfangskonzentration, der Bakterien gebunden und lässt sich in etwa durch folgende Gleichung darstellen:
T= —5 + b
■Je
wobei T die Latenzzeit, C die anfängliche Bakterienkonzentration und a und b Konstanten bedeuten.
Diese Beziehung lässt sich mit folgender Gleichung genauer darstellen:
~ (Op)n
T = —-— . Log 1 +
Log 2 30 wobei
ρ = Bildungszeit, d.h. die unter den festgesetzten Bedingun
'des Mediums und der festgesetzten Temperatur zur Zellteilung erforderliche Zeit;
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(Op) = Sauerstoffkonzentration im Meditim zum Zeitpunkt der Inokulation mit der Bakterienkultur; χ = anfängliche Konzentration der Keime und Q = konstante spezifische maximale Sauerstoffeindringgeschwindigkeit , . die für sämtliche Bakterien, die im Verlauf der Züchtung auftreten, als identisch angenommen wird.
Bei den Logarithmen handelt es sich um natürliche Logarithmen.
Die Entwicklung der Veränderung der beobachteten Potentialunterschiede ist auch eine Punktion der Konzentrationen der Elektronentransportverbindung. Dies zeigen die Kurven von Fig. 3i in denen die beobachteten Veränderungen dargestellt sind, wenn man in Gegenwart von 5» 10, 25, 50 "bzw. 100 ug/ml Liponsäure arbeitet. Dieser Versuch wird unter aeroben Bedingungen mit dem gleichen Medium und mit einem Inokulum von 0,75 ml E. coil der optischen Dichte 0,8 durchgeführt.
Die Kurven zeigen, dass die Latenzzeit abnimmt und gegen 0 geht, wenn die Lip onsäurekonz ent ration sehr hoch wird (Kurve von Fig. 3 entsprechend 100 ^ig Liponsäure),wobei die Veränderung der Steigung relativ gering ist. Im Gegensatz dazu nimmt bei verminderter Liponsäurekonzentration die Latenzzeit ab, und die Steigung der Veränderung wird im Gegensatz dazu stärker. Unter den untersuchten Bedingungen traten die stärksten Steigungen bei 25 pg Liponsäure pro ml Medium auf.
Bei der Anwendung kann somit je nach dem gewünschten Anwendungszweck die Liponsäurekonzentration entsprechend gewählt werden (bei Verwendung von anderen Elektronentransportverbindungen treten diese Erscheinungen in ähnlicher Weise auf), je nachdem ob darauf Wert gelegt wird, die Latenzzeit oder die Zeit, die erforderlich ist, bis die Änderung der Potentialdifferenz einen vorbestimmten Schwellenwert
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1 erreicht, beispielsweise -200 mV, zu bestimmen.
In der Praxis werden zur Durchführung der Messungen unter Ausnutzung der vorgenannten Erscheinungen Liponsäure-Konzentrationen von 10 bis 100 ug/ml angewendet.
Zur Erzielung der bestmöglichen Ergebnisse ist im Medium vorzugsweise eine ausreichende Ionenleitfähigkeit gegeben, dass die Messelektrode möglichst leicht die entstehenden Potentialunterschiede erfassen kann. Besonders bevorzugt ist das Medium von Beispiel 1, das hauptsächlich aus Phosphaten besteht. Bei Verwendung dieses Mediums werden die zu messenden Potentialveränderungen relativ wenig durch die im Medium freigesetzten Stoffwechselprodukte beeinflusst, insbesondere wenn nur die für das Wachstum der Bakterien unter den entsprechenden Bedingungen erforderlichen energiereichen Substrate zugesetzt werden, mit denen der gewünschte Stoffwechselvorgang abläuft. Eine weitere Eigenschaft dieses Mediums besteht darin, dass es eine Pufferung auf einen pH-Wert im ITeutralbereich ergibt, der sich während des Versuchs kaum ändert, auch wenn saure Stoffwechselprodukte der Bakterien freigesetzt werden.
Allgemein ausgedrückt, kann man sich eines "Grundmediums11 (d.h. ein Medium, das weder energiereiches Substrat noch Elektronentransportverbindungen enthält) bedienen, das die entsprechenden Bestandteile enthält, die -· diesem Grundmedium auf der einen Seite eine ausreichende ionische Leitfähigkeit verleihen,dass eine Messung der Potentialveränderungen, die sich aufgrund der Redoxvorgänge im Medium ergeben, mit der Elektrode gemessen werden können, und die andererseits den pH-Wert in entsprechender Weise puffern, dass die Bakterienentwicklung möglich ist, wobei die Pufferung vorzugsweise im ITeutralbereich erfolgt. Ferner werden die Bestandteile vorzugsweise so gewählt, dass die Zellen,
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zellähnlichen Gebilde oder Zellfraktionen, die im Medium vorhanden sind oder diesem zugesetzt werden, als Stoffwechselprodukte keinen Wasserstoff "bilden können, wenn als energiereiche Substrate im Medium nur solche zur Verfügung stehen, die für die Stoffwechselvorgänge, die "bei der oxidati ven Decarboxylierung von oc-Ketocarbonsäuren, wie Brenztraubensäure, erforderlich sind.
Gegenstand der Erfindung sind auch entsprechende Mittel zur Durchführung dieser Verfahren, die sämtliche erforderlichen Bestandteile enthalten und die entsprechend den vorstehenden Ausführungen Proben, deren Zellaktivität untersucht werden soll, zugesetzt werden können.
Ein derartiges Mittel weist beispielsweise folgende Bestandteile auf: - -
a) ein energiereiches Substrat, gewählt entsprechend dem Stoffwechselvorgang, zur Entwicklung der Mikroorganismen, die in dem Medium vorhanden sein können, vorzugsweise unter Ausschluss von allen anderen metabolisierbaren Substraten,
b) mineralische Bestandteile, die zum Wachstum der Mikroorganismen notwendig sind und vorzugsweise Salze, die dazu beitragen, dass das Medium eine erhöhte Ionenleit-., fähigkeit aufweist und ausserdem als pH-Puffer, insbesondere unter Erzielung eines pH-Werts im Neutralbereich, wirken,
c) eine Elektronentransportverbindung der angegebenen Art und
d) gegebenenfalls einen oder mehrere Wachstumsfaktoren, beispielsweise Hefeextrakt oder andere Aktivatdren, " / beispielsweise hormoneller Art. j
•Vorzugsweise stellt.das energiereiche Substrat die einzige iCohlenstoffquelle dieses Mittels dar, mit Ausnahme der
L· .
Elektronentransportverbindung und gegebenenfalls mit Ausnahme des Eedoxindikators und des oder der Wachstumsfaktoren.
Vorzugsweise enthält ein derartiges Medium folgende Bestandteile:
Eine ausreichende Menge an Phosphaten, um die vorstehend angegebene Wirkung hervorzurufen,
Glucose als energiereiches Substrat und/oder einen oder mehrere andere Zucker, insbesondere solche, die von bestimmten Bakterien in den speziellen Medien verwertet werden können, beispielsweise Lactose für E. coli, und Liponsäure, vorzugsweise in oxidierter Form.
Glucose ist ein bevorzugter Vertreter der "konstitutiven" Zucker, die von den Bakterien verwertet werden können,
' wobei unter "konstitutiven" Zuckern solche zu verstehen sind, die ohne vorherige Anpassung verwertet werden können.
Die konstitutiven Zucker können durch sogenannte "adaptive" Zucker ersetzt werden, die von den Mikroorganismen erst nach einer vorhergehenden Anpassung des Stoffwechsels verwertet werden können. Beispiele für · adaptive Zucker sind Xylose, Maltose, Galactose und Arabinose.
Die Erfindung betrifft sowohl Medien, denen direkt die Proben, deren Zellaktivität untersucht werden soll, einverleibt werden können, als auch konzentrierte Lösungen dieser Bestandteile, die entsprechend verdünnt werden, um ein Medium herzustellen, das die Bestandteile in den. für eine Bestimmung der Zellaktivität entsprechenden Verhältnissen enthält.
In zahlreichen Fällen ist es vorteilhaft,diese Mittel gebrauchsfertig einzusetzen. Man kann aber auch die Probe,
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deren Zellaktivität untersucht werden soll mit einem anderen Medium versetzen und anschliessend die einzelnen Bestandteile des genannten Mittels getrennt zugeben, wobei die Eeihenfolge der Zugabe nickt kritisch ist. Insbesondere kann man flüssige Mittel verwenden, die nur einen Teil der genannten Bestandteile enthalten. Diesen Mitteln werden die anderen Bestandteile anschliessend einverleibt.
Die Probe kann gegebenenfalls selbst bereits das Medium darstellen, das sämtliche oder einen. Teil der zur Durchführung der Messungen erforderlichen Bestandteile enthält. Dabei handelt es sich beispielsweise um Flüssigkeiten für Ernährungszwecke, wie Milch, biologische Medien, wie Blut und Urin, oder industrielle Flüssigkeiten, bei denen"eine bakterielle Kontamination befürchtet wird.
Es ist unerlässlich, dass das der Untersuchung zu unterziehende Medium zu Beginn, des Messungszeitraums gleichzeitig das energiereiche Substrat und die entsprechenden mineralischen Bestandteile, die eine Entwicklung einer gegebenenfalls vorhandenen bakteriellen Aktivität ermöglichen, enthalten. Die Elektronentransportverbindung kann anschliessend zugesetzt werden, wobei jedoch selbstverständlich die Zugabe vorzugsweise vor dem Auftreten der nachzuweisenden Redoxvorgänge erfolgt. Mit anderen Worten kann die Elektronentransportverbindung dem Medium vor der Messung, gleichzeitig damit und anschliessend daran zugesetzt werden. Sie kann auch dem Medium erst nach dem Ende der Latenzzeit, die bei einer gegebenenfalls vorhandenen Zellaktivität im Medium auftritt, zugesetzt werden, insbesondere wenn das Ziel der Messung darin besteht, nach einem bestimmten Zeitraum vom Zeitpunkt 0 an gerechnet eine gegebenenfalls vorhandene Zellaktivität nachzuweisen, die eine nachweisbare ■ (insbesondere durch Potentiometrie) Veränderung der Verhältnisse von oxidierter und reduzierter Form der dem Medium
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zugesetzten Elektronentransportverbindung hervorrufen kann.
In den vorstehenden Ausführungen ist der bevorzugte Fall in Betracht gezogen, bei dem dem Medium, das die zu untersuchende Zellaktivität enthält, nur solche energiereichen Substrate zur "Verfügung gestellt werden, die zur Entwicklung der Zellaktivität im Rahmen eines bestimmten Stoffwechselvorgangs erforderlich sind. In der Praxis ist dies aber nicht immer der Fall. Dies trifft beispielsweise bei selektiven Medien zu, die für die Entwicklung der Aktivität von bestimmten Arten von Bakterien unter Ausschluss von anderen Bakterienarten geeignet sind. Die Erfindung kann andererseits im allgemeinen bei Messungen angewendet werden, bei denen die an der in das Medium eingeführten Elektronentransportverbindung beobachtbaren Eedoxvorgänge, die unter dem Einfluss der im Medium vorhandenen Zellaktivität ablaufen, vorherrschend sind. Bei Bedarf kann man die Anteile des energiereichen Substrats im Medium so einstellen, dass das Vorwiegen der nachzuweisenden Erscheinungen verstärkt wird.
Zur Erzielung von reproduzierbaren Ergebnissen ist es wichtig, dass immer die gleichen Arbeitsbedingungen angewendet werden. Insbesondere bei Messungen, bei denen die variablen Säuerstoffmengen im Medium eine gleichzeitige Änderung der Latenzzeit und der Neigung der erhaltenen Kurven hervorrufen können, ist sorgfältig darauf zu achten, dass die anfängliche Konzentration des im Medium gelösten Sauerstoffs bei den verschiedenen Untersuchungen gleich ist.
Es ist unter Umständen vorteilhaft, mit einem mit Sauerstoff gesättigten Medium zu arbeiten, sofern ein derart hoher Sauerstoffgehalt im Medium nicht die gewünschte Ent-
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wicklung der zu untersuchenden Bakterien beeinträchtigt.
Die erhaltenen potentiometrischen Kurven variieren von einem Mikroorganismus zum anderen. Trotzdem ist es möglich für jede Art von Mikroorganismus ein Diagramm aufzustellen, wobei sämtliche Arbeitsparameter fixiert und die Veränderung der Latenzzeit und der Steigungen der potentiometrischen Kurven in Abhängigkeit von der Menge des ursprünglichen Inokulums untersucht werden. Diese Kurven können insbesondere unter den Bedingungen, die beispielsweise für E. coli angegeben worden sind, aufgestellt werden; vgl. Fig. 2.
Somit lässt sich das erfindungsgemässe Verfahren beispielsweise auf die Bestimmung der Toleranzgrenzen von bakteriellen Verunreinigungen in flüssigen Medien anwenden. Das Verfahren besteht darin festzustellen, dass am Ende einer vorbestimmten Zeit, die einem Schwellenwert weit unterhalb der Latenzzeit der eventuell im Medium vorhandenen bakteriellen Verunreinigungen entspricht, entweder die Potentialveränderungen noch nicht registriert sind oder diese Veränderung, sofern sie bereits in Gang gekommen ist, doch nicht zu einer über dem vorbestimmten Schwellenwert liegenden Potentialdifferenz gegenüber dem ursprünglichen Wert geführt hat. In Abwesenheit einer derartigen Veränderung kann man somit den Schluss ziehen, dass das Medium nicht verunreinigt ist oder dass die Verunreinigung unterhalb eines annehmbaren Schwellenwerts liegt. Demgegenüber erlaubt die Feststellung einer derartigen Veränderung zu diesem Zeitpunkt oder vorher den Schluss, dass eine über die Toleranzgrenze hinausgehende Verunreinigung vorliegt.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Untersuchung des . Verhaltens von eventuell in einem Medium, das zumindest teilweise flüssig ist, vorhandenen Verunreinigungen lässt
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sich beispielsweise auf folgenden verschiedenen Gebieten anwenden:
Bei Routinekontrollen, beispielsweise bei der Überwachung von Trink- und Flusswasser;
in der Nahrungsmittelindustrie, beispielsweise bei der bakteriologischen Kontrolle von Milch und anderen !Flüssig- ■ keiten für Nahrungsmittelzwecke sowie auch von festen Nahrungsmitteln, die in Lösung oder Suspension in einem flüssigen Medium vorliegen;
in der Medizin, beispielsweise bei der Untersuchung von bakteriellen Verunreinigungen in biologischen Flüssigkeiten wie Blut oder Urin, sowie gleichermassen in allen Medien, in denen das FirkungsSpektrum eines bestimmten Antibiotikums untersucht werden soll; und **"
bei Routineüberwachungen von industriellen Flüssigkeiten, wie Abwässern und Spülflüssigkeiten, von denen zu befürchten ist, dass sie mit Bakterien verunreinigt sind.
In der Praxis werden beispielsweise bei der Überwachung von Trinkwasser in regelmässigen Abständen Proben entnommen. Diese Proben werden auf die vorbeschriebene Weise untersucht. Die Überwachung einer gegebenen Probe und eines gegebenen Mediums wird während der maximalen Dauer durchgeführt, die der Latenzzeit entspricht, die bei der maximalen Verunreinigung, die bei der Wasserprobe unter den Versuchsbedingungen toleriert werden kann, auftritt.
Dieses Nachweisverfahren ist hochempfindlich. Beispielsweise liegt im Fall einer Verunreinigung von Wasser mit Coli-Bazillen die Latenzzeit in der Grössenordnung von 12 Stunden für Proben, bei denen nach 24—stündiger Inkubation eine Agarplatte unverändert bleibt, was einem Befall der untersuchten Probe mit weniger als 10 Bakterien pro 1 ml entspricht.
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In der Praxis können die Potential Veränderungen aufgezeichnet werden, was eine laufende Verfolgung der Bakterienentwicklung erlaubt. Ferner kann "beispielsweise mit Hilfe einer aufleuchtenden Lampe das Auftreten einer ausreichen— den Potentialveränderung sichtbar gemacht werden. Gegebenenfalls können selbstverständlich auch andere sichtbare oder hörbare Signale gegeben werden.
Es kann auch die Verwendung eines einfachen elektronischen Überwachungssystems vorgesehen werden, das in den Fällen in Funktion tritt, bei denen die festgestellte Latenzzeit unter der Latenzzeit liegt, die der vom Gesetzgeber festgelegten, zulässigen Verunreinigung entspricht.
Um die Überwachung halb kontinuierlich durchzuführen, können die Untersuchungen reihenweise durchgeführt werden, wobei in regelmässigen Abständen Proben entnommen werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren lässt sich auch auf das 2^ äusserst wichtige Gebiet der Identifizierung von Bakterien oder der Untersuchung ihres Verhaltens bei Zusatz von bestimmten, dem Medium zugesetzten Bestandteilen anwenden. Wenn diese Bestandteile den Bakterienstoffwechsel beeinflussen, führen sie im allgemeinen auch zu einer Veränderung der potentiometrischen Kurven der untersuchten Mikroorganismen. Von daher ergibt sich die Möglichkeit, Rückschlüsse über ihr Verhalten zu treffen.
Ein wichtiges Anwendungsgebiet des erfindungsgemässen Verfahrens besteht in der Untersuchung des Verhaltens von Zellorganismen gegenüber den verschiedensten Substanzen,
beispielsweise medizinischen und anderen Wirkstoffen, möglichen Aktivatoren oder Inhibitoren des Zellstoffwechsels
und verschiedenen Regulatoren von Zellaktivitäten, beispielsweise von Membranaktivitäten. Zu derartigen Regula-
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toren gehören insbesondere die Antibiotika.
Die Wirkung eines Antibiotikums auf Bakterien, die in einem erfindungsgeinäss zusammengesetzten Medium enthalten sind oder diesem zugesetzt werden, drückt sich in mehrerer Hinsicht in einem veränderten "Verlauf der zeitabhängigen Veränderungen der Potentialdifferenz aus. Dieser veränderte Verlauf ergibt bestimmte Informationen über das
Verhalten von Bakterien gegenüber den Antibiotika. 10
Folgende Veränderungen lassen sich dabei nachweisen:
1) Die Anwesenheit des Antibiotikums bewirkt eine Verringerung des beobachteten Potentialabfalls, wobei anschliessend ein Wiederanstieg des Potentials erfolgt, was insbesondere auf eine sekundäre Reoxidation der Liponsäure zurückzuführen ist. Dieser Fall tritt bei solchen Antibiotika auf, die kurzzeitig die mikrobielle Aktivität hemmen und gegenüber Bakterien eine letale Wirkung aufweisen. Dies ist insbesondere bei bakterizid wirkenden Antibiotika der Fall.
2) Man beobachtet in Gegenwart des Antibiotikums entweder eine verringerte Steigung der Potentialveränderung aufgrund der erfindungsgemäss ablaufenden Eedoxreaktion oder eine Erhöhung der Latenzzeit. Diese Veränderungen treten bei solchen Antibiotika auf, die in den untersuchten Dosen das Wachstum herabsetzen oder den Bakte.-' rienstoffwechsel nur teilweise hemmen. Dieser Fall tritt insbesondere bei bakteriostatisch wirkenden Antibiotika
30 auf.
Nachstehend sind für bestimmte Regulatoren der Zellaktivität die entsprechenden Veränderungen angegeben: - Eine Verringerung der Amplitude unter sekundärer Reoxidation tritt bei folgenden Verbindungen auf:
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ß-Lactamine: Hemmung der Zellwandsynthese;
; Aminoside: Störung der Proteinsynthese auf der Höhe des Ribosoms 30 S;
Nalidixinsäure: Hemmung der Synthese von Desoxyribonucleinsäure;
eine Verringerung der Steigung tritt bei folgenden Verbindungen ein:
Chloramphenicol: Hemmung der Proteinsynthese auf der Höhe des Ribosoms 50 S;
Polymyxin: Membranveränderungen; eine Verlängerung der Latenzzeit tritt bei folgenden Verbindungen auf:
Rifamycin: Hemmung der RFA-Synthese; Macrolide und verwandte Verbindungen: Störung der Proteinsynthese auf der Höhe des Ribosoms 50 S.
Das erfindungsgemässe Verfahren erlaubt vergleichende Untersuchungen über die Wirkung von verschiedenen Regulatoren gegenüber verschiedenen Organismen oder Zellfraktionen, beispielsweise Vergleiche über die Wirkung von verschiedenen Antibiotika gegenüber einer bestimmten Bakterienart oder eine vergleichende Untersuchung eines einzigen Antibiotikums gegenüber verschiedenen Bakterienarten.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispie 11 Verwendung eines Minimal-Grundmediums
In sämtlichen folgenden Versuchen wird die Züchtung in einem
Kolben mit einem Fassungsvermögen von etwa 60 ml durchgeführt, dessen beide Öffnungen während des milcrobiellen Wachstums luftdicht verschlossen werden können, so dass die den Bakterien nach der Beimpfung zur Verfügung stehende Sauerstoffmenge konstant ist. Eine Öffnung dient zur Einführung der verschiedenen Bestandteile des Mediums und die
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15
35
- 28 -
andere zur Einfünrung einer kombinierten oder Kalomel-Elektrode, die direkt mit einem potentiometrischen Aufzeichnungsgerät verbunden ist.
Das bei diesem Versuch verwendete Volumen des Kulturmediums wird konstant auf 55 ml gehalten.
Das Minimal-Grundmedium weist folgende Zusammensetzung auf, wobei die angegebenen Mengen mit destilliertem Wasser auf 1 Liter aufgefüllt werden:
K2HPO
MgSO.
10,5 s JTeSO4 . 7H2O 5 mg
3,5 s CaCl2 . 2H2O 50 mg
ο,5 ε MnCl2 . 4H2O T mg
0,050 g
Wie bereits erwähnt, werden für Jeden Versuch 35 ml dieses Grundmediums verwendet, das vor der Beimpfung mit einem energiereichen Substrat und einer Elektronentransportverbindung versetzt wird.
In den folgenden Versuchen 1, 2 und 3 besteht das energiereiche Substrat aus 0,2 ml einer 30 gewichtsprozentigen Glucoselösung und die Elektronentransportverbindung aus einer Lösung von 0,2 ml Liponsäure mit einem Gehalt von 1 mg/ml.
Anschliessend wird der Kolben vor Beginn der Messungen luftdicht verschlossen.
Versuch 1
35 ml Grundmedium, das mit den angegebenen Mengen Lipon-
.und Glucose ... , . . _..,, ■ saure/versetzt ist ,werden xn exnen Kolben gegeben und zur Einstellung des Gleichgewichts (O2) Luft ^. (O2) in Lösung heftig bewegt. Anschliessend wird das Medium mit 1 ml einer
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Kultur von Escherichia coli mit einer optischen Dichte von . 0,8 bei 5^6 nm, entsprechend etwa 175 x 10 Keime, versetzt. Sodann wird der Kolben verschlossen. Die Potentialänderungen in Abhängigkeit von der Zeit werden aufgezeichnet.
Es lässt sich feststellen, dass das Potential nach einer Züchtungszeit von 2 Stunden und 20 Minuten drastisch abfällt, was der potentiometrischen "Welle" der Redoxreaktion entspricht.
10
Versuch 2
Es wird das gleiche Züchtungsmedium wie in Versuch 1 verwendet (Grundmedium + Glucose + Liponsäure), wobei aber 0,4 ml Wasser mit einem Gehalt an 20 Prozent Hefe zugesetzt werden·, um das Bakterienwachstum zu begünstigen. Dieses Medium wird durch 15-minütiges Einleiten eines StickstoffStroms (Stickstoff für medizinische Zwecke der Societe L'Air Liquide) desoxydiert.Der Partialdruck des gelösten Sauerstoffs liegt
unter 10 Torr. 20
Anschliessend werden 0,01 ml der gemäss Versuch 1 verwendeten Coli-Kultur, entsprechend 175 x 10 Keime, überimpft. Die Züchtung wird ohne Stickstoffstrom durchgeführt. Die potentiometrische "Welle" erscheint nach Ablauf von 3 Stunden und 20 Minuten nach der Überimpfung.
Versuch 3
Die Zusammensetzung des Mediums ist die gleiche wie im vorhergehenden Fall, mit der Abänderung, dass man als zusätzlichen Wachstumsfaktor Thiaminpyrophosphat (TPP) in einer Menge von 0,4 ml einer Lösung mit einem Gehalt an 0,1 mg/ml zusetzt.
Das Medium wird gemäss Versuch 1 unter freiem Luftzutritt
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1 bewegt und dann mit einer stark verdünnten Kultur von
Escherichia coli beimpft, wobei eine klassische Auszählung einer Agarplatte eine Keimzahl von 100 Bakterien pro 1 ml unmittelbar nach der Beimpfung ergibt. Der Kolben wird sodann verschlossen.. Bei der potentiometrischen Aufzeichnung ergibt sich eine Latenzzeit von 7 Stunden und 10 Minuten.
Versuch 4
Es werden die gleichen Versuchsbedingungen wie in Versuch 1 10
eingehalten, wobei aber die Glucose durch folgende andere
energiereiche Substrate ersetzt wird:
0,5 ml einer Natriumpyruvatlosung (50 mg/ml), 0,4 ml einer Lävuloselösung (50 mg/ml), 0,4 ml einer Galactoselösung (50 mg/ml) oder 0,4 ml einer Lactoselösung (50 mg/ml).
Die erhaltenen Signale sind mit den bei Verwendung von Glucose erhaltenen Signalen vergleichbar, wobei aber die
.Latenzzeit und die Steigung der Potentialwelle vom ver-20
wendeten Substrat abhängen. Bei Verwendung von Pyruvat erfolgt das Signal im Vergleich zu den verschiedenen Zuckern verzögert, da das Bakterienwachstum in Gegenwart dieses Substrats am langsamsten ist.
In der nachstehenden Aufstellung sind die Versuchsergebnisse zusammengestellt, wobei bei Glucose die Bedingungen von Versuch 1 und bei Lävulose, Galactose, Pyruvat und Lactose die Bedingungen von Versuch 4 zugrunde liegen.
In dieser Aufstellung sind die folgenden beiden Werte angegeben: Zeit, die bis zum Auftreten des Signals verstreicht und Zeit, die verstreicht, bis sich in Gegenwart der verschiedenen Substrate eine Potentialveränderung um 200 mV
ergibt. 35
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Si
'S'
cn
Zeit "Ms zum Auftreten des Signals
Glucose Lävulose Galactose Pyruvat Lactose, 3 Std. 15 min. 2 Std. 20 min. 2 Std. 30 min, 7 Std. 35 min. 3 Std. 20 min.
O CD OO OO
Zeit Ms zu einer Potentialänderung von 200. mV
4 Std. 30 min. 4 Std. 30 min. 8 Std. 20 min.
Std.
5 Std. 20 min.
OO IS3 CD CO —i CD J
Die erhaltenen günstigen Ergebnisse zeigen, bis zu welchem Punkt es möglich ist, die Parameter, derer man sich bei einer gegebenen Anwendungsart bedienen will, zu wählen.
5 Beispiel2
Bestimmung von Verunreinigungen in verschiedenen Medien Herstellung des Grundmediums
Man stellt eine Lösung her, die in bezug auf die verschiedenen Bestandteile die 7-fache Konzentration des in den Beispielen 1 bis 4- verwendeten Grundmediums aufweist. 5 ml dieser konzentrierten Losung werden mit 30 ml einer nachstehend als "Träger" bezeichneten Flüssigkeit, deren bakteri elle Verunreinigung untersucht werden soll vermischt. Somit erhält man einen modifizierten Träger, der die gleichen Mine ralsalze in den gleichen Anteilen wie das Grundmedium von Beispiel 1 enthält.
sämtlichen Fällen wird der auf diese Weise erhaltene
modifizierte Träger vor Beginn der Messungen mit Glucose
und Liponsäure in den gleichen Konzentrationen wie in Beispiel 1 versetzt. Ferner werden Wachstumsaktivatoren, wie He fewasser oder Thiaminpyrophosphat (TPP),in den in Versuch von Beispiel 1 angegebenen Konzentrationen zugesetzt.
In diesem Beispiel werden die folgenden zwei Träger verwendet :
Milch mit einem ursprünglichen Gehalt an f 00 Keimen pro 1 ml und
Leitungswasser mit einem Gehalt an 30 Keimen pro 1 ml (die
Anzahl der Keime in diesen beiden Trägern wird vorher durch
herkömmliche Auszählung auf Agarplatten festgestellt).
Bei Einhaltung der vorgenannten Bedingungen lässt sich feststellen, dass im Fall von Milch eine Potentialänderung von 200 mV nach 10 Stunden eintritt. Die gleiche Veränderung
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r _ 33 - ι
lässt sich beim Leitungswasser nach 13 Stunden feststellen.
Bei Berücksichtigung dieser Ergebnisse stellt man fest, dass die beschriebenen Arbeitsbedingungen (oder ähnliche Arbeitsbedingungen) in einem System angewendet werden können, das zur systematischen, gegebenenfalls automatischen und/oder halb kontinuierlichen bakteriologischen Qualitätskontrolle von Wasser oder Milch angewendet werden kann. Bei genauer Anwendung der vorstehend angegebenen Arbeitsbedingungen lässt sich die biologische Verunreinigung von Trinkwasser feststellen, wobei eine Veränderung der ursprünglich gemessenen Potentialdifferenz nach 13 Stunden unter den angegebenen Bedingungen bestimmt wird. Nach den gegenwärtig in Frankreich geltenden Bestimmungen dürfen in Trinkwasser nicht mehr
15 als 30 bis 50 Bakterien pro 1 ml enthalten sein.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist selbstverständlich zu einer Automatisierung oder Halbautomatisierung geeignet, wodurch wiederholte Kontrollen möglich werden. 20
In Fig. 4- ist schematisch eine Vorrichtung abgebildet, mit der ein Kontrollzyklus zur Bestimmung von bakteriellen Verunreinigungen wiederholt durchgeführt werden kann. Die. Vorrichtung weist einen Behälter 2 auf (mit einem Fassungsvermögen von beispielsweise 100 ml), wobei eine nicht abgebildete Vorrichtung zur Thermostatisierung auf 37°C eine Bewegungsvorrichtung (beispielsweise ein Magnetrührer 4-), Einlassöffnungen 6, 8, 10 und 12 und eine Auslassöffnung 14- vorgesehen sind. Ein mit 16 schematisch dargestelltes potentiometrisches Aufzeichnungsgerät, dessen Aufbau an sich bekannt ist, eine Messelektrode 18 zum Eintauchen in das zu untersuchende Medium und eine nicht abgebildete Bezugselektrode sind in entsprechender Weise angeordnet. Die durch das potentiometrische Aufzeichnungsgerät gelieferten Informationen können an einen Zentralspeicher 20 oder eine analoge Ein-
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1 richtung übermittelt werden, wo die erhaltenen Ergebnisse ausgewertet werden.
Die wiederholte Bestimmung umfasst somit die folgenden Messzyklen:
Zufuhr einer standardisierten Probe in den Behälter durch den Einlass 6;
Zufuhr von Luft durch den Einlass 10 und Zufuhr der Reagentien (Mineralsalze, Wachstumsfaktoren, Glucose oder energiereiche Substrate sowie mindestens eine Elektronentransportverbindung) durch den Einlass 12;
Bewegung in Gegenwart von Luft, um das Medium mit Sauerstoff zu sättigen;
Verschliessen sämtlicher Einlassöffnungen; Überwachung des Potentials im Medium mittels der potentiometrischen Vorrichtung während der gewünschten Zeitspanne, insbesondere nach vorher festgelegten Überwachungskriterien, und gleichzeitige Verwertung eines eventuellen Warnsignals, das eine anormale bakterielle Verunreinigung anzeigt; Entleerung durch den Auslass 14 des Behälters (bei offenem Auslass 10);
Spülung des Behälters (Zufuhr von Spülwasser durch den Einlass 6 und von Waschmittel gegebenenfalls durch den Einlass 8); und
Sterilisation des Behälters, der somit für einen neuen Messzyklus zur Verfügung steht.
Diese Vorgänge, insbesondere das Öffnen und Schliessen der Einlass- und Auslassöffnungen werden automatisch entsprechend den durchzuführenden Arbeitsgängen gesteuert.
Beispiel 3 Versuch 1
Unter Verwendung des gleichen Grundmediums und der gleichen 35
Oxygenierungsbedingungen wie in den vorstehenden Beispielen
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Γ - 35- 282931 θ"1
geht man von einem Grundmedium der nachstehend aufgeführten Bestandteile aus:
Glucose 0,2 ml einer 30-
TPP 0,1 ml (0,1 mg/m
20-prozentiges
Hefewasser 0,4- ml
Coenzym A 0,1 (1 mg/ml)
NAD 0,1 (1 -ug/ml)
DAD 0,1 (1 ,ug/ml)
Liponsäure 0,2 ml (1 mg/ml)
Das Medium wird vor der Messung mit 2 ml einer Kultur von Staphylococcus epidermidis mit einer optischen Dichte von 0,8, was etwa 350 Millionen Keimen entspricht, "beimpft. . 1 Std. und 30 min nach der Beimpfung tritt eine drastische Potential veränderung ein.
Die nachstehenden Versuche werden in bestimmten klassischen
Medien anstelle des in den vorstehenden Beispielen verwen-20
deten Grundmediums durchgeführt. Versuch 2
Chapman-Medium (verwendet zur Isolation von pathogenen Staphylokokken).
Das Medium enthält folgende Bestandteile (die angegebenen Mengen beziehen sich auf 1 Liter destilliertes Wasser):
Rindf1eIschextrakt 1 g
Polypepton 10 g
Natriumchlorid 75 g
d-Mannit 10 g
Phenolrot 0,025 g
35 ml dieses Mediums werden mit 0,2 ml einer 30-prozentigen
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Glucoselösung "und 0,2 ml einer Lxponsäurelosung mit einem Gehalt an 1 mg/ml versetzt. Das Medium wird mit Sauerstoff gesättigt und mit einem Inokulum von Coli-Bazillen mit einem Gehalt an 5 x 10 Keimen beimpft. Anschliessend wird der Behälter geschlossen und die Messung begonnen. Nach 9 Std. 25 min wird eine Potentialänderung von 200 mV festgestellt.
Versuch 5
Bei Anwendung der gleichen Bedingungen wie in Versuch 2 unter Verwendung eines Inokulums von Staphylokokken mit einem Gehalt ah etwa Keimen beobachtet man nach 4- Std.
15 min ein Signal, das einer Potential veränderung von 200 mV entspricht. **
Versuch 4-
Verwendung eines Kulturmediums mit einem Gehalt an Brillant-
Dieses Medium dient üblicherweise zur Isolierung von Salmonellen.
Die Zusammensetzung des Mediums ist nachstehend angegeben (die angegebenen Mengen beziehen sich auf 1 Liter destilliertes Wasser):
25
Hefeextrakt 3 S
Polyp epton 10 g
Eatriumchlorid 5 S
Lactose 10 g
Saccharose 10 g
Phenolrot 0,08 g
Brillantgrün 0,0125 g
35 ml dieses Mediums werden gemäss Beispiel 1 mit Glucose und Liponsäure versetzt und anschliessend mit Sauerstoff gesättigt.
L 809884/0829
Man beobachtet parallel die Potentialentwicklung von zwei auf verschiedene Weise initiierten Kulturen, wobei die Gesamtmenge der Keime gleich, ist.
5 Erster Behälter
Das Gemisch enthält drei verschiedenartige Keime in äquivalenten Anteilen, nämlich E. coli, Salmonella typhimurium und Staphylococcus epidermidis. Die Änderung der Potentialdifferenz beginnt 10 Stunden nach der Beimpfung und erreicht nach einer Züchtungszeit von 13 Std. und 30 min 200 mV.
Zweiter Behälter
Es wird ein Gemisch aus zwei Keimen in äquivalenten Anteilen verwendet, nämlich aus E. coli und Staphylococcus epidermidis. Die Potentialänderung beginnt nach 10 Stunden und erreicht nach 20-stündiger Züchtung 200 mV.
Beispiel 4·
Dieses Beispiel zeigt das potentiometrische Verhalten von Blut- und Urinproben, die mit einer bestimmten Menge an Keimen versetzt sind.
1) Untersuchung von Blut
35 ml Blut, das in einem üblichen Hämokulturmedium (Institut 25
Pasteur) suspendiert ist, werden zum Zeitpunkt 0 (Skala auf der Abszisse von Pig. 4-) zu Beginn der Messung mit 10 Keimen von E. coli und 0,2 ml Liponsäure mit einer Konzentration von 1 mg/ml versetzt. Die Kurve 1 stellt die Änderung der
gemessenen Potentialdifferenz in einer Zelle unter den glei-30
chen Bedingungen wie in Beispiel 1 in Abhängigkeit von der Zeit dar. Man stellt eine Potentialänderung, die aufgezeichnet wird, aufgrund der Redoxreaktion der Liponsäure von mehr als 300 mV fest.
In diesem Fall ist es nicht erforderlich, ein Substrat
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(Glucose) dem Medium zuzusetzen, da dieses in ausreichender Menge Nährstoffe und Mineralsalze enthält, so dass die untersuchte Redoxreaktion ablaufen kann.
5 2) Untersuchung von Urin
Die nachstehenden Medien werden beide zum Zeitpunkt 0 mit Keimen von E. coli versetzt.
a. Direkte Untersuchung von Urin 10
Unter analogen Bedingungen wird die Veränderung der Potentialdifferenz an 35 ml menschlichem Urin, der mit 0,2 ml Liponsäure mit einer Konzentration von 1 mg/ml und 0,2 ml einer 30-prozentigen Glucoselösung versetzt ist, untersucht. Die Kurve II von Fig. 4· gibt die beobachteten Erscheinungen wieder. Es tritt keine klare potentiometrische "Welle" auf.
b. Untersuchung des gleichen Urins nach Anreicherung mit Mineralsalzen
Im Gegensatz dazu ergibt sich eine sehr klare potentiometrische "Welle" (Kurve III von Fig. 4) wenn die potentiometrischen Messungen in einem Medium durchgeführt werden, das aus 30 ml des gleichen Urins besteht, der mit 5 ml der konzentrierten Lösung von Beispiel 2 und den gleichen Mengen an Glucose und Liponsäure wie im vorstehenden Versuch versetzt worden ist.
Beispiel 5 3Q Dieses Beispiel zeigt die unterschiedlichen Veränderungen, die bei der Zellentwicklung von verschiedenen Bakterienarten durch Antibiotika auftreten können.
bei 37°C Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen/und unter Rühren
g5 (60U/min) in 50 ml-Zweihalskolben durchgeführt, wobei in eine
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Γ - 39 - ~ι
282931Ö
Öffnung eine kombinierte Elektrode (nicht polarisierbare Messelektrode oder Kalomelelektrode) eingeführt wird und die andere Öffnung zum Zuführen der Bestandteile dient.
Die Versuche werden im Grundmedium gemäss Beispiel 1 mit einem Gehalt an 3 S Glucose/1000 ml in einem Gesamtvolumen (Kulturmedium und Inokulum) von 40 ml durchgeführt. Der Liponsäuregehalt "beträgt 24 pig/ml. Die Überimpfung wird Jeweils mit einem Inokulum von 2 ml einer im gleichen Minimalmedium gezüchteten Kultur in der exponentiellen Vachstuiasphase durchgeführt. Die Kulturflüssigkeit wird auf eine
optische Dichte von 0,5 ^>ei 546 nm eingestellt. Die Endes
konzentration "beträgt etwa 5x10 Bakterien pro 1 ml.
Die zu untersuchenden Antibiotika werden in den nachstehend angegebenen Dosen eingesetzt.
V er s u c h 1
Als Antibiotikum wird Penicillin und als Mikroorganismus 20
Staphylococcus aureus verwendet. Das Antibiotikum wird in Mengen von 0,1, 0,05 und 0,02 Einheiten/ml verwendet.
Die Kurven von J1Xg. 5 stellen die Änderungen der Potential—
differenz in Abhängigkeit von der Zeit dar, die bei An-25
Wesenheit der unterschiedlichen Dosen beobachtet werden. Die Kurve T gibt die Änderung der Potentialdifferenz bei einem Kontrollversuch an.
Es lässt sich feststellen, dass sich die Änderung im wesent 30
liehen auf die Signalamplitude auswirkt: Zum gegebenen Zeit punkt (in Abhängigkeit von der Antibiotikumkonzentration im Medium) stellt man einen Stillstand der Potentialveränderung fest. Anschliessend ergibt sich ein Wiederanstieg des Potentials, entsprechend der Eeoxidation des Mediums aufgrund der Stoffwechselhemmung. Das Penicillin verhält
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1 sich, in diesem Versuch, wie ein Bakterizid.
Versuch. 2
Als Antibiotikum wird Chloramphenicol (in Mengen von 1, 2, 5 bzw. 10 ug/ml) und als Mikroorganismus Staphylococcus aureus verwendet.
Die Kurven von Fig. 6 geben die beobachteten Vorgänge wieder.
Man stellt im wesentlichen eine Veränderung der Neigung der 10
Kurven ohne sekundäre Oxidation und ohne Veränderung des endgültigen Potentials fest, abgesehen von erhöhten, rasch, letal wirkenden Dosen. In einer Dosis von 10 ;ng/ml Chloramphenicol lässt sich nach. Überimpfung der Bakterien ,nicht einmal eine Potentialveränderung feststellen. Bei schwachen Dosen verhält sich die Verbindung in diesem Versuch wie ein Bakteriostatikum.
Versuch 3
2Q Als Antibiotikum wird Rifamycin in Mengen von 1, 2 bzw.
5 ug pro 1 ml in den -unterschiedlichen Versuchen und als Mikroorganismus E. coli verwendet.
Die Kurven von Fig. 8 geben die beobachteten Vorgänge in den einzelnen Fällen wieder, wobei die Kurve T eine Kontrollkurve darstellt. Die bei Anwesenheit des Antibiotikums beobachteten Veränderungen sind sehr charakteristisch. Es lässt sich eine Erhöhung der Latenzzeit und insbesondere eine verstärkte Neigung der Kurven feststellen. Dieses Antibiotikum verhält sich somit mehr als Bakteriostatikum.
Versuch 4-
6 Antibiotika werden in einer Konzentration von 0,5/ig/ml •auf ihre Wirkung gegenüber Staphylococcus aureus untersucht.
Die Kurven von Fig. 9 geben die jeweils beobachteten Vor-
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gänge wieder: Erythromycin (E), Oleandomycin (O), Lincomycin (L), Clindamycin (C), Virginiamycin (V) und Pristinamycin (P).
Es ergeben sich Veränderungen der Latenzzeit und des Potentials. Aus den Kurven ergibt sich, dass Lincomycin und Oleandomycin am wenigsten aktiv sind. Dann folgen Erythromycin und Clindamycin. Am wirksamsten sind Virginiamycin und Pristinamycin.
10
Aus diesem Beispiel ergibt sich, inwiefern mit dem erfindungsgemässen Verfahren leicht eine Unterscheidung zwischen den Aktivitäten von verschiedenen Antibiotika gegenüber bestimmten Bakterien durchgeführt werden kann. 15
Ve r s u c h 5
Bei diesem Versuch wird E. CoIi ΚΊ2 verwendet. Dabei wird das erfindungsgemässe Verfahren auf die Untersuchung der Wirkung von kombinierten Antibiotika im Vergleich mit der Wirkung der einzelnen Antibiotika angewendet.
Als Antibiotika werden Gentamycin (G) in einer Menge von 0,5 ug/ml und Rifamycin (E) in einer Menge von 1 ug/ml verwendet. Die Kurven von Fig. 10 geben die beobachteten Vorgänge für die einzelnen Antibiotika sowie für eine Kombination aus beiden Antibiotika (G + R) wieder. Bei der Analyse der Kurven ergibt sich eine synergistische Wirkung. Während bei Anwesenheit der einzelnen Antibiotika eine Zellentwicklung der Bakterienkultur festzustellen ist (auch wenn diese eingeschränkt ist), ergibt sich bei gleichzeitiger Anwendung der beiden Antibiotika eine vollständige Hemmung der Zellentwicklung.
•In sämtlichen vorstehenden Beispielen bestehen die Elektroden aus einer Gold-Messelektrode und einer Kalomel-Bezugs-
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1 elektrode (Produkt der Firma Tacusel, Typ C8).
Es ist festzustellen, dass, abgesehen von Fällen unter streng anaeroben Bedingungen, die Untersuchungen entweder unter freiem Luftzutritt, unter kontrollierter Atmosphäre oder in einem verschlossenen Behälter durchgeführt v/erden können.
Der Nachweis der Redoxvorgänge beim erfindungsgemässen Verfahren lässt sich nicht nur mit potentiometrischen Verfahren durchführen. Beispielsweise können auch Farbindikatoren angewendet werden. Beispiele für entsprechende Farbindikatoren, die zum Nachweis der vorstehend aufgeführten Redoxvorgänge geeignet sind, sind beispielsweise bei Chariot "Les Methodes de la Chimie Analytique", Masson, 1966, S. 316 bis 322 aufgeführt. Zum Nachweis der Veränderungen der relativen Konzentrationen von reduzierter und oxidierter Form von Elektronentransportverbindungen lassen sich auch andere elektrochemische Verfahren anwenden, beispielsweise spektrophotometrische Verfahren in lichtdurchlässigen Medien.
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Claims (21)

VOSSIUS · VOSSIUS · HILTL · TAUCHNER - HEUNEMANN SIEBERTSTRASSE A- · 8OOO MÜNCHEN SS · PHONE: (O89) 4-74-O7S CABLE: BEN ZOLPATENT MÜNCHEN ■ TELEX 5-29 453 VOPAT D u.Z.: M 783 4. Juli 1978 Case: D. 77 20538 AGENCE NATIONALE DE VALORISATION DE LA RECHERCHE (ANVAR) Neuilly-sur-Seinef Frankreich 10 "Verfahren zum Nachweis und zur Untersuchung von zellulärer Aktivität und Mittel zur Durchführung des Verfahrens" Priorität: 4-. Juli 1977, Frankreich, Nr. 77 20538 Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis und zur Untersuchung des Verhaltens von gegebenenfalls in einem Medium vorhandenen Zellen,zellähnlichen Gebilden oder Zellfraktionen, insbesondere von Bakterien, dadurch gekennzeichnet,
dass man
das Medium, das insbesondere von dem Zeitpunkt an, an dem man eine Zellaktivität fördern will, einerseits einen oder mehrere Nährstoffe, die eine Entwicklung oder Aktivität der Zellen, zellähnlichen Gebilde oder Zellfraktionen gemäss einem oder mehreren bestimmten Stoffwechselvorgängen ermöglichen, und andererseits andere, keine Fährstoffe darstellende, aber zum Wachstum notwendige Grundbestandteile enthält, mit mindestens einer exogenen Verbindung nachstehend als Elektronentransportverbindung bezeichnet,
ORIGINAL INSPECTED
γ -ι
1 die aus einer Gruppe von Verbindungen, insbesondere
von Cofaktoren oder Coenzymen, ausgewählt sind, die in einen der genannten Stoffwechselvorgänge eingreifen und in oxidierter und reduzierter Form eines Redoxsystems vor-
5 liegen können, versetzt, und
ein Messverfahren zum Nachweis einer eventuell auftretenden Veränderung der relativen Anteile von oxidierter und reduzierter Form der Elektronentransportverbindung, die zu einem, bestimmten Zeitpunkt durch die Stoffwechselaktivität der Zellen,zellähnlichen Gebilde oder Zellfraktionen im Medium induziert wird, anwendet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekerrnzeichnet, dass man den oder die Nährstoffe so auswählt, dass sie eine oxidative Decarboxylierung von oc-Ketonsäuren und insbesondere von Brenztraubensäure ermöglichen.
3· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Elektronentransportverbindung Flavin-adenin-dinucleotid oder Nikotinamidadenin-dinucleotid verwendet.
H-, Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Elektronentransportverbxndung Liponsäure verwendet.
5- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4-, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektronentransportverbxndung im Medium in überwiegend oxidiertem Zustand vorhanden ist oder diesem zugesetzt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der oder die Nährstoffe
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oder das oder die energiereichen Substrate, die im Medium, auf das die Messung der Veränderung der relativen Bestandteile der oxidierten und reduzierten Form der Elektronentransportverbindung angewendet wird, enthalten sind, aus dem oder den Nährstoffen allein, die für die Stoffwechselvorgänge, derer man sich zum Nachweis der Zellen, zellähnlichen Gebilde oder Zellfraktionen bedienen will, bestehen, wobei Nährstoffe, die andere StoffWechselvorgänge ermöglichen, praktisch ausgeschlossen sind. 10
7- Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Nährstoff bzw. das energiereiche Substrat aus Glucose besteht.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gek ennz ei chne t, dass das Verfahren in Gegenwart eines Redoxkatalysators durchgeführt wird, wenn die Elektronentransportverbindung selbst nicht die erforderlichen Eigenschaften zum direkten Nachweis der Redoxvorgänge, denen sie selbst unterzogen wird, geeignet ist.
9- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennz e ic hne t, dass der Nachweis der Veränderung der relativen Bestandteile von oxidierter und reduzierter Form der Elektronentransportverbindung durch ein potentiometrisch.es Verfahren vorgenommen wird, das darin besteht, die Änderungen des Potentialunterschieds zwischen einer Messelektrode im Kontakt mit dem untersuchten Medium und einer Bezugselektrode festzustellen.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man als keine Nährstoffe darstellende Grundbestandteile Mineralsalze verwendet, die einerseits dem Medium eine ausreichende Ionenleitfähigkeit verleihen, dass ein Nachweis der Potential-
i— 80 9 884/0829 ~*
Γ - 4 - -i
Veränderungen aufgrund der JRedoxvorgähge mit der Messelektrode möglich, ist, und die andererseits das Medium auf einen für die Zellentwicklung geeigneten pH—Wert, der vorzugsweise in der Nähe des Meutralbereichs liegt,
5 puffern.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1Q, dadurch gekennzeichnet, dass zu einem bestimmten Anfangszeitpunkt sämtliche physiko-chemisehen Parameter bezüglich des Mediums fixiert sind, insbesondere was die anfänglichen Konzentrationen des Mediums an Sauerstoff, Elektr onentransp ortverbindung und sämtlichen anderen Bestandteilen, die für die Ernährung und Entwicklung der zu untersuchenden Zellen erforderlich sind, betrifft, und dass man die Messungen bis zu einem festgelegten Zeitpunkt fortsetzt oder die Messung der eventuellen Veränderung der relativen Verhältnisse von oxidierter und reduzierter Form der Elektronentransportverbindung, die durch die Stoffwechselaktivität der Zellen, zellähnlichen Gebilde oder Zellfraktionen in diesem Medium hervorgerufen worden sein kann, zu diesem bestimmten Zeitpunkt durchführt.
12. Anwendung des Verfahrens gemäss Anspruch 11 auf ein
Kontrollverfahren, bei dem festgestellt werden soll, ob die Zellaktivität in einem Medium eine vorbestimmte Toleranzgrenze übersteigt oder nicht.
13. Ausführungsform nach Anspruch 12, dadurch g e kennzeichnet, dass das Verfahren auf die Bestimmung der Toleranzgrenze einer eventuellen bakteriellen Verunreinigung von für den Verzehr bestimmten Flüssigkeiten oder für biologische Medien angewendet wird.
14.. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch
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gekennzeichnet, dass zu einem bestimmten Anfangszeitpunkt sämtliche physiko-chemischen Parameter bezüglich des Mediums fixiert sind, insbesondere was die anfängliche Konzentration des Mediums an Sauerstoff,· Elektronentransportverbindung und sämtlichen anderen Bestandteilen, die für die Ernährung und Entwicklung der zu untersuchenden Zellen erforderlich sind, betrifft, und dass man die Messung bis zum Auftreten der Veränderung der relativen Verhältnisse von oxidierter und reduzierter Form der Elektronentransportverbindung fortsetzt und gegebenenfalls die Steigung der Kurve, die diese Veränderung in Abhängigkeit von der Zeit wieder gibt, bestimmt.
15. Verfahren nach Anspruch 14-, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium ausserdem einen oder mehrere Substanzen, insbesondere einen oder mehrere Regulatoren der Z eil aktivität,, insbesondere der Membranaktivität, beispielsweise Antibiotika, enthält, deren Einfluss auf die Latenzzeit und/oder auf die Steigung der genannten Kurve untersucht werden soll.
16. Anwendung des Verfahrens nach Anspruch I5 einerseits auf eine vergleichende Untersuchung der Wirkungen eines Regulators der Zellaktivitäten vom genannten Typ gegenüber unterschiedlichen Zellen,zellähnlichen Gebilden oder Zellfraktionen, andererseits auf die vergleichende Untersuchung der Wirkung von verschiedenen Regulatoren der Zellaktivität untereinander oder von verschiedenen Kombinationen von derartigen Regulatoren untereinander oder im Vergleich zu den isolierten Regulatoren gegenüber einer oder mehreren Zellen, zellähnlichen Gebilden oder Zellfraktionen.
17. Mittel zur Durchführung der Verfahren nach einem der An-
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Sprüche 1 bis 16, gekennzeichnet durch
folgende Bestandteile:
a) ein energiereiches Substrat, gewählt entsprechend dem Stoffwechselvorgang, zur Entwicklung der Mikro-
^ Organismen, die in dem Medium vorhanden sein können, vorzugsweise unter Ausschluss von allen anderen metabolisierbaren Substraten,
b) mineralische Bestandteile, die zum Wachstum der Mikroorganismen notwendig sind und vorzugsweise Salze, die dazu beitragen, dass das Medium eine erhöhte Ionenleitfähigkeit aufweist und ausserdem als pH-Puffer, insbesondere unter Erzielung eines pH-Werts im Neutralbereich, wirken,
c) eine Elektronentransportverbindung der angegebenen Art und
d) gegebenenfalls einen oder mehrere Wachstumsfaktoren, beispielsweise Hefeexfcrakt oder analoge Produkte, insbesondere in Fällen, in denen eine bakterielle Beimpfung von verminderter Bedeutung ist oder in denen
20 die Bakterien diese Paktoren benötigen.
18. Mittel nach Anspruch 17, gekennzeichne t durch einen Gehalt an folgenden Bestandteilen: eine ausreichende Menge an Phosphaten, um die vorstehend
25 angegebene Wirkung hervorzurufen,
Glucose als energiereiches Substrat und/oder einen oder mehrere andere Zucker, insbesondere solche, die von bestimmten Bakterien in den speziellen Medien verwertet werden können, beispielsweise Lactose für E. coli,
30 und
Liponsäure, vorzugsweise in oxidierter Form.
19- Mittel nach Anspruch 17 oder 18, d a d u r c h gekennzeichnet, dass das energiereiche Substrat die einzige Kohlenstoffquelle für das Mittel darstellt,
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abgesehen von der Elektronentransportverbindung und gegebenenfalls vom Redoxindikator und dem oder den· Wachstumsfaktoren.
20. Ausführungsform nach Anspruch 12 und 13, wobei eine wiederholte Überwachung durchgeführt wird, die jeweils folgende Massnahmen umfasst:
Einführung einer standardisierten Probe aus dem zu untersuchenden Medium in das Gefäss einer Messvorrichtung, Einführung des Mittels nach einem der Ansprüche 17 ^is 19 bzw. der Bestandteile eines derartigen Mittels und Sättigung des Mediums mit Sauerstoff, insbesondere durch Bewegen in Gegenwart von Luft,
Verschliessen des Behälterinhalts gegen die Umgebung, Feststellen einer eventuellen Veränderung der relativen Verhältnisse von oxidierter und reduzierter Form der Elektronentransportverbindung während einer bestimmten Zeit und eventuelle Ausnutzung eines Warnsignals, das durch einen für die genannte Veränderung charakteristi—
20 sehen Schwellenwert hervorgerufen wird, und
Entleeren, Spülen und Sterilisieren des Behälters, der somit für einen neuen Messzyklus bereitsteht.
21. Ausführungsform nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Überwachung einer eventuellen Veränderung der relativen Verhältnisse von oxidierter und reduzierter Form der El ektr onentransp ortverbindung potentiometrisch vorgenommen wird.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1984004109A1 (en) * 1983-04-19 1984-10-25 Bio Instructa Labkonsult Method and device for analysis of the activity of receptors of certain cells

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5682884A (en) * 1983-05-05 1997-11-04 Medisense, Inc. Strip electrode with screen printing
US5509410A (en) * 1983-06-06 1996-04-23 Medisense, Inc. Strip electrode including screen printing of a single layer
FR2549964B1 (fr) * 1983-07-29 1985-12-20 Claeys Luck Methode et appareil pour mesure de l'activite tampon acido-basique des semences en vue de l'exploration metabolique
US4615877A (en) * 1984-02-27 1986-10-07 Savapa S.R.L. Method of determining the oxidizing activity of a biological liquid, and a corresponding reagent
DE3776806D1 (de) * 1986-03-19 1992-04-02 Pena Paul De La Ltd Vermittler fuer bioelektrochemische zellen.
DE3788151T2 (de) * 1986-04-16 1994-05-19 Water Research Centre Marlow Schadstoffdetektor.
GB8910539D0 (en) * 1989-05-08 1989-06-21 Metal Box Plc Electrochemical detection of growth of micro-organisms
EP0397362B1 (de) * 1989-05-08 1995-06-21 CarnaudMetalbox plc Elektrochemische Feststellung der Mikroorganismenvermehrung
US5135852A (en) * 1989-07-25 1992-08-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Piezoelectric cell growth biosensing method using polymer-metabolic product complex interactions
WO2002047530A1 (en) * 2000-12-15 2002-06-20 Johnsondiversey, Inc. Device for monitoring a wash process
DE102009009292A1 (de) * 2009-02-17 2010-08-26 Siemens Aktiengesellschaft Diagnosegerät

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3506544A (en) * 1964-10-09 1970-04-14 Magna Corp Method of determining microbial populations,enzyme activities,and substrate concentrations by electrochemical analysis
GB1107700A (en) 1966-03-29 1968-03-27 Matsushita Electronics Corp A method for manufacturing semiconductor devices
US4006061A (en) * 1975-12-29 1977-02-01 Monsanto Company Lactate dehydrogenase determination method

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1984004109A1 (en) * 1983-04-19 1984-10-25 Bio Instructa Labkonsult Method and device for analysis of the activity of receptors of certain cells

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