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GEBIET DER ERFINDUNG
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Diese
Erfindung betrifft ein Medium, das für den Nachweis und die Auszählung von
Staphylokokken, einschließlich
Staphylococcus aureus, in einer Probe verwendbar ist, wobei das
Medium eine Indikatorsubstanz in einer ausreichenden Menge enthält, um zwischen
Bacillus-Kolonien
und Staphylococcus-Kolonien zu unterscheiden, wenn die Probe in
dem Medium und mit Verfahren zum Nachweis von Staphylokokken in
einer Probe unter Verwendung eines derartigen Mediums kultiviert
wird.
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ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
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Eine
Vielzahl an Verfahren und Prozessen steht gegenwärtig für die Bestimmung, die Identifizierung und
die Auszählung
von Bakterien in unterschiedlichen Probenarten zur Verfügung. Zum
Beispiel stehen Verfahren zum Identifizieren und Auszählen von
coliformen Bakterien (Coliforme) in Proben aus Wasser, Lebensmitteln
oder Milchprodukten zur Verfügung,
um damit die Qualität
potentieller Kontaminationsspiegel von solchen Proben einzuschätzen.
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Eine
Vorgehensweise zur Abgrenzung gegenüber E. coli, einem speziellen
Typ der coliformen Bakterien, die gemeinhin als gramnegative Stäbchen klassifiziert
werden, aus einer gemischten Population von Coliformen wird in der
US-Patentschrift Nr. 5,210,022 beschrieben.
In diesem Patent sind zwei Substrate, welche kontrastierende unlösliche Präzipitate
in der Anwesenheit von zwei spezifischen bakteriellen Enzymen bilden, der
Beta-Galactosidase und der Beta-Glucuronidase, in ein Testmedium
aufgenommen. Die Verwendung von diesen zwei Substraten ermöglicht die
Abgrenzung von Coliformen gegenüber
E. coli, da alle coliformen Bakterien die Beta-Galactosidase produzieren,
während
nur E. coli die Beta-Glucuronidase produziert. Weil die Kolonien
unter schiedlicher Bakterien wachsen, wenn sie in dem substrathaltigen
Medium inkubiert werden, bilden sich kontrastierend gefärbte Präzipitate
entweder rund um die wachsenden E. coli- oder die coliformen Kolonien.
Die Identifizierung von E. coli-Kolonien unter den anderen coliformen
Kolonien in den gemischten Populationen wird durch die kontrastierenden
Farben von den präzipitierten
Substraten leicht gemacht.
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Eine
Notwendigkeit für
solche selektiven Unterscheidungen existiert für andere Arten von Bakterien, welche
pathogen sind oder die mit gesundheitsschädlichen Wirkungen beim Menschen
assoziiert sind, wie beispielsweise Salmonella, Staphylokokken oder
Streptococcus.
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Staphylococcus
aureus (S. aureus) ist ein wichtiger Indikator, der in der Nahrungsmittel
verarbeitenden Industrie verwendet wird. Der Nachweis von diesem
Organismus ist wichtig, weil einige Stämme dafür bekannt sind, ein hitzestabiles
Toxin, Staphylokokken-Enterotoxin
genannt, zu produzieren, das mit einer Erkrankung assoziiert ist,
die zu schweren Einschränkungen
führt,
bekannt als Staphylokokkenenteritis, eine durch Staphylokokken verursachte
Lebensmittelvergiftung. Darüber
hinaus kann die Anwesenheit von diesem Organismus in verarbeiteten
Nahrungsmitteln ein Hinweis auf eine nach der Verarbeitung aufgetretene
Kontamination durch asymptomatische Träger von den Bakterien auf der
Hautoberfläche
und insbesondere in dem Nasenvorhof sein.
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Aufgrund
von der Bedeutung des Nachweises von S. aureus und anderen enterotoxischen
Staphylokokken, wird eine effiziente, verlässliche und präzise Identifizierung
der Staphylokokken benötigt.
Das am meisten gegenwärtig
gebräuchliche
Medium, welches für
den Nachweis von Staphylokokken verwendet wird, ist Eigelb-Glycin-Tellurit-Pyruvat-Agar
(EYGTP-Agar), der auch Baird-Parker-Agar (BPA) genannt wird. Dieses Medium
verwendet selektive und differentielle Mediumkomponenten, um Staphylokokken
von anderen Bakterien, welche in diesen Nahrungsmittelproben gefunden
werden, zu unterscheiden. Kaliumtellurit und Lithiumchlorid, die
in BPA vorhanden sind, inhibieren die meisten anderen Bakterien.
S. aureus wird in einer BPA-Probe mit Kaliumtellurit unter der Bildung
von schwarzen Kolonien reagieren und reagiert mit dem Lecithin in
dem Eigelb unter Bildung von einem trüben „Hof" rund um die Kolonie. Eine schwarze
Kolonie mit einem trüben
Hof in BPA wird als eine „typische" Kolonie angesehen.
Die BPA-Komponenten gewährleisten
so eine Kombination von unterschiedlichen Reaktionen, welche S.
aureus von anderen Bakterien unterscheiden.
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Unglücklicherweise
sind abweichende Reaktionen von S. aureus und anderen Bakterien
mit BPA möglich.
Die Folge aus den falsch-positiven und falsch-negativen Reaktionen
in diesem Medium ist, dass ein BPA-Ergebnis nur als ein „mutmaßliches" Ergebnis in Betracht
gezogen wird. Die zwei abweichenden Reaktionen sind: (1) Nicht-S. aureus Bakterien
können
auf dem BPA wachsen und ergeben eine falsch-positive Reaktion (d.
h. produzieren typische Kolonien); und (2) nicht alle S. aureus-Stämme sind
fähig,
mit den unterschiedlichen Mediumkomponenten zu reagieren, um eine „typische" BPA-positive Reaktion
zu ergeben (d. h. Tellurit-positive (schwarze Kolonie) und positive
Eigelb- oder Lecithinase-Reaktion (trüber Hof)). Aus diesen Gründen werden
weitere „Bestätigungs-"Schritte von der
BPA-Platte benötigt.
Diese Verfahren schließen
Methoden zum Nachweis der Anwesenheit von Koagulase oder von thermostabiler
Nuklease. Entweder das eine oder das andere Verfahren wird, wenn
es in Verbindung mit dem BPA-Medium verwendet wird, als Bestätigung für die Anwesenheit
oder die Abwesenheit von S. aureus angesehen.
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Um
jedoch von dem BPA-Schritt weiter zur Bestätigung zu gelangen, müssen die
Kolonietypen klar erkannt und für die
weiteren Untersuchungen ausgewählt
werden. Gewöhnlich
werden „typische" Kolonien zur Bestätigung ausgewählt und
Repräsentanten
von jedem der anderen Kolonietypen werden ebenfalls für die Bestätigung ausgewählt. Unter
den Nicht-S. aureus Bakterien, die typische Kolonien produzieren
können,
sind Stämme
aus den Gattungen Bacillus und Enterococcus. Andere Stämme, die
auf BPA wachsen und atypische Kolonien produzieren, schließen Listeria-Spezies
und einige Mitglieder von der Enterobacteriaceae-Familie ein. Selbst
wenn diese Stämme
nicht den typischen Kolonietyp auf BPA produzieren, so werden sie
die Anzahl der erforderlichen „atypischen" Kolonien erhöhen, die
für die
Bestätigungsuntersuchung
ausgewählt
werden müssen.
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Die
US-Patentschrift Nr. 5,443,963 beschreibt
ein Verfahren zur Identifizierung und Auszählung von Staphylokokken in
einer Probe, wobei ein Kulturmedium ein Indolylglucopyranosid-Substrat
als eine Indikatorsubstanz enthält.
Dieses Verfahren nutzt das Prinzip aus, dass die Beta-Glucosidase,
die durch Staphylokokken produziert wird, nicht mit dem Indolylglucopyranosid-Substrat
reagiert, während
die Beta-Glucosidase, welche durch andere Bakterien in der Probe
produziert wird, mit dem Indolylglucopyranosid-Substrat reagiert, um
einen charakteristischen Farbstoff zu bilden. Dieses Verfahren ermöglicht auf
diese Weise, dass Staphylokokken von einigen Nicht-Staphylokokken
in der Probe unterschieden werden können. Das in dieser Patentschrift
dargestellte Verfahren unterscheidet Staphylokokken allerdings nicht
von allen Nicht-Staphylokokken, welche in einer Untersuchungsprobe
potentiell vorhanden sind. Zum Beispiel unterscheidet das in dieser
Patentschrift dargestellte Verfahren Staphylokokken nicht von Bacillus-Spezies,
welche in einer Untersuchungsprobe vorhanden sind. Bacillus-Spezies,
sowie die anderen zuvor genannten Mikroorganismen, sind Quellen für falsch-positive „typische" Kolonien in Medien
wie BPA, die für
das Anwachsen von Proben verwendet werden, welche im Verdacht stehen,
S. aureus zu enthalten. Dementsprechend bleiben falsch-positive
Ergebnisse, welch von „typischen" Nicht-Staphylokokken-Kolonien
abstammen, ein substanzielles Problem. Ein Kultursystem, das derartige
falsch-positive Ergebnisse eliminiert, würde auf dem Gebiet der mikrobiologischen
Untersuchungen sehr nützlich
sein. Die falsch-negativen Ergebnisse sind ebenfalls noch als ein
signifikantes Problem vorhanden; Staphylococcus-Spezies und -Stämme, welche
diese atypischen Kolonien produzieren, sind eine Quelle für diese
falsch-negativen Ergebnisse und machen es nötig, dass alle atypischen Kolonietypen
in den gegenwärtig
verwendeten Systemen noch weiter untersucht werden müssen. Ein
Kultursystem, welches die atypischen Kolonien der Nicht-Staphylokokken
eliminieren könnte
und zumindest mutmaßlich
die atypischen Staphylokokkus-Kolonien
identifiziert, würde äußerst vorteilhaft
sein.
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In
dem gut funktionierenden Nachweis und der Auszählung von S. aureus in Proben
liegt dementsprechend eine Notwendigkeit für Methodiken vor, welche einen
beweiskräftigen
Nachweis von S. aureus und eine Ausschaltung von falsch-positiven
und falsch-negativen Ergebnissen ermöglichen, die durch andere Mikroorganismen
in einer Probe produziert wurden.
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KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
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Im
Allgemeinen weist die Erfindung als Besonderheit ein Kulturmedium
für den
Nachweis von Staphylokokken auf, wobei das Kulturmedium eine Indikatorsubstanz
in ausreichender Menge enthält,
um Kolonien, die Bacillus-Mikroorganismen
enthalten, von Kolonien, die Staphylokokken enthalten, zu unterscheiden.
Das Medium stellt die Fähigkeit
bereit (1) Kolonien von Nicht-Staphylokokken Mikroorganismen zu
eliminieren (als Nicht-Staphylokokken – ein negatives
Ergebnis), welche bisher als „typische" Kolonien, die weitere
Bestätigungsuntersuchungen
benötigten,
identifiziert worden wären,
(2) atypische Nicht-Staphylokokken-Kolonien, welche anderweitig
weitere Untersuchungen benötigen
würden,
zu eliminieren, und (3) mutmaßlich
atypische Staphylokokken-Kolonien zu identifizieren. Die Erfindung
weist ebenfalls Verfahren zum Nachweis von Staphylokokken in einer
Probe auf und für
die Unterscheidung der Staphylokokken-Kolonien, welche aus der Probe gewachsen
sind, von den Kolonien der anderen Mikroorganismen, wie beispielsweise
Bacillus-Mikroorganismen, die aus der Probe gewachsen sind.
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In
einem Aspekt stellt die Erfindung folglich ein Medium bereit, welches
nützlich
ist für
das Nachweisen von Staphylokokken in einer Probe, wobei das Medium
selektiv für
das Wachstum von Staphylokokken ist und ein Glucopyranosid als Indikatorsubstanz
in einer Konzentration von mindestens 100 Mikrogramm pro Milliliter enthält, um die
Bacillus-Kolonien von den Staphylokokken-Kolonien zu unterscheiden,
wenn die Probe in dem Medium kultiviert wird.
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Das
Medium befindet sich in der Form von einem Baird-Parker-Agar. In einer weiteren Ausführungsform
liegt dieses Medium in der Form von einem getrockneten Nährmedium
vor, welches an einem selbsttragenden, wasserundurchlässigen Substrat
von einer Vorrichtung zur Kultur auf dünnen Folien haftet. In noch einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
liegt das Medium in der Form von einem Calcium-Pektinatgel vor.
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Die
Glucopyanosid-Indikatorsubstanz ist vorzugsweise ein Indolyl-Glucopyranosid.
Eine bevorzugte colorimetrische Glucopyranosid-Indikatorsubstanz
ist 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-glucopyranosid.
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Die
Glucopyanosid-Indikatorsubstanz liegt in einer Menge vor, die ausreichend
ist, um Kolonien, welche Bacillus-Mikroorganismen enthalten, von
Kolonien, welche Staphylokokken enthalten, zu unterscheiden.
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Üblicherweise
ist die Indikatorsubstanz in einer Konzentration von mindestens
etwa 100 μg/mL
vorhanden, wenn die Probe in den Nährmedien kultiviert wird.
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In
einem weiteren Aspekt weist die Erfindung ein besonderes Verfahren
zum Nachweisen von Staphylokokken in einer Probe auf. Das Verfahren
beinhaltet den Schritt des Kultivierens einer Probe in einem selektiven
Kulturmedium unter Bedingungen, welche nachweisbare Kolonien hervorbringen,
wobei das Kulturmedium eine Indikatorsubstanz, wie zuvor beschrieben,
in einer Menge enthält,
die ausreichend ist, die Kolonien, welche Bacillus-Mikroorganismen
enthalten, von den Kolonien, die Staphylokokken enthalten, zu unterscheiden.
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Das
Verfahren kann weitere Schritte zur Bestätigung der Anwesenheit von
Staphylokokken in der Probe beinhalten und kann ferner ebenfalls
den Schritt des Auszählens
der Staphylokokken in der Probe beinhalten. Der Schritt der Bestätigung kann
das Feststellen beinhalten, ob die Mikroorganismen, die aus der
Probe gewachsen sind, Koagulaseaktivität aufweisen oder nicht, oder
ob die Mikroorganismen, die aus der Probe gewachsen sind, eine Aktivität der thermostabilen
Nuklease aufweisen oder nicht. Der Schritt des Feststellens, ob
die Kolonien, die aus der Probe gewachsen sind, eine Aktivität der thermostabilen
Nuklease aufweisen, kann vorzugsweise das Einbringen eines Gegenstandes
beinhalten, welcher Toluidinblau O, ein Bindemittel und nicht-hydrolysierte
DNA umfasst.
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Die
mit dem Verfahren untersuchte Probe kann eine Lebensmittelprobe,
eine klinische Probe, eine tiermedizinische Probe, eine kosmetische
Probe, eine pharmazeutische Probe, eine Umweltprobe oder irgendeine
Probe sein, für
die eine Untersuchung auf Staphylokokken gewünscht ist.
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Andere
Vorteile und Merkmale von der Erfindung werden aus der nachfolgenden
Beschreibung und aus den Ansprüchen
offensichtlich werden.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung nutzt das Prinzip der hierin zum ersten Mal
beschriebenen Beobachtung aus, dass eine ausreichende Menge von
einer Glucopyranosid-Indikatorsubstanz in einem Medium, welches selektiv
für das
Wachstum von Staphylokokken ist, Kolonien, welche Bacillus und andere
Mikroorganismen enthalten, von Kolonien, welche Staphylokokken enthalten,
zu unterscheiden, wenn eine Probe, die Staphylokokken und potentiell
Bacillus und andere Mikroorganismen enthält, in dem Medium kultiviert
wird. Diese unerwartete Beobachtung gestattet, dass Mikroorganismen,
wie beispielsweise Bacillus-Spezies – welche „typische" Kolonien in selektiven Medien hervorbringen
können – von Staphylokokken
unterschieden werden können.
Es ermöglicht
ebenfalls, dass bestimmte Staphylococcus-Spezies, welche nicht das
vermutliche, „typische" Ergebnis auf den
gegenwärtig
erhältlichen
Systemen produzieren, als mutmaßliche
Staphylokokken-Kolonien identifiziert werden können. Dies ist insbesondere
vorteilhaft im Zusammenhang mit der Untersuchung von Lebensmittel-,
klinischen oder vielen anderen Typen von Proben, wo der effiziente
und verlässliche
Nachweis von enterotoxischen Organismen wie zum Beispiel von S.
aureus äußerst bedeutend
ist.
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Die
vorliegende Erfindung beinhaltet folglich ein Medium, welches nützlich ist
für das
Nachweisen von Staphylokokken in einer Probe, wobei das Medium selektiv
für das
Wachstum von Staphylokokken ist und ein Glucopyranosid als Indikatorsubstanz
enthält,
welche in einer Konzentration von mindestens 100 Mikrogramm pro
Milliliter vorhanden ist, um die Kolonien, die Bacillus-Mikroorganismen
enthalten, von den Kolonien, die Staphylokokken enthalten, zu unterscheiden.
Die Indika torsubstanz ist ein Glucopyranosid-Substrat für die Beta-Glucosidase
von den Nicht-Staphylococcus-Mikroorganismen und wird nicht durch
Staphylokokken hydrolysiert.
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Die
colorimetrischen Indolyl-Glucopyranoside sind die bevorzugten Glucopyranosid-Indikatorsubstanzen
zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung, wobei 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-glucopyranosid das
bevorzugte Indolyl-Glucopyranosid ist.
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Zusätzliche
Indolyl-Glucopyranoside, welche für die Verwendung in der vorliegenden
Erfindung geeignet sein können,
beinhalten zum Beispiel:
- (1) 5-Brom-6-chlor-3-indoxyl-beta-D-glucopyranosid;
- (2) 6-Chlor-3-indoxyl-beta-D-glucopyranosid; oder
- (3) 3-Indoxyl-beta-D-glucopyranosid.
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Das
bevorzugte 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-glucopyranosid ist gut
für die
Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet, weil, sobald
die Glucosegruppe enzymatisch durch die Beta-Glucosidase der Nicht-Staphylokokken-Organismen
gespalten ist, der verbliebene Anteil dimerisieren wird und in unmittelbarer Nähe von der
Kolonie präzipitiert,
um einen Farbumschlag herbeizuführen.
Die oben angeführten
Verbindungen (1)–(3)
weisen ebenfalls dieses Präzipitationsphänomen auf
und es wird folglich von ihnen erwartet, dass sie ebenfalls gut
für die
Verwendung in dem erfindungsgemäßen Medium
geeignet sind. Diese Verbindungen werden bevorzugt gegenüber den
Indikatorsubstanzen, welche nicht präzipitieren, und infolgedessen
von der Kolonie weg diffundieren, was den Nachweis von dem Indikator
kompliziert macht. Im Allgemeinen wird eine beliebige Glucopyranosid-Substanz,
die (1) mit der Beta-Glucosidase von Nicht-Staphylokokken-Mikroorganismen
reagiert, aber nicht mit der Beta-Glucosidase von Staphylokokken,
und (2) ein nachweisbares Signal bereitstellt, wenn ihre Glucosegruppe
enzymatische gespalten wird, als eine brauchbare Glucopyranosid-Indikatorsubstanz
dienen kann.
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Die
Indikatorsubstanz muss in einer Konzentration von mindestens 100
Mikrogramm pro Milliliter vorliegen, um die Kolonien, die Bacillus-Mikroorganismen
enthalten, von den Kolonien, die Staphylokokken enthalten, zu unterscheiden.
Beispiele für
zusätzliche
Mikroorganismen zu Bacillus, welche von Staphylokokken in Übereinstimmung
mit dieser Erfindung unterschieden werden können, beinhalten Enterococcus,
Listeria und einige Mitglieder von der Familie der Enterobacteriaceae
(einschließlich
Proteus, Enterobacter, Serratia und Klebsiella). Wie hierin beschrieben,
sieht die Erfindung vor, dass die Indikatorsubstanz, wenn sie in
ausreichender Menge vorhanden ist, um Bacillus, Listena und Enterobacteriaceae
zu unterscheiden, jegliche Beta-Glucosidase-positiven Nicht-Staphylococcus-Mikroorganismen
von Staphylokokken unterscheiden wird.
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Von
den gegenwärtig
auf dem Fachgebiet bekannten Systemen an selektiven Wachstumsmedien
zum Nachweisen und Auszählen
von Staphylokokken, ist kein einziges in der Lage, die „typischen" Kolonien von Bacillus
und vielen anderen Gattungen der Mikroorganismen von Staphylokokken
zu unterscheiden. Unerwarteterweise ermöglicht die Einbeziehung von
gewissen Glucopyranosid-Indikatorsubstanzen in ausreichender Menge,
dass solche Mikroorganismen von Staphylokokken unterschieden werden
können.
Darüber
hinaus sind keine davon fähig,
die atypischen Kolonien als Staphylokokken in BPA-Typ Medien mutmaßlich zu
identifizieren; bestimmte Staphylococcus-Spezies produzieren derartige „atypischen" Kolonien. In der
Praxis der vorliegenden Erfindung werden derartige Kolonien mutmaßlich als
Staphylokokken identifiziert.
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Allgemein
sollte die Indikatorsubstanz in einer Konzentration vorhanden sein,
welche sich der Löslichkeitsgrenze
von der Substanz in dem Kulturmedium annähert, wenn die Probe kultiviert
wird. Dies maximiert die Möglichkeit,
dass alle Beta-Glucosidase-positiven Nicht-Staphylococcus-Organismen
nachgewiesen, angefärbt
und von Staphylokokken-Kolonien aus der Probe unterschieden werden
können.
Für die
Indolyl-Glucopyranoside, einschließlich dem bevorzugten 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-glucopyranosid,
sollte die Konzentration mindestens etwa 100 μg/mL, wenn die Probe kultiviert
wird. Fachleute werden es zu schätzen wissen,
dass die optimale Konzentration von der Indolylglucopyranosid-Indikatorsubstanz
in dem Kulturmedium variieren kann, abhängig von dem jeweiligen Indikatormolekül, das verwendet
wird, und dass solche Konzentrationen routinemäßig angepasst und optimiert
werden können.
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Das
erfindungsgemäße Medium
ist in der Form von einem Agargel, wobei das selektive Nährmedium, einschließlich der
differentiellen Indikatorsubstanz, innerhalb des Agars enthalten
sind. Ein Beispiel eines bevorzugten Agargels ist der Baird-Parker-Agar,
welcher zuvor beschrieben wurde und der auf dem Gebiet der Staphylococcus-Untersuchungen
wohlbekannt ist. Der praktische Einsatz der beanspruchten Erfindung
in einer Anwendung in Baird-Parker-Agar ist nachfolgend in Beispiel
1 veranschaulicht. Im Allgemeinen werden in einer Baird-Parker-Anwendung,
welche das erfindungsgemäße Medium
benutzt, die Kolonien der Nicht-Staphylokokken, einschließlich Bacillus
und den anderen, die zuvor erwähnt
wurden, mit einer charakteristischen Farbe angefärbt, welche durch die Glucopyranosid-Indikatorsubstanz
produziert wird (z. B. blau oder grün, falls 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-glucopyranosid
als der Indikator verwendet wird) und diese Kolonien können als
negativ außer
Acht gelassen werden. Kolonien, die schwarz sind, ob „typisch" oder nicht, werden
als Staphylokokken angesehen (einschließlich potentieller S. aureus)
und können
für weitere
Untersuchungen ausgewählt
werden.
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Das
Medium kann in der Form von einer Vorrichtung zur Plattenkultur
auf dünnen
Folien vorliegen, wie beispielsweise eine 3M PETRIFILMTM Kulturvorrichtung.
Zwei beispielhafte Ausführungsformen
von einer Vorrichtung zur Plattenkultur auf dünnen Folien sind (1) eine mit
gepulvertem Medium beschichtete, dünne Folienvorrichtung, in der
ein Pulver, welches die Nährmedienkomponenten
und die Gelierungsmittel umfasst, an einem selbsttragenden, wasserundurchlässigen dünnen Folienträgermaterial
und an einer Deckfolie anhaftet, wobei jede Folie ein nicht-hemmendes
Klebemittel enthält,
und (2) eine mit Nährlösung beschichtete
Vorrichtung aus dünnen
Folien, in welcher eine Nährlösung auf
ein selbsttragendes, wasserundurchlässiges Substrat aus dünnen Folien
aufgetragen ist, mit vorgewählten
Beschichtungsgewichten für
die Mediumkomponenten und getrocknet, und eine Deckfolie, welche
die Gelierungsmittel und wahlweise die Färbemittel daran angeheftet
enthält,
bereitgestellt wird, um die Probe während der Inkubation zu bedecken.
Eine Styroporschicht, welche eine Öffnung hindurch aufweist, kann
zwischen die Deck- und
die Unterfolie derart geschoben werden, dass die Öffnung eine
Vertiefung für
die kultivierte Probe bildet. In der Verwendung von Vorrichtungen
zur Kultur auf dünnen
Folien wie beispielsweise den 3M PETRIFILMTM Vorrichtungen,
ist ein Probenvolumen, oder ein Inokulum (mikrobielle Impfsubstanz),
von einem Milliliter der Standard.
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Vorrichtungen
zur Kultur auf dünnen
Folien, einschließlich
der Nährmedium-
und Pulver-beschichteten Vorrichtungen, werden vollständig in
der 3M
US-Patentschrift Nr. 4,565,783 beschrieben.
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Ein
bevorzugtes selektives Medium für
die Verwendung bei dem Nachweis von Staphylokokken in einer Kulturvorrichtung
aus dünnen
Folien schließt
geeignete Nähr stoffe,
Salze und Ionen ein, die für
die Staphylokokken benötigt
werden, um nachweisbare Kolonien zu produzieren, sowie Inhibitoren,
um damit das Wachstum von anderen unerwünschten Mikroorganismen zu
verhindern. Geeignete Nährstoffe,
Salze und Ionen beinhalten, als nicht-einschränkende Beispiele, Tryptose-Pepton,
Dipepton, Hefeextrakt und Brenztraubensäure. Ausgewählte Inhibitoren sind zu dem
Medium hinzugefügt,
um das Wachstum von unerwünschten Mikroorganismen
zu verhindern, einschließlich,
aber nicht darauf beschränkt,
gramnegative Bakterien, wie beispielsweise E. coli, sowie die meisten
grampositiven Bakterien. Die Inhibierung von diesen unerwünschten Bakterien
gestattet, dass das Wachstum der Staphylokokken selektiv gesteigert
wird. Geeignete Inhibitoren schließen eine Vielzahl von gut bekannten
antimikrobiellen oder antibiotischen Verbindungen ein. Zum Beispiel sind
antibakterielle Verbindungen auf der Basis von Quinolin, wie beispielsweise
Nalidixinsäure,
aus Polymyxin abgeleitete Verbindungen, wie zum Beispiel Colistinmethansulfonat,
antibiotisch wirkende Verbindungen, wie beispielsweise Ceftazidim,
und Salze, wie beispielsweise Lithiumchlorid, bekannte bevorzugte
Inhibitoren.
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Die
Vorrichtung zur Kultur auf dünnen
Folien beinhaltet ebenfalls Gel-bildende Mittel, um ein festes Kulturmedium
bereitzustellen. Ein festes Medium stellt einen festgelegten Bereich
für das
Wachstum von Bakterienkolonien bereit, die in einer Probe vorhanden
sein können.
Geeignete Gel-bildende Mittel schließen handelsüblich erhältlichen Agar und Gel-bildende
Gummis, wie beispielsweise Xanthangummi, Johannisbrotkernmehl, Rhamsan,
Guarkernmehl und Mischungen daraus ein.
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Der
praktische Einsatz der vorliegenden Erfindung in einer Anwendung
einer Vorrichtung zur Kultur auf dünnen Folien ist nachfolgend
in Beispiel 4 veranschaulicht.
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In
den Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung, in welchen das Nährstoffmedium in der Form von
einer Vorrichtung zur Kultur auf dünnen Folien ist, wie zum Beispiel
einer PETRIFILMTM Staphylococcus Zählplatte,
ist die Indikatorsubstanz in einer ausreichenden Menge derart enthalten,
dass, wenn ein Volumen einer Probe, z. B. ein Milliliter, auf die
Vorrichtung aufgetragen wird, die Indikatorsubstanz in dem Kulturmedium mit
der gewünschten
Konzentration vorhanden sein wird (für beispielhafte Präparationsprotokolle
siehe die nachfolgenden Beispiele). Im Anschluss an die Inkubation
von einer Probe in einer derartigen Vorrichtung zur Kultur auf dünnen Folien
werden sich die Staphylokokken-Kolonien rot anfärben (durch den Tetrazolium-Farbstoff,
der in der Deckfolie enthalten ist, siehe nachfolgende Beispiele),
während
hingegen die Kolonien der Nicht-Staphylokokken sich in der charakteristischen
Farbe von der Glucopyranosid-Indikatorsubstanz anfärben. Falls
5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-glucopyranosid als Indikatorsubstanz
verwendet wird, werden sich die Kolonien der Nicht-Staphylokokken,
einschließlich
Bacillus und den anderen, die zuvor erwähnt wurden, mit der charakteristischen
blauen oder grünen
Farbe färben.
An diesem Punkt können
alle blauen oder grünen Kolonien
als negativ auf Staphylokokken verworfen werden, während alle
roten Kolonien mutmaßlich
Staphylokokken sind. Falls alle Kolonien sich blau oder grün anfärben, ist
die Probe für
Staphylokokken negativ und es wird keine weitere Untersuchung benötigt.
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Ein
weiteres geeignetes Kulturformat für die praktische Anwendung
der beanspruchten Erfindung ist ein Nicht-Agar, Calcium-Pektinat-Kultursystem,
wie beispielsweise das REDIGELTM-System,
welches, zum Beispiel, die unterschiedlichen Nachweisreagenzien
des Baird-Parker-Typs enthält.
Der praktische Einsatz der beanspruchten Erfindung in einem REDIGELTM-Format ist nachfolgend in Beispiel 3 veranschaulicht.
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In
der praktischen Anwendung der Erfindung wird ein Kulturmedium in
einer Kulturvorrichtung, wie hierin beschrieben, mit einer Testprobe
inokuliert. Für
die Zwecke dieser Beschreibung wird angenommen, dass das Kulturmedium
ein Indolyl-Glucopyranosid als eine Indikatorsubstanz enthält. Die
Testprobe kann eine Lebensmittel-, eine klinische, eine tiermedizinische,
eine kosmetische, eine pharmazeutische oder eine Umweltprobe sein
oder irgendeine andere Probe, in welcher die Untersuchung auf Staphylokokken
notwendig oder erwünscht
ist. Die Herstellung von derartigen Proben für mikrobiologische Untersuchungen
ist auf dem Fachgebiet gut bekannt.
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Die
Probe wird für
einen Zeitraum (zum Beispiel zwischen etwa 18–48 Stunden) und unter Bedingungen
(zum Beispiel zwischen etwa 30–37°C) kultiviert,
um es den Mikroorganismen aus der Probe zu ermöglichen, nachweisbare Kolonien
in dem Kulturmedium zu bilden. Weil die Kolonien in der Gegenwart
von der Indikatorsubstanz wachsen, werden alle Kolonien von Mikroorganismen
der Beta-Glucosidase-positiven Nicht-Staphylokokken als Konsequenz
aus der Beta-Glucosidase-Reaktion mit dem Glucopyranosid-Substrat eine
charakteristische Färbung,
wie beispielsweise Blau oder Grün,
entwickeln. Die Staphylococcus-Kolonien werden keine charakteristische
Färbung
entwickeln, weil sie, obwohl sie eine Beta-Glucosidase produzieren, kein
Enzym produzieren, das dieses bestimmte Glucopyranosid-Substrat
hydrolysiert.
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Falls
alle Kolonien in dem Kulturmedium die charakteristische Färbung, basierend
auf der Reaktion mit der Glucopyranosid-Indikatorsubstanz entwickeln,
ist die Probe für
Staphylokokken negativ und es wird keine weitere Untersuchung benötigt. Falls
bestimmte Kolonien in dem Kulturmedium als typisch erscheinen und nicht
die kennzeichnenden Eigenschaften entwickeln, sind diese Kolonien
mutmaßlich
Staphylococcus-Kolonien, die enterotoxische oder potentiell enterotoxische
Mikroor ganismen wie beispielsweise S. aureus enthalten, und könnten somit
für weitere
Bestätigungsuntersuchungen
ausgewählt
werden, um zum Beispiel zu bestimmen, ob enterotoxische oder potentiell
enterotoxische Staphylokokken vorhanden sind. Falls bestimmte Kolonien
in dem Kulturmedium atypisch erscheinen, aber sich nichtsdestoweniger
weder Blau noch Grün
färben,
sind diese Kolonien ebenfalls mutmaßliche Staphylokokken und könnten für weitere
derartige Untersuchungen ausgewählt
werden.
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Die
Bestätigung
einer mutmaßlichen
Staphylococcus-Kolonie
kann über
mehrere bekannte Verfahren erreicht werden. Die Kolonie kann hinsichtlich
der Bestimmung, ob sie Koagulaseaktivität aufweist oder ob sie eine
Aktivität
der thermostabilen Nuklease aufweist oder nicht untersucht werden.
Ein positives Ergebnis entweder für Koagulase- oder thermostabile
Nuklease-Aktivität
wird als eine Bestätigung
für die
Anwesenheit von Staphylokokken angesehen. Eine Anzahl von Verfahren
zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Koagulase- oder
thermostabiler Nuklease-Aktivität
sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt.
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Zusätzlich zu
solchen Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, beinhaltet
ein bevorzugtes Mittel zur Bestätigung
der Anwesenheit oder Abwesenheit der thermostabilen Nuklease-Aktivität in einer
kultivierten Probe das Einbringen eines Gegenstandes, der Toluidinblau
(ein metachromatischer Farbstoff, der in der Anwesenheit von hydrolysierter
oder nicht-hydrolysierter DNA unterschiedlich färbt), eine nicht-hydrolysierte DNA
und ein Bindemittel enthält,
gegen die Kolonien in einer Probe nachdem die Probe auf eine Temperatur erhitzt
worden ist, welche ausreicht, die nicht-thermostabilen Nukleasen
zu inaktivieren. Ein nicht-einschränkendes Beispiel für eine bevorzugte
Formulierung für
solch einen Gegenstand und seine Verwendung wird wie folgt veranschaulicht: Inhaltsstoffe
DNA
(Difco Laboratories, Detroit, MI) | 3,6
g/L |
Toluidinblau
O (TBO, Sigma Chemical | 0,32
g/L |
Company,
St. Louis, MO) | |
Calciumchlorid,
wasserfrei | 1,1
mg/L |
(Sigma,
St. Louis, MO) | |
Natriumchlorid | 10
g/L |
(Sigma,
St. Louis, MO) | |
Tris-Hydrochlorid | 6,85
g/L |
(Sigma,
St. Louis, MO) | |
Tris-Base | 0,8
g/L |
(Sigma,
St. Louis, MO) | |
Lambda-Carragenan | 0,4
g/L |
(Sigma,
St. Louis, MO) | |
Guarkernmehl
(Bindemittel) | 10
g/L |
(Rhone-Poulenc
Food Ingredients, | pH
7,3 oder |
Cranbury,
NJ) | 9,0 |
-
Während der
Herstellung des Gegenstandes können
alle Reagenzien (außer
dem TBO und dem Guarkernmehl) zusammen in 1 Liter entionisiertem
Wasser zusammengemischt werden. Die Suspension wird unter fortdauerndem
Rühren
gemischt und bis zum Kochen erhitzt. Das TBO wird zu der Mischung
hinzugefügt und
das Erhitzen eingestellt, während
weiter gerührt
wird. Die Suspension wird danach mit einem Luftmischer (unter heftigem
Rühren)
gemischt und das Guarkernmehl (Bindemittel) hinzugefügt und gemischt,
bis die Suspension einheitlich ist. Die Suspension wird über Nacht
auf 4°C
abgekühlt
und dann mit einer Messerstreichmaschine auf eine 0,18 mm Poly esterfolie
aufgetragen. Es wurden Messerabstände von 12–25 mm festgesetzt (Beschichtungsgewichte
von 0,05–0,10
g/61 Quadratzentimeter (24 Quadrat-Inch)). Die Folien wurden für 2–10 Minuten
bei 93°C
hitzegetrocknet. Gegenstände,
welche eine Dicke von zwischen etwa 0,12 mm bis 0,25 mm aufweisen,
können
anschließend
auf die gewünschte
Form der getrockneten Folien zugeschnitten werden.
-
Im
Anschluss an die Inkubation von einer Probe in dem erfindungsgemäßen Medium,
wird die kultivierte Probe hitzebehandelt, um die nicht-thermostabilen
Nukleasen zu inaktivieren, zum Beispiel bei 60°C für 30 Minuten. Der Gegenstand
wird danach auf die Probe gelegt. Falls Staphylococcus vorhanden
ist, wird sich ein charakteristischer roter oder rosa Farbumschlag
rund um die Kolonie innerhalb von etwa 1 bis 4 Stunden unter angemessenen
Bedingungen entwickeln. Ein roter oder rosa Farbumschlag wird als
Bestätigung
der Anwesenheit von enterotoxischen oder potentiell enterotoxischen
Staphylokokken wie beispielsweise S. aureus angesehen. Ein derartiger
Gegenstand und seine Verwendung sind beschrieben und beansprucht
in dem gemeinsamen 3M-Patent,
US-Patentschrift
Nr. 6,022,682 .
-
Wenn
die Anwesenheit von Staphylokokken in der Probe bestätigt ist,
können
die Anzahl der Staphylokokken-Kolonien
in der kultivierten Probe und die Anzahl der Staphylokokken in der
Originalprobe dann unter Verwendung von irgendeinem aus einer Vielzahl
von Quantifizierungsverfahren bestimmt werden.
-
Die
Erfindung kann mittels der nachfolgenden Beispiele veranschaulicht
werden.
-
BEISPIELE
-
Die
nachfolgenden mikrobiologischen Stämme (Tabelle 1) wurden in den
Experimenten verwendet, die in den nach stehenden Beispielen beschrieben
sind. TABELLE 1
Spezies | Stamm
Bezeichnung | Herkunft |
Bacillus
amyloliquefaciens | 23842 | ATCC2 |
Bacillus
cereus | 11778 | ATCC2 |
Bacillus
cereus | 13061 | ATCC2 |
Bacillus
cereus | 14579 | ATCC2 |
Bacillus
circulans | 61 | ATCC2 |
Bacillus
circulans | 4513 | ATCC2 |
Bacillus
coagulans | 7050 | ATCC2 |
Bacillus
licheniformis | 14580 | ATCC2 |
Bacillus
megaterium | 14581 | ATCC2 |
Bacillus
mycoides | 6462 | ATCC2 |
Bacillus
polymyxa | 842 | ATCC2 |
Bacillus
pumilis | 72 | ATCC2 |
Bacillus
sphaericus | 4525 | ATCC2 |
Bacillus
subtilis | 6051 | ATCC2 |
Bacillus
subtilis | 23059 | ATCC2 |
Bacillus
subtilis | 23856 | ATCC2 |
Bacillus
subtilis | 23857 | ATCC2 |
Bacillus
subtilis | 23858 | ATCC2 |
Bacillus
subtilis | 23859 | ATCC2 |
Bacillus
subtilis | 29056 | ATCC2 |
Bacillus-Spezies | bb | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L1 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L2 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L3 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L4 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L5 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L6 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L7 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L8 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L9 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L10 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L11 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L12 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L13 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L14 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L16 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L17 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L18 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L19 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L20 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L21 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L22 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L23 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L24 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L25 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L26 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L27 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L28 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L29 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | L30 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | LK1 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | LK2 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | LK3 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | LK4 | Lebensmittel-Isolat1 |
Bacillus-Spezies | LK5 | Lebensmittel-Isolat1 |
Enterococcus
faecium | 882 | ATCC2 |
Enterococcus
faecium | 19434 | ATCC2 |
Enterococcus
fecaelis | 29212 | ATCC2 |
Enterococcus
fecaelis | 14990 | ATCC2 |
Enterococcus
fecaelis | 19433 | ATCC2 |
Enterococcus
fecaelis | MMM | Lebensmittel-Isolat1 |
Enterococcus-Spezies | P89 | Klinisches
Isolat3 |
Enterococcus-Spezies | P90 | Klinisches
Isolat3 |
Enterococcus-Spezies | P91 | Klinisches
Isolat3 |
Enterococcus-Spezies | P92 | Klinisches
Isolat3 |
Enterococcus-Spezies | P93 | Klinisches
Isolat3 |
Enterococcus-Spezies | P94 | Klinisches
Isolat3 |
Enterococcus-Spezies | P88 | Klinisches
Isolat3 |
Enterococcus-Spezies | M1026 | Klinisches
Isolat3 |
Enterococcus-Spezies | M1028 | Klinisches
Isolat3 |
Enterococcus-Spezies | M1030 | Klinisches
Isolat3 |
Enterococcus-Spezies | M1032 | Klinisches
Isolat3 |
Enterococcus-Spezies | M1038 | Klinisches
Isolat3 |
Enterococcus-Spezies | M1040 | Klinisches
Isolat3 |
Enterococcus-Spezies | M1044 | Klinisches
Isolat3 |
Enterococcus-Spezies | M1148 | Klinisches
Isolat3 |
Enterococcus-Spezies | M2017 | Klinisches
Isolat3 |
Enterococcus-Spezies | M2022 | Klinisches
Isolat3 |
Enterococcus-Spezies | M1144 | Klinisches
Isolat3 |
Enterococcus-Spezies | M1067 | Klinisches
Isolat3 |
Enterococcus-Spezies | M1062 | Klinisches
Isolat3 |
Staphylococcus
aureus | 25923 | ATCC2 |
Staphylococcus
aureus | W-832 | ATCC2 |
Staphylococcus
aureus | 13301 | ATCC2 |
Staphylococcus
aureus | 13565 | ATCC2 |
Staphylococcus
aureus | 12600 | ATCC2 |
Staphylococcus
aureus | 27659 | ATCC2 |
Staphylococcus
aureus | 12598 | ATCC2 |
S.
epidermidis | 12228 | ATCC2 |
S.
epidermidis | 14990 | ATCC2 |
S.
epidermidis | 35547 | ATCC2 |
Klebsiella
pneumoniae | U28 | Klinisches
Isolat |
Klebsiella
oxytoca | U33 | Klinisches
Isolat |
Listeria
gravi | 11120 | ATCC2 |
Listeria
innocua | 33091 | ATCC2 |
Listeria
ivanovii | 19119 | ATCC2 |
Listeria
ivanovii | 19919 | ATCC2 |
Listeria
monocytogenes | 13932 | ATCC2 |
Listeria
monocytogenes | 15313 | ATCC2 |
Listeria
monocytogenes | 19112 | ATCC2 |
Listeria
monocytogenes | 19118 | ATCC2 |
Listeria
monocytogenes | 43256 | ATCC2 |
Listeria
monocytogenes | 49594 | ATCC2 |
Listeria
murravi | 25401 | ATCC2 |
Proteus
vulgaris | U61 | Klinisches
Isolat3 |
Proteus
vulgaris | U62 | Klinisches
Isolat3 |
Proteus
vulgaris | U63 | Klinisches
Isolat3 |
- 1 Lebensmittel-Isolat
in der 3MTM Microbiology Products Laboratory
Kultursammlung, 3M Center, Saint Paul, MN
- 2 American Type Culture Collection,
Rockville, MD
- 3 Kultursammlung Klinische Mikrobiologie
der Universität
von Minnesota, Minneapolis, MM
-
BEISPIEL 1
-
Anwendung von Baird-Parker-Agar
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht den praktischen Einsatz der beanspruchten
Erfindung in einer Baird-Parker-Agar Anwendung. Materialien:
Baird-Parker-Agar
(BPA) | Difco
Laboratories, |
| Detroit,
MI |
Bacto
Eigelb-Tellurit | Difco
Laboratories, |
Suspension
(EYT) | Detroit,
MI |
5-Brom-4-Chlor-3-indolyl- | Biosynth
International, |
beta-D-Glucopyranosid
(BCIG) | Chicago,
IL |
Dimethyl-Formamid
(DMF) | Fisher
Scientific, |
| Fairlawn,
NJ |
Röhrchen mit
tryptischem | DiMed
Laboratories, |
Soja-Nährmedium | St
Paul, MN |
Tryptische
Soja-Agarplatten | DiMed
Laboratories, |
| St
Paul, MN |
-
Verfahren:
-
Einhundertsechsundzwanzig
g BPA-Pulver (Difco Laboratories) wurden abgewogen und mit 2 Litern entionisiertem
Wasser gemäß der Vorschrift
des Herstellers gemischt. Einhundert Milligramm BCIG wurden in ein
16 × 150
Millimeter Glasröhrchen
mit Schraubkappe abgewogen. Zehn Milliliter DMF wurden zu dem BCIG-Pulver
hinzugefügt
und kräftig
gemischt. Die Suspension wurde auf 60°C in einem Wasserbad erwärmt und
so lange inkubiert, bis das Pulver aufgelöst war. Das vermischte und
erwärmte
BPA-Pulver wurde in acht 200-Milliliter All quots in autoklavierbare
Glasbehälter
mit 500-Milliliter Volumen aufgeteilt. In die ersten sieben Glasbehälter wurden
(jeweils in getrennte Glasbehälter)
2 Milliliter, 1 Milliliter, 0,5 Milliliter, 0,25 Milliliter, 0,125 Milliliter,
0,0625 Milliliter und 0,0313 Milliliter der 10 Milligramm/Milliliter
BCIG-Lösung
hinzugefügt.
Zu dem letzten BPA-Aliquot wurde kein BCIG hinzugefügt. Die
Glasbehälter
wurden bei 121°C
für 15
Minuten bei 15 Atmosphären
Druck autoklaviert. Alle acht Glasbehälter wurden auf 46°C temperiert.
Während
des Temperierens wurde die Bacto Eigelb-Tellurit-(EYT-)Suspension von 2–8°C auf 46°C angewärmt. Nachdem
das BPA 46°C
erreichte, wurden 10 Milliliter von der EYT-Suspension zu jedem
Glasbehälter
hinzugefügt.
Die Glasbehälter
wurden behutsam geschwenkt, um das EYT mit dem geschmolzenen Agar
zu vermischen. Zwanzig Milliliter von dem BCIG-Medium wurden zu
jeder von neun 15 × 150-Millimeter
Petrischalen hinzugefügt.
Nachdem die Platten gegossen waren und zum Festwerden stehen gelassen
wurden, wurden die Platten umgedreht und über Nacht vor der Verwendung
bei Raumtemperatur inkubiert.
-
Die
Bakterienkulturen wurden auf die TSA-Ausstrichplatten ausgestrichen
und bei 37°C über Nacht
inkubiert. Dieselben Platten wurden für wiederholte Experimente verwendet
und bei 2–8°C aufbewahrt.
Vor den Tests wurden die Platten auf Raumtemperatur angewärmt. Die
BCIG/BPA-Platten wurden in acht gleiche tortenstückartige Abschnitte unterteilt.
Es wurden isolierte Kolonien von der TSA-Platte ausgewählt und
auf den BCIG/BPA-Platten ausgestrichen, eine Kolonie pro BCIG/BPA-Abschnitt
pro Konzentration. Die Platten wurden bei 37°C für 48 Stunden inkubiert. Die
Beobachtungen der Platten wurden nach 48 Stunden durchgeführt und
sind in Tabelle 2 angegeben. TABELLE 2
Stamm | Spezies | BPA (BCIG-Konzentration
in μg/mL) |
| | 0 | 100 | 50 | 25 | 12,5 | 6,3 | 3,1 | 1,6 |
27660 | S.
aureus | T1 | T | T | T | T | T | T | T |
13301 | S.
aureus | T | T | T | T | T | T | T | T |
13565 | S.
aureus | T | T | T | T | T | T | T | T |
12600 | S.
aureus | B2 | B | B | B | B | B | B | B |
27659 | S.
aureus | T | T | T | T | T | T | T | T |
W-832 | S.
aureus | T | T | T | T | T | T | T | T |
12598 | S.
aureus | T | T | T | T | T | T | T | T |
25923 | S.
aureus | T | T | T | T | T | T | T | T |
19433 | E.
fecaelis | B | G3 | G | B | B | B | B | B |
MMM | E.
fecaelis | B | G | G | G | B | B | B | B |
882 | E.
faecium | B | G | G | G | B | B | B | B |
19434 | E.
faecium | B | G | G | G | B | B | B | B |
P88 | E.-Spezies | B | G | B | B | B | B | B | B |
P89 | E.-Spezies | B | G | B | B | B | B | B | B |
P90 | E.-Spezies | B | G | B | B | B | B | B | B |
P91 | E.-Spezies | B | G | B | B | B | B | B | B |
P92 | E.-Spezies | B | G | G | G | B | B | B | B |
P93 | E.-Spezies | B | G | G | B | B | B | B | B |
P94 | E.-Spezies | B | G | G | B | B | B | B | B |
M1026 | E.-Spezies | B | G | G | B | B | B | B | B |
M1028 | E.-Spezies | B | G | G | B | B | B | B | B |
M1030 | E.-Spezies | B | G | G | B | B | B | B | B |
M1032 | E.-Spezies | B | G | G | B | B | B | B | B |
M1038 | E.-Spezies | B | G | G | G | B | B | B | B |
L3 | B.-Spezies | B | G | B | B | B | B | B | B |
L4 | B.-Spezies | B | G | G | B | B | B | B | B |
L8 | B.-Spezies | B | G | B | B | B | B | B | B |
L9 | B.-Spezies | B | G | G | B | B | B | B | B |
L11 | B.-Spezies | B | G | B | B | B | B | B | B |
L12 | B.-Spezies | B | G | B | B | B | B | B | B |
L13 | B.-Spezies | B | G | B | B | B | B | B | B |
L14 | B.-Spezies | B | G | B | B | B | B | B | B |
L18 | B.-Spezies | B | G | B | B | B | B | B | B |
L20 | B.-Spezies | B | G | B | B | B | B | B | B |
L24 | B.-Spezies | B | G | B | B | B | B | B | B |
L27 | B.-Spezies | B | G | G | B | B | B | B | B |
LK1 | B.-Spezies | B | G | B | B | B | B | B | B |
LK3 | B.-Spezies | B | G | B | B | B | B | B | B |
LK4 | B.-Spezies | B | G | B | B | B | B | B | B |
LK5 | B.-Spezies | B | G | G | B | B | B | B | B |
- 1 Typische Kolonien
- 2 Nicht-typische Kolonien mit schwarzem
Präzipitat
- 3 Nicht-typische Kolonien mit blaugrünem Präzipitat
mit oder ohne schwarzes Präzipitat
-
BEISPIEL 2
-
Zusätzliche
Stämme
wurden mit BCIG/BPA-Medien bei 0 und 100 Mikrogramm/Milliliter untersucht. Dreiundsechzig
g BPA-Pulver (Difco Laboratories) wurden abgewogen und mit 950 Millilitern
entionisiertem Wasser gemäß der Vorschrift
des Herstellers gemischt. Einhundert Milligramm BCIG wurden in ein
16 × 150 mm
Glasröhrchen
mit Schraubkappe abgewogen. Zehn Milliliter DMF wurden zu dem BCIG-Pulver
hinzugefügt
und energisch gemischt. Die Suspension wurde auf 60°C in einem
Wasserbad erwärmt
und so lange inkubiert, bis das Pulver aufgelöst war. Das vermischte und
erwärmte
BPA-Pulver wurde in zwei 425-Milliliter Aliquots in autoklavierbare
Glasbehälter
mit 1000-Milliliter Volumen aufgeteilt. In einen Glasbehälter wurden
5,0 Milliliter von der 10 Milligramm/Milliliter BCIG-Lösung hinzugefügt. Zu dem
anderen BPA-Aliquot wurde kein BCIG hinzugefügt. Die Glasbehälter wurden
bei 121°C
für 15
Minuten bei 15 Atmosphären
Druck autoklaviert. Beide Glasbehälter wurden auf 46°C temperiert.
Während
des Temperierens wurde die Bacto Eigelb-Tellurit-(EYT-)-Suspension von 2–8°C auf 46°C angewärmt. Nachdem
das BPA 46°C
erreichte, wurden 25 Milliliter von der EYT-Suspension zu jedem
Glasbehälter
hinzugefügt.
Die Glasbehälter
wurden behutsam geschwenkt, um das EYT mit dem geschmolzenen Agar
zu vermischen. Zwanzig Milliliter von dem BCIG-Medium wurden zu
fünfundzwanzig
15 × 100-Millimeter
Petrischalen hinzugefügt.
Nachdem die Platten gegossen waren und zum Festwerden stehen gelassen
wurden, wurden die Platten umgedreht und über Nacht vor der Verwendung bei
Raumtemperatur inkubiert.
-
Die
Bakterienkulturen wurden auf die TSA-Ausstrichplatten ausgestrichen
und bei 37°C über Nacht
inkubiert. Dieselben Platten wurden für wiederholte Experimente verwendet
und bei 2–8°C aufbewahrt.
Vor den Tests wurden die Platten auf Raumtemperatur angewärmt.
-
Die
BCIG/BPA-Platten wurden in acht gleiche tortenstückartige Abschnitte unterteilt.
Es wurden isolierte Kolonien von der TSA-Platte ausgewählt und
auf den BCIG/BPA-Platten ausgestrichen; eine Kolonie pro BCIG/BPA-Abschnitt
pro Konzentration. Die Platten wurden bei 37°C für 48 Stunden inkubiert. Die
Beobachtungen der Platten wurden nach 48 Stunden durchgeführt und
sind in Tabelle 3 angegeben. TABELLE 3
Stamm | Spezies | 0 μg/ml BCIG/BPA | 100 μg/ml BCIG/BPA |
23842 | B.
amyloliquefaciens | B1 | G2 |
11778 | B.
cereus | B | B* |
13061 | B.
cereus | B | B* |
14579 | B.
cereus | B | B* |
61 | B.
circulans | B | G |
4513 | B.
circulans | B | G |
7050 | B.
coagulans | B | G |
14580 | B.
licheniformis | B | G |
14581 | B.
megaterium | ng3 | ng |
6462 | B.
mycoides | B | B* |
842 | B.
polymyxa | B | G |
72 | B.
pumilis | B | G |
4525 | B.
sphaericus | B | B* |
6051 | B.
subtilis | B | G |
23059 | B.
subtilis | B | G |
23856 | B.
subtilis | B | G |
23857 | B.
subtilis | B | G |
23858 | B.
subtilis | B | G |
23859 | B.
subtilis | B | G |
29056 | B.
subtilis | B | G |
BB | B.-Spezies | B | G |
L1 | B.-Spezies | B | G |
L2 | B.-Spezies | ng | ng |
L3 | B.-Spezies | B | G |
L4 | B.-Spezies | B | G |
L5 | B.-Spezies | ng | ng |
L6 | B.-Spezies | ng | ng |
L7 | B.-Spezies | ng | ng |
L8 | B.-Spezies | B | G |
L9 | B.-Spezies | B | G |
L10 | B.-Spezies | ng | ng |
L11 | B.-Spezies | B | G |
L12 | B.-Spezies | B | G |
L13 | B.-Spezies | B | G |
L14 | B.-Spezies | B | G |
L15 | B.-Spezies | ng | ng |
L16 | B.-Spezies | B | G |
L17 | B.-Spezies | B | G |
L18 | B.-Spezies | B | G |
L19 | B.-Spezies | ng | ng |
L20 | B.-Spezies | B | G |
L21 | B.-Spezies | ng | ng |
L22 | B.-Spezies | ng | ng |
L23 | B.-Spezies | ng | ng |
L24 | B.-Spezies | B | G |
L25 | B.-Spezies | ng | ng |
L26 | B.-Spezies | ng | ng |
L27 | B.-Spezies | B | G |
L28 | B.-Spezies | ng | ng |
L29 | B.-Spezies | ng | ng |
L30 | B.-Spezies | B | G |
LK1 | B.-Spezies | B | G |
LK2 | B.-Spezies | ng | ng |
LK3 | B.-Spezies | B | G |
LK4 | B.-Spezies | B | G |
LK5 | B.-Spezies | B | G |
882 | E.
faecium | B | G |
19434 | E.
faecium | B | G |
29212 | E.
fecaelis | B | G |
14990 | E.
fecaelis | B | G |
19433 | E.
fecaelis | B | G |
MMM | E.
fecaelis | B | G |
P89 | E.-Spezies | B | G |
P90 | E.-Spezies | B | G |
P91 | E.-Spezies | B | G |
P92 | E.-Spezies | B | G |
P93 | E.-Spezies | B | G |
P94 | E.-Spezies | B | G |
P88 | E.-Spezies | B | G |
M1026 | E.-Spezies | B | G |
M1028 | E.-Spezies | B | G |
M1030 | E.-Spezies | B | G |
M1032 | E.-Spezies | B | G |
M1038 | E.-Spezies | B | G |
M1040 | E.-Spezies | B | G |
M1044 | E.-Spezies | B | G |
M1148 | E.-Spezies | B | G |
M2017 | E.-Spezies | B | G |
M2022 | E.
Spezies | B | G |
M1144 | E.
Spezies | B | G |
M1067 | E.
Spezies | B | G |
M1062 | E.-Spezies | B | G |
25923 | S.
aureus | T4 | T |
W-832 | S.
aureus | T | T |
13301 | S-
aureus | T | T |
13565 | S.
aureus | T | T |
12600 | S.
aureus | B | B |
27659 | S.
aureus | T | T |
12598 | S.
aureus | T | T |
12228 | S.
epidermidis | B | B |
14990 | S.
epidermidis | B | B |
35547 | S.
epidermidis | B | B |
U28 | Klebsiella
pneumoniae | B | G |
U33 | Klebsiella
oxytoca | B | G |
11120 | Listeria
grayi | B | G |
33091 | Listeria
innocua | B | G |
19119 | Listeria
ivanovii | B | G |
19919 | Listeria
ivanovii | B | G |
13932 | Listeria
monocytogenes | B | G |
15313 | Listeria
monocytogenes | B | G |
19112 | Listeria
monocytogenes | B | G |
19118 | Listeria
monocytogenes | B | G |
43256 | Listeria
monocytogenes | B | G |
49594 | Listeria
monocytogenes | B | G |
25401 | Listeria
murrayi | B | G |
U61 | Proteus
vulgaris | B | G |
U62 | Proteus
vulgaris | B | G |
U63 | Proteus
vulgaris | B | G |
- * BCIG-negativer Stamm
- 1 Nicht-typische Kolonien mit schwarzem
Präzipitat
- 2 Nicht-typische Kolonien mit blaugrünem Präzipitat
mit oder ohne schwarzes Präzipitat
- 3 Kein Wachstum
- 4 Typische Kolonien
-
BEISPIEL 3
-
REDIGELTM Baird-Parker:
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht den praktischen Einsatz der beanspruchten
Erfindung in einer Calcium-Pektinat-(REDIGEL
TM)
Anwendung. Materialien:
Baird-Parker
REDIGELTM | RCR,
Inc., Goshun, IN |
(Größe für 10 Platten) | |
5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl- | Biosynth
International, |
beta-D-Glucopyranosid
(BCIG) | Chicago,
IL |
Dimethyl-Formamid
(DMF) | Fisher
Scientific, |
| Fairlawn,
NJ |
Röhrchen mit
tryptischem | DiMed
Laboratories, |
Soja-Nährmedium | St
Paul, MN |
Tryptische
Soja-Agarplatten | DiMed
Laboratories, |
| St
Paul, MN |
-
Verfahren:
-
REDIGEL
TM, ein handelsüblich erhältliches Produkt, das Calcium-Pektinat
als gelierende Matrix für das
mikrobielle Wachstum und den Nachweis verwendet, benutzt für den Nachweis
von Staphylokokken ein System, das ähnlich zu dem Baird-Parker-Agar
ist. Das für
diese Anwendung verwendete System war ein 10-Platten Kit, das 110
Milliliter Lösung
enthält,
welche die selektiven und unterschiedlichen Reagenzien in der Lösung mit
dem Pektin enthält,
und behandelte Petrischalen, die das Calcium enthalten, welches
benötigt
wird, um die Gelmatrix für
das mikrobielle Wachstum zu bilden. Zu fünf Fläschchen mit der Lösung wurden
die folgenden Volumen von 10 Milligramm BCIG/Milliliter in DMF hinzugefügt: 1,1
Milliliter, 0,55 Milliliter, 0,275 Milliliter, 0,1375 Milliliter,
0,0688 Milliliter und 0 Milliliter. Dies ergab Lösungen mit 100, 50, 25, 12,5,
6,3 und 0 Mikrogramm BCIG pro Milliliter. Elf Milliliter von jeder
Lösung
wurden zu neun einzelnen Platten hinzugefügt. Die Platten wurden aufrecht
stehend für
6 Stunden bei Raumtemperatur stehen lassen. Anschließend wurden TSA-Kulturen
auf den Platten wie in dem vorherigen Abschnitt für die BPA-Evaluierung
ausgestrichen. Die Platten wurden danach bei 37°C für 48 Stunden inkubiert und
gelesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 wiedergegeben. TABELLE 4
Stamm | Spezies | REDIGELTM Baird-Parker (BCIG-Konzentration in μg/mL) |
| 0 | 100 | 50 | 25 | 12,5 | 6,3 |
27660 | S.
aureus | T1 | T | T | T | T | T |
13301 | S.
aureus | T | T | T | T | T | T |
13565 | S.
aureus | T | T | T | T | T | T |
12600 | S.
aureus | B2 | B | B | B | B | B |
27659 | S.
aureus | T | T | T | T | T | T |
W-832 | S.
aureus | T | T | T | T | T | T |
12598 | S.
aureus | T | T | T | T | T | T |
25923 | S.
aureus | T | T | T | T | T | T |
19433 | E.
fecaelis | B1 | G3 | G | G | G | B |
MMM | E.
fecaelis | B | G | G | G | G | B |
882 | E.
faecium | B | G | G | G | G | B |
19434 | E.
faecium | B | G | G | G | G | B |
P88 | E.-Spezies | B | G | G | G | G | B |
P89 | E.-Spezies | B | G | G | G | G | B |
P90 | E.-Spezies | B | G | G | G | G | B |
P91 | E.-Spezies | B | G | G | G | G | B |
P92 | E.-Spezies | B | G | G | G | G | B |
P93 | E.-Spezies | B | G | G | G | G | B |
P94 | E.-Spezies | B | G | G | G | G | B |
M1026 | E.-Spezies | B | G | G | G | G | B |
M1028 | E.-Spezies | B | G | G | G | G | B |
M1030 | E.-Spezies | B | G | G | G | G | B |
M1032 | E.-Spezies | B | G | G | G | G | B |
M1038 | E.-Spezies | B | G | G | G | G | B |
L3 | B.-Spezies | B | G | B | B | B | B |
L4 | B.-Spezies | B | G | G | B | B | B |
L8 | B.-Spezies | B | G | B | B | B | B |
L9 | B.-Spezies | B | G | G | G | B | B |
L11 | B.-Spezies | B | G | G | G | B | B |
L12 | B.-Spezies | B | G | B | B | B | B |
L13 | B.-Spezies | B | G | G | B | B | B |
L14 | B.-Spezies | B | G | G | B | B | B |
L18 | B.-Spezies | B | G | G | B | B | B |
L20 | B.-Spezies | B | G | G | B | B | B |
L24 | B.-Spezies | B | G | G | B | B | B |
L27 | B.-Spezies | B | G | G | G | B | B |
LK1 | B.-Spezies | B | G | G | B | B | B |
LK3 | B.-Spezies | B | G | B | B | B | B |
LK4 | B.-Spezies | B | G | G | B | B | B |
LK5 | B.-Spezies | B | G | G | B | B | B |
- 1 Typische Kolonien
- 2 Nicht-typische Kolonien mit schwarzem
Präzipitat
- 3 Nicht-typische Kolonien mit blaugrünem Präzipitat
mit oder ohne schwarzes Präzipitat
-
BEISPIEL 4
-
Anwendung der PETRIFILMTM Staphylococcus-Zählplatte mit
-
BCIG-Titration
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht den praktischen Einsatz der beanspruchten
Erfindung in einer Vorrichtung zur Kultur auf dünnen Folien. Materialien:
PETRIFILMTM Aerobic Count | 3M
Company, St. Paul, MN |
Deckfolie | |
Xanthangummi | Kelco,
San Diego, CA |
Johannisbrotkernmehl | Genu
Worldwide, Lille |
| Skensved,
Dänemark |
Guarkernmehl | Meyhall
Chemical RG, |
| Zandaam,
Niederlande |
0,19
mm (7,5 mil) Melinex | ICI
Films, |
| Wilmington,
DE |
Nährmadium-Pulver:
Tryptose-Pepton | Acumedia,
Baltimore, MD |
Dipepton | Acumedia,
Baltimore, MD |
Hefeextrakt | BBL,
Baltimore, MD |
Lithiumchlorid | Sigma
Chemical, |
| St.
Louis, MO |
Nalidixinsäure | Sigma
Chemical, |
| St.
Louis, MO |
Ceftazidim | Sigma
Chemical, |
| St.
Louis, MO |
Brenztraubensäure | Sigma
Chemical, |
| St.
Louis, MO |
Eigelb-Suspension | Difco
Laboratories, |
| Detroit,
MI |
5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl- | Biosynth
International, |
beta-D-Glucopyranosid
(BCIG) | Naperville,
IL |
0,5
mm (20 mil) Styropor | Astro-Valcour,
Inc., |
| Glen
Falls, NY |
-
Die
Titration zur Bestimmung des wirksamen Bereiches von BCIG zur Differenzierung
von S. aureus gegenüber
BCIG-positiven Nicht-S. aureus wurde folgendermaßen vervollständigt:
-
Deckfolie:
-
Xanthangummi,
Johannisbrotkernmehl und Guarkernmehl wurden mit einem Verhältnis von
2:2:1 gemischt. Diese Mischung wurde auf die PETRIFILMTM Aerobic
Count Deckfolie, welche Triphenyltetrazoliumchlorid, mit einer Konzentration
von annähernd
0,4 Gramm pro 61 Quadratzentimeter (24 Quadrat-Inch) der Folie enthält, pulverbeschichtet.
-
Nährmedium-Mischung:
-
Die
Nährmedium-Pulver
wurden in der folgenden Weise gemischt:
Tryptose-Pepton | 100
Gramm |
Dipepton | 100
Gramm |
Hefeextrakt | 40
Gramm |
Lithiumchlorid | 40
Gramm |
Nalidixinsäure | 80
Milligramm |
Ceftazidim | 8
Milligramm |
Brenztraubensäure | 40
Gramm |
Eigelb-Suspension | 80
Milliliter |
Entionisiertes
Wasser | 4
Liter |
-
Die
Pulver wurden energisch in das Wasser gemischt. Die Lösung wurde
in acht 500-Milliliter Aliquots aufge teilt. Die nachfolgenden Mengen
an BCIG wurden zu den getrennten Aliquots hinzugefügt und energisch gemischt:
100 Milligramm, 75 Milligramm, 50 Milligramm, 37,5 Milligramm, 25
Milligramm und 12,5 Milligramm. Fünf Gramm einer gleichen Mischung
aus Xanthangummi:Guarkernmehl wurde zu jeder Lösung hinzugefügt und energisch
gemischt. Nachdem alle Pulver hinzugefügt und gut gemischt waren,
wurden die Lösungen
auf 80°C
unter energischem Mischen erhitzt. Die Lösungen wurden anschließend über Nacht
auf 2–8°C abgekühlt. Das
Nährmedium
wurde mit einem Messerabstand von annähernd 0,33 mm (13 mil) auf
die Melinexfolie aufgetragen und dann bei 93°C für ungefähr 10 Minuten getrocknet. Ein
Beschichtungsgewicht von 300–350
Milligramm pro 61 Quadratzentimeter (24 Quadrat-Inch) wurde mit
dieser Beschichtung erreicht. Fünfhundert
Mikrometer (20 mil) Styropor wurden mit einem Acrylsäure-Klebstoff
transferbeschichtet. Es wurden Kreise mit einem Durchmesser von
5,1 Zentimeter (2 Inch) aus dem Styropormaterial entfernt, die als
eine Vertiefung zum Halten des Inokulums fungieren. Das mit dem
Nährmedium
beschichtete Gewebe wurde auf die 0,5 mm (20 mil) Styropor laminiert.
Ein 1,3 Zentimeter (0,5 Inch) dickes, doppelseitiges Klebeband wurde
als Gelenkband verwendet, um die pulverbeschichtete Deckfolie mit
dem Styropor/Nährmedium-beschichteten
Melinex-Laminat zu verbinden. Die Folien wurden in 7,6 × 10,2 cm
(3 × 4
Inch) große
Rechtecke mit dem Kreis annähernd in
dem Zentrum von dem Rechteck zugeschnitten. Die Folien wurden mit
Gammastrahlen bei 5–10
Kilogray vor der Evaluierung bestrahlt. Die Bakterienkulturen wurden
für die
Evaluierung durch Kultivieren in tryptischem Soja-Nährmedium über Nacht
bei 37°C über Nacht
hergestellt. Entsprechende Verdünnungen
von den Kulturen wurden hergestellt, um ungefähr 100 koloniebildende Einheiten
(cfu) pro Milliliter in Butterfields-Standardmethoden-Puffer (Fisher
Scientific, Chicago, IL) zu erhalten. Die Verdünnungen von jedem Bakterium
wurden mit den Ergebnissen verglichen, die von einer äquivalenten
Plattie rung auf PETRIFILM
TM Aerobic-Count Platte
(PAC) erhalten wurden, mit den Ergebnissen, die in Tabelle 5 dargestellt
sind. Die Bakterienverdünnungen
(1,0 Milliliter) wurden ausplattiert und nach 24 Stunden bei 37°C gezählt. TABELLE 5
Stamm | Spezies | PETRIFILMTM Staphylococcus Zähl-Platte (BCIG-Konzentrationin μg/mL) |
| 0 | 100 | 75 | 50 | 37,5 | 25 | 12,5 | PAC |
27660 | S.
aureus | 92- | 83- | 80- | 83- | 62- | 86- | 76- | 85 |
13301 | S.
aureus | 175- | 154- | 184- | 170- | 193- | 194- | 173- | 184 |
13565 | S.
aureus | 39- | 50- | 44- | 44- | 45- | 51- | 43- | 42 |
12600 | S.
aureus | 120- | 121- | 134- | 132- | 120- | 106- | 112- | 130 |
27659 | S.
aureus | 115- | 122- | 144- | 132- | 127- | 130- | 125- | 166 |
W-832 | S.
aureus | 189- | 161- | 159- | 158- | 157- | 170- | 164- | 168 |
12598 | S.
aureus | 115- | 95- | 114- | 106- | 112- | 104- | 92- | 114 |
25923 | S.
aureus | 39- | 49- | 55- | 57- | 59- | 61- | 48- | 54 |
19433 | E.
fecaelis | ng1 | ng | 3* | 24* | 21* | ng | ng | 137 |
MMM | E.
fecaelis | 125- | 98* | 156* | 136* | 145* | 142* | 134* | 205 |
882 | E.
faecium | 41- | 65* | 82* | 69* | 53* | 75* | 69- | 78 |
19434 | E.
faecium | 80- | 41* | 63* | 82* | 91* | 107* | 78- | 131 |
P88 | E.-Spezies | 36- | 10* | 25* | 28* | 28* | 34- | 14- | 103 |
P89 | E.-Spezies | 16- | 32* | 26* | 13* | 41* | 28- | 21- | 81 |
P90 | E.-Spezies | 9- | 3* | 9* | 10* | 20* | 21* | 8* | 115 |
P91 | E.-Spezies | 20- | 7* | 28* | 17* | 64* | 35* | ng | 121 |
P92 | E.-Spezies | ng | ng | ng | ng | 5* | 22* | ng | 102 |
P93 | E.-Spezies | 20- | 2* | 20* | 17* | 12* | 25* | 2- | 80 |
P94 | E.-Spezies | 13- | 4* | 29* | 5* | 29* | 34* | 10- | 102 |
M1026 | E.-Spezies | 2- | 1* | 2* | 1* | ng | 4* | ng | 62 |
M1028 | E.-Spezies | ng | 8* | 16* | 7* | 8* | 25* | 1- | 74 |
M1030 | E.-Spezies | 1- | 5* | ng | ng | 20* | 28* | 1- | 146 |
M1032 | E.-Spezies | ng | 6* | 1* | 4* | 7* | 6* | ng | 70 |
M1038 | E.-Spezies | 11- | ng | ng | ng | 14* | 7* | ng | 67 |
L3 | B.-Spezies | ng | ng | ng | ng | ng | ng | ng | 210 |
L4 | B.-Spezies | ng | ng | ng | ng | ng | ng | ng | >300 |
L8 | B.-Spezies | ng | ng | ng | ng | ng | ng | ng | >300 |
L9 | B.-Spezies | 139- | 121* | 144* | 153* | 135- | 157- | 135- | 180 |
L11 | B.-Spezies | ng | ng | ng | ng | ng | ng | ng | >300 |
L12 | B.-Spezies | ng | ng | ng | ng | ng | ng | ng | 190 |
L13 | B.-Spezies | ng | ng | ng | ng | ng | ng | ng | 200 |
L14 | B.-Spezies | ng | ng | ng | ng | ng | ng | ng | >300 |
L18 | B.-Spezies | ng | ng | ng | ng | ng | ng | ng | >300 |
L20 | B.-Spezies | ng | ng | ng | ng | ng | ng | ng | >300 |
L24 | B.-Spezies | ng | ng | ng | ng | ng | ng | ng | 250 |
L27 | B.-Spezies | ng | ng | ng | ng | ng | ng | ng | >300 |
LK1 | B.-Spezies | ng | ng | ng | ng | ng | ng | ng | 330 |
LK3 | B.-Spezies | ng | ng | ng | ng | ng | ng | ng | 157 |
LK4 | B.-Spezies | ng | ng | ng | ng | ng | ng | ng | 170 |
LK5 | B.-Spezies | 170- | 150* | 180* | 220* | 190* | 210- | 180- | 270 |
- 1 Kein Wachstum
- * Blaue bis rotblaue Kolonien
- - Nur rote Kolonien
-
Um
weiter Stämme
zu evaluieren, wurden PETRIFILM
TM Staphylococcus
Zählplatten-(PSC-)Formulierungen
mit 0 und 100 Milligramm/Milliliter BCIG wie folgt hergestellt: Materialien:
PETRIFILMTM Aerobic Count | 3M
Company, St. Paul, MN |
Deckfolie | |
Xanthangummi | Kelco,
San Diego, CA |
Johannisbrotkernmehl | Genu
Worldwide, Lille |
| Skensved,
Dänemark |
Guarkernmehl | Meyhall
Chemical AG, |
| Zandaam,
Niederlande |
0,19
mm (7,5 mil) Melinex | ICI
Films, Wilmington, DE |
Nährmedium-Pulver:
Tryptose-Pepton | Acumedia,
Baltimore, MD |
Dipepton | Acumedia,
Baltimore, MD |
Hefeextrakt | BBL,
Baltimore, MD |
Lithiumchlorid | Sigma
Chemical, |
| St.
Louis, MO |
Nalidixinsäure | Sigma
Chemical, |
| St.
Louis, MO |
Ceftazidim | Sigma
Chemical, |
| St.
Louis, MO |
Brenztraubensäure | Sigma
Chemical, |
| St.
Louis, MO |
Eigelb-Suspension | Difco
Laboratories, |
| Detroit,
MI |
5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl- | Biosynth
International, |
beta-D-Glucopyranosid
(BCIG) | Naperville,
IL |
0,5
mm (20 mil) Styropor | Astro-Valcour,
Inc., |
| Glen
Falls, NY |
-
Deckfolie:
-
Xanthangummi,
Johannisbrotkernmehl und Guarkernmehl wurden mit einem Verhältnis von
2:2:1 gemischt. Diese Mischung wurde auf die PETRIFILMTM Aerobic-Count
Deckfolie, welche Triphenyltetrazoliumchlorid mit einer Konzentration
von annähernd
0,4 Gramm pro 86,4 Quadrat zentimeter (34 Quadrat-Inch) der Folie
enthält,
pulverbeschichtet.
-
Nährmedium-Mischung:
-
Die
Nährmedium-Pulver
wurden in der folgenden Weise gemischt:
Tryptose-Pepton | 50
Gramm |
Dipepton | 50
Gramm |
Hefeextrakt | 20
Gramm |
Lithiumchlorid | 20
Gramm |
Nalidixinsäure | 40
Milligramm |
Ceftazidim | 4
Milligramm |
Brenztraubensäure | 20
Gramm |
Eigelb-Suspension | 40
Milliliter |
Entionisiertes
Wasser | 2
Liter |
-
Die
Pulver wurden energisch in das Wasser gemischt. Die Lösung wurde
in zwei 1000-Milliliter Aliquots aufgeteilt. Zweihundert Milligramm
BCIG wurde zu einem der Aliquots hinzugefügt und energisch gemischt.
Zwanzig Gramm einer gleichen Mischung aus Xanthangummi:Guarkernmehl
wurde zu beiden Lösungen
hinzugefügt
und energisch gemischt. Nachdem alle Pulver hinzugefügt und gut
gemischt waren, wurden beide Lösungen
auf 80°C
unter energischem Mischen erhitzt. Die Lösungen wurden anschließend über Nacht auf
2–8°C abgekühlt. Das
Nährmedium
wurde mit einem Messerabstand von annähernd 0,25 mm (10 mils) auf die
Melinexfolie aufgetragen und dann bei 93°C für ungefähr 10 Minuten getrocknet. Ein
Beschichtungsgewicht von 300–350
Milligramm pro 61 Quadratzentimeter (24 Quadrat-Inch) wurde mit
dieser Beschichtung erreicht. Fünfhundert
Mikrometer (20 mil) Styropor wurden mit einem Acrylsäure-Klebstoff
transferbeschichtet. Es wurden Kreise mit einem Durchmesser von
5,1 Zentimeter (2 Inch) aus dem Styropormaterial entfernt, die als
eine Vertiefung zum Halten des Inokulums fungierten. Das mit dem
Nährmedium
beschichtete Gewebe wurde auf die 0,5 mm (20 mil) Styropor laminiert.
Ein 1,3 Zentimeter (0,5 Inch) dickes, doppelseitiges Klebeband wurde als
Gelenkband verwendet, um die pulverbeschichtete Deckfolie mit dem
Styropor/Nährmedium-beschichteten Melinex-Laminat
zu verbinden. Die Folien wurden in 7,6 × 10,2 cm (3 × 4 Inch)
große
Rechtecke mit dem Kreis annähernd
in dem Zentrum von dem Rechteck zugeschnitten. Die Folien wurden
mit Gammastrahlen bei 5–10 Kilogray
vor der Evaluierung bestrahlt. Die Bakterienkulturen wurden für die Evaluierung
durch Kultivieren in tryptischem Soja-Nährmedium über Nacht bei 37°C über Nacht
hergestellt. Entsprechende Verdünnungen
von den Kulturen wurden hergestellt, um ungefähr 100 koloniebildende Einheiten
(cfu) pro Milliliter in Butterfields-Standardmethoden-Puffer (Fisher
Scientific, Chicago, IL) zu erhalten. Die Verdünnungen von jedem Bakterium
wurden errechnet aus den Ergebnissen, welche von einer äquivalenten
Ausplattierung auf 3M PETRIFILM
TM Aerobic-Count
Platten erhalten wurden. Die Bakterienverdünnungen (1,0 Milliliter) wurden
als Duplikate ausplattiert und nach 24 Stunden bei 37°C ausgezählt. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. TABELLE 6
Stamm | Spezies | PAC-Platte | PSC-Platte |
| (Mittelwert
cfu/Milliliter) |
23842 | B.
amyloliquefaciens | 265 | ng1 |
11778 | B.
cereus | 86,5 | ng |
13061 | B.
cereus | 320 | ng |
14579 | B.
cereus | 215 | ng |
61 | B.
circulans | 810 | 295* |
4513 | B.
circulans | 570 | 355* |
7050 | B.
coagulans | 230 | ng |
14580 | B.
licheniformis | 208 | 144* |
14581 | B.
megaterium | ng | ng |
6462 | B.
mycoides | ng | ng |
842 | B.
polymyxa | 125 | ng |
72 | B.
pumilis | 940 | 520* |
4525 | B.
sphaericus | 165 | 174- |
6051 | B.
subtilis | 225 | ng |
23059 | B.
subtilis | 149 | ng |
23856 | B.
subtilis | 95 | ng |
23857 | B.
subtilis | > 1.000 | ng |
23858 | B.
subtilis | 265 | ng |
23859 | B.
subtilis | 415 | ng |
29056 | B.
subtilis | 546 | ng |
L3 | B.-Spezies | 148 | ng |
L4 | B.-Spezies | > 1.000 | ng |
L8 | B.-Spezies | 230 | ng |
L9 | B.-Spezies | 154 | 137* |
L11 | B.-Spezies | 800 | ng |
L12 | B.-Spezies | 550 | ng |
L13 | B.-Spezies | > 1.000 | ng |
L14 | B.-Spezies | > 1.000 | ng |
L18 | B.-Spezies | > 1.000 | ng |
L24 | B.-Spezies | 630 | ng |
L27 | B.-Spezies | 210 | ng |
882 | E.
faecium | 26 | 4* |
19433 | E.
fecaelis | 59 | ng |
MMM | E.
fecaelis | 77 | 16* |
P89 | E.-Spezies | 66 | ng |
P90 | E.-Spezies | 84 | ng |
P91 | E.-Spezies | 49 | ng |
P92 | E.-Spezies | 60 | ng |
P93 | E.-Spezies | 70 | ng |
P94 | E.-Spezies | 59 | ng |
P88 | E.-Spezies | 40 | ng |
M1026 | E.-Spezies | 43 | ng |
M1028 | E.-Spezies | 44 | ng |
13301 | S.
aureus | 112 | 108- |
13565 | S.
aureus | 60 | 63- |
12600 | S.
aureus | 79 | 73- |
27659 | S.
aureus | 64 | 78- |
12598 | S.
aureus | 62 | 52- |
35547 | S.
epidermidis | 24 | 22- |
- 1 Kein Wachstum
- * Blaue bis rotblaue Kolonien
- - Nur rote Kolonien
-
Andere
erfindungsgemäße Ausführungsformen
befinden sich innerhalb des Bereiches der anhängenden Ansprüche.