DE69738256T2

DE69738256T2 - Nachstummedium für den auswählenden nachweis von staphylokokkus

Info

Publication number: DE69738256T2
Application number: DE69738256T
Authority: DE
Inventors: Patrick A. Saint Paul MACH; Marlys E. Saint Paul LUND
Original assignee: Minnesota Mining and Manufacturing Co
Current assignee: 3M Co
Priority date: 1997-01-23
Filing date: 1997-05-27
Publication date: 2008-08-14
Anticipated expiration: 2017-05-28
Also published as: EP1873256B1; AU3141697A; EP1873256A2; JP3733143B2; EP1873256A3; AR011557A1; EP0956362B1; WO1998032874A1; DE69738256D1; US5837482A; EP0956362A1; JP2001508305A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft ein Medium, das für den Nachweis und die Auszählung von Staphylokokken, einschließlich Staphylococcus aureus, in einer Probe verwendbar ist, wobei das Medium eine Indikatorsubstanz in einer ausreichenden Menge enthält, um zwischen Bacillus-Kolonien und Staphylococcus-Kolonien zu unterscheiden, wenn die Probe in dem Medium und mit Verfahren zum Nachweis von Staphylokokken in einer Probe unter Verwendung eines derartigen Mediums kultiviert wird.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Eine Vielzahl an Verfahren und Prozessen steht gegenwärtig für die Bestimmung, die Identifizierung und die Auszählung von Bakterien in unterschiedlichen Probenarten zur Verfügung. Zum Beispiel stehen Verfahren zum Identifizieren und Auszählen von coliformen Bakterien (Coliforme) in Proben aus Wasser, Lebensmitteln oder Milchprodukten zur Verfügung, um damit die Qualität potentieller Kontaminationsspiegel von solchen Proben einzuschätzen.
Eine Vorgehensweise zur Abgrenzung gegenüber E. coli, einem speziellen Typ der coliformen Bakterien, die gemeinhin als gramnegative Stäbchen klassifiziert werden, aus einer gemischten Population von Coliformen wird in der US-Patentschrift Nr. 5,210,022 beschrieben. In diesem Patent sind zwei Substrate, welche kontrastierende unlösliche Präzipitate in der Anwesenheit von zwei spezifischen bakteriellen Enzymen bilden, der Beta-Galactosidase und der Beta-Glucuronidase, in ein Testmedium aufgenommen. Die Verwendung von diesen zwei Substraten ermöglicht die Abgrenzung von Coliformen gegenüber E. coli, da alle coliformen Bakterien die Beta-Galactosidase produzieren, während nur E. coli die Beta-Glucuronidase produziert. Weil die Kolonien unter schiedlicher Bakterien wachsen, wenn sie in dem substrathaltigen Medium inkubiert werden, bilden sich kontrastierend gefärbte Präzipitate entweder rund um die wachsenden E. coli- oder die coliformen Kolonien. Die Identifizierung von E. coli-Kolonien unter den anderen coliformen Kolonien in den gemischten Populationen wird durch die kontrastierenden Farben von den präzipitierten Substraten leicht gemacht.
Eine Notwendigkeit für solche selektiven Unterscheidungen existiert für andere Arten von Bakterien, welche pathogen sind oder die mit gesundheitsschädlichen Wirkungen beim Menschen assoziiert sind, wie beispielsweise Salmonella, Staphylokokken oder Streptococcus.
Staphylococcus aureus (S. aureus) ist ein wichtiger Indikator, der in der Nahrungsmittel verarbeitenden Industrie verwendet wird. Der Nachweis von diesem Organismus ist wichtig, weil einige Stämme dafür bekannt sind, ein hitzestabiles Toxin, Staphylokokken-Enterotoxin genannt, zu produzieren, das mit einer Erkrankung assoziiert ist, die zu schweren Einschränkungen führt, bekannt als Staphylokokkenenteritis, eine durch Staphylokokken verursachte Lebensmittelvergiftung. Darüber hinaus kann die Anwesenheit von diesem Organismus in verarbeiteten Nahrungsmitteln ein Hinweis auf eine nach der Verarbeitung aufgetretene Kontamination durch asymptomatische Träger von den Bakterien auf der Hautoberfläche und insbesondere in dem Nasenvorhof sein.
Aufgrund von der Bedeutung des Nachweises von S. aureus und anderen enterotoxischen Staphylokokken, wird eine effiziente, verlässliche und präzise Identifizierung der Staphylokokken benötigt. Das am meisten gegenwärtig gebräuchliche Medium, welches für den Nachweis von Staphylokokken verwendet wird, ist Eigelb-Glycin-Tellurit-Pyruvat-Agar (EYGTP-Agar), der auch Baird-Parker-Agar (BPA) genannt wird. Dieses Medium verwendet selektive und differentielle Mediumkomponenten, um Staphylokokken von anderen Bakterien, welche in diesen Nahrungsmittelproben gefunden werden, zu unterscheiden. Kaliumtellurit und Lithiumchlorid, die in BPA vorhanden sind, inhibieren die meisten anderen Bakterien. S. aureus wird in einer BPA-Probe mit Kaliumtellurit unter der Bildung von schwarzen Kolonien reagieren und reagiert mit dem Lecithin in dem Eigelb unter Bildung von einem trüben „Hof" rund um die Kolonie. Eine schwarze Kolonie mit einem trüben Hof in BPA wird als eine „typische" Kolonie angesehen. Die BPA-Komponenten gewährleisten so eine Kombination von unterschiedlichen Reaktionen, welche S. aureus von anderen Bakterien unterscheiden.
Unglücklicherweise sind abweichende Reaktionen von S. aureus und anderen Bakterien mit BPA möglich. Die Folge aus den falsch-positiven und falsch-negativen Reaktionen in diesem Medium ist, dass ein BPA-Ergebnis nur als ein „mutmaßliches" Ergebnis in Betracht gezogen wird. Die zwei abweichenden Reaktionen sind: (1) Nicht-S. aureus Bakterien können auf dem BPA wachsen und ergeben eine falsch-positive Reaktion (d. h. produzieren typische Kolonien); und (2) nicht alle S. aureus-Stämme sind fähig, mit den unterschiedlichen Mediumkomponenten zu reagieren, um eine „typische" BPA-positive Reaktion zu ergeben (d. h. Tellurit-positive (schwarze Kolonie) und positive Eigelb- oder Lecithinase-Reaktion (trüber Hof)). Aus diesen Gründen werden weitere „Bestätigungs-"Schritte von der BPA-Platte benötigt. Diese Verfahren schließen Methoden zum Nachweis der Anwesenheit von Koagulase oder von thermostabiler Nuklease. Entweder das eine oder das andere Verfahren wird, wenn es in Verbindung mit dem BPA-Medium verwendet wird, als Bestätigung für die Anwesenheit oder die Abwesenheit von S. aureus angesehen.
Um jedoch von dem BPA-Schritt weiter zur Bestätigung zu gelangen, müssen die Kolonietypen klar erkannt und für die weiteren Untersuchungen ausgewählt werden. Gewöhnlich werden „typische" Kolonien zur Bestätigung ausgewählt und Repräsentanten von jedem der anderen Kolonietypen werden ebenfalls für die Bestätigung ausgewählt. Unter den Nicht-S. aureus Bakterien, die typische Kolonien produzieren können, sind Stämme aus den Gattungen Bacillus und Enterococcus. Andere Stämme, die auf BPA wachsen und atypische Kolonien produzieren, schließen Listeria-Spezies und einige Mitglieder von der Enterobacteriaceae-Familie ein. Selbst wenn diese Stämme nicht den typischen Kolonietyp auf BPA produzieren, so werden sie die Anzahl der erforderlichen „atypischen" Kolonien erhöhen, die für die Bestätigungsuntersuchung ausgewählt werden müssen.
Die US-Patentschrift Nr. 5,443,963 beschreibt ein Verfahren zur Identifizierung und Auszählung von Staphylokokken in einer Probe, wobei ein Kulturmedium ein Indolylglucopyranosid-Substrat als eine Indikatorsubstanz enthält. Dieses Verfahren nutzt das Prinzip aus, dass die Beta-Glucosidase, die durch Staphylokokken produziert wird, nicht mit dem Indolylglucopyranosid-Substrat reagiert, während die Beta-Glucosidase, welche durch andere Bakterien in der Probe produziert wird, mit dem Indolylglucopyranosid-Substrat reagiert, um einen charakteristischen Farbstoff zu bilden. Dieses Verfahren ermöglicht auf diese Weise, dass Staphylokokken von einigen Nicht-Staphylokokken in der Probe unterschieden werden können. Das in dieser Patentschrift dargestellte Verfahren unterscheidet Staphylokokken allerdings nicht von allen Nicht-Staphylokokken, welche in einer Untersuchungsprobe potentiell vorhanden sind. Zum Beispiel unterscheidet das in dieser Patentschrift dargestellte Verfahren Staphylokokken nicht von Bacillus-Spezies, welche in einer Untersuchungsprobe vorhanden sind. Bacillus-Spezies, sowie die anderen zuvor genannten Mikroorganismen, sind Quellen für falsch-positive „typische" Kolonien in Medien wie BPA, die für das Anwachsen von Proben verwendet werden, welche im Verdacht stehen, S. aureus zu enthalten. Dementsprechend bleiben falsch-positive Ergebnisse, welch von „typischen" Nicht-Staphylokokken-Kolonien abstammen, ein substanzielles Problem. Ein Kultursystem, das derartige falsch-positive Ergebnisse eliminiert, würde auf dem Gebiet der mikrobiologischen Untersuchungen sehr nützlich sein. Die falsch-negativen Ergebnisse sind ebenfalls noch als ein signifikantes Problem vorhanden; Staphylococcus-Spezies und -Stämme, welche diese atypischen Kolonien produzieren, sind eine Quelle für diese falsch-negativen Ergebnisse und machen es nötig, dass alle atypischen Kolonietypen in den gegenwärtig verwendeten Systemen noch weiter untersucht werden müssen. Ein Kultursystem, welches die atypischen Kolonien der Nicht-Staphylokokken eliminieren könnte und zumindest mutmaßlich die atypischen Staphylokokkus-Kolonien identifiziert, würde äußerst vorteilhaft sein.
In dem gut funktionierenden Nachweis und der Auszählung von S. aureus in Proben liegt dementsprechend eine Notwendigkeit für Methodiken vor, welche einen beweiskräftigen Nachweis von S. aureus und eine Ausschaltung von falsch-positiven und falsch-negativen Ergebnissen ermöglichen, die durch andere Mikroorganismen in einer Probe produziert wurden.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Im Allgemeinen weist die Erfindung als Besonderheit ein Kulturmedium für den Nachweis von Staphylokokken auf, wobei das Kulturmedium eine Indikatorsubstanz in ausreichender Menge enthält, um Kolonien, die Bacillus-Mikroorganismen enthalten, von Kolonien, die Staphylokokken enthalten, zu unterscheiden. Das Medium stellt die Fähigkeit bereit (1) Kolonien von Nicht-Staphylokokken Mikroorganismen zu eliminieren (als Nicht-Staphylokokken – ein negatives Ergebnis), welche bisher als „typische" Kolonien, die weitere Bestätigungsuntersuchungen benötigten, identifiziert worden wären, (2) atypische Nicht-Staphylokokken-Kolonien, welche anderweitig weitere Untersuchungen benötigen würden, zu eliminieren, und (3) mutmaßlich atypische Staphylokokken-Kolonien zu identifizieren. Die Erfindung weist ebenfalls Verfahren zum Nachweis von Staphylokokken in einer Probe auf und für die Unterscheidung der Staphylokokken-Kolonien, welche aus der Probe gewachsen sind, von den Kolonien der anderen Mikroorganismen, wie beispielsweise Bacillus-Mikroorganismen, die aus der Probe gewachsen sind.
In einem Aspekt stellt die Erfindung folglich ein Medium bereit, welches nützlich ist für das Nachweisen von Staphylokokken in einer Probe, wobei das Medium selektiv für das Wachstum von Staphylokokken ist und ein Glucopyranosid als Indikatorsubstanz in einer Konzentration von mindestens 100 Mikrogramm pro Milliliter enthält, um die Bacillus-Kolonien von den Staphylokokken-Kolonien zu unterscheiden, wenn die Probe in dem Medium kultiviert wird.
Das Medium befindet sich in der Form von einem Baird-Parker-Agar. In einer weiteren Ausführungsform liegt dieses Medium in der Form von einem getrockneten Nährmedium vor, welches an einem selbsttragenden, wasserundurchlässigen Substrat von einer Vorrichtung zur Kultur auf dünnen Folien haftet. In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt das Medium in der Form von einem Calcium-Pektinatgel vor.
Die Glucopyanosid-Indikatorsubstanz ist vorzugsweise ein Indolyl-Glucopyranosid. Eine bevorzugte colorimetrische Glucopyranosid-Indikatorsubstanz ist 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-glucopyranosid.
Die Glucopyanosid-Indikatorsubstanz liegt in einer Menge vor, die ausreichend ist, um Kolonien, welche Bacillus-Mikroorganismen enthalten, von Kolonien, welche Staphylokokken enthalten, zu unterscheiden.
Üblicherweise ist die Indikatorsubstanz in einer Konzentration von mindestens etwa 100 μg/mL vorhanden, wenn die Probe in den Nährmedien kultiviert wird.
In einem weiteren Aspekt weist die Erfindung ein besonderes Verfahren zum Nachweisen von Staphylokokken in einer Probe auf. Das Verfahren beinhaltet den Schritt des Kultivierens einer Probe in einem selektiven Kulturmedium unter Bedingungen, welche nachweisbare Kolonien hervorbringen, wobei das Kulturmedium eine Indikatorsubstanz, wie zuvor beschrieben, in einer Menge enthält, die ausreichend ist, die Kolonien, welche Bacillus-Mikroorganismen enthalten, von den Kolonien, die Staphylokokken enthalten, zu unterscheiden.
Das Verfahren kann weitere Schritte zur Bestätigung der Anwesenheit von Staphylokokken in der Probe beinhalten und kann ferner ebenfalls den Schritt des Auszählens der Staphylokokken in der Probe beinhalten. Der Schritt der Bestätigung kann das Feststellen beinhalten, ob die Mikroorganismen, die aus der Probe gewachsen sind, Koagulaseaktivität aufweisen oder nicht, oder ob die Mikroorganismen, die aus der Probe gewachsen sind, eine Aktivität der thermostabilen Nuklease aufweisen oder nicht. Der Schritt des Feststellens, ob die Kolonien, die aus der Probe gewachsen sind, eine Aktivität der thermostabilen Nuklease aufweisen, kann vorzugsweise das Einbringen eines Gegenstandes beinhalten, welcher Toluidinblau O, ein Bindemittel und nicht-hydrolysierte DNA umfasst.
Die mit dem Verfahren untersuchte Probe kann eine Lebensmittelprobe, eine klinische Probe, eine tiermedizinische Probe, eine kosmetische Probe, eine pharmazeutische Probe, eine Umweltprobe oder irgendeine Probe sein, für die eine Untersuchung auf Staphylokokken gewünscht ist.
Andere Vorteile und Merkmale von der Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung und aus den Ansprüchen offensichtlich werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung nutzt das Prinzip der hierin zum ersten Mal beschriebenen Beobachtung aus, dass eine ausreichende Menge von einer Glucopyranosid-Indikatorsubstanz in einem Medium, welches selektiv für das Wachstum von Staphylokokken ist, Kolonien, welche Bacillus und andere Mikroorganismen enthalten, von Kolonien, welche Staphylokokken enthalten, zu unterscheiden, wenn eine Probe, die Staphylokokken und potentiell Bacillus und andere Mikroorganismen enthält, in dem Medium kultiviert wird. Diese unerwartete Beobachtung gestattet, dass Mikroorganismen, wie beispielsweise Bacillus-Spezies – welche „typische" Kolonien in selektiven Medien hervorbringen können – von Staphylokokken unterschieden werden können. Es ermöglicht ebenfalls, dass bestimmte Staphylococcus-Spezies, welche nicht das vermutliche, „typische" Ergebnis auf den gegenwärtig erhältlichen Systemen produzieren, als mutmaßliche Staphylokokken-Kolonien identifiziert werden können. Dies ist insbesondere vorteilhaft im Zusammenhang mit der Untersuchung von Lebensmittel-, klinischen oder vielen anderen Typen von Proben, wo der effiziente und verlässliche Nachweis von enterotoxischen Organismen wie zum Beispiel von S. aureus äußerst bedeutend ist.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet folglich ein Medium, welches nützlich ist für das Nachweisen von Staphylokokken in einer Probe, wobei das Medium selektiv für das Wachstum von Staphylokokken ist und ein Glucopyranosid als Indikatorsubstanz enthält, welche in einer Konzentration von mindestens 100 Mikrogramm pro Milliliter vorhanden ist, um die Kolonien, die Bacillus-Mikroorganismen enthalten, von den Kolonien, die Staphylokokken enthalten, zu unterscheiden. Die Indika torsubstanz ist ein Glucopyranosid-Substrat für die Beta-Glucosidase von den Nicht-Staphylococcus-Mikroorganismen und wird nicht durch Staphylokokken hydrolysiert.
Die colorimetrischen Indolyl-Glucopyranoside sind die bevorzugten Glucopyranosid-Indikatorsubstanzen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung, wobei 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-glucopyranosid das bevorzugte Indolyl-Glucopyranosid ist.
Zusätzliche Indolyl-Glucopyranoside, welche für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sein können, beinhalten zum Beispiel:

(1) 5-Brom-6-chlor-3-indoxyl-beta-D-glucopyranosid;
(2) 6-Chlor-3-indoxyl-beta-D-glucopyranosid; oder
(3) 3-Indoxyl-beta-D-glucopyranosid.

Das bevorzugte 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-glucopyranosid ist gut für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet, weil, sobald die Glucosegruppe enzymatisch durch die Beta-Glucosidase der Nicht-Staphylokokken-Organismen gespalten ist, der verbliebene Anteil dimerisieren wird und in unmittelbarer Nähe von der Kolonie präzipitiert, um einen Farbumschlag herbeizuführen. Die oben angeführten Verbindungen (1)–(3) weisen ebenfalls dieses Präzipitationsphänomen auf und es wird folglich von ihnen erwartet, dass sie ebenfalls gut für die Verwendung in dem erfindungsgemäßen Medium geeignet sind. Diese Verbindungen werden bevorzugt gegenüber den Indikatorsubstanzen, welche nicht präzipitieren, und infolgedessen von der Kolonie weg diffundieren, was den Nachweis von dem Indikator kompliziert macht. Im Allgemeinen wird eine beliebige Glucopyranosid-Substanz, die (1) mit der Beta-Glucosidase von Nicht-Staphylokokken-Mikroorganismen reagiert, aber nicht mit der Beta-Glucosidase von Staphylokokken, und (2) ein nachweisbares Signal bereitstellt, wenn ihre Glucosegruppe enzymatische gespalten wird, als eine brauchbare Glucopyranosid-Indikatorsubstanz dienen kann.
Die Indikatorsubstanz muss in einer Konzentration von mindestens 100 Mikrogramm pro Milliliter vorliegen, um die Kolonien, die Bacillus-Mikroorganismen enthalten, von den Kolonien, die Staphylokokken enthalten, zu unterscheiden. Beispiele für zusätzliche Mikroorganismen zu Bacillus, welche von Staphylokokken in Übereinstimmung mit dieser Erfindung unterschieden werden können, beinhalten Enterococcus, Listeria und einige Mitglieder von der Familie der Enterobacteriaceae (einschließlich Proteus, Enterobacter, Serratia und Klebsiella). Wie hierin beschrieben, sieht die Erfindung vor, dass die Indikatorsubstanz, wenn sie in ausreichender Menge vorhanden ist, um Bacillus, Listena und Enterobacteriaceae zu unterscheiden, jegliche Beta-Glucosidase-positiven Nicht-Staphylococcus-Mikroorganismen von Staphylokokken unterscheiden wird.
Von den gegenwärtig auf dem Fachgebiet bekannten Systemen an selektiven Wachstumsmedien zum Nachweisen und Auszählen von Staphylokokken, ist kein einziges in der Lage, die „typischen" Kolonien von Bacillus und vielen anderen Gattungen der Mikroorganismen von Staphylokokken zu unterscheiden. Unerwarteterweise ermöglicht die Einbeziehung von gewissen Glucopyranosid-Indikatorsubstanzen in ausreichender Menge, dass solche Mikroorganismen von Staphylokokken unterschieden werden können. Darüber hinaus sind keine davon fähig, die atypischen Kolonien als Staphylokokken in BPA-Typ Medien mutmaßlich zu identifizieren; bestimmte Staphylococcus-Spezies produzieren derartige „atypischen" Kolonien. In der Praxis der vorliegenden Erfindung werden derartige Kolonien mutmaßlich als Staphylokokken identifiziert.
Allgemein sollte die Indikatorsubstanz in einer Konzentration vorhanden sein, welche sich der Löslichkeitsgrenze von der Substanz in dem Kulturmedium annähert, wenn die Probe kultiviert wird. Dies maximiert die Möglichkeit, dass alle Beta-Glucosidase-positiven Nicht-Staphylococcus-Organismen nachgewiesen, angefärbt und von Staphylokokken-Kolonien aus der Probe unterschieden werden können. Für die Indolyl-Glucopyranoside, einschließlich dem bevorzugten 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-glucopyranosid, sollte die Konzentration mindestens etwa 100 μg/mL, wenn die Probe kultiviert wird. Fachleute werden es zu schätzen wissen, dass die optimale Konzentration von der Indolylglucopyranosid-Indikatorsubstanz in dem Kulturmedium variieren kann, abhängig von dem jeweiligen Indikatormolekül, das verwendet wird, und dass solche Konzentrationen routinemäßig angepasst und optimiert werden können.
Das erfindungsgemäße Medium ist in der Form von einem Agargel, wobei das selektive Nährmedium, einschließlich der differentiellen Indikatorsubstanz, innerhalb des Agars enthalten sind. Ein Beispiel eines bevorzugten Agargels ist der Baird-Parker-Agar, welcher zuvor beschrieben wurde und der auf dem Gebiet der Staphylococcus-Untersuchungen wohlbekannt ist. Der praktische Einsatz der beanspruchten Erfindung in einer Anwendung in Baird-Parker-Agar ist nachfolgend in Beispiel 1 veranschaulicht. Im Allgemeinen werden in einer Baird-Parker-Anwendung, welche das erfindungsgemäße Medium benutzt, die Kolonien der Nicht-Staphylokokken, einschließlich Bacillus und den anderen, die zuvor erwähnt wurden, mit einer charakteristischen Farbe angefärbt, welche durch die Glucopyranosid-Indikatorsubstanz produziert wird (z. B. blau oder grün, falls 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-glucopyranosid als der Indikator verwendet wird) und diese Kolonien können als negativ außer Acht gelassen werden. Kolonien, die schwarz sind, ob „typisch" oder nicht, werden als Staphylokokken angesehen (einschließlich potentieller S. aureus) und können für weitere Untersuchungen ausgewählt werden.
Das Medium kann in der Form von einer Vorrichtung zur Plattenkultur auf dünnen Folien vorliegen, wie beispielsweise eine 3M PETRIFILM^TM Kulturvorrichtung. Zwei beispielhafte Ausführungsformen von einer Vorrichtung zur Plattenkultur auf dünnen Folien sind (1) eine mit gepulvertem Medium beschichtete, dünne Folienvorrichtung, in der ein Pulver, welches die Nährmedienkomponenten und die Gelierungsmittel umfasst, an einem selbsttragenden, wasserundurchlässigen dünnen Folienträgermaterial und an einer Deckfolie anhaftet, wobei jede Folie ein nicht-hemmendes Klebemittel enthält, und (2) eine mit Nährlösung beschichtete Vorrichtung aus dünnen Folien, in welcher eine Nährlösung auf ein selbsttragendes, wasserundurchlässiges Substrat aus dünnen Folien aufgetragen ist, mit vorgewählten Beschichtungsgewichten für die Mediumkomponenten und getrocknet, und eine Deckfolie, welche die Gelierungsmittel und wahlweise die Färbemittel daran angeheftet enthält, bereitgestellt wird, um die Probe während der Inkubation zu bedecken. Eine Styroporschicht, welche eine Öffnung hindurch aufweist, kann zwischen die Deck- und die Unterfolie derart geschoben werden, dass die Öffnung eine Vertiefung für die kultivierte Probe bildet. In der Verwendung von Vorrichtungen zur Kultur auf dünnen Folien wie beispielsweise den 3M PETRIFILM^TM Vorrichtungen, ist ein Probenvolumen, oder ein Inokulum (mikrobielle Impfsubstanz), von einem Milliliter der Standard.
Vorrichtungen zur Kultur auf dünnen Folien, einschließlich der Nährmedium- und Pulver-beschichteten Vorrichtungen, werden vollständig in der 3M US-Patentschrift Nr. 4,565,783 beschrieben.
Ein bevorzugtes selektives Medium für die Verwendung bei dem Nachweis von Staphylokokken in einer Kulturvorrichtung aus dünnen Folien schließt geeignete Nähr stoffe, Salze und Ionen ein, die für die Staphylokokken benötigt werden, um nachweisbare Kolonien zu produzieren, sowie Inhibitoren, um damit das Wachstum von anderen unerwünschten Mikroorganismen zu verhindern. Geeignete Nährstoffe, Salze und Ionen beinhalten, als nicht-einschränkende Beispiele, Tryptose-Pepton, Dipepton, Hefeextrakt und Brenztraubensäure. Ausgewählte Inhibitoren sind zu dem Medium hinzugefügt, um das Wachstum von unerwünschten Mikroorganismen zu verhindern, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, gramnegative Bakterien, wie beispielsweise E. coli, sowie die meisten grampositiven Bakterien. Die Inhibierung von diesen unerwünschten Bakterien gestattet, dass das Wachstum der Staphylokokken selektiv gesteigert wird. Geeignete Inhibitoren schließen eine Vielzahl von gut bekannten antimikrobiellen oder antibiotischen Verbindungen ein. Zum Beispiel sind antibakterielle Verbindungen auf der Basis von Quinolin, wie beispielsweise Nalidixinsäure, aus Polymyxin abgeleitete Verbindungen, wie zum Beispiel Colistinmethansulfonat, antibiotisch wirkende Verbindungen, wie beispielsweise Ceftazidim, und Salze, wie beispielsweise Lithiumchlorid, bekannte bevorzugte Inhibitoren.
Die Vorrichtung zur Kultur auf dünnen Folien beinhaltet ebenfalls Gel-bildende Mittel, um ein festes Kulturmedium bereitzustellen. Ein festes Medium stellt einen festgelegten Bereich für das Wachstum von Bakterienkolonien bereit, die in einer Probe vorhanden sein können. Geeignete Gel-bildende Mittel schließen handelsüblich erhältlichen Agar und Gel-bildende Gummis, wie beispielsweise Xanthangummi, Johannisbrotkernmehl, Rhamsan, Guarkernmehl und Mischungen daraus ein.
Der praktische Einsatz der vorliegenden Erfindung in einer Anwendung einer Vorrichtung zur Kultur auf dünnen Folien ist nachfolgend in Beispiel 4 veranschaulicht.
In den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, in welchen das Nährstoffmedium in der Form von einer Vorrichtung zur Kultur auf dünnen Folien ist, wie zum Beispiel einer PETRIFILM^TM Staphylococcus Zählplatte, ist die Indikatorsubstanz in einer ausreichenden Menge derart enthalten, dass, wenn ein Volumen einer Probe, z. B. ein Milliliter, auf die Vorrichtung aufgetragen wird, die Indikatorsubstanz in dem Kulturmedium mit der gewünschten Konzentration vorhanden sein wird (für beispielhafte Präparationsprotokolle siehe die nachfolgenden Beispiele). Im Anschluss an die Inkubation von einer Probe in einer derartigen Vorrichtung zur Kultur auf dünnen Folien werden sich die Staphylokokken-Kolonien rot anfärben (durch den Tetrazolium-Farbstoff, der in der Deckfolie enthalten ist, siehe nachfolgende Beispiele), während hingegen die Kolonien der Nicht-Staphylokokken sich in der charakteristischen Farbe von der Glucopyranosid-Indikatorsubstanz anfärben. Falls 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-glucopyranosid als Indikatorsubstanz verwendet wird, werden sich die Kolonien der Nicht-Staphylokokken, einschließlich Bacillus und den anderen, die zuvor erwähnt wurden, mit der charakteristischen blauen oder grünen Farbe färben. An diesem Punkt können alle blauen oder grünen Kolonien als negativ auf Staphylokokken verworfen werden, während alle roten Kolonien mutmaßlich Staphylokokken sind. Falls alle Kolonien sich blau oder grün anfärben, ist die Probe für Staphylokokken negativ und es wird keine weitere Untersuchung benötigt.
Ein weiteres geeignetes Kulturformat für die praktische Anwendung der beanspruchten Erfindung ist ein Nicht-Agar, Calcium-Pektinat-Kultursystem, wie beispielsweise das REDIGEL^TM-System, welches, zum Beispiel, die unterschiedlichen Nachweisreagenzien des Baird-Parker-Typs enthält. Der praktische Einsatz der beanspruchten Erfindung in einem REDIGEL^TM-Format ist nachfolgend in Beispiel 3 veranschaulicht.
In der praktischen Anwendung der Erfindung wird ein Kulturmedium in einer Kulturvorrichtung, wie hierin beschrieben, mit einer Testprobe inokuliert. Für die Zwecke dieser Beschreibung wird angenommen, dass das Kulturmedium ein Indolyl-Glucopyranosid als eine Indikatorsubstanz enthält. Die Testprobe kann eine Lebensmittel-, eine klinische, eine tiermedizinische, eine kosmetische, eine pharmazeutische oder eine Umweltprobe sein oder irgendeine andere Probe, in welcher die Untersuchung auf Staphylokokken notwendig oder erwünscht ist. Die Herstellung von derartigen Proben für mikrobiologische Untersuchungen ist auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Die Probe wird für einen Zeitraum (zum Beispiel zwischen etwa 18–48 Stunden) und unter Bedingungen (zum Beispiel zwischen etwa 30–37°C) kultiviert, um es den Mikroorganismen aus der Probe zu ermöglichen, nachweisbare Kolonien in dem Kulturmedium zu bilden. Weil die Kolonien in der Gegenwart von der Indikatorsubstanz wachsen, werden alle Kolonien von Mikroorganismen der Beta-Glucosidase-positiven Nicht-Staphylokokken als Konsequenz aus der Beta-Glucosidase-Reaktion mit dem Glucopyranosid-Substrat eine charakteristische Färbung, wie beispielsweise Blau oder Grün, entwickeln. Die Staphylococcus-Kolonien werden keine charakteristische Färbung entwickeln, weil sie, obwohl sie eine Beta-Glucosidase produzieren, kein Enzym produzieren, das dieses bestimmte Glucopyranosid-Substrat hydrolysiert.
Falls alle Kolonien in dem Kulturmedium die charakteristische Färbung, basierend auf der Reaktion mit der Glucopyranosid-Indikatorsubstanz entwickeln, ist die Probe für Staphylokokken negativ und es wird keine weitere Untersuchung benötigt. Falls bestimmte Kolonien in dem Kulturmedium als typisch erscheinen und nicht die kennzeichnenden Eigenschaften entwickeln, sind diese Kolonien mutmaßlich Staphylococcus-Kolonien, die enterotoxische oder potentiell enterotoxische Mikroor ganismen wie beispielsweise S. aureus enthalten, und könnten somit für weitere Bestätigungsuntersuchungen ausgewählt werden, um zum Beispiel zu bestimmen, ob enterotoxische oder potentiell enterotoxische Staphylokokken vorhanden sind. Falls bestimmte Kolonien in dem Kulturmedium atypisch erscheinen, aber sich nichtsdestoweniger weder Blau noch Grün färben, sind diese Kolonien ebenfalls mutmaßliche Staphylokokken und könnten für weitere derartige Untersuchungen ausgewählt werden.
Die Bestätigung einer mutmaßlichen Staphylococcus-Kolonie kann über mehrere bekannte Verfahren erreicht werden. Die Kolonie kann hinsichtlich der Bestimmung, ob sie Koagulaseaktivität aufweist oder ob sie eine Aktivität der thermostabilen Nuklease aufweist oder nicht untersucht werden. Ein positives Ergebnis entweder für Koagulase- oder thermostabile Nuklease-Aktivität wird als eine Bestätigung für die Anwesenheit von Staphylokokken angesehen. Eine Anzahl von Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Koagulase- oder thermostabiler Nuklease-Aktivität sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt.

Zusätzlich zu solchen Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, beinhaltet ein bevorzugtes Mittel zur Bestätigung der Anwesenheit oder Abwesenheit der thermostabilen Nuklease-Aktivität in einer kultivierten Probe das Einbringen eines Gegenstandes, der Toluidinblau (ein metachromatischer Farbstoff, der in der Anwesenheit von hydrolysierter oder nicht-hydrolysierter DNA unterschiedlich färbt), eine nicht-hydrolysierte DNA und ein Bindemittel enthält, gegen die Kolonien in einer Probe nachdem die Probe auf eine Temperatur erhitzt worden ist, welche ausreicht, die nicht-thermostabilen Nukleasen zu inaktivieren. Ein nicht-einschränkendes Beispiel für eine bevorzugte Formulierung für solch einen Gegenstand und seine Verwendung wird wie folgt veranschaulicht: Inhaltsstoffe

DNA (Difco Laboratories, Detroit, MI)	3,6 g/L
Toluidinblau O (TBO, Sigma Chemical	0,32 g/L
Company, St. Louis, MO)
Calciumchlorid, wasserfrei	1,1 mg/L
(Sigma, St. Louis, MO)
Natriumchlorid	10 g/L
(Sigma, St. Louis, MO)
Tris-Hydrochlorid	6,85 g/L
(Sigma, St. Louis, MO)
Tris-Base	0,8 g/L
(Sigma, St. Louis, MO)
Lambda-Carragenan	0,4 g/L
(Sigma, St. Louis, MO)
Guarkernmehl (Bindemittel)	10 g/L
(Rhone-Poulenc Food Ingredients,	pH 7,3 oder
Cranbury, NJ)	9,0

Während der Herstellung des Gegenstandes können alle Reagenzien (außer dem TBO und dem Guarkernmehl) zusammen in 1 Liter entionisiertem Wasser zusammengemischt werden. Die Suspension wird unter fortdauerndem Rühren gemischt und bis zum Kochen erhitzt. Das TBO wird zu der Mischung hinzugefügt und das Erhitzen eingestellt, während weiter gerührt wird. Die Suspension wird danach mit einem Luftmischer (unter heftigem Rühren) gemischt und das Guarkernmehl (Bindemittel) hinzugefügt und gemischt, bis die Suspension einheitlich ist. Die Suspension wird über Nacht auf 4°C abgekühlt und dann mit einer Messerstreichmaschine auf eine 0,18 mm Poly esterfolie aufgetragen. Es wurden Messerabstände von 12–25 mm festgesetzt (Beschichtungsgewichte von 0,05–0,10 g/61 Quadratzentimeter (24 Quadrat-Inch)). Die Folien wurden für 2–10 Minuten bei 93°C hitzegetrocknet. Gegenstände, welche eine Dicke von zwischen etwa 0,12 mm bis 0,25 mm aufweisen, können anschließend auf die gewünschte Form der getrockneten Folien zugeschnitten werden.
Im Anschluss an die Inkubation von einer Probe in dem erfindungsgemäßen Medium, wird die kultivierte Probe hitzebehandelt, um die nicht-thermostabilen Nukleasen zu inaktivieren, zum Beispiel bei 60°C für 30 Minuten. Der Gegenstand wird danach auf die Probe gelegt. Falls Staphylococcus vorhanden ist, wird sich ein charakteristischer roter oder rosa Farbumschlag rund um die Kolonie innerhalb von etwa 1 bis 4 Stunden unter angemessenen Bedingungen entwickeln. Ein roter oder rosa Farbumschlag wird als Bestätigung der Anwesenheit von enterotoxischen oder potentiell enterotoxischen Staphylokokken wie beispielsweise S. aureus angesehen. Ein derartiger Gegenstand und seine Verwendung sind beschrieben und beansprucht in dem gemeinsamen 3M-Patent, US-Patentschrift Nr. 6,022,682 .
Wenn die Anwesenheit von Staphylokokken in der Probe bestätigt ist, können die Anzahl der Staphylokokken-Kolonien in der kultivierten Probe und die Anzahl der Staphylokokken in der Originalprobe dann unter Verwendung von irgendeinem aus einer Vielzahl von Quantifizierungsverfahren bestimmt werden.
Die Erfindung kann mittels der nachfolgenden Beispiele veranschaulicht werden.
BEISPIELE

Die nachfolgenden mikrobiologischen Stämme (Tabelle 1) wurden in den Experimenten verwendet, die in den nach stehenden Beispielen beschrieben sind. TABELLE 1

Spezies	Stamm Bezeichnung	Herkunft
Bacillus amyloliquefaciens	23842	ATCC²
Bacillus cereus	11778	ATCC²
Bacillus cereus	13061	ATCC²
Bacillus cereus	14579	ATCC²
Bacillus circulans	61	ATCC²
Bacillus circulans	4513	ATCC²
Bacillus coagulans	7050	ATCC²
Bacillus licheniformis	14580	ATCC²
Bacillus megaterium	14581	ATCC²
Bacillus mycoides	6462	ATCC²
Bacillus polymyxa	842	ATCC²
Bacillus pumilis	72	ATCC²
Bacillus sphaericus	4525	ATCC²
Bacillus subtilis	6051	ATCC²
Bacillus subtilis	23059	ATCC²
Bacillus subtilis	23856	ATCC²
Bacillus subtilis	23857	ATCC²
Bacillus subtilis	23858	ATCC²
Bacillus subtilis	23859	ATCC²
Bacillus subtilis	29056	ATCC²
Bacillus-Spezies	bb	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L1	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L2	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L3	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L4	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L5	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L6	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L7	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L8	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L9	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L10	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L11	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L12	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L13	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L14	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L16	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L17	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L18	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L19	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L20	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L21	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L22	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L23	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L24	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L25	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L26	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L27	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L28	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L29	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	L30	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	LK1	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	LK2	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	LK3	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	LK4	Lebensmittel-Isolat¹
Bacillus-Spezies	LK5	Lebensmittel-Isolat¹
Enterococcus faecium	882	ATCC²
Enterococcus faecium	19434	ATCC²
Enterococcus fecaelis	29212	ATCC²
Enterococcus fecaelis	14990	ATCC²
Enterococcus fecaelis	19433	ATCC²
Enterococcus fecaelis	MMM	Lebensmittel-Isolat¹
Enterococcus-Spezies	P89	Klinisches Isolat³
Enterococcus-Spezies	P90	Klinisches Isolat³
Enterococcus-Spezies	P91	Klinisches Isolat³
Enterococcus-Spezies	P92	Klinisches Isolat³
Enterococcus-Spezies	P93	Klinisches Isolat³
Enterococcus-Spezies	P94	Klinisches Isolat³
Enterococcus-Spezies	P88	Klinisches Isolat³
Enterococcus-Spezies	M1026	Klinisches Isolat³
Enterococcus-Spezies	M1028	Klinisches Isolat³
Enterococcus-Spezies	M1030	Klinisches Isolat³
Enterococcus-Spezies	M1032	Klinisches Isolat³
Enterococcus-Spezies	M1038	Klinisches Isolat³
Enterococcus-Spezies	M1040	Klinisches Isolat³
Enterococcus-Spezies	M1044	Klinisches Isolat³
Enterococcus-Spezies	M1148	Klinisches Isolat³
Enterococcus-Spezies	M2017	Klinisches Isolat³
Enterococcus-Spezies	M2022	Klinisches Isolat³
Enterococcus-Spezies	M1144	Klinisches Isolat³
Enterococcus-Spezies	M1067	Klinisches Isolat³
Enterococcus-Spezies	M1062	Klinisches Isolat³
Staphylococcus aureus	25923	ATCC²
Staphylococcus aureus	W-832	ATCC²
Staphylococcus aureus	13301	ATCC²
Staphylococcus aureus	13565	ATCC²
Staphylococcus aureus	12600	ATCC²
Staphylococcus aureus	27659	ATCC²
Staphylococcus aureus	12598	ATCC²
S. epidermidis	12228	ATCC²
S. epidermidis	14990	ATCC²
S. epidermidis	35547	ATCC²
Klebsiella pneumoniae	U28	Klinisches Isolat
Klebsiella oxytoca	U33	Klinisches Isolat
Listeria gravi	11120	ATCC²
Listeria innocua	33091	ATCC²
Listeria ivanovii	19119	ATCC²
Listeria ivanovii	19919	ATCC²
Listeria monocytogenes	13932	ATCC²
Listeria monocytogenes	15313	ATCC²
Listeria monocytogenes	19112	ATCC²
Listeria monocytogenes	19118	ATCC²
Listeria monocytogenes	43256	ATCC²
Listeria monocytogenes	49594	ATCC²
Listeria murravi	25401	ATCC²
Proteus vulgaris	U61	Klinisches Isolat³
Proteus vulgaris	U62	Klinisches Isolat³
Proteus vulgaris	U63	Klinisches Isolat³

¹ Lebensmittel-Isolat in der 3M^TM Microbiology Products Laboratory Kultursammlung, 3M Center, Saint Paul, MN
² American Type Culture Collection, Rockville, MD
³ Kultursammlung Klinische Mikrobiologie der Universität von Minnesota, Minneapolis, MM

BEISPIEL 1
Anwendung von Baird-Parker-Agar

Dieses Beispiel veranschaulicht den praktischen Einsatz der beanspruchten Erfindung in einer Baird-Parker-Agar Anwendung. Materialien:

Baird-Parker-Agar (BPA)	Difco Laboratories,
	Detroit, MI
Bacto Eigelb-Tellurit	Difco Laboratories,
Suspension (EYT)	Detroit, MI
5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-	Biosynth International,
beta-D-Glucopyranosid (BCIG)	Chicago, IL
Dimethyl-Formamid (DMF)	Fisher Scientific,
	Fairlawn, NJ
Röhrchen mit tryptischem	DiMed Laboratories,
Soja-Nährmedium	St Paul, MN
Tryptische Soja-Agarplatten	DiMed Laboratories,
	St Paul, MN

Verfahren:
Einhundertsechsundzwanzig g BPA-Pulver (Difco Laboratories) wurden abgewogen und mit 2 Litern entionisiertem Wasser gemäß der Vorschrift des Herstellers gemischt. Einhundert Milligramm BCIG wurden in ein 16 × 150 Millimeter Glasröhrchen mit Schraubkappe abgewogen. Zehn Milliliter DMF wurden zu dem BCIG-Pulver hinzugefügt und kräftig gemischt. Die Suspension wurde auf 60°C in einem Wasserbad erwärmt und so lange inkubiert, bis das Pulver aufgelöst war. Das vermischte und erwärmte BPA-Pulver wurde in acht 200-Milliliter All quots in autoklavierbare Glasbehälter mit 500-Milliliter Volumen aufgeteilt. In die ersten sieben Glasbehälter wurden (jeweils in getrennte Glasbehälter) 2 Milliliter, 1 Milliliter, 0,5 Milliliter, 0,25 Milliliter, 0,125 Milliliter, 0,0625 Milliliter und 0,0313 Milliliter der 10 Milligramm/Milliliter BCIG-Lösung hinzugefügt. Zu dem letzten BPA-Aliquot wurde kein BCIG hinzugefügt. Die Glasbehälter wurden bei 121°C für 15 Minuten bei 15 Atmosphären Druck autoklaviert. Alle acht Glasbehälter wurden auf 46°C temperiert. Während des Temperierens wurde die Bacto Eigelb-Tellurit-(EYT-)Suspension von 2–8°C auf 46°C angewärmt. Nachdem das BPA 46°C erreichte, wurden 10 Milliliter von der EYT-Suspension zu jedem Glasbehälter hinzugefügt. Die Glasbehälter wurden behutsam geschwenkt, um das EYT mit dem geschmolzenen Agar zu vermischen. Zwanzig Milliliter von dem BCIG-Medium wurden zu jeder von neun 15 × 150-Millimeter Petrischalen hinzugefügt. Nachdem die Platten gegossen waren und zum Festwerden stehen gelassen wurden, wurden die Platten umgedreht und über Nacht vor der Verwendung bei Raumtemperatur inkubiert.

Die Bakterienkulturen wurden auf die TSA-Ausstrichplatten ausgestrichen und bei 37°C über Nacht inkubiert. Dieselben Platten wurden für wiederholte Experimente verwendet und bei 2–8°C aufbewahrt. Vor den Tests wurden die Platten auf Raumtemperatur angewärmt. Die BCIG/BPA-Platten wurden in acht gleiche tortenstückartige Abschnitte unterteilt. Es wurden isolierte Kolonien von der TSA-Platte ausgewählt und auf den BCIG/BPA-Platten ausgestrichen, eine Kolonie pro BCIG/BPA-Abschnitt pro Konzentration. Die Platten wurden bei 37°C für 48 Stunden inkubiert. Die Beobachtungen der Platten wurden nach 48 Stunden durchgeführt und sind in Tabelle 2 angegeben. TABELLE 2

Stamm	Spezies	BPA (BCIG-Konzentration in μg/mL)
		0	100	50	25	12,5	6,3	3,1	1,6
27660	S. aureus	T¹	T	T	T	T	T	T	T
13301	S. aureus	T	T	T	T	T	T	T	T
13565	S. aureus	T	T	T	T	T	T	T	T
12600	S. aureus	B²	B	B	B	B	B	B	B
27659	S. aureus	T	T	T	T	T	T	T	T
W-832	S. aureus	T	T	T	T	T	T	T	T
12598	S. aureus	T	T	T	T	T	T	T	T
25923	S. aureus	T	T	T	T	T	T	T	T
19433	E. fecaelis	B	G³	G	B	B	B	B	B
MMM	E. fecaelis	B	G	G	G	B	B	B	B
882	E. faecium	B	G	G	G	B	B	B	B
19434	E. faecium	B	G	G	G	B	B	B	B
P88	E.-Spezies	B	G	B	B	B	B	B	B
P89	E.-Spezies	B	G	B	B	B	B	B	B
P90	E.-Spezies	B	G	B	B	B	B	B	B
P91	E.-Spezies	B	G	B	B	B	B	B	B
P92	E.-Spezies	B	G	G	G	B	B	B	B
P93	E.-Spezies	B	G	G	B	B	B	B	B
P94	E.-Spezies	B	G	G	B	B	B	B	B
M1026	E.-Spezies	B	G	G	B	B	B	B	B
M1028	E.-Spezies	B	G	G	B	B	B	B	B
M1030	E.-Spezies	B	G	G	B	B	B	B	B
M1032	E.-Spezies	B	G	G	B	B	B	B	B
M1038	E.-Spezies	B	G	G	G	B	B	B	B
L3	B.-Spezies	B	G	B	B	B	B	B	B
L4	B.-Spezies	B	G	G	B	B	B	B	B
L8	B.-Spezies	B	G	B	B	B	B	B	B
L9	B.-Spezies	B	G	G	B	B	B	B	B
L11	B.-Spezies	B	G	B	B	B	B	B	B
L12	B.-Spezies	B	G	B	B	B	B	B	B
L13	B.-Spezies	B	G	B	B	B	B	B	B
L14	B.-Spezies	B	G	B	B	B	B	B	B
L18	B.-Spezies	B	G	B	B	B	B	B	B
L20	B.-Spezies	B	G	B	B	B	B	B	B
L24	B.-Spezies	B	G	B	B	B	B	B	B
L27	B.-Spezies	B	G	G	B	B	B	B	B
LK1	B.-Spezies	B	G	B	B	B	B	B	B
LK3	B.-Spezies	B	G	B	B	B	B	B	B
LK4	B.-Spezies	B	G	B	B	B	B	B	B
LK5	B.-Spezies	B	G	G	B	B	B	B	B

¹ Typische Kolonien
² Nicht-typische Kolonien mit schwarzem Präzipitat
³ Nicht-typische Kolonien mit blaugrünem Präzipitat mit oder ohne schwarzes Präzipitat

BEISPIEL 2
Zusätzliche Stämme wurden mit BCIG/BPA-Medien bei 0 und 100 Mikrogramm/Milliliter untersucht. Dreiundsechzig g BPA-Pulver (Difco Laboratories) wurden abgewogen und mit 950 Millilitern entionisiertem Wasser gemäß der Vorschrift des Herstellers gemischt. Einhundert Milligramm BCIG wurden in ein 16 × 150 mm Glasröhrchen mit Schraubkappe abgewogen. Zehn Milliliter DMF wurden zu dem BCIG-Pulver hinzugefügt und energisch gemischt. Die Suspension wurde auf 60°C in einem Wasserbad erwärmt und so lange inkubiert, bis das Pulver aufgelöst war. Das vermischte und erwärmte BPA-Pulver wurde in zwei 425-Milliliter Aliquots in autoklavierbare Glasbehälter mit 1000-Milliliter Volumen aufgeteilt. In einen Glasbehälter wurden 5,0 Milliliter von der 10 Milligramm/Milliliter BCIG-Lösung hinzugefügt. Zu dem anderen BPA-Aliquot wurde kein BCIG hinzugefügt. Die Glasbehälter wurden bei 121°C für 15 Minuten bei 15 Atmosphären Druck autoklaviert. Beide Glasbehälter wurden auf 46°C temperiert. Während des Temperierens wurde die Bacto Eigelb-Tellurit-(EYT-)-Suspension von 2–8°C auf 46°C angewärmt. Nachdem das BPA 46°C erreichte, wurden 25 Milliliter von der EYT-Suspension zu jedem Glasbehälter hinzugefügt. Die Glasbehälter wurden behutsam geschwenkt, um das EYT mit dem geschmolzenen Agar zu vermischen. Zwanzig Milliliter von dem BCIG-Medium wurden zu fünfundzwanzig 15 × 100-Millimeter Petrischalen hinzugefügt. Nachdem die Platten gegossen waren und zum Festwerden stehen gelassen wurden, wurden die Platten umgedreht und über Nacht vor der Verwendung bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Bakterienkulturen wurden auf die TSA-Ausstrichplatten ausgestrichen und bei 37°C über Nacht inkubiert. Dieselben Platten wurden für wiederholte Experimente verwendet und bei 2–8°C aufbewahrt. Vor den Tests wurden die Platten auf Raumtemperatur angewärmt.

Die BCIG/BPA-Platten wurden in acht gleiche tortenstückartige Abschnitte unterteilt. Es wurden isolierte Kolonien von der TSA-Platte ausgewählt und auf den BCIG/BPA-Platten ausgestrichen; eine Kolonie pro BCIG/BPA-Abschnitt pro Konzentration. Die Platten wurden bei 37°C für 48 Stunden inkubiert. Die Beobachtungen der Platten wurden nach 48 Stunden durchgeführt und sind in Tabelle 3 angegeben. TABELLE 3

Stamm	Spezies	0 μg/ml BCIG/BPA	100 μg/ml BCIG/BPA
23842	B. amyloliquefaciens	B¹	G²
11778	B. cereus	B	B*
13061	B. cereus	B	B*
14579	B. cereus	B	B*
61	B. circulans	B	G
4513	B. circulans	B	G
7050	B. coagulans	B	G
14580	B. licheniformis	B	G
14581	B. megaterium	ng³	ng
6462	B. mycoides	B	B*
842	B. polymyxa	B	G
72	B. pumilis	B	G
4525	B. sphaericus	B	B*
6051	B. subtilis	B	G
23059	B. subtilis	B	G
23856	B. subtilis	B	G
23857	B. subtilis	B	G
23858	B. subtilis	B	G
23859	B. subtilis	B	G
29056	B. subtilis	B	G
BB	B.-Spezies	B	G
L1	B.-Spezies	B	G
L2	B.-Spezies	ng	ng
L3	B.-Spezies	B	G
L4	B.-Spezies	B	G
L5	B.-Spezies	ng	ng
L6	B.-Spezies	ng	ng
L7	B.-Spezies	ng	ng
L8	B.-Spezies	B	G
L9	B.-Spezies	B	G
L10	B.-Spezies	ng	ng
L11	B.-Spezies	B	G
L12	B.-Spezies	B	G
L13	B.-Spezies	B	G
L14	B.-Spezies	B	G
L15	B.-Spezies	ng	ng
L16	B.-Spezies	B	G
L17	B.-Spezies	B	G
L18	B.-Spezies	B	G
L19	B.-Spezies	ng	ng
L20	B.-Spezies	B	G
L21	B.-Spezies	ng	ng
L22	B.-Spezies	ng	ng
L23	B.-Spezies	ng	ng
L24	B.-Spezies	B	G
L25	B.-Spezies	ng	ng
L26	B.-Spezies	ng	ng
L27	B.-Spezies	B	G
L28	B.-Spezies	ng	ng
L29	B.-Spezies	ng	ng
L30	B.-Spezies	B	G
LK1	B.-Spezies	B	G
LK2	B.-Spezies	ng	ng
LK3	B.-Spezies	B	G
LK4	B.-Spezies	B	G
LK5	B.-Spezies	B	G
882	E. faecium	B	G
19434	E. faecium	B	G
29212	E. fecaelis	B	G
14990	E. fecaelis	B	G
19433	E. fecaelis	B	G
MMM	E. fecaelis	B	G
P89	E.-Spezies	B	G
P90	E.-Spezies	B	G
P91	E.-Spezies	B	G
P92	E.-Spezies	B	G
P93	E.-Spezies	B	G
P94	E.-Spezies	B	G
P88	E.-Spezies	B	G
M1026	E.-Spezies	B	G
M1028	E.-Spezies	B	G
M1030	E.-Spezies	B	G
M1032	E.-Spezies	B	G
M1038	E.-Spezies	B	G
M1040	E.-Spezies	B	G
M1044	E.-Spezies	B	G
M1148	E.-Spezies	B	G
M2017	E.-Spezies	B	G
M2022	E. Spezies	B	G
M1144	E. Spezies	B	G
M1067	E. Spezies	B	G
M1062	E.-Spezies	B	G
25923	S. aureus	T⁴	T
W-832	S. aureus	T	T
13301	S- aureus	T	T
13565	S. aureus	T	T
12600	S. aureus	B	B
27659	S. aureus	T	T
12598	S. aureus	T	T
12228	S. epidermidis	B	B
14990	S. epidermidis	B	B
35547	S. epidermidis	B	B
U28	Klebsiella pneumoniae	B	G
U33	Klebsiella oxytoca	B	G
11120	Listeria grayi	B	G
33091	Listeria innocua	B	G
19119	Listeria ivanovii	B	G
19919	Listeria ivanovii	B	G
13932	Listeria monocytogenes	B	G
15313	Listeria monocytogenes	B	G
19112	Listeria monocytogenes	B	G
19118	Listeria monocytogenes	B	G
43256	Listeria monocytogenes	B	G
49594	Listeria monocytogenes	B	G
25401	Listeria murrayi	B	G
U61	Proteus vulgaris	B	G
U62	Proteus vulgaris	B	G
U63	Proteus vulgaris	B	G

* BCIG-negativer Stamm
¹ Nicht-typische Kolonien mit schwarzem Präzipitat
² Nicht-typische Kolonien mit blaugrünem Präzipitat mit oder ohne schwarzes Präzipitat
³ Kein Wachstum
⁴ Typische Kolonien

BEISPIEL 3
REDIGEL^TM Baird-Parker:

Dieses Beispiel veranschaulicht den praktischen Einsatz der beanspruchten Erfindung in einer Calcium-Pektinat-(REDIGEL^TM) Anwendung. Materialien:

Baird-Parker REDIGEL^TM	RCR, Inc., Goshun, IN
(Größe für 10 Platten)
5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-	Biosynth International,
beta-D-Glucopyranosid (BCIG)	Chicago, IL
Dimethyl-Formamid (DMF)	Fisher Scientific,
	Fairlawn, NJ
Röhrchen mit tryptischem	DiMed Laboratories,
Soja-Nährmedium	St Paul, MN
Tryptische Soja-Agarplatten	DiMed Laboratories,
	St Paul, MN

Verfahren:

REDIGEL^TM, ein handelsüblich erhältliches Produkt, das Calcium-Pektinat als gelierende Matrix für das mikrobielle Wachstum und den Nachweis verwendet, benutzt für den Nachweis von Staphylokokken ein System, das ähnlich zu dem Baird-Parker-Agar ist. Das für diese Anwendung verwendete System war ein 10-Platten Kit, das 110 Milliliter Lösung enthält, welche die selektiven und unterschiedlichen Reagenzien in der Lösung mit dem Pektin enthält, und behandelte Petrischalen, die das Calcium enthalten, welches benötigt wird, um die Gelmatrix für das mikrobielle Wachstum zu bilden. Zu fünf Fläschchen mit der Lösung wurden die folgenden Volumen von 10 Milligramm BCIG/Milliliter in DMF hinzugefügt: 1,1 Milliliter, 0,55 Milliliter, 0,275 Milliliter, 0,1375 Milliliter, 0,0688 Milliliter und 0 Milliliter. Dies ergab Lösungen mit 100, 50, 25, 12,5, 6,3 und 0 Mikrogramm BCIG pro Milliliter. Elf Milliliter von jeder Lösung wurden zu neun einzelnen Platten hinzugefügt. Die Platten wurden aufrecht stehend für 6 Stunden bei Raumtemperatur stehen lassen. Anschließend wurden TSA-Kulturen auf den Platten wie in dem vorherigen Abschnitt für die BPA-Evaluierung ausgestrichen. Die Platten wurden danach bei 37°C für 48 Stunden inkubiert und gelesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 wiedergegeben. TABELLE 4

Stamm	Spezies	REDIGEL^TM Baird-Parker (BCIG-Konzentration in μg/mL)
		0	100	50	25	12,5	6,3
27660	S. aureus	T¹	T	T	T	T	T
13301	S. aureus	T	T	T	T	T	T
13565	S. aureus	T	T	T	T	T	T
12600	S. aureus	B²	B	B	B	B	B
27659	S. aureus	T	T	T	T	T	T
W-832	S. aureus	T	T	T	T	T	T
12598	S. aureus	T	T	T	T	T	T
25923	S. aureus	T	T	T	T	T	T
19433	E. fecaelis	B¹	G³	G	G	G	B
MMM	E. fecaelis	B	G	G	G	G	B
882	E. faecium	B	G	G	G	G	B
19434	E. faecium	B	G	G	G	G	B
P88	E.-Spezies	B	G	G	G	G	B
P89	E.-Spezies	B	G	G	G	G	B
P90	E.-Spezies	B	G	G	G	G	B
P91	E.-Spezies	B	G	G	G	G	B
P92	E.-Spezies	B	G	G	G	G	B
P93	E.-Spezies	B	G	G	G	G	B
P94	E.-Spezies	B	G	G	G	G	B
M1026	E.-Spezies	B	G	G	G	G	B
M1028	E.-Spezies	B	G	G	G	G	B
M1030	E.-Spezies	B	G	G	G	G	B
M1032	E.-Spezies	B	G	G	G	G	B
M1038	E.-Spezies	B	G	G	G	G	B
L3	B.-Spezies	B	G	B	B	B	B
L4	B.-Spezies	B	G	G	B	B	B
L8	B.-Spezies	B	G	B	B	B	B
L9	B.-Spezies	B	G	G	G	B	B
L11	B.-Spezies	B	G	G	G	B	B
L12	B.-Spezies	B	G	B	B	B	B
L13	B.-Spezies	B	G	G	B	B	B
L14	B.-Spezies	B	G	G	B	B	B
L18	B.-Spezies	B	G	G	B	B	B
L20	B.-Spezies	B	G	G	B	B	B
L24	B.-Spezies	B	G	G	B	B	B
L27	B.-Spezies	B	G	G	G	B	B
LK1	B.-Spezies	B	G	G	B	B	B
LK3	B.-Spezies	B	G	B	B	B	B
LK4	B.-Spezies	B	G	G	B	B	B
LK5	B.-Spezies	B	G	G	B	B	B

BEISPIEL 4
Anwendung der PETRIFILM^TM Staphylococcus-Zählplatte mit
BCIG-Titration

Dieses Beispiel veranschaulicht den praktischen Einsatz der beanspruchten Erfindung in einer Vorrichtung zur Kultur auf dünnen Folien. Materialien:

PETRIFILM^TM Aerobic Count	3M Company, St. Paul, MN
Deckfolie
Xanthangummi	Kelco, San Diego, CA
Johannisbrotkernmehl	Genu Worldwide, Lille
	Skensved, Dänemark
Guarkernmehl	Meyhall Chemical RG,
	Zandaam, Niederlande
0,19 mm (7,5 mil) Melinex	ICI Films,
	Wilmington, DE

Nährmadium-Pulver:

Tryptose-Pepton	Acumedia, Baltimore, MD
Dipepton	Acumedia, Baltimore, MD
Hefeextrakt	BBL, Baltimore, MD
Lithiumchlorid	Sigma Chemical,
	St. Louis, MO
Nalidixinsäure	Sigma Chemical,
	St. Louis, MO
Ceftazidim	Sigma Chemical,
	St. Louis, MO
Brenztraubensäure	Sigma Chemical,
	St. Louis, MO
Eigelb-Suspension	Difco Laboratories,
	Detroit, MI
5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-	Biosynth International,
beta-D-Glucopyranosid (BCIG)	Naperville, IL
0,5 mm (20 mil) Styropor	Astro-Valcour, Inc.,
	Glen Falls, NY

Die Titration zur Bestimmung des wirksamen Bereiches von BCIG zur Differenzierung von S. aureus gegenüber BCIG-positiven Nicht-S. aureus wurde folgendermaßen vervollständigt:
Deckfolie:
Xanthangummi, Johannisbrotkernmehl und Guarkernmehl wurden mit einem Verhältnis von 2:2:1 gemischt. Diese Mischung wurde auf die PETRIFILM^TM Aerobic Count Deckfolie, welche Triphenyltetrazoliumchlorid, mit einer Konzentration von annähernd 0,4 Gramm pro 61 Quadratzentimeter (24 Quadrat-Inch) der Folie enthält, pulverbeschichtet.
Nährmedium-Mischung:

Die Nährmedium-Pulver wurden in der folgenden Weise gemischt:

Tryptose-Pepton	100 Gramm
Dipepton	100 Gramm
Hefeextrakt	40 Gramm
Lithiumchlorid	40 Gramm
Nalidixinsäure	80 Milligramm
Ceftazidim	8 Milligramm
Brenztraubensäure	40 Gramm
Eigelb-Suspension	80 Milliliter
Entionisiertes Wasser	4 Liter

Die Pulver wurden energisch in das Wasser gemischt. Die Lösung wurde in acht 500-Milliliter Aliquots aufge teilt. Die nachfolgenden Mengen an BCIG wurden zu den getrennten Aliquots hinzugefügt und energisch gemischt: 100 Milligramm, 75 Milligramm, 50 Milligramm, 37,5 Milligramm, 25 Milligramm und 12,5 Milligramm. Fünf Gramm einer gleichen Mischung aus Xanthangummi:Guarkernmehl wurde zu jeder Lösung hinzugefügt und energisch gemischt. Nachdem alle Pulver hinzugefügt und gut gemischt waren, wurden die Lösungen auf 80°C unter energischem Mischen erhitzt. Die Lösungen wurden anschließend über Nacht auf 2–8°C abgekühlt. Das Nährmedium wurde mit einem Messerabstand von annähernd 0,33 mm (13 mil) auf die Melinexfolie aufgetragen und dann bei 93°C für ungefähr 10 Minuten getrocknet. Ein Beschichtungsgewicht von 300–350 Milligramm pro 61 Quadratzentimeter (24 Quadrat-Inch) wurde mit dieser Beschichtung erreicht. Fünfhundert Mikrometer (20 mil) Styropor wurden mit einem Acrylsäure-Klebstoff transferbeschichtet. Es wurden Kreise mit einem Durchmesser von 5,1 Zentimeter (2 Inch) aus dem Styropormaterial entfernt, die als eine Vertiefung zum Halten des Inokulums fungieren. Das mit dem Nährmedium beschichtete Gewebe wurde auf die 0,5 mm (20 mil) Styropor laminiert. Ein 1,3 Zentimeter (0,5 Inch) dickes, doppelseitiges Klebeband wurde als Gelenkband verwendet, um die pulverbeschichtete Deckfolie mit dem Styropor/Nährmedium-beschichteten Melinex-Laminat zu verbinden. Die Folien wurden in 7,6 × 10,2 cm (3 × 4 Inch) große Rechtecke mit dem Kreis annähernd in dem Zentrum von dem Rechteck zugeschnitten. Die Folien wurden mit Gammastrahlen bei 5–10 Kilogray vor der Evaluierung bestrahlt. Die Bakterienkulturen wurden für die Evaluierung durch Kultivieren in tryptischem Soja-Nährmedium über Nacht bei 37°C über Nacht hergestellt. Entsprechende Verdünnungen von den Kulturen wurden hergestellt, um ungefähr 100 koloniebildende Einheiten (cfu) pro Milliliter in Butterfields-Standardmethoden-Puffer (Fisher Scientific, Chicago, IL) zu erhalten. Die Verdünnungen von jedem Bakterium wurden mit den Ergebnissen verglichen, die von einer äquivalenten Plattie rung auf PETRIFILM^TM Aerobic-Count Platte (PAC) erhalten wurden, mit den Ergebnissen, die in Tabelle 5 dargestellt sind. Die Bakterienverdünnungen (1,0 Milliliter) wurden ausplattiert und nach 24 Stunden bei 37°C gezählt. TABELLE 5

Stamm	Spezies	PETRIFILM^TM Staphylococcus Zähl-Platte (BCIG-Konzentrationin μg/mL)
		0	100	75	50	37,5	25	12,5	PAC
27660	S. aureus	92-	83-	80-	83-	62-	86-	76-	85
13301	S. aureus	175-	154-	184-	170-	193-	194-	173-	184
13565	S. aureus	39-	50-	44-	44-	45-	51-	43-	42
12600	S. aureus	120-	121-	134-	132-	120-	106-	112-	130
27659	S. aureus	115-	122-	144-	132-	127-	130-	125-	166
W-832	S. aureus	189-	161-	159-	158-	157-	170-	164-	168
12598	S. aureus	115-	95-	114-	106-	112-	104-	92-	114
25923	S. aureus	39-	49-	55-	57-	59-	61-	48-	54
19433	E. fecaelis	ng¹	ng	3*	24*	21*	ng	ng	137
MMM	E. fecaelis	125-	98*	156*	136*	145*	142*	134*	205
882	E. faecium	41-	65*	82*	69*	53*	75*	69-	78
19434	E. faecium	80-	41*	63*	82*	91*	107*	78-	131
P88	E.-Spezies	36-	10*	25*	28*	28*	34-	14-	103
P89	E.-Spezies	16-	32*	26*	13*	41*	28-	21-	81
P90	E.-Spezies	9-	3*	9*	10*	20*	21*	8*	115
P91	E.-Spezies	20-	7*	28*	17*	64*	35*	ng	121
P92	E.-Spezies	ng	ng	ng	ng	5*	22*	ng	102
P93	E.-Spezies	20-	2*	20*	17*	12*	25*	2-	80
P94	E.-Spezies	13-	4*	29*	5*	29*	34*	10-	102
M1026	E.-Spezies	2-	1*	2*	1*	ng	4*	ng	62
M1028	E.-Spezies	ng	8*	16*	7*	8*	25*	1-	74
M1030	E.-Spezies	1-	5*	ng	ng	20*	28*	1-	146
M1032	E.-Spezies	ng	6*	1*	4*	7*	6*	ng	70
M1038	E.-Spezies	11-	ng	ng	ng	14*	7*	ng	67
L3	B.-Spezies	ng	ng	ng	ng	ng	ng	ng	210
L4	B.-Spezies	ng	ng	ng	ng	ng	ng	ng	>300
L8	B.-Spezies	ng	ng	ng	ng	ng	ng	ng	>300
L9	B.-Spezies	139-	121*	144*	153*	135-	157-	135-	180
L11	B.-Spezies	ng	ng	ng	ng	ng	ng	ng	>300
L12	B.-Spezies	ng	ng	ng	ng	ng	ng	ng	190
L13	B.-Spezies	ng	ng	ng	ng	ng	ng	ng	200
L14	B.-Spezies	ng	ng	ng	ng	ng	ng	ng	>300
L18	B.-Spezies	ng	ng	ng	ng	ng	ng	ng	>300
L20	B.-Spezies	ng	ng	ng	ng	ng	ng	ng	>300
L24	B.-Spezies	ng	ng	ng	ng	ng	ng	ng	250
L27	B.-Spezies	ng	ng	ng	ng	ng	ng	ng	>300
LK1	B.-Spezies	ng	ng	ng	ng	ng	ng	ng	330
LK3	B.-Spezies	ng	ng	ng	ng	ng	ng	ng	157
LK4	B.-Spezies	ng	ng	ng	ng	ng	ng	ng	170
LK5	B.-Spezies	170-	150*	180*	220*	190*	210-	180-	270

¹ Kein Wachstum
* Blaue bis rotblaue Kolonien
^- Nur rote Kolonien

Um weiter Stämme zu evaluieren, wurden PETRIFILM^TM Staphylococcus Zählplatten-(PSC-)Formulierungen mit 0 und 100 Milligramm/Milliliter BCIG wie folgt hergestellt: Materialien:

PETRIFILM^TM Aerobic Count	3M Company, St. Paul, MN
Deckfolie
Xanthangummi	Kelco, San Diego, CA
Johannisbrotkernmehl	Genu Worldwide, Lille
	Skensved, Dänemark
Guarkernmehl	Meyhall Chemical AG,
	Zandaam, Niederlande
0,19 mm (7,5 mil) Melinex	ICI Films, Wilmington, DE

Nährmedium-Pulver:

Deckfolie:
Xanthangummi, Johannisbrotkernmehl und Guarkernmehl wurden mit einem Verhältnis von 2:2:1 gemischt. Diese Mischung wurde auf die PETRIFILM^TM Aerobic-Count Deckfolie, welche Triphenyltetrazoliumchlorid mit einer Konzentration von annähernd 0,4 Gramm pro 86,4 Quadrat zentimeter (34 Quadrat-Inch) der Folie enthält, pulverbeschichtet.
Nährmedium-Mischung:

Die Nährmedium-Pulver wurden in der folgenden Weise gemischt:

Tryptose-Pepton	50 Gramm
Dipepton	50 Gramm
Hefeextrakt	20 Gramm
Lithiumchlorid	20 Gramm
Nalidixinsäure	40 Milligramm
Ceftazidim	4 Milligramm
Brenztraubensäure	20 Gramm
Eigelb-Suspension	40 Milliliter
Entionisiertes Wasser	2 Liter

Die Pulver wurden energisch in das Wasser gemischt. Die Lösung wurde in zwei 1000-Milliliter Aliquots aufgeteilt. Zweihundert Milligramm BCIG wurde zu einem der Aliquots hinzugefügt und energisch gemischt. Zwanzig Gramm einer gleichen Mischung aus Xanthangummi:Guarkernmehl wurde zu beiden Lösungen hinzugefügt und energisch gemischt. Nachdem alle Pulver hinzugefügt und gut gemischt waren, wurden beide Lösungen auf 80°C unter energischem Mischen erhitzt. Die Lösungen wurden anschließend über Nacht auf 2–8°C abgekühlt. Das Nährmedium wurde mit einem Messerabstand von annähernd 0,25 mm (10 mils) auf die Melinexfolie aufgetragen und dann bei 93°C für ungefähr 10 Minuten getrocknet. Ein Beschichtungsgewicht von 300–350 Milligramm pro 61 Quadratzentimeter (24 Quadrat-Inch) wurde mit dieser Beschichtung erreicht. Fünfhundert Mikrometer (20 mil) Styropor wurden mit einem Acrylsäure-Klebstoff transferbeschichtet. Es wurden Kreise mit einem Durchmesser von 5,1 Zentimeter (2 Inch) aus dem Styropormaterial entfernt, die als eine Vertiefung zum Halten des Inokulums fungierten. Das mit dem Nährmedium beschichtete Gewebe wurde auf die 0,5 mm (20 mil) Styropor laminiert. Ein 1,3 Zentimeter (0,5 Inch) dickes, doppelseitiges Klebeband wurde als Gelenkband verwendet, um die pulverbeschichtete Deckfolie mit dem Styropor/Nährmedium-beschichteten Melinex-Laminat zu verbinden. Die Folien wurden in 7,6 × 10,2 cm (3 × 4 Inch) große Rechtecke mit dem Kreis annähernd in dem Zentrum von dem Rechteck zugeschnitten. Die Folien wurden mit Gammastrahlen bei 5–10 Kilogray vor der Evaluierung bestrahlt. Die Bakterienkulturen wurden für die Evaluierung durch Kultivieren in tryptischem Soja-Nährmedium über Nacht bei 37°C über Nacht hergestellt. Entsprechende Verdünnungen von den Kulturen wurden hergestellt, um ungefähr 100 koloniebildende Einheiten (cfu) pro Milliliter in Butterfields-Standardmethoden-Puffer (Fisher Scientific, Chicago, IL) zu erhalten. Die Verdünnungen von jedem Bakterium wurden errechnet aus den Ergebnissen, welche von einer äquivalenten Ausplattierung auf 3M PETRIFILM^TM Aerobic-Count Platten erhalten wurden. Die Bakterienverdünnungen (1,0 Milliliter) wurden als Duplikate ausplattiert und nach 24 Stunden bei 37°C ausgezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. TABELLE 6

Stamm	Spezies	PAC-Platte	PSC-Platte
		(Mittelwert cfu/Milliliter)
23842	B. amyloliquefaciens	265	ng¹
11778	B. cereus	86,5	ng
13061	B. cereus	320	ng
14579	B. cereus	215	ng
61	B. circulans	810	295*
4513	B. circulans	570	355*
7050	B. coagulans	230	ng
14580	B. licheniformis	208	144*
14581	B. megaterium	ng	ng
6462	B. mycoides	ng	ng
842	B. polymyxa	125	ng
72	B. pumilis	940	520*
4525	B. sphaericus	165	174-
6051	B. subtilis	225	ng
23059	B. subtilis	149	ng
23856	B. subtilis	95	ng
23857	B. subtilis	> 1.000	ng
23858	B. subtilis	265	ng
23859	B. subtilis	415	ng
29056	B. subtilis	546	ng
L3	B.-Spezies	148	ng
L4	B.-Spezies	> 1.000	ng
L8	B.-Spezies	230	ng
L9	B.-Spezies	154	137*
L11	B.-Spezies	800	ng
L12	B.-Spezies	550	ng
L13	B.-Spezies	> 1.000	ng
L14	B.-Spezies	> 1.000	ng
L18	B.-Spezies	> 1.000	ng
L24	B.-Spezies	630	ng
L27	B.-Spezies	210	ng
882	E. faecium	26	4*
19433	E. fecaelis	59	ng
MMM	E. fecaelis	77	16*
P89	E.-Spezies	66	ng
P90	E.-Spezies	84	ng
P91	E.-Spezies	49	ng
P92	E.-Spezies	60	ng
P93	E.-Spezies	70	ng
P94	E.-Spezies	59	ng
P88	E.-Spezies	40	ng
M1026	E.-Spezies	43	ng
M1028	E.-Spezies	44	ng
13301	S. aureus	112	108-
13565	S. aureus	60	63-
12600	S. aureus	79	73-
27659	S. aureus	64	78-
12598	S. aureus	62	52-
35547	S. epidermidis	24	22-

¹ Kein Wachstum
* Blaue bis rotblaue Kolonien
^- Nur rote Kolonien

Andere erfindungsgemäße Ausführungsformen befinden sich innerhalb des Bereiches der anhängenden Ansprüche.

Claims

Medium zum Nachweisen von Staphylokokken in einer Probe, wobei das Medium aus Komponenten, die selektiv für das Wachstum von Staphylokokken sind, und einer Glucopyranosid-Indikatorsubstanz in einer Konzentration von mindestens 100 Mikrogramm pro Milliliter besteht, um Kolonien, die Staphylokokken enthalten, von Kolonien, die Bacillus-Mikroorganismen enthalten, zu unterscheiden, wenn die Probe in dem Medium kultiviert ist, wobei das Medium in der Form eines Agargels ist, wobei das Agargel ein Baird-Parker Agargel umfasst.
Medium nach Anspruch 1, wobei das Medium in der Form getrockneten Nährmediums ist, das an einem selbsttragenden, wasserundurchlässigen Substrat von einer Vorrichtung zur Kultur auf dünnen Folien haftet.
Verfahren zum Nachweisen von Staphylokokken in einer Probe unter Verwendung der Medien nach Anspruch 1, umfassend: Kultivieren der Probe in dem Medium nach Anspruch 1 unter Bedingungen, die nachweisbare Kolonien hervorbringen.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Verfahren ferner das Bestätigen der Anwesenheit oder Abwesenheit von Staphylokokken in der Probe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Verfahren ferner das Auszählen der Staphylokokken in der Probe umfasst.
Vorrichtung zum Nachweis von Staphylokokken in einer Probe, wobei die Vorrichtung das Medium nach Anspruch 1 in der Form getrockneten Nährmediums enthält, das an einem selbsttragenden, wasserundurchlässigen Substrat einer Kultur auf dünnen Folien haftet.
Vorrichtung nach Anspruch 6, wobei die Glucopyranosid-Indikatorsubstanz ein Indolyl-Glucopyranosid umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei die Indikatorsubstanz 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-glucopyranosid umfasst.