DE2841896C3

DE2841896C3 - Verfahren zum Nachweis einer toxischen Substanz

Info

Publication number: DE2841896C3
Application number: DE2841896A
Authority: DE
Inventors: Anthony A Bulich; Don L Isenberg; Edward H Sie
Original assignee: Microbics Corp
Current assignee: Azur Environmental Carlsbad Calif Us
Priority date: 1977-09-28
Filing date: 1978-09-26
Publication date: 1996-09-26
Anticipated expiration: 1998-09-27
Also published as: DE2841896A1; DE2841896C2; GB2005018B; FR2404847A1; GB2005018A; BE870833A; NL7809821A; SE462166C; SE7810154L; FR2404847B1; JPS5728272B2; SE462166B; CA1103050A; JPS5458492A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis toxischer Substanzen unter Verwendung von Änderungen in den Stoffwechselprozessen biologischer Organismen als Indikator.

Biologische Organismen bilden einen empfindlichen und verhältnismäßig zuverlässigen Indikator für das Vorliegen selbst relativ kleiner Anteile toxischer Substanzen in einem Strömungsmittel. Mit zunehmender Besorgnis wegen der Verunreinigung von Wasser und der schädlichen Auswirkung toxischer Substanzen auf den Menschen wurde die Umweltschutzbehörde ("Environmental Protection Agency" = US-Umweltschutzbehörde) mit der Verantwortlichkeit für die Aufstellung von Vorschriften und Testverfahren für den Nachweis des Vorliegens toxischer Substanzen in Wasser betraut. Das derzeit von den meisten Forschern auf diesem Gebiet bevorzugte Testprogramm bzw. -protokoll sieht vor, daß man biologische Organismen, wie beispielsweise kleine Fische oder Wasserflöhe, mit dem zu untersuchenden Wasser in Berührung bringt. Das Vorliegen toxischer Substanzen wird hierbei durch gestörtes zielloses physiologisches Ansprechverhalten oder gar durch den Tod der Fische oder Wasserflöhe angezeigt; die Konzentration des toxischen Materials wird aus der Überlebensrate der Organismen bestimmt. Diese Tests sind zeitaufwendig und kostspielig. So werden beispielsweise bei der Verwendung von Elritzen zur Testuntersuchung von Wasser auf toxische Substanzen die Tests über eine Zeitperiode von 48 bis 96 Stunden durchgeführt; für die Stabilisierung der Elritzenpopulation vor den tatsächlichen Tests ist noch eine viel längere Zeit in der Größenordnung von 1 bis 4 Wochen erforderlich. Abgesehen von den langen Testdauern kann auch wegen der Besonderheit jeder jeweiligen für das Testverfahren verwendeten Fischpopulation die Erzielung reproduzierbarer Ergebnisse Schwierigkeiten bereiten.

Man hat auch bereits vorgeschlagen, Mikroorganismen zur Testanalyse von Proben zum Nachweis verschiedener Substanzen zu verwenden. So wird beispielsweise in der US-Patentschrift 33 70 175 die Verwendung lumineszierender Mikroorganismen für den Nachweis toxischer Substanzen in Luft beschrieben. Der Stoffwechsel der Leuchtmikroorganismen wird durch niedrige Pegelwerte von Schadstoffen beeinflußt, was sich wiederum auf die Intensität der Lichtemission auswirkt. Durch Messung von Änderungen der Lichtausgangsleistung lassen sich das Vorliegen und die relative Konzentration eines toxischen Schadstoffes nachweisen. Ähnliche Systeme sind in den US-Patentschriften 38 49 653 und 39 58 938 beschrieben.

Die in den vorstehend genannten Patentschriften beschriebenen Systeme sind speziell für den Nachweis toxischer Substanzen in Dampf, Aerosol oder Gasform bestimmt und setzen voraus, daß die Mikroorganismenkulturen sich in einem Wachstumszustand auf Festkörpersubstraten befinden, um einen maximalen Kontakt zwischen der zu untersuchenden Luft und der Kultur zu gewährleisten. Diese bekannten Systeme eignen sich daher nicht zur Verwendung in einer Flüssigkeitsumgebung und sind daher für die Testuntersuchung von Wasser und anderen Flüssigkeiten nicht gangbar. Für die Anwendung dieser Systeme sollen vorzugsweise die Umgebungsbedingungen hinsichtlich Feuchtigkeit und Temperatur auf bestimmten optimalen Pegelwerten gehalten werden, um ein kontinuierliches Wachstum der Mikroorganismenkultur zu gewährleisten. Dies ist erforderlich, da die gleiche Kultur mehrere Male immer wieder verwendet wird.

Insgesamt besitzen die vorstehend beschriebenen bekannten Systeme nach dem Stand der Technik den Nachteil, daß sie entweder zeitaufwendig, schwierig und kostspielig in der Durchführung sind oder daß sie sich nicht zur Anwendung für die Testuntersuchung toxischer Substanzen in flüssiger Umgebung eignen.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zum Nachweis einer toxischen Substanz oder eines toxischen Zustandes durch Bestimmung der Änderung der von einem Biolumineszenzorganismus ausgehenden Lumineszenzemission als Maß der Einwirkung der toxischen Substanz bzw. des toxischen Zustandes auf den Stoffwechsel des Biolumineszenzorganismus.

Ausgehend von den oben erwähnten bekannten Verfahren dieser Art liegt der Erfindung als Aufgabe die Schaffung eines derartigen Biolumineszenz-Nachweisverfahrens für Toxizitätsgehalte in Strömungsmittelproben zugrunde,

- das sich zur Anwendung zum Toxizitätsnachweis in flüssiger Umgebung, d. h. in flüssigen Proben, insbesondere Gewässerproben, eignet,
- das in seiner Vorbereitung und Ausführung einfach und kostengünstig durchführbar ist und insbesondere keine langwierigen und kritischen Präparierungsarbeiten zur Bereitstellung einer in Wachstum befindlichen Mikroorganismenkultur unter optimalen Wachstumsbedingungen erfordert,
- das infolge seines bezüglich der Präparierung der verwendeten Lumineszenzmikroorganismen geringen Arbeits-, Sorgfalts- und Kostenaufwands ggf. auch die Durchführung im Einwegverfahren bezüglich der verwendeten Mikroorganismen gestattet und
- das - bezogen auf die jeweilige Probenmenge und den Einsatz an Mikroorganismen - eine hohe Lichtausbeute gewährleistet und damit eine verbesserte Empfindlichkeit und Genauigkeit ermöglicht.

Zur Lösung dieser Aufgabe sieht die Erfindung bei einem Verfahren der vorstehend genannten Art die folgenden Verfahrensschritte vor:

(a) Herstellen einer Suspension eines lyophilisierten Kulturstammes eines Lumineszenzleuchtmikroorganismus in einem wäßrigen Suspensionsmedium, wobei die Zellen nicht mehr zahlenmäßig anwachsen dürfen, und anschließende unmittelbare Verwendung der suspendierten Leuchtmikroorganismen,
(b) direktes Bestimmen der Änderung der Lumineszenzausgangsgröße der Suspension nach Einbringen einer zu untersuchenden wäßrigen Lösung oder Suspension oder eines zu untersuchenden Pulvers.

Nach dem Grundgedanken der Erfindung wird somit aus einem in lyophilisierter Form vorliegenden Lumineszenz- bzw. Leuchtmikroorganismus eine Suspension hergestellt, die als Arbeitslösung für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens dient. In diese aus einer lyophilisierten (und daher leicht beliebig lager- und versandfähigen) Kultur des Mikroorganismus hergestellte Arbeitssuspension wird sodann die zu untersuchende Probe in Form einer wäßrigen Lösung, einer wäßrigen Suspension oder eines Pulvers eingebracht, was in einfacher Weise durch Vermischung erfolgen kann. Diese mit der zu messenden Probe versetzte Suspension wird sodann auf die Änderung (d. h. in der Regel: den Abfall) der Lumineszenzausgangsleistung gegenüber dem vorherigen, nicht mit der Probe versetzten Zustand der Arbeitssuspension überwacht und die festgestellte Änderung als Anzeige des Toxizitätsgehalts der untersuchten Probe ausgewertet.

Diese erfindungsgemäße Vorgangsweise erbringt eine Reihe bedeutsamer Vorteile:

(a) die Ausgangsform des jeweils verwendeten Mikroorganismenstammes in lyophilisierter Form ist in einfacher Weise ohne nennenswerten Aufwand beliebig lager- und versandfähig, derart daß das Grundmaterial in großer Menge jederzeit verfügbar gehalten werden kann;
(b) die Rekonstituierung der Mikroorganismen aus dieser lager- und versandfähigen lyophilisierten Form ist in einfachster Weise durch Suspendieren in einem wäßrigen Suspensionsmedium möglich, wodurch der Mikroorganismus in einen aktiven, für den Einsatz als Toxizitätsdetektor im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ausreichenden Zustand versetzt wird, ohne daß hierfür zeitaufwendige und kritische Vorbereitungsmaßnahmen zur Überführung der Mikroorganismenkultur speziell in einen Wachstumszustand unter genau kontrollierten Umgebungsbedingungen wie bei den bekannten, in trockener Phase arbeitenden und auf Wiederverwendung der Mikroorganismen angelegten Verfahren erforderlich sind. Diese äußerst einfache Art der Präparierung durch einfache Rekonstituierung der lyophilisierten Form in einem geeigneten wäßrigen Suspensionsmedium gestattet es, den Mikroorganismus jeweils fall- und bedarfsweise für die Anwendung zu aktivieren, und zwar nur in der jeweils benötigten Menge;
(c) die Anwendung des Mikroorganismus in einer Arbeitslösung in Suspensionsform gewährleistet gleichzeitig eine intensive Aktivierung der verwendeten Mikroorganismen (verglichen etwa mit dem Fall der Herstellung der Kultur auf einem Festkörpersubstrat), und sie ermöglicht gleichzeitig eine intensive Kontaktierung des aktivierten Mikroorganismus mit der zu untersuchenden Probe durch einfaches Vermischen mit der Arbeitssuspension. Bezogen auf eine gegebene Probenmenge und/oder eine gegebene Einsatzmenge von Mikroorganismen erbringt das erfindungsgemäße Verfahren damit ein wesentlich größeres, zugleich gleichmäßigeres und besser reproduzierbares Ausgangssignal und insgesamt eine höhere Empfindlichkeit und bessere Reproduzierbarkeit;
(d) die erfindungsgemäße Anwendung des Mikroorganismus durch einfache Rekonstituierung einer lyophilisierten Form des Mikroorganismus in einem Arbeitsmedium zu einer Arbeitslösung ermöglicht es gleichzeitig, auf eine Mehrfachverwendung des Mikroorganismus zu verzichten und die jeweilige Arbeitslösung im Einwegverfahren zu verwenden, die nach einem Versuchsgang weggeschüttet werden kann; demgemäß ist für die Aufrechterhaltung des Mikroorganismus in seinem aktivierten Zustand nur ein wesentlich geringerer Sorgfalts- und apparativer Aufwand erforderlich im Vergleich mit den auf eine Mehrfachverwendung der Mikroorganismenkultur angelegten bekannten Verfahren, bei welchen die Kultur sich bei der Anwendung in einem genau kontrollierten Wachstumszustand befinden muß, der nach Durchführung der Messung auch nachher wieder genau hergestellt und aufrechterhalten werden muß, bis zur Wiederverwendung;
(e) auch gegenüber den derzeit gebräuchlichen, mit höheren Organismen wie Fischen arbeitenden biologischen Testverfahren zur Überwachung von Toxizitätsgehalten weist das erfindungsgemäße Verfahren wesentliche Vorteile auf. Die bekannten, mit Fischen als Indikatoren arbeitenden Testverfahren benötigen zum einen beträchtliche Testdauern zur Feststellung der Auswirkung der toxischen Substanz oder des toxischen Zustands auf die als Indikator dienenden Organismen (Fische) und sind zudem meist verhältnismäßig ungenau. Demgegenüber kann das erfindungsgemäße Verfahren im Verlauf von wenigen Minuten durchgeführt werden und eignet sich praktisch als Testmethode für den Feldeinsatz. Die Ergebnisse sind praktisch sofort verfügbar, so daß sich das erfindungsgemäße Verfahren besonders zur Anwendung bei Ablaßsituationen eignet, wo die Zeit eine wesentliche Rolle darstellt, um ggf. die in ein Gewässer oder dergleichen abgelassene Menge von einen unzulässigen Schadstoffpegel enthaltenden Abwässern möglichst gering zu halten. Das erfindungsgemäße Verfahren ist zudem sehr genau, und die Gestehungskosten sind gegenüber herkömmlichen Testverfahren wesentlich geringer. Das erfindungsgemäße Testverfahren eignet sich daher insbesondere auch für private Anwendungen, beispielsweise in Industrielaboratorien und dergleichen, und kann als Routinetestverfahren mit entsprechend häufiger Frequenz beispielsweise zur Überwachung der Abwässer von Fabriken eingesetzt werden;
(f) das erfindungsgemäße Verfahren ist auch unkritisch hinsichtlich der Aufeinanderfolge der beiden Verfahrensschritte "Herstellung der Suspension" und "Kontaktierung mit der toxischen Substanz"; so kann beispielsweise unter bestimmten Umständen (etwa in Fällen niedriger Toxizitätskonzentrationen in der zu untersuchenden Flüssigkeitsprobe) der Mikroorganismus direkt in die zu untersuchende Probe eingebracht und in dieser suspendiert werden;
(g) das erfindungsgemäße Verfahren ist grundsätzlich auch nicht auf anfänglich flüssige Form des auf Toxizität zu untersuchenden Materials beschränkt, vielmehr reicht es aus, daß die zu untersuchende Probe in flüssige Form überführt werden kann.

Aus der DE-OS 21 25 126 ist es bekannt, den Gehalt einer Flüssigkeit an einem Bakterium (lebend oder tot) unter Heranziehung einer Chemolumineszenzreaktion zweier chemischer Reaktanten in Abhängigkeit von dem (lebenden oder toten) Bakterium nachzuweisen. Die Anwendung von Leuchtmikroorganismen als Indikator für einen Toxizitätszustand unter Heranziehung der von dem Toxizitätszustand abhängigen Biolumineszenz der Mikroorganismen als Meßgröße ist hieraus nicht bekannt.

Aus "Soil Biology and Biochemistry", Vol. 7, pp. 39 to 44, ist ein spezifisches Biotestverfahren für die Photosynthese inhibierende Herbizide bekannt, im Rahmen dessen eine flüssige Suspension von Biolumineszenzbakterien Anwendung findet. Bei dem bekannten Verfahren handelt es sich um ein indirektes, zweistufiges Verfahren, bei welchem die auf ihren Herbizidgehalt zu untersuchende Flüssigkeitsprobe, beispielsweise wäßrige Bodenextrakte, mit einer Algenart versetzt und die so mit der Algenart versetzte Flüssigkeitsprobe einer Bestrahlung zur Einleitung und Unterhaltung einer kontrollierten Photosynthese der Algen ausgesetzt wird. Die Photosynthese wird je nach dem Herbizidgehalt der Flüssigkeitsprobe mehr oder weniger behindert. Der bei der Photosynthese der Algen gebildete Sauerstoff dient als primäres Meßkriterium. Dieser Sauerstoff wird seinerseits in einer zweiten Stufe des Meßverfahrens nach einer Biolumineszenzmethode unter Verwendung eines Lumineszenzbakteriums bestimmt. Hierzu wird - von der zu überwachenden Probenlösung getrennt - eine flüssige Suspension des Lumineszenzbakteriums hergestellt, und der in der Probenlösung durch die Algenphotosynthese erzeugte Sauerstoff in diese Lumineszenzbakteriensuspension eingeleitet, zur lumineszenzphotometrischen Bestimmung des Sauerstoffgehalts. Die beiden Suspensionen: die zu messende, das Herbizid enthaltende Probenlösung einerseits und die für den Sauerstoffnachweis in der zweiten Stufe verwendete Lumineszenzbakteriensuspension andererseits, müssen während des gesamten Verfahrens voneinander getrennt gehalten werden, die Lumineszenzbakteriensuspension kommt somit zu keinem Zeitpunkt in direkten Kontakt mit der die Toxizität enthaltenden Probenlösung, insbesondere unterliegt das Lumineszenzbakterium zu keiner Zeit einer direkten Einwirkung durch den Toxizitätsgehalt der zu überwachenden Probe, sondern dient wie gesagt lediglich in einer zweiten gesonderten Verfahrensstufe zur lumineszenzphotometrischen Bestimmung des in der ersten Stufe durch Photosynthese der Algen erzeugten Sauerstoffs. Dieses bekannte Verfahren ist daher seinem Wesen nach auf die Bestimmung solcher Toxizitätssubstanzen oder -zustände beschränkt, welche eine Inhibitorwirkung auf die Photosynthese von Algen haben. Dieses bekannte Verfahren ist zudem verfahrensmäßig umständlich und aufwendig und langwierig. In der mit den Algen versetzten Probenflüssigkeit muß anfänglich jeder Sauerstoffgehalt entfernt und die Probenflüssigkeit während des gesamten Testvorgangs frei von jeglichem anderen Sauerstoff als dem durch die Photosynthese der Algen gebildeten gehalten werden, um den Photosynthesesauerstoff als primäres Meßkriterium für den Toxizitätsgehalt der Flüssigkeitsprobe heranziehen zu können. Ebenso muß die davon gesonderte Lumineszenzbakteriumsuspension von ihrem anfänglichen Sauerstoffgehalt befreit und während des Testvorgangs von der Bildung oder dem Zutritt anderweitigen Sauerstoffs als dem aus der Photosynthese der Algen zugeführten Sauerstoff freigehalten werden. Zu diesem Zweck der Beseitigung und Verhinderung jeglichen anderen Sauerstoffs als dem durch die Photosynthese gebildeten Sauerstoff müssen bei dem bekannten Verfahren die beiden Suspensionen evakuiert werden und der Evakuierungszustand während des gesamten Verfahrens aufrechterhalten werden. Sowohl die Algensuspension (als primäre Meßstufe) als auch die Lumineszenzbakteriumsuspension (als sekundäre Stufe) müssen sorgfältig und unter kontrollierten Bedingungen für optimalen Wachstumszustand vorbereitet werden. Insbesondere für die Zubereitung der Lumineszenzbakteriumsuspension sind Inkubationszeiten in der Größenordnung von einem Tag erforderlich. Die Dauer des eigentlichen Tests liegt in der Größenordnung von 30 Minuten bis 1 Stunde. Demgegenüber betrifft das erfindungsgemäße Verfahren ein direktes, einstufiges Biotestverfahren, bei welchem der Lumineszenzmikroorganismus in flüssiger Suspension, die in einfacher, rascher Weise aus einem lyophilisierten Kulturstamm rasch und quantitativ genau kontrollierbar herstellbar ist, unmittelbar mit der toxizitätshaltigen Probe vermischt wird und die direkte Einwirkung des Toxizitätsgehalts auf den Stoffwechsel des Lumineszenzmikroorganismus als primäres Meßkriterium dient.

Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann vorgesehen sein, daß als Lumineszenz- bzw. Leuchtmikroorganismen Bakterien aus der Gruppe der Gattungen Photobacterium, Vibrio, Achromobacter, Lucibacterium sowie Gemische hiervon, vorzugsweise Lumineszenz- bzw. Leuchtmikroorganismen aus der Gruppe P. splendidum, P. mandapamensis, P. phosphoreum, V. fischeri, A. fischeri, L. harveyi sowie Gemische hiervon, verwendet werden.

Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung kann vorgesehen sein, daß das wäßrige Suspensionsmedium zwischen 0,5 Gew.-% und 6 Gew.-% eines löslichen Alkalimetallsalzes enthält.

Bei der praktischen Erprobung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde festgestellt, daß die Temperatur, auf welcher die Mikroorganismensuspension gehalten wird, die Empfindlichkeit und die Lichtausgangsleistung der Mikroorganismen beeinflussen kann. Obzwar dies keine kritische Bedingung ist, wird daher zur Erzielung bester Ergebnisse eine Überwachung der Temperatur der Probe und der Mikroorganismensuspension vorgezogen.

Im folgenden werden Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung beschrieben; in dieser zeigen

Fig. 1 ein Blockdiagramm einer für die Durchführung der Erfindung verwendeten Anordnung zur Lichtausgangsmessung,

Fig. 2 die Beziehung zwischen der Lichtausgangsleistung eines Leuchtmikroorganismus in Abhängigkeit von einer Phenolkonzentration.

Die Erfindung gibt, wie dargelegt, ein Verfahren zum Nachweis einer toxischen Substanz oder eines toxischen Zustands in Flüssigkeiten anhand, unter Verwendung von Leuchtmikroorganismen als biologischer Indikator. Der Begriff "Flüssigkeit" soll dabei jede zur Aufrechterhaltung von Leben geeignete Flüssigkeit umfassen, die somit typischerweise einen größeren Anteil Wasser und einen kleineren Anteil anderweitiger Bestandteile in darin gelöster oder suspendierter Form aufweist. Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher zum Nachweis toxischer Substanzen oder toxischer Zustände in Wassserversorgungen, ablaufenden Oberflächengewässern u. dgl. dienen. Darüber hinaus eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Anwendung beim Nachweis toxischer Substanzen oder eines toxischen Zustands in Körperflüssigkeiten und Seren sowie anderweitigen Strömungsmedien auf wäßriger Grundlage, in welchen Leben bestehen kann.

Unter der Bezeichnung "Zustand" in dem hier verwendeten Sinn soll die von einer Flüssigkeit gebildete Umgebung für Mikroorganismen verstanden werden.

Eine Substanz oder ein Zustand werden dann als toxisch angesehen, falls er die Stoffwechselvorgänge der erfindungsgemäß verwendeten biologischen Indikatoren nachteilig beeinflußt, was sich in einer Änderung der Lichtausgangsleistung niederschlägt. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zum Nachweis einer breiten Vielfalt toxischer Substanzen und Zustände, wobei jedoch bestimmte Substanzen bekanntermaßen in verhältnismäßig kleinen Konzentrationen Toxizität bezüglich Lebensformen besitzen. Diese Stoffe können in durch industrielle und landwirtschaftliche Abfälle verunreinigten Strömen, Flüssen und anderweitigen Gewässern vorliegen, und die Toxizitätstests für Wasserversorgungen sind daher normalerweise speziell auf den Nachweis des Vorliegens dieser Substanzen abgestellt.

So wurde etwa das Vorliegen von Quecksilber-, Chrom-, Blei- und Zinkverbindungen, Ammoniak, Nitraten, Phosphorverbindungen, Sulfaten und Kupferverbindungen aus den verschiedensten Quellen, sämtlich in durch industrielle Abfälle verunreinigten Gewässern, festgestellt. Außerdem sind auch verschiedene Herbizide, Pestizide, oberflächenaktive Stoffe und anderweitige organische Substanzen in durch industrielle und landwirtschaftliche Nutzungen verunreinigten Gewässern zu erwarten; Beispiele derartiger organischer Verbindungen sind DDT, Phenol, Lindan, Heptachlor, Aldrin, Toluol, 7-12-Dimethylbenzanthracen, 3-Methylcholanthren, o-Aminoazotoluol, 4-Dimethyl-Amino-Azobenzol, Pentachlorphenol, Tetrachlorkohlenstoff, Aceton, Natriumlaurylsulfat sowie Chlordan.

Die vorstehende Liste ist keineswegs erschöpfend und soll keinerlei einschränkende Bedeutung besitzen, sondern lediglich die breite Vielfalt von Substanzen veranschaulichen, deren Vorliegen oder Fehlen toxische Zustände für biologische Organismen bedeuten kann. Typischerweise enthalten die meisten industriellen Abfälle Gemische von als Pollutionssubstanzen geltenden Stoffen, wobei ein oder mehrere dieser Stoffe in ausreichend hohen Konzentrationen vorliegen können, um die Stoffwechselprozesse des biologischen Indikators nachteilig zu beeinflussen und so toxische Zustände begründen zu können.

Die toxische Substanz braucht in der untersuchten Flüssigkeit nicht hochlöslich zu sein. Jedoch muß eine Substanz, um toxisch oder einen toxischen Zustand hervorzurufen, ausreichende physikalische oder chemische Eigenschaften besitzen, daß sie entweder in toxischen Mengen absorbiert werden kann oder die Flüssigkeit, in welcher sie enthalten ist, entweder physikalisch oder chemisch so beeinflussen kann, daß sie einen toxischen Zustand in der Flüssigkeit hervorruft. Praktisch alle toxischen Substanzen, für die ein Test erwünscht ist, erfüllen eine oder beide dieser Bedingungen.

Das auf Toxizität zu untersuchende Material braucht anfänglich nicht als wäßrige Flüssigkeit vorzuliegen. Beispielsweise können die auf Toxizität zu untersuchenden Materialien in Form eines fein verteilten Pulvers vorliegen, das anschließend in einer wäßrigen Trägerflüssigkeit gelöst oder dispergiert oder direkt zu der wäßrigen Suspension der Mikroorganismen zugegeben werden kann.

Allgemein sind Leuchtmikroorganismen in breitestem Sinn empfindlich für toxische Substanzen oder Zustände, unabhängig von dem jeweiligen Mikroorganismusstamm oder -spezies. Jedoch wurde festgestellt, daß einige Mikroorganismenstämme empfindlich für eine bestimmte Substanz oder einen bestimmten Zustand sind und daher bei Kontakt mit dieser Substanz oder diesem Zustand eine deutlicher ausgeprägte Änderung der Lichtausgangsleistung zeigen als für diese gleiche Substanz oder diesen gleichen Zustand weniger empfindliche Stämme. Daher ist jeweils die Verwendung eines speziell nach seiner Empfindlichkeit gegenüber einer bestimmten Substanz oder einem bestimmten Zustand ausgewählten Mikroorganismenstamms vorzuziehen. Die Erfindung erstreckt sich auch auf die Verwendung eines Gemischs von Mikroorganismenstämmen, wobei die einzelnen Stämme jeweils spezielle Empfindlichkeit für bestimmte Substanzen oder Zustände besitzen. Der Gesamteffekt eines derartigen Gemischs von Mikroorganismusstämmen besteht dann in einer erhöhten und verbreiterten Empfindlichkeit für bestimmte verschiedene ausgewählte Arten von Substanzen oder Zuständen.

Jedoch ist andererseits eine genaue Kenntnis der jeweiligen toxischen Substanz oder des toxischen Zustands in dem untersuchten Material nicht erforderlich. Wie erwähnt, sind Leuchtmikroorganismen im breitesten Sinn empfindlich für toxische Substanzen, unabhängig von dem jeweiligen Stamm oder der jeweiligen Spezies und zeigen daher eine Veränderung der Lichtausgangsleistung in Gegenwart einer toxischen Substanz oder eines toxischen Zustandes in der Testflüssigkeit. Wie noch im einzelnen erläutert wird, bildet die Änderung der Lichtausgangsleistung der Mikroorganismen eine bequeme Anzeige der Konzentration der toxischen Substanz in der Testflüssigkeit.

Es ist bekannt, daß bestimmte Bakterienstämme eine starke Lumineszenz im Lauf ihres Wachstumszyklus zeigen. Besonders gut bekannte und leicht verfügbare Spezies von Leuchtbakterien sind u. a. das Photobacterium wie beispielsweise P. splendidum, P. mandapamensis, P. phosphoreum. Auch Bakterienstämme aus der Gattung Vibrio zeigen Lumineszenz, wie beispielsweise V. fischeri; ebenso Mikroorganismen aus der Gattung Lucibacterium, wie beispielsweise L. harveyi und Achromobacter. Neben den verschiedenen Bakterien zeigen auch andere Mikroorganismustypen Luminosität wie beispielsweise bestimmte Meeres-Dinoflagellaten, zu denen insbesondere Noctiluca und Gonyaulax gehören. Auch bestimmte Arten von Pilzen (Basidiomyceten) zeigen Lumineszenz, beispielsweise Armillaria mellea, Panus stipticus, Mycena polygramma und Omphalia flavida. Leuchtmikroorganismen vom Bakterien- und Pilztypus sind von der American Type Culture Collection, 12301 Parkland Drive, Rockville, Maryland, oder den Northern Regional Research Laboratories, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, erhältlich, wie auch von vielen anderweitigen kommerziellen und Universitätslaboratorien.

Typischerweise werden die Stock- bzw. Vorratskulturen der Bakterien oder Pilze aus einer Aufbewahrungs- oder Konservierungskultur gezüchtet, indem man einen Teil der Zellen von der Konservierungskultur auf ein Nährmedium überträgt, wo sie zum Wachstum und zur Vermehrung gebracht werden. Die Wahl des jeweiligen Mediums für die Wachstumsvermehrung der Kultur hängt von der Art der verwendeten Kultur und von der Weise ab, in welcher die Mikroorganismen nachfolgend zur Vorbereitung für die erfindungsgemäße Verwendung weiterbehandelt werden sollen.

Ein bevorzugtes Wachstumsmedium für die gebräuchlicheren Lumineszenzorganismen weist üblicherweise bis etwa 2% Agar, zwischen etwa 0,25% und etwa 0,7% Natrium oder Kaliumpyrophosphat, etwa 0,5% Glycerol, zwischen 0,5% und etwa 1% Peptone (tierischen und/oder pflanzlichen Ursprungs), bis zu etwa 1% hydrolysiertes Casein sowie zwischen etwa 0,5 bis etwa 5% Natriumchlorid, Rest Wasser, auf. Der pH-Wert des Wachstumsmediums liegt vorzugsweise im Bereich zwischen etwa 6,5 bis 7,5 und besonders bevorzugt in der Größenordnung von 7,0. Für Meeresmikroorganismen kann in dem Nährmedium anstelle von Wasser Meerwasser verwendet werden. Ebenfalls je nach dem zu vermehrenden Mikroorganismenstamm kann auch ein Extrakt wie beispielsweise Fleisch-, Tintenfisch- oder Fischextrakt in dem Nährmedium äußerst nützlich sein.

Leuchtpilze werden zweckmäßig in einer wäßrigen Brühe mit etwa 10% Brotkrümeln sowie in künstlichen Nährbrühen oder in einer gekochten Kirschenbrühe gezüchtet. Sie lassen sich auch auf einem festen Agarnährboden züchten, der beispielsweise 2% Agar und 10% Brotkrumen und Wasser enthält.

Die Konzentration der Zellen in dem lyophilisierten Kulturstamm wird vor der Lyophilisierung eingestellt und eine Arbeitssuspension mit der gewünschten Basislinie durch einfache Zugabe von destilliertem Wasser zu dem Lyophil hergestellt. Die Konzentration der Zellen in der Suspension ist nicht kritisch und kann innerhalb eines breiten Bereichs schwanken. Jedoch soll selbstverständlich eine ausreichende Menge Zellen in der Suspension vorliegen, damit die Gesamtlichtausgangsleistung der Arbeitssuspension im Nachweisbereich der für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Lichtmeßapparatur liegt. Die Basislichtausgangsleistung wird jeweils für jede Suspension vor der Einbringung der Testflüssigkeit aufgezeichnet. Diese Basislinie dient als Bezugswert der Lichtausgangsleistung, gegenüber welcher nachfolgende Änderungen der Lichtausgangsleistungen gemessen werden. Änderungen oder Schwankungen der Basislinie infolge anderer Ursachen als dem Vorliegen einer toxischen Substanz oder eines toxischen Zustands sind unerwünscht und können zu irreführenden oder falschen Ablesungen führen, falls sie durch die Lichtmeßvorrichtung nicht kompensiert werden. Eine Änderung der Basislinien-Lichtausgangsgröße der Arbeitssuspension über eine bestimmte Zeitperiode ist nicht abnormal. Eine derartige Änderung der Lichtausgangsgröße in Abwesenheit einer toxischen Substanz oder eines toxischen Zustands wird als Basisliniendrift bezeichnet und wird üblicherweise durch eine Kontrollmessung für jede mit einem bestimmten Mikroorganismenstamm durchgeführte Testserie bestimmt. Wo es die Testverfahren zulassen, wird die Basisliniendrift vorzugsweise für jede Arbeitssuspension bestimmt. Eine Basisliniendrift ist in vielen photometrischen analytischen Systemen nicht ungewöhnlich und kann durch geeignete Maßnahmen wie elektronische oder Handregelung oder durch Kompensationsinstrumente in bekannter Weise kompensiert werden. Vorzugsweise wird die Basisliniendrift auf einem möglichst niedrigen Wert gehalten, da ein niedriger Wert der Basisliniendrift die Anwendung einfacherer und daher weniger kostspieliger Instrumente als Lichtmeßvorrichtungen ermöglicht.

Es wurde festgestellt, daß das Suspensionsmedium eine wesentliche Auswirkung auf die Größe der Basisliniendrift haben kann. Gute Ergebnisse wurden erzielt, wenn das Suspensionsmedium zwischen etwa 0,5% bis etwa 6 Gew.-% Natriumchlorid enthielt, mit etwa 2% bis etwa 6% Natriumchloridgehalt als bevorzugtem Bereich und 3% Natriumchlorid als besonders bevorzugtem Wert. Diese Salzkonzentrationen stimmen im wesentlichen mit den im Nährmedium während des Wachstumszyklus der Zellen verwendeten Salzkonzentrationen überein. Es wurde ferner auch festgestellt, daß gute Ergebnisse erzielt wurden, wenn das wäßrige Suspensionsmedium kleinere Mengen anderweitiger Salze wie beispielsweise Natriumsulfat und Natriumpyrophosphat sowie Nährstoffe wie Hefeextrakt enthält. Die Gründe, warum die Einbeziehung dieser vorstehend genannten Zusatzstoffe in dem Suspensionsmedium die Stabilität der Lichtausgangsgröße verbessert und die Basislinienabdrift in der Suspension herabsetzt, sind noch nicht vollständig aufgeklärt; im erfindungsgemäßen Verfahren dürfen die Zellen zwar nicht mehr zahlenmäßig anwachsen; man geht jedoch davon aus, daß das Suspensionsmedium nach wie vor noch eine Umgebung bildet, welche den Zellstoffwechsel auf einem annehmbaren Pegel hält, derart daß die Lichtausgangsgröße relativ stabil bleibt. Ein bevorzugtes Suspensionsmedium weist zusätzlich zu Natriumchlorid zwischen 1 und etwa 10 Mikrogramm/ml Hefeextrakt und zwischen etwa 50 und 250 Mikrogramm/ml Natriumpyrophosphat auf.

Nachdem in dieser Weise eine Suspension von Leuchtmikroorganismen hergestellt und die Basislinien-Lichtausgangsgröße der Suspension gemessen und aufgezeichnet wurde, wird eine auf einen Gehalt an einer toxischen Substanz oder einen toxischen Zustand verdächtige Probe in den Behälter mit der Arbeitssuspension eingeführt. Der Behälterinhalt wird umgerührt, um eine gründliche Durchmischung der Suspension und des eingebrachten Materials herbeizuführen. Sodann wird eine eventuelle Änderung der Lichtausgangsgröße bestimmt, und zwar entweder indem man die Gesamtänderung der Lichtausgangsgröße über eine gegebene Zeitdauer oder aber die Änderungsgeschwindigkeit der Lichtausgangsgröße mißt. Ob die Änderung der Lichtausgangsgröße als Änderungsgeschwindigkeit oder als Gesamtänderung über eine gegebene Zeitperiode gemessen wird, hängt von Faktoren wie Art und Konzentration der toxischen Substanz, Empfindlichkeit des Mikroorganismus, der jeweiligen Art der Vorrichtung zur Messung der Lichtausgangsgröße usw. ab, und das jeweils anzuwendende Verfahren kann in einfacher Weise durch Voruntersuchung der Mikroorganismen und der zu untersuchenden Flüssigkeit bestimmt werden.

Das Vorliegen einer toxischen Substanz oder eines toxischen Zustands wird als Änderung der Lichtausgangsleistung der Mikroorganismensuspension gegenüber der Basislichtausgangsleistung angezeigt. Typischerweise bewirken eine toxische Substanz oder ein toxischer Zustand eine Verringerung der Lichtausgangsleistung, obwohl je nach dem verwendeten Mikroorganismenstamm bestimmte toxische Substanzen oder Zustände wenigstens teilweise auch einen Anstieg der Lichtausgangsleistung der Mikroorganismensuspension hervorrufen können. Der Betrag der Lichtänderung steht in Beziehung zur Konzentration der toxischen Substanz bzw. zum Ausmaß des toxischen Zustandes.

Daher kann unter Verwendung von Standardkurven die Konzentration einer gegebenen toxischen Substanz bestimmt werden, unter der Voraussetzung, daß die toxische Substanz identifiziert ist. Des weiteren kann eine Korrelation zwischen den Ergebnissen des erfindungsgemäßen Verfahrens und den Ergebnissen des sogenannten "Fisch-Tests" aufgestellt werden; bei dem erwähnten Fisch-Test handelt es sich um den derzeit geläufigsten Test für den Versuch einer Bestimmung des Vorliegens einer toxischen Substanz in Wasser, wie eingangs erläutert wurde.

Zur Messung der Lichtausgangsleistung der wäßrigen Lösung von Mikroorganismen und der danach hergestellten Mischung aus Mikroorganismen und untersuchtem Material nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann jede beliebige herkömmliche Lichtmeßvorrichtung verwendet werden. Bekanntlich gibt es verschiedene Arten photometrischer und optischer analytischer Geräte, die sämtlich nach den gleichen allgemeinen bekannten Prinzipien arbeiten.

In Fig. 1 ist ein zum Nachweis des Ausgangslichtes von den Lumineszenzmikroorganismen geeignetes photometrisches System schematisch dargestellt. Das als Ganzes mit 10 bezeichnete System weist eine geeignete Zelle bzw. Küvette oder Behälter 12 auf, in welchem die Suspension von Leuchtmikroorganismen und die Testprobe für die Ausgangslichtmessung untergebracht sind. Ein Lichtdetektor wie beispielsweise eine Photomultiplierröhre 14 oder eine Photozelle ist in solcher geometrischer Relativstellung bezüglich dem Behälter 12 angeordnet, daß sie von dem ausgesandten Licht getroffen wird und einen der Intensität des auf den Detektor auffallenden Lichts entsprechenden Strom niedriger Spannung erzeugt. Die Ausgangsgröße der Zelle 14 wird durch einen Photozellenverstärker 16 geleitet, in welchem die Ausgangsgröße verstärkt und sodann an eine Wiedergabevorrichtung wie beispielsweise ein Meßgerät 18 weitergeleitet wird. Die Art der Wiedergabevorrichtung ist nicht kritisch, und beispielsweise kann anstelle des oder zusätzlich zu dem Meßgerät 18 in dem System eine Registrierschreibervorrichtung oder eine Digitalanzeige- bzw. -registriervorrichtung herkömmlicher Art vorgesehen sein.

Es sei darauf hingewiesen, daß die Temperatur der Arbeitssuspension sowohl die Empfindlichkeit wie auch die tatsächliche Lichtausgangsleistung der Mikroorganismen in der Arbeitssuspension beeinflußt. Daher sollen vorzugsweise sämtliche mit einem bestimmten Mikroorganismenstamm vorgenommenen und einen bestimmten Schadstoff betreffenden Tests bei der gleichen Temperatur ausgeführt werden, um Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. So wurde beispielsweise für Schadstoffe wie Phenol festgestellt, daß für eine gegebene Schadstoffkonzentration die jeweilige prozentuale Abnahme der Lichtausgangsleistung einer Arbeitssuspension von Mikroorganismen mit zunehmender Temperatur abnimmt. Für andere Schadstoffe, wie beispielsweise Isopropylalkohol, nimmt die prozentuale Abnahme der Lichtausgangsgröße der Arbeitslösung mit zunehmender Temperatur zu. Vorzugsweise sollte daher, insbesondere wenn an neuen Testproben gearbeitet wird, zunächst die Änderung der Lichtausgangsgröße der Arbeitssuspension über einen Bereich von Temperaturen zwischen etwa 10°C bis etwa 30°C aufgezeichnet werden. Die bevorzugte Testtemperatur ist dann diejenige Temperatur, bei welcher eine maximale Änderung der Lichtausgangsleistung aufgezeichnet wurde. Dies bezeichnet diejenige Temperatur, bei welcher der betreffende Mikroorganismus eine maximale Empfindlichkeit für den Schadstoff oder das Gemisch von Schadstoffen in der Testlösung besitzt.

In Fällen, wo Reproduzierbarkeit der Ergebnisse oder maximale Empfindlichkeit keine besondere Rolle spielen, kann das erfindungsgemäße Verfahren bei auf Umgebungstemperatur in dem Photometer befindlicher Arbeitslösung ausgeführt werden. Auf jeden Fall sollte dafür gesorgt werden, daß die Arbeitssuspension sich zunächst auf eine stabile Temperatur einstellen kann, bevor die Lichtausgangsleistung aufgezeichnet wird, da Änderungen der Temperatur auch die Basislichtausgangsleistung beeinflussen und daher zu einer überhöhten Basisliniendrift führen. Im nachfolgenden Beispiel wurde die Arbeitssuspension zunächst auf die Umgebungstemperatur des Photometers stabilisiert, bevor die Lichtausgangsleistung gemessen bzw. aufgezeichnet wurde.

Beispiel (a) Herstellen einer Suspension eines lyophilisierten Kulturstamms

Kulturen von P. mandapamensis, ATCC 27561; L. harveyi, ATCC 14126, und A. fischeri, NRRL B-11177, wurden als Schüttelkolbenkulturen gezüchtet. Als Wachstumsmedium diente ein Medium der folgenden Zusammensetzung:

KH₂PO₄
0,25 Gew.-%
NaCl	3,0 Gew.-%
Glycerin	0,5 Gew.-%
Hefeextrakt	0,1 Gew.-%
Polypepton	0,5 Gew.-%
Hydrolysiertes Casein	1,0 Gew.-%
Tintenfischextrakt	10,0 Vol.-%
Destilliertes Wasser	90,0 Vol.-%

Die Herstellung des Tintenfischextrakts erfolgte in der Weise, daß man 454 g ganzen Tintenfisch homogenisierte und mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1 Liter auffüllte. Die Aufschlämmung wurde 15 Min. lang im Autoklaven bei 121°C behandelt und die so erhaltene Suspension durch Zentrifugation geklärt.

Die Kulturen wurden jeweils in 500-ml-Kolben mit 3-fach-Böden gezüchtet, wobei jeder Kolben 100 ml Kultur enthielt. Die Kulturen wurden 18 Stunden lang bei 22°C gezüchtet, wobei die Kulturen während der Wachstumsperiode auf einer New-Brunswick-Kreiselschüttelvorrichtung mit 240 U/Min. geschüttelt wurden.

Die Kulturen wurden während der logarithmischen Wachstumsphase durch Zentrifugation von der Brühe abgetrennt und die so erhaltenen Zellkuchen auf 4°C abgekühlt. Die gekühlten Zelltabletten wurden in einer 3%igen Natriumchloridlösung suspendiert und auf einer Temperatur von 4°C gehalten. Die Natriumchloridlösung wurde zu der Suspension zugegeben, bis eine homogene Zellsuspension mit einer optischen Dichte von 160 erreicht war.

Die Zellsuspension wurde mit einer wäßrigen Milchlösung (20 Gew.-% Magermilch, 2 Gew.-% NaCl, pH 7,1) in einem Volumenverhältnis von ein Teil Zellsuspension auf 19 Teile Milchlösung gemischt. Die Zell-Milch-Suspension wurde in Teilmengen von 1 ml auf 10 ml Röhrchen verteilt und im Schnellfrierverfahren auf eine Temperatur von -50°C eingefroren. Die Zellen wurden sodann bei -5°C 18 Stunden lang unter 55 Mikron Vakuum getrocknet. Danach wurden die Röhrchen vakuumversiegelt.

Aus diesen lyophilisierten Proben wurden jeweils durch Zugabe von 1 ml destilliertem Wasser zu den Röhrchen Arbeitssuspensionen hergestellt. Die so erhaltenen Suspensionen zeigten einen guten Wert der Basislichtausgangsleistung.

(b) Bestimmen der Änderung der Lumineszenzausgangsgröße der Suspension

Die gemäß (a) hergestellten Arbeitssuspensionen wurden unterschiedlichen Konzentrationen von bekanntermaßen für biologische Organismen toxischen Substanzen ausgesetzt, um die Auswirkung des so herbeigeführten Zustandes auf die Lichtausgangsleistung der Zellen zu bestimmen.

Die folgenden toxischen Substanzen wurden für die Schaffung toxischer Zustände verwendet: Phenol, Natriumlaurylsulfat; sowie ein nachfolgend als Gemisch 401 bezeichnetes Gemisch verschiedener Substanzen.

Das Bezugsgemisch 401 wurde in der Weise hergestellt, daß man 3,82 g NH₄Cl, 0,093 g K₂CrO₄, 0,128 g Na₂S, 0,9 g H₂O, 0,20 g Kaolin, 0,1 g Phenol und 1,28 ml Nr. 2 Heizöl auf 100 ml destilliertes Wasser zugab.

Die Durchführung der Tests erfolgte, indem man jeweils zwischen 10 und 100 Mikroliter der betreffenden Lösungen der toxischen Substanz in eine Küvette zusetzte, welche eine Arbeitssuspension der Lösungen enthielt, für welche die Basislinie und die Basisliniendrift zuvor festgestellt worden war. Nach Zugabe der toxischen Substanz wurden die Küvetten mehrere Male umgedreht, um eine Durchmischung der Suspension und des die toxische Substanz enthaltenden Materials zu gewährleisten. Die Küvetten wurden sodann wieder in das Photometer eingesetzt, und es wurde die prozentuale Lichtabnahme nach einer Periode von 2 Min. nach der Zugabe der toxischen Substanz bestimmt. Gleichzeitig mit den Testproben wurden auch Kontrollproben untersucht, welche jeweils aus einer Arbeitssuspension der betreffenden Kulturen und 10 Mikroliter einer 3%igen Natriumchloridlösung bestanden.

Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle A zusammengestellt. Dabei sind jeweils die Konzentrationen der toxischen Substanzen in Milligramm/Liter angegeben, mit Ausnahme für das Gemisch 401, für welches die Konzentration als Volumprozent des Gemischs in der Testlösung angegeben ist.

Tabelle A

Eine gemäß (a) gezüchtete und lyophilisierte, gefriergetrocknete Probe von A. fischeri, NRRL B-11177, diente zum Nachweis der Beziehung zwischen der Konzentration der toxischen Substanzen und der Abnahme der Lichtausgangsleistung nach einem Kontakt von 2 Min.

In Küvetten, welche 1 ml einer Arbeitssuspension des rekonstituierten Leuchtmikroorganismus (A. fischeri) enthielten, für welche die Basislinie zuvor bestimmt worden war, wurden jeweils 10 Mikroliter der Phenol in unterschiedlichen Konzentrationen enthaltenden Proben eingeführt und die Küvetten für eine gute Durchmischung umgedreht. Nach zwei Minuten wurde die Abnahme der Lichtausgangsleistung gemessen und als prozentuale Lichtabnahme aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle B zusammengestellt:

Phenolkonzentration (ppm)
Prozentuale Lichtabnahme nach 2 Minuten Kontaktzeit
5
1
10	3
20	10
30	18
40	21
50	25
60	30
70	31
80	37
90	40
100	40

Fig. 2 zeigt eine graphische Darstellung der Daten aus der Tabelle B, wobei die Phenolkonzentration auf der vertikalen logarithmischen Skala und die prozentuale Lichtabnahme linear auf der horizontalen Skala aufgetragen sind. Für diese Art der Darstellung wurde eine direkte Beziehung zwischen der Phenolkonzentration und der Abnahme der Lichtausgangsleistung festgestellt.

In den vorhergehenden Beispielen wurde das toxische Substanzen enthaltende Material jeweils zu der Suspension der Lumineszenzmikroorganismen in dem wäßrigen Suspensionsmedium zugegeben. Es wurde jedoch festgestellt, daß in Fällen niedriger Konzentrationen der toxischen Substanz in der Flüssigkeit sich gute Ergebnisse erzielen lassen, indem man die Zellen direkt in der die toxische Substanz enthaltenden Flüssigkeit zu der Arbeitssuspension suspendiert. In diesem Fall wird dem auf einen Gehalt an toxischer Substanz verdächtigen Material Natriumchlorid in ausreichender Menge zur Herstellung einer 3%igen Salzlösung zugesetzt. Die Lichtausgangsgröße wird gemessen und mit der Lichtausgangsleistung einer Arbeitssuspension der Lumineszenzzellen in dem Suspensionsmedium allein verglichen.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis einer toxischen Substanz oder eines toxischen Zustands durch Bestimmung der Änderung der von einem Biolumineszenzorganismus ausgehenden Lumineszenzemission als Maß der Einwirkung der toxischen Substanz bzw. des toxischen Zustandes auf den Stoffwechsel des Biolumineszenzorganismus, gekennzeichnet durch

(a) Herstellen einer Suspension eines lyophilisierten Kulturstammes eines Lumineszenzleuchtmikroorganismus in einem wäßrigen Suspensionsmedium, wobei die Zellen nicht mehr zahlenmäßig anwachsen dürfen, und anschließende unmittelbare Verwendung der suspendierten Leuchtmikroorganismen durch
(b) Einbringen einer zu untersuchenden wäßrigen Lösung bzw. Suspension oder eines Pulvers und direkte Bestimmung der Änderung der Lumineszenzausgangsgröße der Suspension.

2. Abänderung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Fällen niedriger Konzentration der toxischen Substanz in der zu untersuchenden Flüssigkeit die lyophilisierten Mikroorganismen direkt in dieser Flüssigkeit suspendiert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Lumineszenz- bzw. Leuchtmikroorganismen Bakterien aus der Gruppe der Gattungen Photobacterium, Vibrio, Achromobacter, Lucibacterium sowie Gemische hiervon verwendet werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß Lumineszenz- bzw. Leuchtmikroorganismen aus der Gruppe P. mandapamensis, P. phosphoreum, V. fischeri, A. fischeri, L. harveyi sowie Gemische hiervon verwendet werden.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Suspensionsmedium zwischen 0,5 Gew.-% und 6 Gew.-% eines löslichen Alkalimetallsalzes enthält.