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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für den quantitativen
Nachweis und die Unterscheidung biologischer Materialien in einer
Probe, die eine Vielzahl verschiedener biologischer Materialien enthält und ein
Testmedium zur Verwendung in dem Verfahren.
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Die
Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein quantitatives Verfahren
für das
Erkennen und den Nachweis von Escherichia coli 0157 und das gleichzeitige
quantitative Erkennen und Nachweisen anderer Stämme von Escherichia coli (E.
coli), von allgemeinen Coliformen und von nicht-coliformen Enterobacteriaceae
in gemischten mikrobiellen Proben.
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Es
gibt eine anhaltende Notwendigkeit der Überprüfung von Fleisch, Milchprodukten,
Wasser und anderen Lebensmittelproben auf das Vorhandensein von
krank machenden Substanzen, wie Bakterien, anderen Mikroben und
Zellen und Geweben anderer Organismen. Diese Notwendigkeit hat nach
der Entdeckung der enteropathogenen E. coli 0157-Bakterien in den
frühen
80er Jahren eine zusätzliche
Bedeutung erhalten. Ein zusätzlicher
Antrieb ergab sich aus den vor kurzem öffentlich bekannt gewordenen
Fällen
von Erkrankungen und Tod durch den Verzehr von wenig gekochtem Rinderhackfleisch.
In der Folge wurde der Entwicklung von Testverfahren für den Nachweis
des Vorhandenseins und der Mengen derartiger schädigender Substanzen inDbiologischen
Materialien, wie Nahrungsmitteln, Milchprodukten, Getränken und
Wasser, sowie in medizinischen und veterinärmedizinischen Testmaterialien
große
Aufmerksamkeit geschenkt. Dies ist sowohl für die Identifizierung potentieller
Gefahren in Materialien wie für
diagnostische Zwecke wichtig.
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Zusätzlich zu
der oben erwähnten
Notwendigkeit des Nachweises des Vorhandenseins und der Mengen von
E. coli 0157 in einer Testprobe gibt es einen fortwährenden
Bedarf an schnelleren und zuverlässigeren Testverfahren
für den
Nachweis des Vorhandenseins vieler anderer biologischer Materialien
in einer Testprobe, von denen bekannt ist, dass sie die Qualität und die
Sicherheit eines Produkts beeinträchtigen. Der Nachweis des Vorhandenseins
oder des Fehlens derartiger biologischer Materialien liefert eine
zusätzliche
Basis, auf der die Qualität
und die Sicherheit verschiedener Substanzen beurteilt werden kann.
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Die
Verwendung von Indikatororganismen in der Biotechnologie, der diagnostischen
Chemie, der Mikrobiologie, der Molekularbiologie und auf damit verwandten
Fachgebieten als Basis, auf der die Qualität eines Produkts oder einer
Testprobe bestimmt werden kann, ist allgemein bekannt. Beispielsweise
wird die Menge oder die Zahl der E. coli-Bakterien oder anderer Coliforme, die
in Wasser vorhanden sind, als ein wichtiger Indikator für die Sauberkeit
und Sicherheit dieses Wassers angesehen. In ähnlicher Weise wird das Vorhandensein
von E. coli oder anderer Coliforme in Nahrungsmitteln und Milchprodukten
als ein wichtiger Indikator für
die Qualität
dieser Produkte angesehen. Ebenso ist die schnelle und genaue Identifizierung
bestimmter Gebilde in medizinischen Testproben wichtig für die Diagnose
von Krankheitszuständen.
Verbesserte Testverfahren für
die effiziente Identifizierung, Trennung und Zählung derartiger Bakterientypen
sind erforderlich, und es gibt eine andauernde Suche nach schnelleren,
genaueren und vielseitigeren Testverfahren auf diesem Gebiet.
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Es
sind zahlreiche Testverfahren verwendet worden, um einen oder mehrere
Indikatororganismen zu bestimmen, zu identifizieren und zu zählen. Einige
dieser Testverfahren zeigen nur das Vorhandensein oder die Abwesenheit
der Mikroorganismen an, während
andere Verfahren auch versuchen, einen oder mehrere der speziellen
Organismen in der Testprobe zu quantifizieren. Beispielsweise kann
ein Test, der als Vorhandensein-/Abwesenheits-Test (oder V/A-Test)
bezeichnet wird, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Coliformen
und E. coli in einer Testprobe zu ermitteln. Ein Testmedium, das
das β-Galactosidase-Substrat O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid
(ONPG) und das β-Glucuronidase-Substrat
4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid
(MUG) enthält,
wird mit der Testprobe beimpft. Um die allgemeinen Coliformen von
E. coli zu unterscheiden, beruht dieser Test auf der Tatsache, dass
im Allgemeinen alle Coliforme β-Galactosidase
erzeugen, während
nur E. coli zusätzlich
zu β-Galactosidase
auch β-Glucuronidase
erzeugt. Falls irgendwelche Coliforme vorhanden sind (einschließlich E.
coli), nimmt das Bouillonmedium eine gelbe Farbe an aufgrund der
Einwirkung des Galactosidasenzyms auf das ONPG-Material, was die
Freisetzung eines diffusionsfähigen
gelben Pigments hervorruft. Falls E. coli vorhanden ist, zeigt das
Bouillonmedium eine blaue Fluoreszenz, wenn es mit Ultraviolett-Strahlung
bestrahlt wird aufgrund des Zerfalls des MUG-Reagens unter Freisetzung
des fluorogenen Farbstoffs, die durch das Reaktionsprodukt des Glucuronidaseenzyms
verursacht wird. Diese Reaktionen sind sehr spezifisch und erlauben
den Nachweis sowohl der Coliformen im Allgemeinen als auch von E.
coli in einer einzigen Probe. Ein Nachteil dieses Tests besteht
darin, dass er für
beide Bakterientypen nicht direkt quantitativ ist, da beide Reagenzien
diffusionsfähige
Pigmente erzeugen. Der Test erfordert außerdem eine spezielle Ausrüstung für die Erzeugung
der Ultraviolett-Strahlung. Außerdem
kann dieser Test nur für
den Nachweis von Coliformen und von E. coli verwendet werden. Andere
wichtige Organismen, wie der Stamm E. coli 0157, der Glucuronidase-negativ
ist, werden nicht nachgewiesen, und Gleiches gilt für andere
Mikroorganismen, die Galactosidase-Glucuronidase nicht erzeugen.
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Das
Kristallviolett-Neutralrot-Galle-Agar-Verfahren (VRBA-Verfahren)
ist verwendet worden, um die Menge sowohl an Coliformen als auch
an E. coli in einer Testprobe zu ermitteln. Das in diesem Verfahren
verwendete Testmedium enthält
Gallensalze (um Nicht-Coliforme zu hemmen), Lactose und den pH-Indikator Neutralrot.
Die Coliforme (eingeschlossen E. coli) wachsen in dem Medium, die
Lactose wird unter Säurebildung
fermentiert, und das Neutralrot nimmt in dem Bereich der Bakterienkolonie
eine ziegelsteinrote Farbe an. Die Ergebnisse dieses Tests lassen
sich nicht immer einfach interpretieren, und für die Ermittlung des Vorhandenseins
von E. coli müssen
Nachfolgetests, wie die Brillantgrün-Lactose-Bouillon-Fermentierung,
das Wachstum in EC-Bouillon bei 44,5 °C und das Ausstreichen auf Eosin-Methylenblau-Agar
(EMBA) durchgeführt
wird. Beim Membranfilter-Verfahren (MF-Verfahren) werden Micropore-Filter
verwendet, durch die Proben hindurch treten, wobei die Bakterien
auf der Oberfläche
des Filters zurückgehalten
werden. Dieses Verfahren wird am häufigsten verwendet, wenn Bakterienpopulationen
sehr klein sind, und eine große
Probe benötigt
wird, um hinreichende Zahlen zu erhalten. Der Filter wird dann auf
der Oberfläche
eines ausgewählten Mediums
angeordnet, inkubiert, und die Bakterienkolonien, die auf der Membranfilteroberfläche wachsen,
werden gezählt
und ausgewertet. Dieses Verfahren findet breite Anwendung und liefert
gute Ergebnisse, wenn es mit geeigneten Reagenzien und Medien kombiniert
wird. Ein Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es teuer
und zeitaufwändig
ist. Es funktioniert auch nicht gut mit festen Proben oder mit Proben,
die eine hohe Zahl von Mikroorganismen enthalten. Das MF-Verfahren
kann in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, das in dieser
Anmeldung beschrieben wird, verwendet werden.
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Das
Reagens 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid
(X-gal) ist eine bekannte Testverbindung für den Nachweis von Coliformen.
Wenn das β-Galactosidaseenzym,
das von den Coliformen produziert wird, auf X-gal einwirkt, bildet
das X-gal einen unlöslichen,
indigoblauen Niederschlag. X-gal kann in ein Nährstoffmedium wie eine Agarplatte,
eingebracht werden, und falls eine Probe, die Coliforme enthält, vorhanden
ist, wachsen die Coliforme als indigoblaue Kolonien. X-gal hat gegenüber der
Verbindung ONPG, die oben beschrieben wird, den Vorteil, dass es
einen wasserunlöslichen
Niederschlag anstelle einer diffu sionsfähigen Verbindung bildet, wodurch
die Durchführung
einer quantitativen Bestimmung der Coliformen ermöglicht wird, wenn
die Testprobe in ein oder auf ein verfestigtes Medium gegeben wird.
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Ein ähnliche
Verbindung, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid (X-gluc) ist eine
bekannte Testverbindung für
den Nachweis von E. coli. Wenn das β-Glucuronidaseenzym, das von
den meisten E. coli-Stämmen erzeugt
wird, darauf einwirkt, bildet X-gluc einen unlöslichen indigoblauen Niederschlag.
X-gluc hat gegenüber
der Verbindung MUG, die oben beschrieben wird, den Vorteil, dass
es einen wasserunlöslichen
Niederschlag bildet, anstelle einer diffusionsfähigen Verbindung, wodurch die
Durchführung
einer quantitativen Bestimmung von E. coli ermöglicht wird, wenn die Testprobe
in ein oder auf ein verfestigtes Medium gegeben wird. Außerdem erfordert
es nicht die Verwendung von Ultraviolettlicht. X-gluc und seine
Fähigkeit,
E. coli nachzuweisen, werden in Watkins et al., Appl. Environ. Microbiol.
54:1874-1875 (1988)
beschrieben. Eine ähnliche
Verbindung, Indoxyl-β-D-glucuronid, die ebenfalls
tiefblaue Kolonien von E. coli erzeugt, wurde in Ley, et al., Can.
J. Microbiol. 34:690-693 (1987) beschrieben.
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Auch
wenn X-gal und X-gluc einzeln genommen brauchbar sind für die quantitative
Bestimmung entweder von Coliformen (X-gal) oder E. coli (X-gluc),
weisen diese Indikatorverbindungen den Nachteil auf, dass sie beide
das gleiche Chromogen enthalten. Daher können sie nicht zusammen verwendet
werden, um sowohl E. coli als auch allgemeine Coliforme in einem
einzigen Test mit einer einzigen Probe zu identifizieren und zu unterscheiden,
da sie beide identisch gefärbte
indigoblaue Kolonien erzeugen. Eine Person, die beide Reagenzien
zusammen verwendet, wäre
imstande, die Gesamtzahl der Coliformen quantitativ zu bestimmen,
das gleiche Ergebnis, als wenn X-gal alleine verwendet würde, aber
sie wäre
nicht imstande, anzugeben, welche der Kolonien E. coli waren und
welche andere Coliforme außer
E. coli waren.
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Ein
vor kurzem entwickeltes Testverfahren für den quantitativen Nachweis
und die Unterscheidung allgemeiner Coliforme und von E. coli in
einer Testprobe wird in dem
US-Patent
Nr. 5,210,022 beschrieben, die auf den Anmelder dieser
Anmeldung übertragen
wurde. Dieses Verfahren verbessert die Verfahren des Standes der
Technik, da es die quantitative Bestimmung allgemeiner Coliforme
und von E. coli in einer einzigen Probe erlaubt. Zusätzliche,
bestätigende
Tests sind nicht erforderlich. Die Testprobe wird zu einem Medium
gegeben, das ein β-Galactosidase-Substrat,
wie 6-Chlorindolyl-β-D-galactosid,
und ein β-Glucuronidase-Substrat,
wie 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid (X-gluc)
enthält.
Das β-Galactosidase-Substrat
ist imstande, bei der Reaktion mit β-Galactosidase einen wasserunlöslichen
Niederschlag mit einer ersten Farbe zu bilden, und das β-Glucuronidase-Substrat ist imstande,
bei der Reaktion mit β-Glucuronidase
einen wasserunlöslichen
Niederschlag mit einer zweiten Farbe, die gegenüber der ersten Farbe kontrastiert,
zu bilden. Als Ergebnis können
allgemeine Coliforme quantifiziert werden, indem die Kolonien mit
der ersten Farbe (die eine β-Galactosidase-Aktivität haben)
ausgezählt
werden, und E. coli kann quantifiziert werden, indem die Kolonien
mit der zweiten Farbe (die sowohl eine β-Galactosidase- als auch β-Glucuronidase-Aktivität haben)
ausgezählt werden.
Obwohl das in dem Patent beschriebene Verfahren hervorragende Ergebnisse
bei der Unterscheidung und dem Nachweis von allgemeinen Coliformen
und von E. coli liefert, ist es nicht imstande, das Vorhandensein
von E. coli 0157-Stämmen und
nicht-coliformen Enterobacteriaceae festzustellen und zu quantifizieren.
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Ein
Verfahren zum Zählen
von E. coli und der Gesamtzahl der Coliformen wird in der PCT-Anmeldung mit
der internationalen Veröffentlichungsnummer
WO 95/30024 offenbart. Dieses
Verfahren schließt
die Verwendung eines β-D-Galactosidase-Substrats
und einer Kohlenstoffquelle, wie Adonit, Esculin, Salicin, Amygdalin,
oder Cellobiose, ein. Sowohl E. coli- als auch Nicht-E. coli-coliforme
Bakterien liefern in Gegenwart des β-D-Galactosidase-Substrats Reaktionsproduktsignale.
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Zusätzlich erzeugen
die nicht-E. coli-coliformen Bakterien ein Reaktionsproduktsignal
in Gegenwart der Kohlenstoffquelle. Das Reaktionsproduktsignal kann
sich als eine Reaktion niedrigerer Intensität, bezogen auf die β-D-Galactosidasereaktion,
in einem lokalen Bereich, offenbaren, oder es kann ein niedrigerer
lokaler pH-Wert oder eine höhere
reduktive Metabolitkonzentration sein. E. coli metabolisiert die
Kohlenstoffquelle nicht und sorgt daher nicht für ein Reaktionsproduktsignal
in dessen Gegenwart. Die PCT-Anmeldung mit der internationalen Veröffentlichungsnummer
WO 95/30024 schlägt außerdem vor,
dass das Verfahren einen Schritt enthalten kann, mit dem eine Kontamination
mit einer Subspezies durch E. coli 0157:H7 ausgeschlossen werden
kann. Das Dokument schlägt
vor, dass ein β-D-Glucuronpyranosid-Substrat
oder Sorbit ausgenutzt werden kann; das Dokument liefert jedoch
keinen Hinweis oder keine spezifischen Beispiele, wie diese Verbindungen
in dem Verfahren verwendet werden könnten. Außerdem ist die Verwendung von
Sorbit chemisch und optisch inkompatibel mit dem Verfahren entgegen
der Beschreibung. Außerdem
können
mindestens einige der pH-Indikatoren (d. h. wie Phenolrot), die
von
WO 95/30024 vorgeschlagen
werden, chemisch und optisch inkompatibel mit dem X-Gluc-Substrat
(β-D-Glucuronpyranosid)
sein, dessen Verwendung mit dem Red-Gal-Galactosidase-Substrat empfohlen
wird.
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Andere
bekannte Verfahren für
den Nachweis und für
die Unterscheidung bestimmter Mikroorganismen basieren auf den Unterschieden,
die die Mikroorganismen im Hinblick auf ihre Fähigkeit zeigen, bestimmte Kohlenwasserstoffe,
wie den Zucker Sorbit, zu fermentieren. Man weiß beispielsweise von allgemeinen
Coliformen und von den meisten Stämmen von E. coli, dass sie
die Fähigkeit
haben, Sorbit zu fermentieren. E. coli 0157 und die meisten nicht-coliformen
Enterobacteriaceae fermentieren Sorbit nicht. Im Ergebnis, wenn eine
Testprobe zu einem fermentierbaren Medium gegeben wird, das Sorbit
als die einzige Kohlenstoffquelle enthält, wie MacConkey-Sorbit-Agar,
in Gegenwart eines geeigneten pH-Indikators, wie Neutralrot, wachsen die allgemeinen
Coliformen und die meisten E. coli-Stämme aufgrund der Säureproduktion
bei der Sorbitfermentation als rote Kolonien, Stämme, die Sorbit nicht fermentieren,
wie E. coli 0157, auf diesem Medium als farblose Kolonien. Da es
jedoch auch viele nicht-sorbit-fermentierende Enterobacteriaceae
gibt, ist es praktisch unmöglich,
E. coli 0157 mit irgendeiner Sicherheit auf diesem Medium nachzuweisen.
Zusätzlich
ist der Test nicht im Stande, E. coli von allgemeinen Coliformen
zu unterscheiden.
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Es
gibt daher einen Bedarf an der Bereitstellung eines Testverfahrens,
das für
die Unterscheidung einer größeren Vielzahl
biologischer Materialien in Proben, die gemischte Populationen enthalten,
brauchbar ist, als dies mit den existierenden Verfahren erreicht
werden kann. Weiterhin gibt es einen Bedarf an Verfahren, die schneller,
einfacher und vielseitiger als die Verfahren des Stands der Technik
sind.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung überwindet
die Nachteile der Verfahren des Standes der Technik, indem sie ein
Testverfahren für
den quantitativen Nachweis und die Unterscheidung biologischer Materialien
in einer Testprobe, die eine Vielzahl verschiedener biologischer
Materialien enthält,
und ein Medium zur Verwendung in dem Testverfahren bereitstellt.
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In
einer ihrer Ausführungsformen
umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren für den Nachweis des
Vorhandenseins und den quantitativen Nachweis und die Unterscheidung
bestimmter biologischer Materialien in einer Testprobe, die eine
Vielzahl verschiedener biologischer Materialien umfasst, wobei ein
erstes biologisches Material eine Enzymspezifität für ein erstes chromogenes Substrat
und ein zweites biologisches Material eine Enzymspezifität für ein zweites
chromogenes Substrat hat, und wobei mindestens einige der biologischen
Materialien imstande sind, ein Kohlenhydrat, wie einen Zucker, zu
fermentie ren. Ein Testmedium, das imstande ist, eine Matrix oder
eine feste Oberfläche
mit der Testprobe zu bilden, wird bereitgestellt. Das Testmedium
umfasst ein erstes chromogenes Substrat, ein zweites chromogenes
Substrat, eine fermentierbare Kohlenstoffquelle, wie einen speziellen
Zucker, einen pH-Indikator und ein Nährstoffgrundmedium. Das erste
chromogene Substrat ist imstande, bei der Umsetzung mit einem Enzym,
das von dem ersten biologischen Material erzeugt wird oder in diesem
vorhanden ist, eine wasserunlösliche
Verbindung mit einer ersten Farbe zu bilden, und das zweite chromogene
Substrat ist imstande, bei der Umsetzung mit einem Enzym, das von dem
zweiten biologischen Material erzeugt wird oder in diesem vorhanden
ist, eine wasserunlösliche
Verbindung mit einer Farbe zu bilden, die gegenüber der ersten Farbe kontrastiert.
Die fermentierbare Kohlenstoffquelle ist imstande, einen Teil des
Mediums bei der Fermentierung durch Zuckerfermentierende Bestandteile der
Testprobe anzusäuern.
Der PH-Indikator verursacht eine dritte Farbe, die als Reaktion
auf die Ansäuerung gebildet
wird, wobei die dritte Farbe eine gefärbte Zone um die Zucker-fermentierenden
Bestandteile umfasst und visuell von der allgemeinen Hintergrundfarbe
des Mediums unterscheidbar ist. Das Nährstoffgrundmedium umfasst
vorzugsweise einen Feststoff, ein Gel oder eine Lösung für die Bildung
eines Feststoffs. Der pH-Wert des Testmediums wird auf einen Bereich
eingestellt, der für
die Farbänderung
des pH-Indikators bei der Ansäuerung
des Mediums förderlich
ist, und anschließend
wird die Testprobe in das Testmedium geimpft. Das Testmedium, das
mit der Testprobe geimpft wurde, wird dann unter Bedingungen inkubiert,
die für
das Wachstum von Kolonien des biologischen Materials förderlich
sind. Die inkubierte Testprobe kann dann untersucht werden: Auf
das Vorhandensein von Kolonien, die die erste Farbe aufweisen und
die die dritte gefärbte
Zone sichtbar wahrnehmbar und unterscheidbar darum herum haben,
wobei diese Kolonien Zucker-fermentierende Kolonien des ersten biologischen
Materials darstellen; auf das Vorhandensein von Kolonien, die eine
zweite Farbe aufweisen und die die dritte gefärbte Zone sichtbar erkennbar
und unterscheidbar darum herum aufweisen, wobei diese Kolonien Zucker fermentierende
Kolonien des zweiten biologischen Materials darstellen, auf das
Vorhandensein von Kolonien, die die erste Farbe haben und die weder
die zweite Farbe noch die dritte gefärbte Zone erkennbar und unterscheidbar
aufweisen, wobei diese Kolonien Kolonien eines dritten biologischen
Materials darstellen; auf das Vorhandensein von Kolonien, die weder
die erste noch die zweite Farbe haben, mit der oder ohne die dritte
gefärbte
Zone, wobei derartige Kolonien Kolonien von mindestens einem vierten
biologischen Material sind; und auf das Vorhandensein von Kolonien,
die eine vierte Farbe haben, mit der oder ohne die dritte gefärbte Zone,
wobei derartige Kolonien Kolonien von mindestens einem fünften biologischen
Material sind. Alle der jeweiligen Kolonien werden dann gezählt, um
die Zahl aller spezifizierten biologischen Materialien, die in der
Testprobe vorhanden sind, zu liefern.
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In
einer anderen Ausführungsform
umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren für das Erkennen des
Vorhandenseins und den quantitativen Nachweis und die Unterscheidung
von E. coli 0157, anderer E. coli-Stämme, die E. coli 0157 nicht
einschließen,
allgemeiner Coliforme und nicht-coliformer Enterobacteriaceae in
einer Testprobe. Ein Testmedium, das imstande ist, eine Matrix oder
eine feste Oberfläche
mit der Testprobe zu bilden, wird bereitgestellt. Das Testmedium
umfasst ein chromogenes β-Galactosidase-Substrat,
das imstande ist, bei der Umsetzung mit β-Galactosidase eine wasserunlösliche Verbindung
mit einer ersten Farbe zu bilden, ein chromogenes β-Glucuronidase-Substrat, das imstande
ist, bei der Umsetzung mit β-Glucuronidase
einen zweiten wasserunlöslichen
Bestandteil mit einer Farbe zu bilden, die sichtbar gegenüber der
ersten Farbe kontrastiert, Sorbit als die einzige fermentierbare
Kohlenstoffquelle, einen pH-Indikator zum Verursachen einer dritten
Farbe, die bei der Ansäuerung
gebildet wird, die aus der Sorbitfermentierung resultiert, wobei die
dritte Farbe eine gefärbte
Zone um die Sorbit-fermentierenden Bestandteile umfasst, die gegenüber der normalen
Hintergrundfarbe des Mediums kontrastiert, und ein Nährstoffgrundmedium.
Der pH-Wert des Testmediums wird auf einen Bereich eingestellt,
der für
die Farbänderung
des pH-Indika tors beim Ansäuern
des Mediums förderlich
ist, und die Probe wird anschließend in das Testmedium geimpft.
Das Testmedium, das die Probe enthält, wird unter Bedingungen
inkubiert, die für
das Wachsturn von allgemeinen Coliformen, E. coli, E. coli 0157
und nicht-coliformen Enterobacteriaceae förderlich ist, um so den ersten
gefärbten
und den zweiten gefärbten
Niederschlag, die den Kolonien entsprechen, zu erzeugen, und eine
Zone mit der dritten Farbe um die Sorbitfermentierenden Bestandteile
zu erzeugen. Das Testmedium kann dann auf das Vorhandensein von Kolonien
untersucht werden, die die erste Farbe und die dritte gefärbte Zone
sichtbar erkennbar und unterscheidbar darum herum aufweisen, wobei
diese Kolonien Kolonien allgemeiner Coliforme sind, die eine β-Galactosidase-Aktivität, jedoch
keine β-Glucuronidase-Aktivität aufweisen
und die Kolonien sind, die Sorbit fermentieren; auf das Vorhandensein
von Kolonien, die eine zweite Farbe und die dritte gefärbte Zone
sichtbar erkennbar und unterscheidbar darum herum aufweisen, wobei
diese Kolonien Kolonien von E. coli sind, die eine β-Glucuronidase-Aktivität und eine β-Galactosidase-Aktivität aufweisen
und die Kolonien sind, die Sorbit fermentieren; auf das Vorhandensein
von Kolonien, die die erste Farbe und weder die zweite Farbe noch
die dritte gefärbte,
erkennbare und davon unterscheidbare Zone aufweisen, wobei diese
Kolonien Kolonien von E. coli 0157 sind, die eine β-Galactosidase-Aktivität, aber
keine β-Glucuronidase-Aktivität aufweisen
und die Kolonien sind, die Sorbit nicht fermentieren; auf das Vorhandensein
von Kolonien, die weder die erste Farbe noch die zweite Farbe haben,
mit oder ohne die dritte gefärbte
Zone, wobei diese Kolonien nicht-coliforme Enterobacteriaceae sind,
die weder eine β-Galactosidase-Aktivität, noch
eine β-Glucuronidase-Aktivität aufweisen, mit
oder ohne die Fähigkeit,
Sorbit zu fermentieren; und auf das Vorhandensein von Kolonien,
die eine vierte Farbe haben, mit oder ohne die dritte gefärbte Zone,
wobei diese Kolonien bestimmte Stämme einiger Gattungen, wie
Salmonella oder Shigella, repräsentieren,
die keine β-Galactosidase-Aktivität aufweisen,
aber eine β-Glucuronidase-Aktivität haben,
mit oder ohne die Fähigkeit,
Sorbit zu fermentieren. All diese Kolonien können dann ausge zählt werden,
um ein Zählergebnis
für alle
ausgewählten
Mikroorganismen zu liefern. Alternativ müssen nur die besonderen Kolonien
von Interesse in der besonderen Testprobe gezählt werden.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst in einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung ein Testmedium für
den Nachweis des Vorhandenseins biologischer Materialien in einer
Testprobe. Das Testmedium umfasst ein erstes chromogenes Substrat,
das ein β-Galactosid
ist, ein zweites chromoges Substrat, das ein β-Glucuronid ist, eine fermentierbare
Kohlenstoffquelle, die Sorbit umfasst, einen pH-Indikator und ein
Nährstoffgrundmedium.
Das erste chromogene Substrat ist bei der Umsetzung mit einem Enzym
des ersten biologischen Materials imstande, eine wasserunlösliche Verbindung
mit einer ersten Farbe zu bilden, und das zweite chromogene Substrat
ist bei der Umsetzung mit einem Enzym des zweiten biologischen Materials
imstande, eine wasserunlösliche
Verbindung mit einer zweiten Farbe zu bilden, die gegenüber der
ersten Farbe kontrastiert. Die fermentierbare Kohlenstoffquelle
ist imstande, einen Teil des Mediums bei der Fermentierung durch
Zucker-fermentierende Bestandteile der Testprobe anzusäuern. Der
pH-Indikator verursacht eine dritte Farbe, die als Reaktion auf
die Ansäuerung
gebildet wird, wobei die dritte Farbe eine gefärbte Zone um die Zucker-fermentierenden
Bestandteile bildet. Das Nährstoffgrundmedium
kann einen Feststoff, ein Gel oder eine Lösung für die Bildung eines Feststoffs
umfassen.
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Das
Verfahren und die Medien der vorliegenden Erfindung erlauben es,
biologische Substanzen gleichzeitig zu züchten, zu isolieren, zu quantifizieren
und nachzuweisen, wie allgemeine E. coli-Stämme, E. coli 0157, andere coliforme
und nicht-coliforme Mitglieder der Enterobacteriaceae-Familie in
einer Probe, die in einer einzigen Petrischale in das Testmedium
eingebracht wird. Eine vorherige Anreicherung der Probe ist nicht
erforderlich, obwohl eine vorherige Anreicherung angewendet werden
kann, wenn dies erwünscht
wird. Die Testergebnisse stehen innerhalb von 24-48 Stunden zur
Verfügung,
und der Test um fast im Wesentlichen die bloße Zugabe der Testprobe zu
dem Medium in der Platte, das Inkubieren des Testmediums und das
Zählen
der jeweiligen Kolonien in der Testprobe. Die meisten anderen Tests
erfordern mehr Schritte und sie erfordern im Allgemeinen einen längeren Zeitraum, über den
die Testergebnisse erhalten werden. Zusätzlich hängt das erfindungsgemäße Verfahren
nicht von einer sorgfältig
kontrollierten Inkubationstemperatur ab.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Das
Verfahren und das Medium der vorliegenden Erfindung erlauben es,
eine Vielzahl ausgewählter biologischer
Materialien in einer Probe aus gemischten Populationen biologischer
Materialien gleichzeitig quantitativ nachzuweisen und zu unterscheiden.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
und Medium sind besonders gut brauchbar für den quantitativen Nachweis
und die Unterscheidung von E. coli 0157 in gemischten mikrobiellen
Proben, mit gleichzeitigem quantitativem Nachweis und Unterscheidung
anderer Stämme
von E. coli, von allgemeinen Coliformen, und von nicht-coliformen
Enterobacteriaceae.
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Mikroorganismen,
die eine β-Galactosidase-Aktivität aufweisen,
schließen
die Mikroorganismen ein, die allgemein unter der Bezeichnung "coliform" bekannt sind. Es
gibt verschiedene Definitionen von "coliform", aber die allgemein akzeptierten Definitionen
schließen
Bakterien ein, die Mitglieder der Familie der Enterobacteriaceae
sind und die die Fähigkeit
haben, den Zucker Lactose unter Entwicklung von Gasen und Säuren zu fermentieren.
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Mikroorganismen,
die eine β-Glucuronidase-Aktivität zusätzlich zur β-Galactosidase-Aktivität aufweisen,
schließen
in erster Linie die meisten Stämme
der Coliforme der Art E. coli mit Ausnahme von E. coli 0157 ein.
E. coli 0157 ist einer von etwa 3 % E. coli-Stämmen, die β-Galactosidase-Aktivität zeigen,
jedoch keine β-Glucuronidase-Aktivität zeigen.
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Der
Ausdruck "allgemeine
Coliforme", wie
er in dieser Anmeldung verwendet wird, bezieht sich auf Coliforme,
die verschieden sind von den verschiedenen Stämmen von E. coli. Diese "allgemeinen Coliforme" sind gram-negativ,
keine Sporen bildende Mikroorganismen, die β-Galactosidase-Aktivität aufweisen
(d. h. sie fermentieren Lactose), jedoch keine β-Glucuronidase-Aktivität aufweisen
und die die Fähigkeit
haben, den Zucker Sorbit zu fermentieren.
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Der
Ausdruck "nicht-coliforme
Enterobacteriaceae",
wie er in dieser Anmeldung verwendet wird, bezieht sich auf Mikroorganismen
der Familie Enterobacteriaceae, die keine β-Galactosidase-Aktivität haben.
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Der
Ausdruck "β-Galactosidase-Substrat", wie er hier verwendet
wird, bezieht sich auf ein β-Galactosid,
das Galactose enthält,
die über
eine β-Bindung
mit einem Substituenten verbunden ist, der einen unlöslichen,
gefärbten
Niederschlag bildet, wenn er durch die Einwirkung von β-Galactosidase
auf das Substrat freigesetzt wird.
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Der
Ausdruck "β-Glucuronidase-Substrat", wie er hier verwendet
wird, bezieht sich auf ein β-Glucuronid,
das Glucuronsäure
enthält,
die über
eine β-Bindung
mit einem Substituenten verbunden ist, der einen unlöslichen,
gefärbten
Niederschlag bildet, wenn er durch die Einwirkung von β-Glucuronidase
auf das Substrat freigesetzt wird.
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Die β-Galactosidase-Substrate
und Verbindungen, die hier als "Galactoside" bezeichnet werden,
sowie die β-Glucuronidase-Substrate
und Verbindungen, die hier als "Glucuronide" bezeichnet werden,
können jeweils
Carboxylatsalze umfassen, die bei der Umsetzung einer passenden
Base mit der geeigneten Carboxygruppe des Galactosids oder der Glucuronsäure gebildet
werden. Geeignete Basen schließen
Alkalimetall- oder Erdalkalimetallhydroxide, Alkalimetall- oder
Erdalkali metallcarbonate ein, zum Beispiel Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid,
Calciumhydroxid, Magnesiumhydroxid und die entsprechenden Carbonate;
und Stickstoffbasen, wie Ammoniak, und Alkylamine, wie Trimethylamin,
Triethylamin und Cyclohexylamin.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung ist so konzipiert, dass es
die unterscheidenden Merkmale, die in bestimmten Mikroorganismen
gefunden werden, ausnützt,
um damit die Mikroorganismen quantitativ nachzuweisen und voneinander
zu unterscheiden. Das Verfahren ist besonders geeignet für den quantitativen Nachweis
und die Unterscheidung der verschiedenen Klassen der zuvor beschriebenen
Mikroorganismen, d. h. von allgemeinen Coliformen, E. coli und von
E. coli 0157 und nicht-coliformen Enterobacteriaceae. Auch wenn
das erfindungsgemäße Verfahren
für die
oben beschriebenen Mikroorganismen besonders gut geeignet ist, ist
es nicht auf den quantitativen Nachweis und die Unterscheidung dieser
speziellen Mikroorganismen beschränkt, da die Techniken Anwendung
bei dem quantitativen Nachweis und der Unterscheidung einer großen Vielzahl
biologischer Materialien finden.
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Die
Abtrennung und der Nachweis von E. coli 0157 von anderen Stämmen von
E. coli ist besonders problematisch gewesen, da alle E. coli-Stämme viele
gemeinsame Merkmale haben. Es gibt jedoch drei Hauptunterschiede,
die eine Grundlage liefern, auf der E. coli 0157 von den anderen
E. coli-Stämmen
unterschieden werden kann. Diese sind das unvorteilhafte Wachstum
von E. coli 0157 bei Temperaturen oberhalb von 42 °C, die Unfähigkeit
von E. coli 0157, das Enzym Glucuronidase zu erzeugen, und die Unfähigkeit
von E. coli 0157, den Zucker Sorbit zu fermentieren. Auch wenn diese
Unterschiede einen allgemeinen Hintergrund für die Verwendung beim Nachweis
und dem Trennen der beiden E. coli-Typen liefern, werden dieser
Nachweis und diese Trennung durch zusätzliche Faktoren erschwert.
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In
gemischten Populationen von Mikroorganismen, die in der Natur gefunden
werden, wie denjenigen, die sowohl E. coli als auch E. coli 0157
enthalten, sind normalerweise auch viele andere nahe verwandte Organismen
vorhanden. Viele dieser Mikroorganismen sind imstande, unter den
gleichen oder ähnlichen
Bedingungen wie die E. coli-Stämme
zu leben und ihren Stoffwechsel durchzuführen. Die meisten der nahe
verwandten Organismen sind Mitglieder aus der Familie der Enterobacteriaceae,
wie dies alle Arten von E. coli sind. Die Enterobacteriaceae sind
gram-negative, keine Sporen bildende, stäbchenförmige Bakterien. Einige der
am besten bekannten Gattungen sind Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter,
Escherichia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Shigella und Yersinia.
Zu dieser Familie gehören
die Gattungen, die üblicherweise
als die coliformen Bakterien bezeichnet werden. Coliforme Bakterien
weisen die allgemeinen gattungsgemäßen Merkmale auf, sie erzeugen
aber zusätzlich
das Enzym Galactosidase, das bei der Fermentierung des Zuckers Lactose
mitwirkt. Die coliforme Gattung Escherichia erzeugt ebenfalls das
Enzym Galactosidase, und zusätzlich
erzeugen die meisten Stämme
dieser Gattung auch das Enzym Glucuronidase. Der Stamm E. coli 0157 ist
jedoch einer von nur etwa 3 % Escherichia coli-Stämme, die
nicht die Fähigkeit
haben, Glucuronidase zu erzeugen.
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Aufgrund
der charakteristischen Ähnlichkeiten
dieser nahe verwandten Bakterien hat es sich als schwierig erwiesen,
E. coli 0157 nachzuweisen und von den anderen Mitgliedern aus der
Familie der Enterobacteriaceae-Familie zu trennen. Im Ergebnis sind
einfach zu studierende und zu formulierende Testmedien für die Durchführung dieses
Nachweises und dieser Trennung, nicht verfügbar gewesen, und es ist im
Allgemeinen notwendig gewesen, zu komplizierten und kostspieligen
Verfahren überzugehen,
die Antigen-Antikörper-Übereinstimmung
oder DNA-Sonden verwenden, um das Vorhandensein von E. coli 0157
in gemischten mikrobiellen Populationen zu ermitteln. Derartige
Techniken sind nicht nur kostspielig und zeitaufwändig, sondern
sie liefern oft auch falsch positive oder falsch negative Ergebnisse.
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Das
in dem
US-Patent Nr. 5,210,022 beschriebene
Verfahren erlaubt den quantitativen Nachweis und die Unterscheidung
von allgemeinen Coliformen und von E. coli. Die Unterscheidung dieser
beiden Mikroorganismen basiert auf der charakteristischen Fähigkeit
der allgemeinen Coliformen, Galactosidase zu erzeugen, und dadurch
bei der Umsetzung mit einem β-Galactosid
einen wasserunlöslichen
Niederschlag mit einer ersten Farbe zu bilden, und der charakteristischen
Fähigkeit
von E. coli, zusätzlich
zur Galactosidase Glucuronidase zu erzeugen und dadurch bei der
Umsetzung mit einem β-Glucuronid
einen wasserunlöslichen
Niederschlag mit einer Farbe zu bilden, die gegenüber der
ersten Farbe kontrastiert.
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Die
vorliegende Erfindung geht über
das in dem
US-Patent Nr. 5,210,022 gelehrte
Verfahren hinaus. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann nicht nur
wie in dem Patent ein quantitativer Nachweis und eine Unterscheidung
von allgemeinen Coliformen und von E. coli, sondern auch des enteropathogenen
E. coli 0157 wie auch von verschiedenen Arten von nicht-coliformen
Enterobacteriaceae durchgeführt
werden. Sorbit und ein geeigneter pH-Indikator werden in ein Testmedium
mit den chromogenen Reagenzien eingebracht. Da einer der Unterschiede
zwischen E. coli 0157 und anderen E. coli die Unfähigkeit
von E. coli 0157 ist, den Zucker Sorbit zu verstoffwechseln, liefert
die Verwendung von Sorbit in dem Testmedium ein Mittel für die Unterscheidung
dieser beiden E. coli-Stämme.
Die chromogenen Reagenzien werden so ausgewählt, dass sie eine Grundlage
für die
quantitative Unterscheidung von Coliformen, die eine β-Galactosidase-Aktivität aufweisen, von
denjenigen Stämmen
von E. coli bieten, die β-Galactosidase-Aktivität zusätzlich zur β-Glucuronidase-Aktivität aufweisen.
Die Aufnahme von Sorbit und des pH-Indikators in das Medium beeinträchtigt diese
quantitative Unterscheidung der Coliformen von E. coli nicht, sondern
erlaubt zusätzlich
den quantitativen Nachweis und die quantitative Unterscheidung von
E. coli 0157 und nicht-coliformer Enterobacteriaceae von allgemeinen Coliformen
und den meisten anderen E. coli. E. coli 0157 kann von den nicht-coliformen Enterobactertaceae aufgrund
der β-Galactosidase-Aktivität von E.
coli 0157 unterschieden werden, einer Aktivität, die in den nicht-coliformen
Enterobacteriaceae nicht vorhanden ist.
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Das
spezifische β-Galactosidase-Substrat
(β-Galactosid)
und das spezifische β-Glucuronidase-Substrat
(β-Glucuronid)
zur Verwendung in dem Testmedium werden so ausgewählt, dass
die von allen Substraten gebildeten Niederschläge kontrastierende Farben aufweisen,
wodurch ein Weg bereitgestellt wird, allgemeine Coliforme von E.
coli zu unterscheiden. Im Ergebnis können Kolonien von Mikroorganismen,
die β-Galactosidase-Aktivität, aber
keine β-Glucuronidase-Aktivität aufweisen,
und Kolonien von Mikroorganismen, die entweder nur die β-Glucuronidase-Aktivität oder sowohl
die β-Galactosidase-
als auch die β-Glucuronidase-Aktivität aufweisen,
visuell unterschieden werden. Die genaue Farbe der einzelnen Typen
von Kolonien von Mikroorganismen ist nicht kritisch, solange alle
Typen unterschieden werden können.
Die Niederschläge
sollten in dem Testmedium unlöslich
sein, so dass die Kolonien von Mikroorganismen, die die Niederschläge bilden, visuell
ausgezählt
werden können.
Weiterhin sollte es sich bei dem β-Galactosid
und dem β-Glucuronid
um Verbindungen handeln, die nahezu farblos oder nicht dunkel gefärbt sind,
damit sie den Nachweis der gefärbten
unlöslichen
Niederschläge,
die durch die Einwirkung von β-Galactosidase
und β-Glucuronidase
erzeugt werden, nicht stören.
Die β-Galactoside
und β-Glucuronide
sollten Verbindungen sein, die in dem Testmedium löslich gemacht
werden können.
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Die
Entscheidung, ob ein gegebenes β-Galactosid
oder β-Glucuronid
in dem Testmedium brauchbar ist, kann durch einen einfachen Test
erfolgen. Das β-Galactosid
oder β-Glucuronid
wird in ein festes Testmedium eingebracht, das dann mit allgemeinen
Coliformen oder E. coli beimpft wird. Wenn in dem Testmedium gefärbte Kolonien
wachsen, kann das spezielle β-Galactosid
oder β-Glucuronid
verwendet werden, vorbehaltlich des folgenden Tests. Ob ein gegebenes β-Galactosid
und ein gegebenes β-Glucuronid
zusammen verwendet werden können,
kann durch das gemeinsame Einbringen der beiden Verbindungen in
ein festes Medium entschieden werden, das dann mit einem Gemisch
aus allgemeinen Coliformen und E. coli beimpft wird und bei einer
geeigneten Temperatur inkubiert wird. Falls die Kolonien von E.
coli und die Kolonien von allgemeinen Coliformen durch einen Farbkontrast
zwischen allen Kolonietypen visuell unterschieden werden können, ist
die spezielle Kombination aus β-Galactosid
und β-Glucuronid
geeignet.
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Eine
geeignete chromogene Verbindung für die Durchführung des
Verfahrens dieser Erfindung ist 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid
(X-gal). X-gal ist ein im Handel erhältliches β-Galactosidase-Substrat, das einen
unlöslichen
Niederschlag bildet, der eine annähernd indigoblaue Farbe hat,
wenn es durch β-Galactosidase
umgesetzt wird. Zulässige β-Glucuronide,
die mit X-gal verwendet werden können, schließen Verbindungen
ein, die einen unlöslichen
Niederschlag bilden, der eine Farbe wie Rot oder Gelb hat, die mit
Indigoblau kontrastiert und die von der indigoblauen Farbe nicht
vollständig
maskiert wird. Ein Beispiel hierfür ist die Verbindung 6-Chlorindolyl-β-D-glucuronid. Diese Verbindung
erzeugt einen unlöslichen
Niederschlag, der eine magentafarbene Farbe aufweist, die mit Indigoblau
kontrastiert und von Indigoblau visuell unterscheidbar ist. Die
Herstellung dieser Verbindung und anderer geeigneter Verbindungen
zur Verwendung in dieser Erfindung wird in dem oben erwähnten
US-Patent Nr. 5,210,022 beschrieben.
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Eine
andere geeignete chromogene Verbindung für die Durchführung des
Verfahrens ist 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid (X-gluc). X-gluc
ist ein im Handel erhältliches β-Glucuronid,
das einen unlöslichen
Niederschlag erzeugt, der eine annähernd indigoblaue Farbe hat,
wenn es durch β-Glucuronidase umgesetzt
wird. Indoxyl-β-D-glucuronid
ist eine ähnliche
Verbindung, deren Herstellung in dem oben erwähnten Artikel von Ley et al.,
in Can J. Microbiol. beschrieben wird. Zulässige β-Galactoside, die mit X-gluc
oder Indoxyl-β-D-glucuronid verwendet
werden können,
schließen
Substrate ein, die einen unlöslichen
Niederschlag bilden, der eine Farbe wie Rot oder Gelb aufweist,
die mit Indigoblau kontrastiert. Ein Beispiel für ein geeignetes β-Galactosid
ist die Verbindung 6-Chlorindolyl-β-D-galactosid. Diese Verbindung
erzeugt einen unlöslichen
Niederschlag, der eine magentafarbene Farbe aufweist, die mit Indigoblau
kontrastiert und von Indigoblau visuell unterscheidbar ist. Die
Herstellung dieser Verbindung wird in dem oben erwähnten
US-Patent Nr. 5,210,022 beschrieben.
Andere geeignete chromogene Verbindungen werden ebenfalls in dem
Patent aufgelistet.
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Es
ist bevorzugt, dass das β-Galactosid
und das β-Glucuronid
so ausgewählt
werden, dass das β-Glucuronid
einen unlöslichen
Niederschlag erzeugt, dessen Farbe dunkler ist als die Farbe des
unlöslichen
Niederschlags, der von dem β-Galactosid
erzeugt wird. Dies ermöglicht
es dem Niederschlag, der von dem β-Glucuronid
erzeugt wird, den Niederschlag zu maskieren, der von dem β-Galactosid
in Kolonien von E. coli erzeugt wird, und macht es für Kolonien
von E. coli einfacher, von Kolonien von allgemeinen Coliformen unterschieden zu
werden. Alternativ kann der Niederschlag, der durch das β-Galactosid
erzeugt wird, durch die Verwendung von mehr von dem β-Glucuronid
und weniger von dem β-Galactosid
maskiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird 6-Chlor-3-indolylgalactosid
als das β-Galactosid
verwendet und 5-Brom-4-chlor-3-indolylglucuronid wird als das β-Glucuronid verwendet.
Wenn diese Substrate in dem Medium verwendet werden, werden Coliforme
durch das Vorhandensein von roten Kolonien nachgewiesen, die durch
das Vorhandensein des Enzym Galactosidase erzeugt werden. E. coli
wird durch die Bildung purpurfarbener (rot und blau) Kolonien nachgewiesen,
die durch das Vorhandensein sowohl von Galactosidase (die rote Kolonien
erzeugt) als auch von Glucuronidase (die blaue Kolonien erzeugt)
in diesen Stämmen
von E. coli nachgewiesen.
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Andere β-Galactoside
und β-Glucuronide,
die verwendet werden können,
schließen
diejenigen ein, die in die allgemeine Kategorie substituierter Indolyl-β-galactoside
und Indolyl-β-glucuronide
fallen. Auch wenn es nicht beabsichtigt ist, die Erfindung auf eine
besondere Theorie oder einen besonderen Mechanismus einzuschränken, wird
angenommen, dass, wenn β-Galactosidase-
und β-Glucuronidase-Substrate,
die substituierte Indolylsubstituenten aufweisen, durch ihre jeweiligen
Enzyme umgesetzt werden, die substituierten Indolylsubstituenten,
die durch die Einwirkung der Enzyme freigesetzt werden, in situ
in unlösliche
Indigoanaloga umgewandelt werden. Wenn beispielsweise 6-Chlorindolyl-β-D-galactosid
durch β-Galactosidase
umgesetzt wird, reagiert das freigesetzte 6-Chlorindolyl mit sich
selbst und bildet 6,6'-Dichlorindigo, einen
magentafarbenen Niederschlag. Dies deutet darauf hin, dass andere
Verbindungen, die 6-Chlorindolyl-β-D-galactosid
oder 6-Chlorindolyl-β-D-glucuronid ähneln, hergestellt
werden könnten
und verwendet werden könnten,
basierend auf symmetrischen Indigoanaloga, die eine Farbe aufweisen,
die 6,6'-Dichlorindigo ähnelt. Über die
Synthese und die Absorptionsspektren symmetrischer Chlorindigos
wurde von Sadler et al., JACS 78, 1251-1255 (1956) berichtet. Es
erscheint darin, dass die Verbindungen 4,4',6,6'-Tetrachlorindigo,
6,6',7,7'-Tetrachlorindigo
und 4,4',6,6',7,7'-Hexachlorindigo
eine ähnliche
Farbe wie 6,6'-Dichlorindigo
haben. Die entsprechenden β-Galactoside,
nämlich
4,6-Dichlorindolyl-β-D-galactosid,
6,7-Dichlorindolyl-β-D-galactosid
und 4,6,7-Trichlorindolyl-β-D-galactosid
und deren Salze könnten
demnach hergestellt werden und als β-Galactosidase-Substrate in gleicher
Weise wie 6-Chlorindolyl-β-D-galactosid
verwendet werden. Andere Galactosidase-Substrate, die für die Verwendung
in der Erfindung geeignet sind, um rötlich gefärbte Niederschläge zu bilden,
schließen 5-Brom-6-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid
und 6-Chlor-3-indolyl-β-D-galactosid
ein. Es ist außerdem
herausgefunden worden, dass bestimmte Naphthyl-substituierte Galactoside,
wie 2-Naphthyl-β-D-galactosid als
Galactosidase-Substrate verwendet werden können, da diese Naphthyl-substituierten
Verbindungen unter den Bedingun gen, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren
angegeben werden, einen roten Niederschlag bilden.
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In ähnlicher
Weise könnten
die entsprechenden β-Glucuronide,
nämlich
4,6-Dichlorindolyl-β-D-glucuronid,
6,7-DichIorindolyl-β-D-glucuronid
und 4,6,7-Trichlorindolyl-β-D-glucuronid
und deren Salze sowie Naphthyl-substituierte Glucuronide, wie Naphthol-AS-BA-β-D-glucuronid,
hergestellt werden und als β-Glucuronidase-Substrate
in gleicher Weise wie 6-Chlorindolyl-β-D-glucuronid verwendet werden.
Andere geeignete Glucuronidase-Substrate, die rötlich gefärbte Niederschläge bilden,
schließen
5-Brom-6-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid
und 6-Chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid
ein. In der Praxis würden
die oben aufgezählten
Glucuronide jedoch nicht mit den aufgezählten Galactosiden verwendet,
weil die gefärbten
Niederschläge,
die durch die jeweiligen Substrate erzeugt werden, nicht leicht
unterschieden werden könnten,
da sie alle das gleiche Chromogen enthalten. In solchen Fällen, in
denen ein rötlicher
Niederschlag durch das Galactosidase-Substrat erzeugt wird, können eher
Glucuronide wie 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid,
Indoxyl-β-D-glucuronid,
4-Chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid, 5-Brom-3-indolyl-β-D-glucuronid
und N-Methyl-3-indolyl-β-D-glucuronid
und deren Salze verwendet werden, da die Niederschläge, die
von diesen Substraten gebildet werden, eine Farbe (im Allgemeinen
Blau oder Grün)
aufweisen, die gegenüber
der Farbe kontrastiert, die von diesen Galactosiden (im Allgemeinen
eine rötliche
Farbe) gebildet wird.
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In ähnlicher
Weise würden,
falls die oben angegebenen Glucuronide verwendet werden, die einen
rötlich
gefärbten
Niederschlag bilden, die ausgewählten
Galactoside diejenigen sein, die Niederschläge bilden, die eine Farbe aufweisen,
die von der Farbe der Niederschläge
unterscheidbar ist, die durch das Glucuronidase-Substrat gebildet
wird. In diesem Fall würden
geeignete Galactoside 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid, 4-Chlor-3-indolyl-β-D-galactosid,
5-Brom-3-indolyl-β-D-glucuronid und N-Methyl-3-indolyl-β-D-galactosid und
deren Salze einschließen.
Die meisten der oben aufgezählten
Verbindungen oder deren Salze können
von kommerziellen Bezugsquellen erhalten werden, wie Inalco Pharmaceuticals,
Inc., Horsham, PA, und Diagnostic Chemicals Limited, Oxford, CT.
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Eine
geeignete Kohlenstoffquelle und ein geeigneter pH-Indikator werden
ebenfalls in das Testmedium eingebracht. Der Zucker Sorbit wird
als Kohlenstoffquelle verwendet, um die Unterscheidung von Sorbitfermentierenden
Mikroorganismen, wie allgemeine Coliforme und E. coli, von Mikroorganismen,
die Sorbit nicht fermentieren, wie E. coli 0157 und einige nicht-coliforme
Enterobacteriaceae, zu ermöglichen.
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Der
pH-Indikator ruft eine gefärbte
Zone hervor, die um diejenigen Kolonien erzeugt wird, die Sorbit unter
Erzeugung einer Säure
fermentieren. Keine Zone wird in der Umgebung der Kolonien erzeugt,
die Sorbit nicht fermentieren. Der pH-Wert des fertigen Mediums
ist kritisch für
die Effektivität
dieses Verfahrens, da der pH-Wert so sein muss, dass der pH-Indikator
die Farbe des Mediums in die gewünschte
Farbe umwandelt. Obwohl verschiedene pH-Indikatoren verwendet werden
können,
ist Phenolrot der bevorzugte Indikator, wenn das Verfahren verwendet
wird, um E. coli 0157 nachzuweisen und von den oben angegebenen
Mikroorganismen zu unterscheiden. Wenn Phenolrot als pH-Indikator verwendet
wird, sollte der pH-Wert innerhalb des Bereichs von etwa 7,0 bis
7,6 und vorzugsweise auf etwa 7,2 eingestellt werden. Durch die
Verwendung von Phenolrot bei diesem pH-Wert wird in der Umgebung
der Sorbit-fermentierenden Mikroorganismen aufgrund der Erzeugung
einer Säure
bei der Fermentierung eine gelbe Zone erzeugt. Der Bereich um die
Mikroorganismen herum, die Sorbit nicht fermentieren, bleibt farblos,
oder in einigen Fällen
wird er rot aufgrund einer kleinen Menge Farbstoff, die aus den
Niederschlägen
heraustritt, die durch das Vorhandensein von Galactosidase gebildet
werden. Andere Indikatoren wie Bromthymolblau (BTB) sind ebenfalls
verwendet worden, um E. coli 0157 nachzuweisen und von E. coli zu
unterscheiden. Wenn andere pH-Indikatoren verwendet werden, müssen die
Reakti onsbedingungen auf den passenden pH-Wert für den speziellen ausgewählten Indikator
eingestellt werden. Zusätzlich
ist es wichtig, wenn ein pH-Indikator ausgewählt wird, einen Indikator auszuwählen, der
beim Ansäuern
oder Alkalischmachen Farben erzeugt, die von den Farben der speziellen,
in dem Testmedium verwendeten Chromogene unterscheidbar sind.
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Es
ist wichtig, die Zuckermenge, die in das Medium eingebracht wird,
zu kontrollieren. Beispielsweise führt eine zu hohe Konzentration
an Sorbit zu einer übermäßigen Säurebildung.
In einem solchen Fall kann eine relativ kleine Zahl säurebildender
Kolonien dafür
sorgen, dass sich das Medium in der gesamten Petrischale gelb verfärbt, wodurch
die Kolonien maskiert werden, die Sorbit nicht verwenden. Die Sorbitmenge
sollte vorzugsweise im Bereich von 2 bis 7 Gramm pro Liter Medium,
am bevorzugtesten bei etwa 5 g/l Medium liegen.
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Für beste
Ergebnisse sollte zusätzlich
ein Überzug
aus dem Medium über
der Probe angeordnet werden, um die Bakterien in der Matrix des
Mediums zu fixieren. Da Kolonien, die auf einer der Luft ausgesetzten Oberfläche des
Mediums wachsen, gegebenenfalls nicht in exakt gleicher Weise wie
diejenigen reagieren, die in das Medium eingebettet sind, führt die
Zugabe eines Überzugs
aus dem Medium zu konsistenteren und genaueren Testergebnissen.
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Herstellung des Testmediums
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Die
Herstellung eines Testmediums zur Verwendung beim quantitativen
Nachweis und der Unterscheidung von E. coli 0157 unter gleichzeitigem
quantitativem Erkennen und Nachweis von E. coli, von allgemeinen coliformen
und nicht-coliformen Enterobacteriaceae in gemischten mikrobiellen
Proben wird im Folgenden beschrieben.
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Das
Testmedium wird erzeugt, indem die ausgewählten Chromogene, d. h. das β-Galactosid
und das β-Glucuronid,
Sorbit und der pH- Indikator
mit einem Nährstoffgrundmedium
kombiniert werden. Sorbit ist der einzige Zucker, der zu dem Medium
gegeben wird, da das Testverfahren von der Fermentierung oder der Nicht-Fermentierung
von Sorbit als einem der Vorgänge
für die
Unterscheidung abhängt.
Wenn Phenolrot als pH-Indikator verwendet wird, ist dieser Indikator
unter neutralen oder alkalischen Bedingungen rot, und er ist gelb
unter sauren Bedingungen, die bei der Fermentierung von Sorbit entstehen.
In einer bevorzugten Ausführungsform
werden auch Gallensalze zu dem Medium gegeben, um das Wachstum vieler
Bakterien, die von den Mitgliedern der Enterobacteriaceae verschieden
sind, zu hemmen, wodurch der Test selektiver gemacht wird.
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Das
Nährstoffgrundmedium
kann ein beliebiges Medium von vielen Kulturmediumsformulierungen sein,
die auf dem Fachgebiet für
die Züchtung
von Mikroorganismen auf dem Fachgebiet bekannt sind. Im Allgemeinen
schließen
derartige Medien Wachstumsnährstoffe,
Puffer, Wasser und einen Gelbildner ein. Mögliche Gelbildner schließen u. a.
Agare, Pektine, Carrageenane, Alginate, Johannisbrotkernmehl, Xanthane,
Guar-Mehl und Gellane ein.
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Das
folgende Beispiel beschreibt die Herstellung eines Testmediums,
das für
die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Die Mengen
der aufgezählten
einzelnen Bestandteile werden für
ein Liter Testmedium angegeben:
| Pepton
(hydrolysiertes Casein) | 10
g |
| Hefeextrakt | 5
g |
| Natriumchlorid | 3
g |
| Gallensalze | 1
g |
| Sorbit | 5
g |
| Phenolrot | 25
mg |
| 5-Brom-4-chlor-3-indolylglucuronid | 75
mg |
| 6-Chlor-3-indolylgalactosid | 150
mg |
| Agar
mit bakteriologischer Qualität | 17
g |
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Die
obigen Bestandteile werden in etwa einem Liter entionisiertem Wasser,
das auf 90-100 °C
erhitzt ist, vermischt. Der pH-Wert der Lösung wird dann mit NaOH oder
Weinsäure
(10 %-ige Lösungen)
auf etwa 7,2 eingestellt. Das Medium wird 15 Minuten bei 121 °C und einem
Druck von 15 Pfund sterilisiert, auf 45 °C abgekühlt und für die Verwendung in sterile
Petriplatten gegossen (20 ml/Platte).
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Ein
Testmedium auf Pektinbasis kann unter Anwendung der gleichen Schritte,
wie sie oben beschrieben werden, hergestellt werden, mit dem Unterschied,
dass 25 g niedrig methoxyliertes Pektin anstelle des Agargummis
als Verfestigungsmedium verwendet werden. Dieses Medium wird bei
Raumtemperatur in Petrischalen gegossen, die eine dünne Gelschicht
enthalten, die Calciumionen enthält,
die sich mit dem Pektin unter Bildung eines festen Gels verbinden.
Ein geeignetes Pektin-Kulturmedium
wird in dem
US-Patent Nr. 4,241,186 und
dem
US-Patent Nr. 4,282,317 beschrieben.
Ein Medium auf Pektin-Basis ist gegenüber einem Standard-Agarmedium
bevorzugt, weil es für
den Anwender die Vorteile der Bequemlichkeit und der Temperaturunabhängigkeit
mit sich bringt. Die Verwendung von Pektin-Medium ist in der Literatur
ausführlich
beschrieben worden, und sie wurde als Ergebnis gemeinschaftlicher
ADAC-Studien sowie anderer veröffentlichter
und betriebsinterner Untersuchungen angenommen. Ein geeignetes Pektin-Medium
zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren ist von RCR Scientific,
Inc., Goshen, Indiana, im Handel erhältlich.
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Obwohl
das Verfahren als ein Verfahren beschrieben worden ist, das in seiner
bevorzugten Ausführungsform
ein festes Pektin- oder Agarmedium verwendet, muss das Medium nicht
notwendigerweise in fester Form vorliegen. Beispielsweise kann eine
Einlage als Absorptionsmittel in einer Petrischale angeordnet werden,
und ein flüssiges
Medium, das alle zuvor beschriebenen erforderlichen Nährstoffe
und Reagenzien enthält,
wird so zugegeben, dass es von der Einlage absorbiert wird. Die
als Absorptionsmittel verwendete Einlage bildet liefert eine feste Oberfläche, auf
der die Mikroorganismen als getrennte Koloniebildende Einheiten
wachsen können,
die denjenigen ähneln,
die sich auf einem Medium entwickeln, das mit Agar oder anderen
Verfestigungsmitteln verfestigt ist.
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Beimpfen des Testmediums mit
der Probe
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Das
Testmedium kann mit der zu untersuchenden Probe unter Anwendung
jedes beliebigen Verfahrens beimpft werden, das auf dem Fachgebiet
für das
Beimpfen eines Mediums mit einer Probe, die Mikroorganismen enthält, bekannt
ist. Beispielsweise kann die zu untersuchende Probe vor der Zugabe
des Mediums in die Petrischale gegeben werden, oder die Probe kann
zu dem nichtverfestigten Medium gegeben werden, bevor dieses in
die Schalen gegossen wird (Gießplattierungstechnik – "pour plate technique"). Wenn die Gießplattierungstechnik
verwendet wird, wird eine Überzugsschicht
zugegeben, nachdem sich das Medium in der Schale verfestigt hat.
Alternativ kann die Testprobe auf der Oberfläche der Platten verteilt werden,
nachdem die Platten abgekühlt
sind und sich verfestigt haben, und anschließend kann sie mit einer Überzugsschicht
bedeckt werden (Ausstreichplattierungstechnik – "swab" bzw. "streck plate technique").
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann außerdem
in Kombination mit dem oben beschriebenen Membranfilter-Verfahren
(MF-Verfahren) verwendet werden. Bei diesem Verfahren wird die Probe,
die in den meisten Fällen
eine wässrige
Lösung
umfasst, die das nachzuweisende biologische Material enthält, durch
einen Micropore-Filter filtriert, wobei die biologischen Materialien
auf der Oberfläche
des Filters festgehalten werden. Der Filter wird dann in einer Petrischale
auf der Oberfläche
des für
die Inkubation vorgesehenen Mediums angeordnet, um es den biologischen
Materialien auf der Oberfläche
zu ermöglichen,
zu sichtbaren Kolonien heranzuwachsen. Das Medium in der Petrischale
kann vorverfestigtes Agarmedium oder vorverfestigtes Medium auf
Pektinbasis oder alternativ eine Einlage als Absorptionsmittel sein, die
mit dem flüssigen
Medium getränkt ist,
das die erforderlichen Nährstoffe
und Reagenzien enthält.
Letztere Vorgehensweise erlaubt es, das erfindungsgemäße Verfahren
ohne ein gesondertes Verfestigungsmittel in dem Medium zu verwenden,
und stellt dennoch eine harte Oberfläche bereit, auf der sich die
biologischen Materialien entwickeln können, so dass sie als deutliche,
getrennte Kolonie-bildende Einheiten wachsen können, die den Einheiten ähneln, die
sich auf einem Medium entwickeln, das mit Agar oder anderen Mitteln
verfestigt worden ist.
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Inkubation des Testmediums
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Das
beimpfte Testmedium wird über
einen ausreichenden Zeitraum und bei einer ausreichenden Temperatur
inkubiert, um es den einzelnen Mikroorganismen, die in der Probe
vorhanden sind, zu ermöglichen,
zu nachweisbaren Kolonien zu wachsen. Geeignete Inkubationsbedingungen
für das
Wachstum von Mikroorganismen in einem Medium sind auf dem Fachgebiet
wohl bekannt. Für
den quantitativen Nachweis und die quantitative Unterscheidung von
E. coli 0157 in der beschriebenen Weise wird das Testmedium vorzugsweise etwa
24-48 Stunden bei einer Temperatur von etwa 30-40 °C inkubiert.
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Die
Selektivität
des Verfahrens kann gewünschtenfalls
weiter verbessert werden, indem die Inkubationstemperatur auf 42 °C anstelle
eines Wertes im Bereich von 30-40 °C eingestellt wird. E. coli
(eingeschlossen der Stamm 0157) wächst gut bei 42 °C, diese
Temperatur wirkt jedoch hemmend auf das Wachstum vieler anderer
verwandter Mikroben. Die Verwendung dieser höheren Temperatur kann für verbesserte
Ergebnisse für
bestimmte Mikroorganismen sorgen, indem die Selektivität verbessert
wird, gleichzeitig nimmt jedoch die Gesamtbrauchbarkeit des allgemeinen
Mediums ab, da es keinen genauen Hinweis auf das Vorhandensein bestimmter
anderer mikrobieller Arten gibt.
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Soweit
keine Inhibitoren der allgemeinen mikrobiellen Population verwendet
werden, wächst
auch die allgemeine mikrobielle Population (zusätzlich zu den nicht-coliformen
Enterobacteriaceae, den allgemeinen Coliformen, E. coli und E. coli
0157) in dem inkubierten Testmedium. Da die von den allgemeinen
Coliformen und den verschiedenen E. coli-Stämmen verschiedenen Mikroorganismen
selten β-Galactosidase
oder β-Glucuronidase
erzeugen, zeigen sich die meisten Mikroorganismen der allgemeinen
mikrobiellen Population normalerweise auf einer Standard-Agargießplatte
als weiße
oder farblose Kolonien.
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Untersuchung des Testmediums
und Auszählung
der Mikroorganismen
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Allgemeine
Coliforme erzeugen β-Galactosidase,
die auf das β-Galactosid
in dem Testmedium einwirkt, was zur Folge hat, dass das β-Galactosid
einen unlöslichen
Niederschlag bildet, der eine Farbe aufweist, die sich nach dem
speziellen verwendeten β-Galactosid
richtet. Da der gebildete Niederschlag in dem Testmedium unlöslich ist,
bleibt er in der unmittelbaren Umgebung der β-Galactosidase-erzeugenden Mikroorganismen.
Da sich diese Mikroorganismen unter Bildung von Kolonien vermehren,
haben die Kolonien die Farbe, die von dem β-Galactosid erzeugt wird.
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Da
die meisten Stämme
von E. coli sowohl β-Galactosidase
als auch β-Glucuronidase erzeugen,
werden unlösliche
Niederschläge
sowohl vom β-Galactosid
als auch vom β-Glucuronid
erzeugt durch die Einwirkung der jeweiligen Enzyme. Die Kolonien
von E. coli zeigen sich als Kolonien, die eine Farbe aufweisen,
die verschieden von der Farbe der Kolonien der allgemeinen Coliformen
sind und gegenüber
dieser Farbe kontrastieren aufgrund des Vorhandensein des kontrastierend
gefärbten
unlöslichen
Niederschlags des β-Glucuronids.
E. coli 0157 reagiert, da es einer von den 3 % E. coli-Stämmen ist,
die Glucuronidase-negativ sind, in gleicher Weise wie die allgemeinen
Coliformen und verursacht die Bildung eines unlöslichen Niederschlags, der
die gleiche Far be wie der Niederschlag aufweist, der von den allgemeinen
Coliformen gebildet wird.
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Die
Kolonien derjenigen Mikroorganismen, die Sorbit fermentieren, werden
infolge der Säure,
die bei der Sorbitfermentierung entsteht, weiter verändert. In
der Umgebung dieser Sorbit-fermentierenden Kolonien wird eine Zone
erzeugt, die in Übereinstimmung
mit dem speziellen verwendeten pH-Indikator und dem pH-Wert des
Reaktionsmediums gefärbt
ist. Keine Zone wird in der Umgebung der Kolonien erzeugt, die Sorbit nicht
fermentieren, wie E. coli 0157.
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Da
die spezifischen Chromogene, nämlich β-Galactosidase
und β-Glucuronid,
und der spezifische pH-Indikator so ausgewählt werden, dass die bei der
Inkubation resultierenden Farben einen sichtbaren Kontrast liefern,
können
die vorhandenen Kolonien jedes Typs von Mikroorganismen visuell
unterschieden werden. Wenn beispielsweise 6-Chlor-3-indolylgalactosid
als β-Galactosid
verwendet wird, 5-Brom-4-chlor-3-indolylglucuronid
als β-Glucuronid
verwendet wird und Phenolrot als pH-Indikator in dem Testmedium
verwendet wird, erscheinen E. coli 0157-Kolonien in dem inkubierten
Medium als rote Kolonien (CFU), die von einer merklichen rötlichen
Trübung
um die Kolonie herum umgeben sind. Die rötliche Trübung um diese Kolonien herum wird
von einer kleinen Menge Enzym verursacht, die in das Medium, das
die Kolonie umgibt, hinauswandert, wobei dieses Hinauswandern einen
schwach gefärbten
roten Hof um die Kolonie erzeugt, und sie wird nicht infolge eines
Farbwechsels des pH-Indikators erzeugt. Andere E. coli-Kolonien
erscheinen als purpurfarbene (resultierend von der Kombination von
roten und blauen Kolonien) Kolonien (CFU), die von einer gelben
Zone umgeben sind, die durch die Reaktion des pH-Indikators auf
die Säure,
die bei der Fermentierung entsteht, hervorgerufen wird. Allgemeine
Coliforme erscheinen als rote Kolonien (CFU), die von einer gelben
Zone umgeben sind. Einige nicht-coliforme Enterobacteriaceae, wie
die meisten Salmonella-Stämme
erscheinen als farblose oder weiße Kolonien (CFU), die von
einer gelben Zone umgeben sind, da die meisten Salmonella Sorbit
unter Säurebildung
fermentieren, aber weder Galactosidase noch Glucuronidase erzeugen.
Bestimmte Stämme
einiger Gattungen, wie Salmonella oder Shigella, wachsen als hellblaue
Kolonien aufgrund der Erzeugung von Glucuronidase (aber nicht Galactosidase).
Andere Enterobacteriaceae, wie Proteus, erscheinen als farblose
Kolonien ohne jegliche Zone, die diese Kolonien umgibt, aufgrund
des Fehlens entweder der Produktion beider Enzyme oder der Fermentierung
von Sorbit unter Säurebildung.
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Die
Kolonien aller Typen von Mikroorganismen können dann durch Zählen der
Kolonien mit der jeweiligen Farbkombination oder durch die Anwendung
anderer Verfahren, die auf dem Fachgebiet für das Auszählen von Mikroorganismen auf
einer Testplatte bekannt sind, ausgezählt werden. Die Anzahl der
Kolonien jedes Typs weist auf die Anzahl der Mikroorganismen jeden
Typs hin, die ursprünglich
in der Probe vor der Inkubation enthalten war. Die Vielseitigkeit
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ermöglicht
den quantitativen Nachweis und die Unterscheidung von genau so vielen
der biologischen Materialien, wie sie in der speziellen Testprobe von
Interesse sein können.
Wenn in einer speziellen Probe beispielsweise nur allgemeine Coliforme,
E. coli und E. coli 0157 von Interesse sind, können die Kolonien, die diesen
Bakterien entsprechen, ausgezählt
werden, und in diesem Fall ist es nicht erforderlich, auch die Kolonien
anderer biologischer Materialien, wie Salmonella, Shigella und Proteus,
auszuzählen.
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Es
soll demnach verstanden werden, dass die Erfindung, so wie sie beschrieben
wird, verwendet werden kann, um vielfältige Typen von Mikroorganismen
in einer eirizigen Testprobe quantitativ nachzuweisen und zu unterscheiden,
indem einfach verschiedene Farbkombinationen unterschieden werden,
die als Ergebnis von kontrollierten Reaktionen, an denen diese Mikroorganismen
beteiligt sind, gebildet werden.
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Optionale Bestandteile
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
erfordert keine Inhibitoren. Wie jedoch festgestellt wurde, kann
das Medium selektiver gemacht werden, wenn es für den Nachweis und die Differenzierung
biologischer Materialien, wie allgemeiner Coliforme, E. coli und
E. coli 0157 verwendet wird, indem verschiedene Verbindungen zugegeben
werden, von denen bekannt ist, dass sie die allgemeine mikrobielle
Population hemmen, jedoch nur geringfügige oder keine Auswirkungen
auf Coliforme haben. Beispielsweise können Substanzen wie Galle, Natriumlaurylsulfat,
Desoxycholate und/oder Polyglycolether zu dem Medium gegeben werden,
um das Wachstum von Bakterien, die in dem speziellen Test nicht
von Interesse sind, zu hemmen. Vorgeschlagene Konzentrationen dieser
Verbindungen pro Liter Medium sind: a) Gallensalze, etwa 1,0 g/Liter,
b) Natriumlaurylsulfat (etwa 0,2 g/Liter), c) Natriumdesoxycholat,
etwa 0,2 g/Liter, d) Polyglycolether, etwa 0,1 ml/Liter. Die Zugabe
von einer oder mehreren dieser Verbindungen kann den Hintergrund
der vorhandenen Mikroorganismen (Nicht-Enterobacteriaceae) verringern,
wodurch eine weniger voll belegte Platte erhalten wird, und sie kann
die Möglichkeit
einer Hemmung oder einer Störung
durch die Nicht-Enterobacteriaceae-Organismen in der Probe verringern.
Es ist auch möglich,
das Vorhandensein einiger Nicht-E. coli-Enterobacteriaceae und/oder
Coliforme durch die Zugabe von Chemikalien wie Acriflavin, und/oder
Antibiotika, wie Cefsulodin, Cefoxim, Novobiocin und ähnlicher
hemmender Verbindungen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, zu
beseitigen. Wie mit den obigen Inhibitoren verringert dieser Ansatz
jedoch die Fähigkeit
des Mediums, diejenigen Mikroorganismen, die durch diese Materialien
gehemmt oder entfernt werden, durchzumustern und zu quantifizieren.
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Es
ist auch möglich,
die Enzymerzeugung der allgemeinen Coliformen durch die Zugabe von
sehr kleinen Mengen Enzym-Induktoren zu verstärken. Ein spezieller Induktor
für β-Galactosidase
ist beispielsweise im Handel erhältlich
und ist chemisch als Isopropyl-β-D-thiogalactopy ranosid
(IPTG) bekannt. Die Zugabe von etwa 150 mg IPTG pro Liter Medium
hat eine positive und merkliche Wirkung auf die Geschwindigkeit
der Enzymerzeugung für
einige Arten von Coliformen.
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Beispiel
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Es
wurden Testplatten hergestellt, die die in der oben angegebenen
Formulierung aufgezählten
Bestandteile enthalten, jedoch unter Ersatz des Agars durch Pektin
als Gelbildner. Das Medium wurde mit den jeweiligen, in der folgenden
Tabelle angegebenen Bakterien beimpft.
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Die
Tabelle beschreibt die Art und Weise, in der E. coli 0157, allgemeine
Coliforme, E. coli und die nicht-coliformen Enterobacteriaceae,
Proteus und Salmonella, unterschieden werden können, wenn das in dem obigen
Beispiel beschriebene Testmedium verwendet wird. Wie in der Tabelle
gezeigt wird, können,
wenn das erfindungsgemäße Testmedium
in einem Test für
den Nachweis oder die Unterscheidung von E. coli 0157 in einer Probe
verwendet wird, die allgemeine Coliforme oder E. coli und nicht-coliforme
Enterobacteriaceae, Proteus und Salmonella, enthält, visuelle Unterscheidungen
für jede
der spezifischen Kolonien der jeweiligen Mikroorganismen getroffen
werden. Die Vielseitigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens ist mit dem
anderen, in der Tabelle beschriebenen Testmedien nicht möglich. VERGLEICHSMEDIEN
| Medium
Nr. | (1) | (2) | (3) | (4) | (5) | (6) |
| ECO157 | rot
rote Trübung | rot
rote Zone | weiß keine Zone | weiß | blau | weiß |
| Andere E. coli (meistens) | purpurfarben gelbe Zone | rot gelbe Zone | blau | rot | blau | blau |
| gelbe Zone |
| Coliforme (meistens) | rot gelbe Zone | rot gelbe Zone | weiß | rot | blau | weiß |
| gelbe Zone |
| Proteus (meistens) | weiß keine Zone | weiß keine Zone | weiß keine Zone | weiß | weiß | weiß |
| Salmonella (meistens) | weiß gelbe Zone | weiß gelbe Zone | weiß | weiß o. rot | weiß o. rot | weiß o. rot |
| gelbe Zone | | |
- (1) Oben angegebene Formulierung des Mediums.
- (2) Oben angegebene Formulierung des Mediums ohne 5-Brom-4-chlor-3-indolylglucuronid.
- (3) Oben angegebene Formulierung des Mediums ohne 6-Chlor-3-indolylgalactosid.
- (4) MacConkey-Sorbit-Standardformulierung.
- (5) MacConkey-Sorbit plus 5-Brom-4-chlor-3-indolylgalactosid.
- (6) MacConkey-Sorbit plus 5-Brom-4-chlor-3-indolylglucuronid.
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Auch
wenn diese Erfindung primär
im Hinblick auf ihre bevorzugte Ausführungsform beschrieben worden
ist, ist es dem Fachmann unmittelbar ersichtlich, dass die vorliegende
Erfindung weiter abgewandelt werden kann, um den Nachweis und die
Unterscheidung anderer biologischer Materialien, die in Proben gemischter
Populationen enthalten sind, zu ermöglichen. Diese Anmeldung ist
daher so gedacht, dass sie beliebige Veränderungen, Verwendungen oder
Anpassungen die Erfindung, die ihre allgemeinen Prinzipien anwenden, abdeckt.
Die erfindungsgemäße Technik
kann beispielsweise verwendet werden, um eine große Vielzahl
biologischer Materialien quantitativ nachzuweisen und zu unterscheiden,
solange diese biologischen Materialien Unterschiede hinsichtlich
der Enzymspezifität
zeigen und mindestens einige der biologischen Materialien Unterschiede
hinsichtlich ihrer jeweiligen Fähigkeiten
zeigen, verschiedene Kohlenwasserstoffe bei einem ausge wählten pH-Wert
in Gegenwart eines geeigneten pH-Indikators zur Verwendung bei dem
pH-Wert zu fermentieren. Bei der praktischen Durchführung der
vorliegenden Erfindung muss man nur feststellen, dass die speziellen
Chromogene, die für
die visuelle Unterscheidung verwendet werden sollen, bei der Umsetzung
mit den jeweiligen Enzymen unterscheidbare Farben liefern, und man
muss einen geeigneten Kohlenwasserstoff und einen geeigneten pH-Indikator
so auswählen,
dass noch eine weitere visuell unterscheidbare Farbe bei der Fermentierung
des Kohlenwasserstoffs unter den geeigneten Reaktionsbedingungen
für den
pH-Indikator erzeugt wird.
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Zusätzlich zu
dem oben Beschriebenen ist die vorliegende Anmeldung so gedacht,
dass sie solche Abwandlungen von der vorliegenden Offenbarung einschließt, die
einem bei der bekannten und gewöhnlichen Praxis
auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, einfallen und die innerhalb
der Grenzen der beigefügten
Ansprüche
liegen.