MX2014007888A - Metodo para detectar un microorganismo de salmonella. - Google Patents

Abstract

Se proporciona una composición para detectar un microorganismo Salmonella en una muestra. La composición comprende al menos un primer agente selectivo que inhibe el crecimiento de microorganismos Grampositivos, un primer sistema indicador diferencial que comprende al menos un primer compuesto indicador diferencial que es convertido a un primer producto detectable por un microorganismo Salmonella, y un segundo sistema indicador diferencial que comprende un segundo compuesto indicador diferencial que es convertido por la actividad de la enzima ureasa a un segundo producto detectable. Opcionalmente, la composición puede comprender un tercer sistema indicador diferencial que comprende un tercer compuesto indicador diferencial que es convertido por una actividad de enzima ß-galactosidasa a un tercer producto detectable. Se proporcionan también los métodos de uso de la composición para detectar un microorganismo Salmonella.

Description

METODO PARA DETECTAR UN MICROORGANISMO DE SALMONELLA Antecedentes de la Invención La familia Enterobacteriaceae incluye un gran número de bacterias facultativamente anaeróbicas, metabólicamente diversas, que son capaces de fermentar azúcares (por ejemplo, glucosa) a ácido láctico y/u otros productos finales ácidos. La familia incluye varios patógenos humanos bien conocidos tales como Escherichia coli, diversas subespecies de Salmonella, Yersinia pestls, varias especies de Klebsiella, y varias especies de Shigella .

El género Salmonella incluye dos especies, S. entérica y S. bongori, que incluyen subespecies capaces de provocar enfermedad en humanos. Algunas de las Salmonellas patógenas pueden ser transmitidas a humanos vía la ingestión de alimentos o bebidas contaminadas. La detección de los microorganismos Salmonella en muestras de alimentos puede ser difícil debido a la presencia de números relativamente bajos de los microorganismos Salmonella en la muestra, la presencia de números relativamente altos de microorganismos entéricos no Salmonellas, estrechamente relacionados en la muestra, y/o la presencia de materiales no microorganismos (por ejemplo, partículas de alimento o sustancias químicas solubles) en la muestra, que interfieren con el crecimiento o la detección de los microorganismos Salmonella.

Ref. 249605 Una variedad de medios de cultivos microbiológicos selectivos y/o diferenciales han sido desarrollados para detectar los microorganismos Salmonella en una muestra y para distinguirlos de uno o de más microorganismos no Salmonella . Típicamente, estos medios de cultivo incluyen un agente selectivo que inhibe el crecimiento de los microorganismos no entéricos. Además, muchos de estos medios de cultivo confían en uno o más sistemas indicadores diferenciales para distinguir entre los microorganismos Salmonella y no Salmonella .

A pesar de la variedad de medios de cultivo microbiológicos para detectar los microorganismos Salmonella en una muestra, sigue existiendo una necesidad para métodos mejorados para detectar un microorganismo Salmonella en una muestra.

Breve Descripción de la Invención En general, la presente descripción se refiere a las composiciones y métodos para detectar una presencia o ausencia de un microorganismo Salmonella en una muestra de prueba. En particular, la composición facilita el crecimiento de los microorganismos Salmonella e incluye al menos un agente selectivo que inhibe el crecimiento de los microorganismos Gran positivos. Además, la composición incluye al menos dos sistemas indicadores di erenciales. Al menos uno de los sistemas indicadores diferenciales diferencia positivamente los microorganismos Salmonella de los microorganismos no Salmonella y al menos uno de los sistemas indicadores diferenciales diferencia negativamente los microorganismos Salmonella de los microorganismos no Salmonella.

En un aspecto, la presente descripción proporciona una composición. La composición puede comprender un medio de cultivo semi-sólido que incluye un agente de gelificación, al menos un primer agente selectivo que inhibe el crecimiento de los microorganismos Grampositivos , un primer sistema indicador diferencial que comprende al menos un primer compuesto indicador diferencial, y un segundo sistema indicador diferencial que comprende un segundo compuesto indicador diferencial que es convertido por la actividad de la enzima ureasa a un segundo producto detectable. El primer compuesto indicador diferencial es capaz de ser convertido por una pluralidad de miembros del género Salmonella a un primer producto detectable . El primer compuesto indicador diferencial no puede ser convertido al primer producto detectable por una pluralidad de géneros de los microorganismos entéricos Gramnegativos no Salmonella, que forman colonias detectables en y/o sobre el medio de cultivo.

En cualquier modalidad de la composición, el primer compuesto indicador diferencial puede comprender un compuesto seleccionado del grupo que consiste de melibiosa, 2-desoxi-D- ribosa, manitol, L-arabinosa, dulcitol, maltosa, L-ramnosa, trehalosa, D-xilosa, sorbitol, y una combinación de cualesquiera dos o más de los compuestos anteriores. En cualquiera de las modalidades anteriores, la composición puede comprender además un agente amortiguador. El agente amortiguador puede ser seleccionado del grupo que consiste de MOPS, una sal de fosfato, TES, HEPES, y combinaciones de los mismos .

En cualquiera de las modalidades anteriores, la composición puede comprender además un tercer sistema indicador diferencial que comprende un tercer compuesto indicador diferencial que es convertido por una actividad de enzima ß-galactosidasa un tercer producto detectable. En cualquier modalidad, el tercer compuesto indicador diferencial puede comprender un sustrato de enzima cromogénica. En cualquier modalidad, el tercer compuesto indicador diferencial puede ser seleccionado del grupo que consiste de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranósido; 5 -bromo- 6 -cloro- 3 - indolil-p-D-galactopiranósido ; o-nitrofenil-P-D-galactopiranosido; o-nitrofenil -ß-D-galactopiranósido; p-nitrofenil-p-D-galactopiranósido ; 3,4-ciclohexenesculetin--D-galactopiranósido; y 6-cloro-3-indolil--D-galactopiranósido .

En cualquiera de otras modalidades anteriores, al menos un primer agente selectivo puede ser seleccionado del grupo que consiste de sales biliares, ácido cólico, ácido desoxicólico, cristal violeta o una combinación de cualesquiera dos o más de los compuestos anteriores. En cualquiera de las modalidades anteriores, el indicador de pH puede ser seleccionado del grupo que consiste de rojo de fenol, rojo de clorofenol, rojo neutro, azul de bromotimol y púrpura de bromotimol.

En cualquiera de las modalidades anteriores, la composición puede comprender además al menos un segundo agente selectivo que inhibe el crecimiento de al menos un microorganismo entérico Gram negativo que no es un miembro del género Salmonella . Al menos un segundo agente selectivo puede ser seleccionado del grupo que consiste de un antibiótico de ß-lactama, un antibiótico aminoglucósido, un antibiótico de quinolona, un antibiótico sulfa, un antibiótico de polimixina, y una combinación de cualesquiera dos o más de los antibióticos anteriores; en donde la concentración de al menos un segundo agente selectivo se selecciona para permitir el crecimiento de un microorganismo Salmonella. En cualquiera de las modalidades anteriores, el agente de gelificación se selecciona del grupo que consiste de agar, agarosa, pectina, gelatina, goma guar, goma de xantano, goma de algarrobo, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, alcohol polivinílico, algina, y una combinación de cualesquiera dos o más de los agentes de gelificación anteriores.

En otro aspecto más, la presente descripción proporciona un método para detectar un microorganismo Salmonella . El método puede comprender la provisión de una muestra de prueba, un dispositivo de cultivo, y la composición de cualquiera de las modalidades anteriores; la puesta en contacto en el dispositivo de cultivo la composición y la muestra de prueba para formar un dispositivo de cultivo inoculado; la incubación del dispositivo de cultivo inoculado por un primer periodo de tiempo; y la observación del dispositivo de cultivo para detectar un primer producto detectable, en donde el primer producto detectable es una primera indicación de una presencia de un microorganismo Salmonella.

En cualquier modalidad del método, la detección del primer producto detectable puede comprender la observación de una reacción del indicador de pH con un compuesto ácido producido por una bacteria. En cualquier modalidad, el método puede comprender además la observación del medio nutritivo para detectar un segundo producto detectable, en donde el segundo producto detectable indica una presencia de un microorganismo no Salmonella. La detección de un segundo producto detectable puede comprender la observación de una reacción del indicador de pH con un compuesto básico producido por una bacteria. En cualquier modalidad," el método puede comprender además la observación del medio nutritivo para detectar un tercer producto detectable, en donde el tercer producto detectable indica una presencia de un microorganismo no Salmonella. La detección del tercer producto detectable puede comprender la detección de un producto coloreado producido por la actividad de la enzima ß-galactosidasa .

En cualquiera de las modalidades anteriores, el método puede comprender además la provisión de un artículo con un compuesto indicador confirmatorio que puede ser metabolizado por un microorganismo Salmonella a un cuarto producto detectable, en donde el cuarto producto detectable puede ser distinguido del primer producto detectable, el segundo producto detectable, y el tercer producto detectable, si está presente; poniendo en contacto el artículo con el medio de cultivo; incubando el dispositivo por un segundo periodo de tiempo; y observando el dispositivo de cultivo para detectar el cuarto producto detectable; en donde la detección del cuarto producto detectable yuxtapuesto con el primer producto detectable es una segunda indicación de la presencia en la muestra de un microorganismo Salmonella.

En cualquiera de las modalidades anteriores, el método puede comprender además el conteo de un número de colonias de un primer tipo de microorganismos. En cualquier modalidad, el método puede comprender además el conteo de un número de colonias de un segundo tipo de microorganismos. En cualquier modalidad del método, la observación del dispositivo de cultivo puede comprender la observación del dispositivo de cultivo visualmente. En cualquier modalidad del método, la observación del dispositivo de cultivo puede comprender la creación de una imagen del dispositivo de cultivo utilizando un dispositivo de formación de imagen. En cualquier modalidad, el método puede comprender además el análisis de la imagen utilizando un procesador.

Las palabras "preferido" y "preferentemente" se refieren a modalidades de la invención que pueden proporcionar ciertos beneficios, bajo ciertas circunstancias. No obstante, otras modalidades pueden ser también preferidas, bajo las mismas u otras circunstancias. Además, la indicación de una o más modalidades preferidas no implica que otras modalidades no sean útiles, y no se pretende excluir otras modalidades del alcance de la invención.

"Microorganismo Salmonella" , como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier microorganismo que pertenezca al género Salmonella .

"Sistema indicador diferencial", como se utiliza en la presente, se refiere a uno o más compuestos que son utilizados para distinguir dos tipos de microorganismos con base en la habilidad respectiva del género para convertir al menos uno de los compuestos (denominado en la presente como un "compuesto indicador diferencial") a un producto detectable. En algunos casos, por ejemplo, el compuesto indicador diferencial (por ejemplo, 2-nitrofenil-ß-?-galactósido) puede ser convertido por un tipo de microorganismo directamente al producto detectable (por ejemplo, 2 -nitrofenol ) . En algunos casos, por ejemplo, el compuesto indicador diferencial (por ejemplo, 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-a-D-galactopiranósido) puede ser convertido por un tipo de microorganismo a un producto intermediario que, en presencia de aire puede reaccionar para formar el producto detectable (un tipo de colorante índigo) . En algunos casos, por ejemplo, el compuesto indicador diferencial (por ejemplo, un carbohidrato fermentable tal como melibiosa) puede ser convertido por un tipo de microorganismo al producto detectable (por ejemplo, ácido láctico) , el cual puede reaccionar con otro componente del sistema indicador diferencial (por ejemplo, un indicador de pH tal como rojo de clorofenol) para provocar un cambio de color detectable en el otro componente.

Los términos "comprende" y variaciones del mismo no tienen un significado limitante donde estos términos aparecen en la descripción y en las reivindicaciones.

Como se utilizan en la presente, "un", "uno", "una", "el", "la", "los", "al menos un," y "uno o más" son utilizados intercambiablemente. De este modo, por ejemplo, se puede interpretar que un microorganismo significa "uno o más" microorganismos.

El término "y/o" significa uno o todos los elementos listados o una combinación de cualesquiera dos o más de los elementos listados.

También en la presente, las indicaciones de intervalos numéricos por puntos finales incluyen todos los números incluidos dentro de ese intervalo (por ejemplo, 1 a 5 incluye 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5, etc.).

La breve descripción anterior de la presente invención no está destinada a describir cada modalidad descrita o cada implementacion de la presente invención. La descripción que sigue ejemplifica más particularmente las modalidades ilustrativas. En varios sitios a todo lo largo de la solicitud, se proporciona una guía a través de lista de ejemplos, cuyos ejemplos pueden ser utilizados en diversas combinaciones. En cada caso, la lista citada ha sido únicamente como un grupo representativo y no debe ser interpretada como una lista exclusiva.

Los detalles adicionales de éstas y otras modalidades se describen en las figuras anexas y la descripción más adelante. Otras características, objetivos y ventajas se volverán aparentes a partir de la descripción y las figuras, y a partir de las reivindicaciones.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra un diagrama de bloques de una modalidad de un método de detección de un microorganismo Salmonella de acuerdo a la presente descripción.

La Figura 2 muestra un diagrama de bloques de una modalidad de un diagrama de flujo utilizado para interpretar los resultados obtenidos mediante el uso del método mostrado en la Figura 1.

Descripción Detallada de la Invención El género Salmonella incluye dos especies, Salmonella entérica y Salmonella bongori . El parentesco genético de las dos especies ha sido estudiado por Fookes et al. ("Salmonella bongori Provides Insights into the Evolution of the Salmonellae" , PLOs Pathogens at www.plospathogens.org, 2011, vol . 7, número de artículo el002191, páginas 1-16, que es incorporada por referencia en la presente en su totalidad) . Aunque las subespecies de S. entérica son mejor conocidas que S. bongori por su habilidad para infectar y provocar enfermedades en humanos, S. bongori ha mostrado también que provoca infecciones en humanos. De este modo, una prueba diseñada para detectar los microorganismos Salmonella potencialmente patógenos, debe ser capaz de detectar ambas especies.

La presente descripción se refiere en general a un método para la detección de microorganismos Salmonella en una muestra. En particular, la presente descripción se refiere a las composiciones y a los métodos de detección basados en crecimiento, que son capaces de distinguir los microorganismos Salmonella de los microorganismos no Salmonella (por ejemplo, Escherichia coli y otros miembros de la familia Enterobacteriaceae) . El método de la invención combina un medio de crecimiento selectivo que incluye una pluralidad de reactivos indicadores diferenciales. Opcionalmente , el método puede utilizar una temperatura de incubación elevada para diferenciar a los microorganismos S. bongori de los microorganismos productores de ß-D-galactosidasa no Salmonella.

La detección y la identificación basadas en el crecimiento de Salmonella, requiere en general el uso de reacciones bioquímicas que detectan específicamente las cepas de Salmonella en presencia de microorganismos no Salmonella . Desafortunadamente, la mayoría de los sistemas de detección convencionales no proporcionan la especificidad adecuada para diferenciar los microorganismos Salmonella de los microorganismos Enterobacteriaceae no Salmonella que pueden estar presentes en la muestra. Las pruebas frecuentemente requieren reactivos y procedimientos adicionales (por ejemplo, pruebas inmunogénicas o genéticas) para diferenciar los microorganismos no Salmonella de los microorganismos Salmonella encontrados en una muestra.

Por desgracia, algunas de las reacciones que son comúnmente utilizadas para detectar los grupos de los microorganismos entéricos no Salmonella (por ejemplo, bacterias coliformes) no diferencian negativamente todas las cepas de Salmonella . Por ejemplo, existen algunos microorganismos Salmonella que tienen la capacidad metabólica de utilizar ciertos compuestos (por ejemplo, melibiosa, 2-desoxi-D-ribosa, dulcitol, trehalosa) como una fuente de carbono y/o de energía. En el proceso de utilización de estos compuestos, los microorganismos Salmonella pueden producir un producto final detectable (es decir, un ácido orgánico) . De este modo, un sistema indicador para detectar la utilización de estos compuestos puede ser utilizado para detectar la presencia de un microorganismo Salmonella en una muestra de prueba. La mayoría de otros microorganismos no poseen las mismas capacidades metabólicas. Sin embargo, algunos microorganismos entéricos Gramnegativos , no Salmonella pueden tener la habilidad para utilizar los compuestos. Por lo tanto, es deseable incluir al menos otro sistema indicador para distinguir los microorganismos no Salmonella de los microorganismos Salmonella . El o los otros sistemas indicadores pueden servir para diferenciar positivamente los microorganismos Salmonella de los microorganismos no Salmonella (es decir, los microorganismos Salmonella reaccionan en general con el sistema indicador y los microorganismos no Salmonella no reaccionan en general con el sistema indicador) o pueden servir para diferenciar negativamente los microorganismos Salmonella de los microorganismos no Salmonella (es decir, los microorganismo Salmonella en general no reaccionan con el sistema indicador y los microorganismos no Salmonella reaccionan en general con el sistema indicador) .

La composición inventiva de la presente descripción incluye al menos dos sistemas indicadores diferenciales que permiten que el operador realice un método que distingue (es decir, diferencia) un microorganismo Salmonella de al menos dos tipos de microorganismos entéricos, Gramnegativos , no Salmonella. Es decir, la composición de la presente descripción distingue positivamente los microorganismos Salmonella de los microorganismos no salmonella que no metabolizan un primer compuesto indicador y, simultáneamente, la composición distingue negativamente los microorganismos Salmonella que son incapaces de metabolizar un segundo compuesto indicador diferencial de los microorganismos no salmonella que son capaces de metabolizar el segundo compuesto indicador diferencial. El método y la composición proporcionan presunta evidencia de una presencia o una ausencia de un microorganismo Salmonella en una muestra de prueba. Además, la composición puede incluir opcionalmente un tercer sistema indicador diferencial y/o puede ser utilizado en un método con un cuarto sistema indicador diferencial para proporcionar evidencia confirmatoria de la presencia de un microorganismo Salmonella en la muestra de prueba .

La presente descripción proporciona una composición para detectar un microorganismo Salmonella . La composición comprende un medio de cultivo semi-sólido que incluye un agente de gelificación, al menos un primer agente selectivo que inhibe el crecimiento de los microorganismos Gran positivos, un primer sistema indicador diferencial que comprende al menos un primer compuesto indicador diferencial, y un segundo sistema indicador diferencial que comprende un segundo compuesto indicador diferencial que es convertido por la actividad de la enzima ureasa a un segundo producto detectable. Al menos un primer compuesto indicador diferencial es capaz de ser convertido por una pluralidad de miembros del género Salmonella a un primer producto detectable. Además, al menos un primer compuesto indicador diferencial no puede ser convertido por una pluralidad de géneros de microorganismos entéricos Gramnegativos , no Salmonella, que forman colonias detectables en y/o sobre el medio de cultivo.

El medio de cultivo de la presente descripción comprende un agente de gelificación . El agente de gelificación puede comprender cualquier agente de gelificación adecuado para el uso en un medio de cultivo microbiológico, semi-sólido utilizado para cultivar un microorganismo entérico Gram negativo. Los ejemplos no limitantes de los agentes de gelificación adecuados incluyen 5 agar, agarosa, pectina, gelatina, goma guar, goma de xantano, goma de algarrobo, hidroxietilcelulosa , carboximetilcelulosa, alcohol polivinílico, algina, y una combinación de cualesquiera dos o más de los anteriores.

El medio de cultivo de la presente descripción 10 puede comprender además un nutriente para facilitar el crecimiento de los microorganismos entéricos Gramnegativos . Tales nutrientes son bien conocidos en la técnica y pueden incluir, por ejemplo, una o más peptonas (por ejemplo, digestión pancreática de caseína, digestión péptica de tejido -j^ animal, peptona, digestión pancreática de gelatina, peptona proteosa, y similares) y/o uno o más suplementos de crecimiento (por ejemplo, extracto de levadura; extracto de carne (res/porcina, etc.); una sal de magnesio, manganeso y/o calcio; un azúcar) . El medio de cultivo puede comprender 2Q otros nutrientes (por ejemplo, minerales u otros componentes) , con la condición de que éstos no interfieran sustancialmente con la función del primer sistema indicador diferencial, el segundo sistema indicador diferencial, y/o el tercer sistema indicador diferencial, si están presentes. 25 El medio de cultivo de la presente descripción comprende un primer sistema indicador diferencial que comprende al menos un primer compuesto indicador diferencial. El primer sistema indicador diferencial es un sistema indicador diferencial que diferencia positivamente un microorganismo Salmonella de una pluralidad de microorganismos entéricos Gramnegativos , no Salmonella. En consecuencia, el primer compuesto indicador diferencial es capaz de ser convertido por una pluralidad de miembros del género Salmonella a un primer producto detectable. Además, el primer compuesto indicador diferencial no es convertido por una pluralidad de géneros de los microorganismos entéricos Gramnegativos, no Salmonella, al primer producto detectable .

Preferentemente, el primer compuesto indicador diferencial puede ser convertido al primer producto detectable por el microorganismo que pertenece a la especie Salmonella bongori . Más preferentemente, el primer compuesto indicador diferencial también es convertido al primer producto detectable por un microorganismo Salmonella que pertenece a una especie diferente de S. bongori (por ejemplo, S. entérica) . En algunas modalidades, el primer sistema indicador diferencial puede comprender un primer compuesto indicador diferencial que puede ser convertido al primer producto detectable por al menos un microorganismo entérico no Salmonella. Ventajosamente, el segundo sistema indicador diferencial y/o el tercer sistema indicador diferencial, si está presente, puede ser utilizado para diferenciar negativamente un microorganismo no Salmonella que crece en o sobre la composición a partir de un miembro del género Salmonella .

En algunas modalidades, el primer compuesto indicador diferencial es un nutriente (por ejemplo, un carbohidrato) que puede ser convertido (por ejemplo, vía la fermentación) por un microorganismo (por ejemplo, un microorganismo que pertenece al género Salmonella) a un primer producto detectable (por ejemplo, uno o más compuestos ácidos tales como el ácido láctico, por ejemplo, y/o un gas tal como el dióxido de carbono y/o hidrógeno, por ejemplo. Una persona que tenga experiencia ordinaria en la técnica reconocerá, cuando el primer producto detectable sea un compuesto ácido producido por la fermentación del primer compuesto indicador diferencial, que los compuestos ácidos producidos por dos diferentes microorganismos pueden ser el mismo compuesto ácido o éstos pueden ser diferentes compuestos ácidos.

En una modalidad en donde un compuesto ácido es el primer producto detectable, el primer sistema indicador diferencial puede comprender además un indicador de pH. Un número de indicadores de pH para detectar los compuestos ácidos producidos por las bacterias, son conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitantes de indicadores de pH adecuados incluyen rojo de fenol, rojo de clorofenol, rojo neutro, azul de bromotimol y púrpura de bromotimol. En algunas modalidades, en donde el primer producto detectable comprende un gas, el gas puede ser detectado, por ejemplo, mediante el atrapamiento del gas (por ejemplo, mediante el atrapamiento de éste en un hidrogel en un dispositivo de cultivo de película delgada, como se describe en la Guía de Interpretación para la Placa de Conteo de Enterobacteriaceae PETRIFILM, que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad) .

Preferentemente, en una modalidad en donde el primer compuesto indicador diferencial comprende un nutriente, el primer compuesto indicador diferencial es convertido al primer producto detectable por una pluralidad de especies y/o subespecies de Salmonella al primer producto detectable. Más preferentemente, el primer indicador diferencial comprende un nutriente que no es convertido al primer producto detectable por muchas especies de microorganismos entéricos, Gramnegativos , que no pertenecen al género Salmonella . Aún más preferentemente, el nutriente primer indicador diferencial comprende un nutriente que no es convertido al primer producto detectable por un microorganismo no Salmonella. Los ejemplos no limitantes de primeros compuestos indicadores diferenciales adecuados incluyen un compuesto seleccionado del grupo que consiste de melibiosa, 2-desoxi-D-ribosa, manitol, L-arabinosa, dulcitol, maltosa, L-ramnosa, trehalosa, D-xilosa, sorbitol, y una combinación de cualesquiera dos o más de los compuestos anteriores.

En algunas modalidades, el primer compuesto indicador puede comprender un sustrato enzimático. Los sustratos enzimáticos adecuados incluyen un sustrato de enzima cromogénica o un sustrato de enzima fluorogénica que es convertido (por ejemplo, hidrolizado por una enzima) a un primer producto detectable (por ejemplo, un producto coloreado o un producto fluorescente) por un microorganismo que pertenece al género Salmonella . Preferentemente, el sustrato enzimático es convertido al primer producto detectable por un mic oorganismo que pertenece a la especie Salmonella bongori y por un microorganismo que pertenece a la especie S. entérica . Los ejemplos no limitantes de sustratos enzimáticos adecuados incluyen los sustratos enzimáticos para detectar la actividad de la enzima caprilato-esterasa o para detectar la actividad de la enzima oc-galactosidasa . Los sustratos de enzima cromogénicas adecuados incluyen, por ejemplo, un sustrato enzimático seleccionado del grupo que consiste de caprilato de 5-bromo-6-cloro-3-indolilo, caprilato de 4 -nitrofenilo, caprilato de 2-naftilo, caprilato de -metilumbeliferilo, 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-a-D- galactopiranosido, 6-cloro-3-indoxil-cc-D-galactopiranósido, 5-bromo-6 -cloro-3 - indoxil- -D-galactopiranosido, 1-naftil-a-D-galactopiranosido, 2 -naftil-a-D-galactopiranosido, resorrufinil-a-D-galactopiranosido, 4 -nitrofenil -OC-D-galactopiranósido, y 4 -metilumbelliferil-a-D-galactopiranósido, combinaciones de los mismos.

El medio de cultivo de la presente descripción comprende un segundo sistema indicador diferencial que comprende un indicador de la actividad de la enzima ureasa. El segundo sistema indicador diferencial es un sistema indicador diferencial que diferencia negativamente un microorganismo Salmonella de una pluralidad de microorganismos entéricos Gramnegativos no Salmonella. En consecuencia, el segundo compuesto indicador diferencial es capaz de ser convertido por una pluralidad de géneros de microorganismos entéricos Gramnegativos, no Salmonella al segundo producto detectable. Además, el segundo compuesto indicador diferencial no es convertido por una pluralidad de miembros del género Salmonella al segundo producto detectable .

La ureasa es una enzima que es encontrada en ciertos microorganismos entéricos Gramnegativos, no Salmonella (por ejemplo, ciertas especies que pertenecen a los géneros Proteus, Klebsiella, Morganella, Providencia, y Serratia) . Algunos de estos microorganismos (por ejemplo, Proteus mirabilis; ver, por ejemplo, JM Matsen et al., 1972, Appl . Microbiol., vol . 23, pp 592-594, que es incorporada por referencia en la presente en su totalidad) son capaces de convertir uno o más de los primeros compuestos indicadores diferenciales (por ejemplo, trehalosa, xilosa) al primer producto detectable. De este modo, en un medio de cultivo diferencial que contiene exclusivamente el primer sistema indicador diferencial descrito en la presente, puede no ser posible distinguir un microorganismo Salmonella de uno de estos microorganismos entéricos Gramnegati os , no Salmonella . Ventajosamente, al agregar al medio de cultivo el segundo sistema indicador diferencial, los microorganismos Salmonella pueden ser diferenciados de los microorganismos no Salmonella debido a que los microorganismos Salmonella típicamente no poseen la actividad de la enzima ureasa.

Los segundos sistemas indicadores diferenciales de la presente descripción pueden comprender urea y un indicador de pH adecuado (por ejemplo, rojo de fenol, rojo de clorofenol, rojo neutro, azul de bromotimol, y púrpura de bromotimol o ftalhidrazidilazoacetilacetona) . La actividad de la enzima ureasa hidroliza la urea en dióxido de carbono y amoniaco el cual, en presencia de agua forma hidróxido de amonio. De este modo, en algunas modalidades, el segundo producto detectable comprende un compuesto de amonio . Una colonia microbiana que tiene actividad de ureasa y que se desarrolla en presencia de urea produce un compuesto de amonio, el cual provoca que el pH del medio de cultivo que rodea a la colonia se eleve. Un indicador de pH apropiado presente en el medio de cultivo puede indicar un cambio de pH resultante, típicamente como una zona o un halo que abarca la colonia bacteriana (por ejemplo, en el caso del rojo de fenol como el indicador de pH, la colonia puede ser teñida de violeta y/o la colonia puede tener una zona violeta que la rodea) . Otros indicadores de la actividad de la enzima ureasa pueden ser adecuados incluyendo, por ejemplo, un sustrato de enzima ureasa fluorogénica (por ejemplo, 3 - (1-acetilacetonilazo) ftalhidrazida) .

Las composiciones de la presente descripción comprenden además al menos un primer agente selectivo para inhibir el crecimiento de los microorganismos Grampositivos , con lo cual se reduce la competencia para nutrientes y se facilita el crecimiento de los microorganismos Gramnegativos tales como los miembros del género Salmonella . Los ejemplos no limitantes de primeros agentes selectivos adecuados incluyen un agente selectivo seleccionado del grupo que consiste de un antibiótico, sales biliares, sales biliares No. 3, ácido cólico, ácido desoxicólico, cristal violeta, cloruro de sodio, novobiocina, ácido nalidíxico, estreptomicina, polimixina B) , y una combinación de cualesquiera dos o más de los agentes selectivos anteriores.

Las composiciones de la presente descripción puede comprender opcionalmente al menos un segundo agente selectivo para inhibir el crecimiento de al menos un microorganismo entérico Gram negativo que no es un miembro del género Salmonella . En algunas modalidades, el segundo agente selectivo puede también inhibir el crecimiento de al menos un microorganismo Gram positivo. Ventajosamente, el segundo agente selectivo, en combinación con el primer agente selectivo, inhibe adicionalmente a los microorganismos (microorganismos Gramnegativos y/o Grampositivos) , con lo cual se reduce la competencia por nutrientes y se facilita el crecimiento de un microorganismo Salmonella. Además, al menos un segundo agente selectivo puede también prevenir sustancialmente el crecimiento de un microorganismo Gram negativo no Salmonella que de otro modo podría convertir el primer compuesto diferencial y/o el tercer compuesto diferencial a su respectivo producto detectable .

De este modo, el segundo agente selectivo puede reducir la probabilidad del crecimiento de un microorganismo no Salmonella en o sobre la composición, y ser interpretado como un posible microorganismo Salmonella. Los ejemplos no limitantes de los segundos agentes selectivos, adecuados, incluyen un agente selectivo seleccionado del grupo que consiste de un antibiótico ß-lactámico, un antibiótico aminoglucósido, un antibiótico de quinolona, un antibiótico sulfa, un antibiótico de polimixina, y una combinación de cualesquiera dos o más de los antibióticos anteriores. En una modalidad, al menos un segundo agente selectivo comprende una combinación de ácido nalidíxico, estreptomicina, y polimixina B. Preferentemente, la concentración de cada uno de al menos uno de los segundos agentes selectivos en el medio nutritivo se selecciona para permitir el crecimiento de un microorganismo Salmonella . Más preferentemente, la concentración de cada uno de al menos uno de los segundos agentes selectivos en el medio nutritivo se selecciona para permitir el crecimiento de todos los microorganismos Salmonella .

Opcionalmente , las composiciones de la presente descripción pueden comprender además un tercer sistema indicador diferencial que comprende un tercer compuesto indicador diferencial que es convertido por una actividad de enzima ß-galactosidasa a un tercer producto detectable. Los terceros sistemas indicadores diferenciales de la presente descripción comprenden un tercer compuesto indicador diferencial que puede ser convertido a un tercer producto detectable por una actividad de enzima ß-galactosidasa . En consecuencia, el tercer sistema indicador diferencial distingue entre los microorganismos que producen actividad de enzima ß-galactosidasa y los microorganismos que no producen actividad de enzima ß-galactosidasa . Por ejemplo, muchas Salmonellas no producen actividad de enzima ß-galactosidasa y pueden ser diferenciadas de los miembros que utilizan lactosa de la familia Enterobacteriaceae mediante el uso de un indicador de la actividad de la enzima ß-galactosidasa, como se describe por A. Rambach ("New píate médium for facilitated differentiation of Salmonella spp. From Proteus sp . y other enteric bacteria", 1990, Appl . Environ. Microbiol . , vol . 56, pp. 301-303; la cual se incorpora por referencia en la presente en su totalidad) .

Sin embargo, algunos reportes indican que se ha encontrado que más del 90% de los microorganismos aislados provenientes de algunas especies de Salmonella (por ejemplo, S. bongori) y subespecies (por ejemplo, S. entérica arizonae y S. entérica diarizonae) producen actividad de enzima ß-galactosidasa (por ejemplo, ver A.M. Littell, "Plating médium for differentiating Salmonella arizonae from other Salmonellae" , 1977, Appl. Environ. Microbiol., vol. 33, pp. 485-487; la cual se incorpora por referencia en la presente en su totalidad) . De este modo, un medio de cultivo y/o un procedimiento correspondiente diseñado para distinguir entre los microorganismos Salmonella y los microorganismos no Salmonella con base en la actividad de la enzima ß-galactosidasa, puede subestimar erróneamente el número de microorganismos Salmonella en una muestra si las Salmonellas productoras de ß-galactosidasa están presentes en la muestra. Los investigadores han descubierto un método que, sorprendentemente, es capaz de distinguir algunos microorganismos Salmonella productores de ß-galactosidasa, incluso cuando el medio de cultivo utilizado en el método confía en un indicador de la actividad de la enzima ß-galactosidasa para distinguir entre los microorganismos Salmonella y los microorganismos no salmonella .

Los ejemplos no limitantes de los terceros compuestos indicadores diferenciales adecuados de acuerdo a la presente descripción incluyen 5-bromo-4-cloro-3-indolil- -D-galactopiranosido; 5-bromo-3 -indolil-P-D-galactopiranósido; 5-bromo-6-cloro-3-indolil- -D-galactopiranósido; 2-nitrofenil- -D-galactopiranósido; 3 , 4 -ciclohexenesculetin-ß-D-galactopiranósido; y 4-nitrofenil-P-D-galactopiranósido . En algunas modalidades, el tercer sistema indicador diferencial comprende un tercer compuesto indicador diferencial (por ejemplo, lactosa) y un indicador de pH. En cualquier modalidad, opcionalmente , la composición puede comprender además un inductor de la actividad de la enzima ß-galactosidasa tal como ß-D-l-tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG, por sus siglas en Inglés), por ejemplo.

Cualquier modalidad de la composición puede ser utilizada en un dispositivo de cultivo para detectar los microorganismos en una muestra de prueba. Tales dispositivos de cultivo incluyen, por ejemplo, cualquier dispositivo de cultivo que sea utilizado para mantener un medio nutritivo en un proceso para detectar microorganismos presentes en una muestra. Los ejemplos no limitantes de dispositivos de cultivo adecuados incluyen cajas de Petri, placas de múltiples pozos, tubos, matraces, dispositivos de cultivo de película delgada, y similares.

La composición de la presente descripción puede ser colocada en el dispositivo de cultivo de película delgada en una forma deshidratada como se describe en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,565,783; 5,601,998; 5,681,712; 6,265,203; y 6,638,755; cada una de las cuales cual se incorpora por referencia en la presente en su totalidad. En estas modalidades, la muestra (por ejemplo, una muestra líquida acuosa o una muestra sólida suspendida en un medio suspensor acuoso) puede ser puesta en contacto con los componentes deshidratados mediante transferencia con pipeta de la muestra dentro del dispositivo de cultivo, por ejemplo. En esta modalidad, uno o más de los componentes de la composición puede ser disuelto o suspendido en la muestra antes de o después de que la muestra es depositada dentro del dispositivo de cultivo.

Opcionalmente, un dispositivo de cultivo (por ejemplo, un dispositivo de cultivo de película delgada) que contiene una composición de la presente descripción puede comprender además un sistema indicador no diferencial. Los compuestos indicadores no diferenciales, adecuados, incluyen los compuestos indicadores que son metabol izados por, o de otro modo reaccionan con, los microorganismos en crecimiento, y al hacerlo así producen un cuarto producto detectable que puede provocar que las colonias microbianas o el medio nutritivo adyacente a las colonias, sea coloreado o florezca para facilidad de visualización, formación de imagen, y/o cuantif icación. El indicador no diferencial, y el cuarto producto detectable derivado del mismo, no deben de interferir sustancialmente con la detección del primer producto detectable o el segundo producto detectable y/o el tercer producto detectable, si está presente en el medio de cultivo inoculado. Los ejemplos no limitantes de los compuestos indicadores no diferenciales, adecuados, incluyen indicadores redox cromogénicos tales como el cloruro de trifenil-tetrazolio, rojo de p-tolil-tetrazolio, violeta de tetrazolio, azul de veratril-tetrazolio, y la sal disódica del 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato. El sistema indicador no diferencial opcionalmente puede ser proporcionado en una capa adhesiva en el dispositivo de cultivo de película delgada como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4,565,783.

En una modalidad, la composición consiste esencialmente de un agente gelificante (por ejemplo, cualquier agente gelificante adecuado como se describe en la presente) , un nutriente (por ejemplo, cualquier nutriente adecuado como se describe en la presente) para facilitar el crecimiento de un microorganismo Salmonella, al menos un primer agente selectivo (por ejemplo, cualquier primer agente selectivo adecuado como se describe en la presente) que inhibe el crecimiento de los microorganismos Grampositivos , un primer sistema indicador diferencial que comprende al menos un primer compuesto indicador diferencial (por ejemplo, cualquier primer sistema indicador diferencial adecuado y primer compuesto indicador como se describe en la presente) , y un segundo sistema indicador diferencial que comprende un segundo compuesto indicador diferencial que es convertido por la actividad de la enzima ureasa a un segundo producto detectable (por ejemplo, cualquier segundo sistema indicador diferencial adecuado y segundo compuesto indicador diferencial como se describen en la presente) . En esta modalidad, el primer compuesto indicador diferencial es capaz de ser convertido por una pluralidad de miembros del género Salmonella a un primer producto detectable. En esta modalidad, el primer compuesto indicador diferencial no puede ser convertido por una pluralidad de géneros de microorganismos entéricos Gramnegativos , no Salmonella , que forman colonias detectables en y/o sobre el medio de cultivo.

En una modalidad, la composición consiste esencialmente de un agente gelificante (por ejemplo, cualquier agente gelificante adecuado como se describe en la presente) , un nutriente (por ejemplo, cualquier nutriente adecuado como se describe en la presente) para facilitar el crecimiento de un microorganismo Salmonella, al menos un primer agente selectivo (por ejemplo, cualquier primer agente selectivo adecuado como se describe en la presente) que inhibe el crecimiento de los microorganismos Grampositivos , un primer sistema indicador diferencial que comprende al menos un primer compuesto indicador diferencial (por ejemplo, cualquier primer sistema indicador diferencial adecuado y primer compuesto indicador como se describe en la presente) , un segundo sistema indicador diferencial que comprende un segundo compuesto indicador diferencial que es convertido por la actividad de la enzima ureasa a un segundo producto detectable (por ejemplo, cualquier segundo sistema indicador diferencial adecuado y segundo compuesto indicador diferencial como se describen en la presente) , y un tercer sistema indicador diferencial que comprende un tercer compuesto indicador diferencial que es convertido por una actividad de la enzima ß-galactosidasa a un tercer producto detectable (por ejemplo, cualquier tercer sistema indicador diferencial adecuado y tercer compuesto indicador como se describe en la presente) . En esta modalidad, el primer compuesto indicador diferencial es capaz de ser convertido por una pluralidad de miembros del género Salmonella a un primer producto detectable. En esta modalidad, el primer compuesto indicador diferencial no puede ser convertido por una pluralidad de géneros de microorganismos entéricos Gramnegativos , no Salmonella, que forman colonias detectables en y/o sobre el medio de cultivo.

Las composiciones de la presente descripción pueden ser utilizadas en un método para detectar un microorganismo Salmonella en una muestra. Las muestras probadas en el método de la presente descripción incluyen una variedad de muestras que pueden ser sospechosas de contener un microorganismo Salmonella . Las muestras de interés particular incluyen material bruto, material en proceso, un material de producto terminado proveniente de operaciones de procesamiento de alimentos o procesamiento de bebidas. Otras muestras adecuadas incluyen, por ejemplo, muestras de agua (por ejemplo, agua superficial, agua de proceso), muestras ambientales (por ejemplo, muestras de aire; muestras superficiales de paredes, piso, de desagües, superficies en contacto con alimentos, equipo de proceso); y muestras clínicas) . Los ejemplos no limitantes de muestras clínicas incluyen sangre, bilis, muestras gastrointestinales, muestras rectales, y muestras fecales. Las muestras de prueba pueden incluir líquidos, así como uno o varios sólidos disueltos o suspendidos en un medio líquido.

La Figura 1 muestra una modalidad de un método 10 de detección de un microorganismo Salmonella en una muestra de acuerdo a la presente descripción. El método 10 comprende el paso 45 de proporcionar una muestra de prueba, los componentes de la composición, y un dispositivo de cultivo. Los componentes de la composición pueden ser proporcionados en el dispositivo de cultivo (por ejemplo, como una composición hidratada en una caja de Petri; como un recubrimiento rehidratable, sustancialmente libre de agua, o una pluralidad de recubrimientos en un dispositivo de cultivo de película delgada) o éstos pueden ser agregados al dispositivo de cultivo de acuerdo a los métodos que son conocidos en la técnica.

El método 10 comprende además el paso 50 de poner en contacto la composición y la muestra para formar un dispositivo de cultivo inoculado. La muestra puede ser puesta en contacto en el dispositivo de cultivo con la composición en cualquiera de una variedad de formas. Por ejemplo, en una modalidad del método, la composición puede ser colocada en el dispositivo de cultivo como una mezcla en una forma hidratada (por ejemplo, en un medio de cultivo semi-sólido, hidratado, por ejemplo) . En esta modalidad, la muestra (por ejemplo, una muestra líquida, una muestra sólida, un líquido y/o una muestra sólida capturada sobre un filtro, una muestra sólida suspendida en un medio líquido) puede ser depositada y, opcionalmente distribuida, dentro o sobre de la mezcla mediante técnicas que son conocidas en la materia tales como, por ejemplo, transferencia con pipeta, técnicas de inoculación en placa por dispersión, técnicas de inoculación en placa por estriado.

En una modalidad alternativa, la muestra (por ejemplo, que comprende un material líquido y/o sólido) es puesta en contacto y mezclada con una mezcla líquida (por ejemplo, una solución de agar líquida, templada fundida) que comprende la composición. Si no está ya presente en un dispositivo de cultivo, la mezcla que comprende la muestra y la composición, es transferida al dispositivo de cultivo.

En otra modalidad alternativa, la composición es colocada en un dispositivo de cultivo en una forma deshidratada, tal como en un dispositivo de cultivo de película delgada descrito en la presente. Un líquido acuoso adecuado (por ejemplo, agua estéril, un diluyente estéril; que comprende opcionalmente uno o más de los componentes de la composición) es retenido con pipeta hacia el dispositivo de cultivo y el agente gelificante se deja rehidratar. Subsecuentemente, la muestra puede ser depositada (por ejemplo, mediante transferencia con pipeta, estriado, colocación de un filtro de membrana que comprende la muestra) dentro del dispositivo de cultivo en contacto con la composición .

Una persona que tiene habilidad ordinaria en la técnica reconocerá una variedad de otros procedimientos en los cuales la composición puede ser puesta en contacto con la muestra en un dispositivo de cultivo.

Con referencia nuevamente a la Figura 1, el método 10 comprende además el paso 55 de incubar el dispositivo de cultivo inoculado por un primer periodo de tiempo. Típicamente, el dispositivo de cultivo inoculado es incubado (por ejemplo, en una incubadora, un horno, o similar) a una temperatura elevada (por ejemplo, aproximadamente 35-45 grados C) para facilitar el crecimiento de los microorganismos entéricos. En algunas modalidades, el dispositivo de cultivo inoculado es incubado a una temperatura de aproximadamente 37 grados C. En algunas modalidades, la incubación del dispositivo de cultivo puede comprender la incubación del dispositivo de cultivo a una temperatura entre 41-44 grados C, inclusive. En algunas modalidades, en donde la composición comprende un sistema indicador para detectar la actividad de la enzima ß-galactosidasa, el dispositivo de cultivo inoculado puede ser incubado a una temperatura mayor de 40 grados C para diferenciar la Salmonella bongori de otros microorganismos entéricos Gramnegativos en la muestra, como se describe en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 61/580,860, presentada el 28 de Diciembre del 2011, la cual se incorpora por referencia en la presente en su totalidad.

El dispositivo de cultivo es incubado por un primer periodo de tiempo, suficiente para permitir el crecimiento y la multiplicación de los microorganismos entéricos presentes en la muestra. Típicamente, el dispositivo de cultivo será incubado por un primer periodo de al menos 6 horas . En algunas modalidades, los dispositivos de cultivo son incubados por un primer periodo de al menos 8 horas . En algunas modalidades, los dispositivos de cultivo son incubados por un primer periodo de al menos 10 horas. En algunas modalidades, los dispositivos de cultivo son incubados por un primer periodo de aproximadamente 14 a aproximadamente 48 horas. En algunas modalidades, los dispositivos de cultivo son incubados por un primer periodo de aproximadamente 18 a aproximadamente 48 horas. En algunas modalidades, los dispositivos de cultivo son incubados por un primer periodo de aproximadamente 24 a aproximadamente 36 horas. En una modalidad preferida, los dispositivos de cultivo son incubados por un primer periodo de aproximadamente 24 + 2 horas.

El método 10 comprende además el paso 60 de observar el dispositivo de cultivo para detectar un producto detectable. El producto detectable puede ser el primer producto detectable descrito en la presente. El primer producto detectable es una indicación de una posible presencia de un microorganismo Salmonella en la muestra de prueba. El microorganismo Salmonella convierte el primer compuesto indicador diferencial (por ejemplo, vía la 5 fermentación, vía la actividad metabólica, vía una actividad enzimática) al primer producto detectable. Típicamente, el medio nutritivo en el dispositivo de cultivo es observado después del primer periodo de incubación. En cualquier modalidad, la observación del medio nutritivo para detectar 10 la presencia del primer producto detectable puede comprender la observación del dispositivo de cultivo para detectar un primer color detectable. En algunas modalidades, el primer color detectable puede ser detectado por fluorescencia (por ejemplo, en una modalidad en donde el primer compuesto 15 indicador diferencial comprende 4-metilumbel-liferil-oc-D- galactopiranósido) .

En una modalidad en donde el primer sistema indicador diferencial comprende un carbohidrato fermentable y un indicador de pH, el primer color detectable puede ser una 20 zona coloreada asociada con el indicador de pH próxima (por ejemplo, adyacente) a una colonia de microorganismos capaz de convertir el carbohidrato a uno o más productos ácidos. En algunas modalidades, la colonia puede parecer tener el mismo color que el indicador de pH en el medio nutritivo ->_¦ circunvecino.

En una modalidad, en donde el primer compuesto indicador diferencial comprende un substrato enzimático cromogénico, el primer color detectable puede ser una zona coloreada próxima a una colonia de microorganismos. Por ejemplo, la zona coloreada puede comprender un producto soluble en agua, difundible (por ejemplo, 4-nitrofenol) que resulta de una reacción enzimática microbiana con el sustrato cromogénico (por ejemplo, 4 -nitrofenil -a-D-galactopiranósido) . Alternativamente, la zona coloreada puede comprender un producto soluble en agua (por ejemplo, índigo) que resulta de una reacción enzimática microbiana con el sustrato cromogénico (5-bromo-4-cloro-3-indolil-0C-D-galactopiranósido) .

La observación del dispositivo de cultivo (paso 60) incluye la observación del dispositivo de cultivo para detectar la presencia o la ausencia del segundo producto detectable descrito en la presente. El segundo producto detectable es producido por la hidrólisis de un substrato de enzima ureasa por la actividad de la enzima ureasa, que puede estar asociada con una colonia bacteriana. En algunas modalidades, el segundo producto detectable puede comprender un indicador de pH, el cual cambia de color en presencia de hidróxido de amonio, un producto generado por la hidrólisis de la urea por la actividad de la enzima ureasa en un medio acuoso. En contraste al primer sistema indicador diferencial, el cual puede incluir, por ejemplo, un carbohidrato que es fermentado a un producto ácido que disminuye el pH del medio de cultivo adyacente a la colonia que reacciona con el primer indicador diferencial, una colonia que reacciona con el segundo indicador diferencial (por ejemplo urea) produce suficiente hidróxido de amonio para elevar el pH del medio de cultivo adyacente a la colonia, incluso si la colonia es capaz de fermentar el primer compuesto indicador a un producto ácido. De este modo, una observación del segundo producto detectable (por ejemplo, una zona coloreada asociada con la hidrólisis de la urea) adyacente a una colonia microbiana, es una indicación de que la colonia no pertenece al género Salmonella.

Cuando el tercer sistema indicador diferencial está presente en el dispositivo de cultivo (por ejemplo, el cual está presente en la composición) , la observación del dispositivo de cultivo (paso 60) incluye la observación del dispositivo de cultivo para detectar la presencia o la ausencia del tercer producto detectable descrito en la presente. De manera similar a la detección del segundo producto detectable, una observación del tercer producto detectable (por ejemplo, una colonia microbiana coloreada o fluorescente y/o zona adyacente a la colonia) es una indicación de que la colonia no pertenece al género Salmonella.

En algunas modalidades, el método 10 puede comprender además el paso opcional 65 de poner en contacto el medio nutritivo inoculado con un cuarto sistema indicador diferencial que comprende un tercer compuesto indicador diferencial. El tercer compuesto indicador diferencial que puede ser convertido por un microorganismo Salmonella a un cuarto producto detectable y, de este modo, el cuarto sistema indicador diferencial funciona para confirmar el resultado (es decir, una indicación de la presencia de un microorganismo Salmonella) del primer sistema indicador diferencial. Es decir, el primer producto detectable y el cuarto producto detectable proporcionan una indicación de la presencia de un microorganismo Salmonella .

El cuarto compuesto indicador diferencial puede ser cualquier compuesto indicador adecuado para detectar un microorganismo Salmonella, con la condición de que el cuarto producto detectable derivado del mismo sea distinguible; preferentemente, ópticamente distinguible, más preferentemente, visualmente distinguible; a partir del primer producto detectable del primer sistema indicador diferencial, el segundo producto detectable del segundo sistema indicador diferencial, y el tercer producto detectable del tercer sistema indicador diferencial. De este modo, en una modalidad, el cuarto sistema indicador diferencial puede comprender un indicador de pH en conjunto con un nutriente (por ejemplo, un carbohidrato) que puede ser convertido (por ejemplo vía la fermentación) a un primer producto detectable (por ejemplo, un compuesto ácido tal como ácido láctico, por ejemplo, y/o un gas tal como dióxido de carbono, por ejemplo), como se describe en la presente. En otra modalidad más, el cuarto sistema indicador diferencial puede comprender un substrato de enzima cromogénica, como se describe en la presente. En otra modalidad más, el cuarto sistema indicador diferencial puede ser un sustrato de enzima cromogénica, como se describe en la presente. Cualquier primer sistema indicador diferencial descrito en la presente puede ser adecuado para el uso como un cuarto sistema indicador diferencial, con la condición de que éste no interfiera sustancialmente con, y sea distinguible de, el primero y el segundo sistema indicador diferencial y/o el cuarto sistema indicador diferencial, si está presente.

Ventajosamente, el cuarto sistema indicador diferencial puede ser utilizado como un medio para "confirmar" la presencia de un microorganismo Salmonella en la muestra. Es decir, cuando una presencia de un primer producto detectable es observada en el dispositivo de cultivo, esa presencia puede ser inferida como una indicación de la posible presencia de un microorganismo Salmonella en la muestra. Sin embargo, cuando una presencia de un cuarto producto detectable es observada en yuxtaposición con la presencia de un primer producto detectable (es decir, el primero y el cuarto productos detectables están asociados con la misma colonia bacteriana) ; la observación puede indicar una más alta probabilidad (por ejemplo, una probabilidad significativamente más alta) , de la presencia de un microorganismo Salmonella en la muestra.

Después del primer periodo de incubación, el cuarto sistema indicador diferencial puede ser puesto en contacto con el medio nutritivo en un dispositivo de cultivo inoculado utilizando una variedad de procedimientos que incluyen, por ejemplo, la puesta en contacto de un artículo que comprende el cuarto sistema indicador, con el medio nutritivo. Esto puede ser realizado, por ejemplo, mediante el uso de un artículo que tiene un recubrimiento que comprende el cuarto sistema indicador diferencial. Por ejemplo, el artículo que tiene un recubrimiento que comprende el cuarto sistema indicador diferencial puede ser elaborado utilizando un sistema similar a aquel descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 6,022,682; la cual se incorpora por referencia en la presente en su totalidad.

Después de que el cuarto sistema indicador diferencial que comprende un cuarto compuesto indicador diferencial es puesto en contacto con el medio nutritivo inoculado, el método puede incluir el paso opcional (no mostrado) de incubar la placa por un segundo periodo de tiempo .

La incubación del dispositivo de cultivo inoculado por un segundo periodo de tiempo puede comprender la retención del dispositivo a una temperatura elevada (por ejemplo, en una incubadora de temperatura controlada) . La incubación del dispositivo de cultivo inoculado a una temperatura elevada (por ejemplo, mayor de 25 grados C pero menor o igual a aproximadamente 44 grados C) puede facilitar la conversión por los microorganismos entéricos (por ejemplo, los miembros del género Salmonella) del cuarto compuesto indicador diferencial al cuarto producto detectable . Preferentemente, la incubación del dispositivo de cultivo inoculado por un segundo periodo de tiempo, comprende la incubación del dispositivo de cultivo a una temperatura de 35 a 42°C, inclusive. En una modalidad preferida, la incubación del dispositivo de cultivo inoculado por un segundo periodo de tiempo comprende la incubación del dispositivo de cultivo a una temperatura de 42°C ± 1°C).

En algunas modalidades, el cuarto sistema indicador diferencial es puesto en contacto con el medio nutritivo inoculado después del primer periodo de incubación. Ventajosamente, esto puede reducir la longitud del segundo periodo de incubación necesario para detectar el cuarto producto detectable. De este modo, en algunas modalidades, el segundo periodo de incubación puede ser de 1 hora a aproximadamente 6 horas. En algunas modalidades, el segundo periodo de incubación puede ser de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 5 horas. En una modalidad preferida, el segundo periodo de incubación es de 4 horas ± 1 hora.

Una persona que tenga experiencia ordinaria en la técnica reconocerá que, en cualquier modalidad, cualquiera del primero, segundo, tercero o cuarto productos detectables, si están presentes, no deben interferir sustancialmente con la detección (por ejemplo, por enmascaramiento de color o apagado fluorescente) de cualquiera del otro producto detectable . Una persona que tenga experiencia ordinaria en la técnica reconocerá que, en una modalidad en donde el primero, segundo, tercero y/o cuarto productos detectables son detectados por color y/o fluorescencia, cada producto detectable debe comprender un cromóforo y/o fluoróforo que sea diferente (es decir, cromáticamente distinguible) que los otros productos detectables.

Los métodos de la presente descripción incluyen la observación del dispositivo de cultivo para detectar un primero, segundo, tercero y/o un cuarto producto detectable. En cualquier modalidad del método, la observación del dispositivo de cultivo puede comprender la observación del medio nutritivo en el dispositivo de cultivo. En cualquier modalidad del método, la observación del dispositivo de cultivo puede comprender la observación del dispositivo de cultivo visualmente (por ejemplo, utilizando uno o más ojos humanos) .

Adicional o alternativamente, en cualquier modalidad, la observación del dispositivo de cultivo puede comprender la observación del dispositivo de cultivo mecánicamente (por ejemplo, utilizando un sistema de formación de imagen tal como, por ejemplo, el sistema de formación de imagen descrito en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,243,486; 7,496,225; y 7,351,574; cada una de las cuales se incorpora por referencia en la presente en su totalidad. En esta modalidad, la observación del dispositivo de cultivo puede comprender la creación de una imagen del dispositivo de cultivo utilizando un dispositivo de formación de imagen. Además de crear una imagen del dispositivo de cultivo, el método puede comprender opcionalmente el análisis de la imagen utilizando un procesador.

Los métodos de la presente descripción pueden ser utilizados para detectar y, opcionalmente, contar los microorganismos en una muestra. Por ejemplo, la observación de la presencia del primer producto detectable en el dispositivo de cultivo puede indicar una posible presencia, en la muestra, de un microorganismo Salmonella (por ejemplo, un miembro de la especie Salmonella bongori y/o un miembro de la especie Salmonella entérica) . Sin embargo, en los métodos de acuerdo a la presente descripción, la observación de la presencia del primer producto detectable yuxtapuesto con el segundo producto detectable, indica una presencia de un microorganismo diferente de un microorganismo Salmonella .

El conteo de los microorganismos de acuerdo a la presente descripción puede comprender además el conteo de uno o más tipos de microorganismos. Los tipos pueden ser distinguidos por su reacción respectiva, o falta de la misma, con uno o más de los sistemas indicadores. Los ejemplos no limitantes de los tipos de microorganismos que pueden ser contados por el presente método incluyen los microorganismos Salmonella, microorganismos no Salmonella, microorganismos productores de ß-galactosidasa, y microorganismos productores de ureasa.

Cuando se utiliza de acuerdo a la presente descripción, el método puede detectar la presencia o la ausencia de una microorganismo Salmonella en una muestra. La Figura 2 muestra una modalidad de un diagrama de flujo analítico utilizado en conjunto con los resultados obtenidos a partir del método mostrado en la Figura 1. El diagrama de flujo puede ser utilizado para decidir si cualquier colonia microbiana dada, si está sustancialmente pura y espacxalmente separada de otras colonias microbianas, comprende un miembro del género Salmonella o un microorganismo entérico Gram negativo, no Salmonella.

Después del primer periodo de incubación descrito anteriormente, el dispositivo de cultivo es observado para detectar una presencia o una ausencia de un primer producto detectable (paso 100) y para detectar una presencia o una ausencia de un segundo producto detectable (paso 110) . El primero y/o el segundo productos detectables pueden ser detectados como se describe en la presente.

Si el primer producto detectable no se detectado después del periodo de incubación, se presume que la muestra de prueba no contiene un microorganismo Salmonella (es decir, el resultado 105 es considerado "Presuntamente Negativo" . Si el primer producto detectable es observado, el dispositivo de cultivo es observado adicionalmente para detectar la presencia del segundo producto detectable, yuxtapuesto con el primer producto detectable. Si el primer producto detectable y el segundo producto detectable son ambos observados como asociados con una colonia microbiana, se presume que la colonia microbiana no contiene un microorganismo Salmonella (es decir, el resultado 115 es considerado "Negativo").

Si se observa que el primer producto detectable está asociado con una colonia microbiana y el segundo producto detectable no es observado asociado con la colonia, el resultado 117 es considerado "Presuntamente Positivo" (es decir, los resultados indican que la colonia puede pertenecer al género Salmonella. En este caso, el operador puede utilizar el cuarto sistema indicador diferencial descrito en la presente para confirmar si el microorganismo es un miembro del género Salmonella. De este modo, después de observar una colonia microbiana para detectar el primero y segundo productos detectables, se observa la colonia para detectar la presencia o la ausencia del cuarto producto detectable (paso 120) . Si se observa que el cuarto producto detectable está asociado con una colonia que produce el primer producto detectable y que no produce el segundo producto detectable, el resultado 125 para esa colonia es considerado "Positivo Confirmado" (es decir, existen tres resultados independientes que indica que el microorganismo presente en la colonia pertenece al género Salmonella) . Si se observa que el cuarto producto detectable no está asociado con una colonia que produce el primer producto detectable y que no produce el segundo producto detectable, el resultado 135 indica que la colonia microbiana puede o no pertenecer al género Salmonella y que pueden ser utilizadas pruebas adicionales (por ejemplo, pruebas genéticas, pruebas inmunológicas , pruebas bioquímicas) para ayudar a identificar el microorganismo.

MODALIDADES La Modalidad 1 es una composición, que comprende: un medio de cultivo semisólido que incluye: un agente de gelificación; al menos un primer agente selectivo que inhibe el crecimiento de los microorganismo Gram-positivos ; un primer sistema indicador diferencial que comprende al menos un primer compuesto indicador diferencial; y un segundo sistema indicador diferencial que comprende un segundo compuesto indicador diferencial que es convertido por la actividad de la enzima ureasa a un segundo producto detectable ; en donde el primer compuesto indicador diferencial es capaz de ser convertido por una pluralidad de miembros del género Salmonella a un primer producto detectable; en donde el primer compuesto indicador diferencial no puede ser convertido por una pluralidad de géneros de microorganismos entéricos Gramnegativos , no Salmonella , que forman colonias detectables en y/o sobre el medio de cultivo.

La Modalidad 2 es la composición de la Modalidad 1, en donde el primer compuesto indicador diferencial es un compuesto seleccionado del grupo que consiste de melibiosa, 2-desoxi-D-ribosa, manitol, L-arabinosa, dulcitol, maltosa, L-ramnosa, trehalosa, D-xilosa, sorbitol, y una combinación de cualesquiera dos o más de los compuestos anteriores.

La Modalidad 3 es la composición de la Modalidad 1 o la Modalidad 2, que comprende además un agente amortiguador .

La Modalidad 4 es la composición de la Modalidad 3, en donde el agente amortiguador se selecciona del grupo que consiste de MOPS, una sal de fosfato, TES , HEPES, y combinaciones de los mismos.

La Modalidad 5 es la composición de cualquiera de las Modalidades precedentes, que comprende además un tercer sistema indicador diferencial que comprende un tercer compuesto indicador diferencial que es convertido por una actividad de enzima ß-galactosidasa a un tercer producto detectable .

La Modalidad 6 es la composición de la Modalidad 5, en donde el tercer compuesto indicador diferencial es un sustrato de enzima cromogénica.

La Modalidad 7 es la composición de la Modalidad 6, en donde el tercer compuesto indicador diferencial se selecciona del grupo que consiste de 5 -bromo-4 -cloro- 3 -indolil-P-D-galactopiranósido; 5 -bromo-6 -cloro-3 -indolil -ß-D-galactopiranósido; o-nitrofenil -ß-D-galactopiranósido; p-nitrofenil^-D-galactopiranósido; 3 , 4 -ciclohexenoesculetin-ß-D-galactopiranósido; y 6-cloro-3-indolil^-D-galactopiranósido .

La Modalidad 8 es la composición de cualquiera de las Modalidades precedentes, en donde al menos un primer agente selectivo se selecciona del grupo que consiste de sales biliares, ácido cólico, ácido desoxicólico, cristal violeta o una combinación de cualesquiera de dos o más de los compuestos anteriores.

La Modalidad 9 es la composición de cualquiera de las Modalidades precedentes, en donde el indicador de pH se selecciona del grupo que consiste de rojo de fenol, rojo de clorofenol, rojo neutro, azul de bromotimol, y púrpura de bromotimol .

La Modalidad 10 es la composición de cualquiera de las Modalidades precedentes, que comprende además al menos un segundo agente selectivo que inhibe el crecimiento de al menos un microorganismo entérico gran negativo que no es un miembro del género Salmonella .

La modalidad 11 es la composición de la Modalidad 10, en donde al menos un segundo agente selectivo se selecciona del grupo que consiste de un antibiótico ß-lactámico, un antibiótico aminoglucósido, un antibiótico de quinolona, un antibiótico de sulfa, un antibiótico de polimixina, y una combinación de cualquiera de dos o más de los antibióticos anteriormente mencionados; en donde la concentración de al menos un segundo agente selectivo se selecciona para permitir el crecimiento de un microorganismo Salmonella .

La Modalidad 12 es la composición de la Modalidad 11, en donde al menos un segundo agente selectivo comprende una combinación de ácido nalidíxico, estreptomicina y polimixina B; en donde una concentración de cada uno de al menos un agente selectivo en la combinación, es seleccionado para permitir el crecimiento de un microorganismo Salmonella .

La Modalidad 13 es la composición de la Modalidad 5, en donde el primer agente selectivo comprende sales biliares; al menos un primer compuesto indicador diferencial comprende 2-desoxi-D-ribosa y melibiosa; el indicador de pH comprende rojo de fenol, el segundo sistema indicador diferencial comprende la urea, el tercer sistema indicador diferencial comprende 5-cloro-4-bromo-3-indoxil-ß-D-galactopiranósido ; y al menos un segundo agente selectivo comprende ácido nalidíxico, estreptomicina y polimixina B.

La Modalidad 14 es la composición de cualquiera de las Modalidades precedentes, en donde el agente de gelificación se selecciona del grupo que consiste en agar, agarosa, pectina, gelatina, goma guar, goma de xantano, goma de algarrobo, hidroxietilcelulosa , carboximetilcelulosa , alcohol polivinílico, alginato, y una combinación de cualesquiera dos o más de los anteriores.

La Modalidad 15 es una composición que consiste esencialmente de: un medio de cultivo semisólido que incluye: un agente de gelificación; un nutriente para facilitar el crecimiento de una pluralidad de microorganismos entéricos Gramnegat ivos ; al menos un primer agente selectivo que inhibe el crecimiento de una pluralidad de microorganismos Gramposit ivos ; un primer sistema indicador diferencial que comprende al menos un primer compuesto indicador diferencial; y un segundo sistema indicador diferencial que comprende un segundo compuesto indicador diferencial que es convertido por la actividad de la enzima ureasa a un segundo producto detectable; en donde el primer compuesto indicador diferencial es capaz de ser convertido por una pluralidad de miembros del género Salmonella a un primer producto detectable; en donde el primer compuesto indicador diferencial no puede ser convertido por una pluralidad de géneros de microorganismos entéricos Gramnegat ivos , no Salmonella , que forman colonias detectables en y/o sobre el medio de cultivo.

La modalidad 16 es una composición, que consiste esencialmente de: un medio de cultivo semisólido que incluye: un agente de gelif icación; un nutriente para facilitar el crecimiento de un microorganismo Salmonella; al menos un primer agente selectivo que inhibe el crecimiento de los microorganismos Grampositivos ; un primer sistema indicador diferencial que comprende al menos un primer compuesto indicador diferencial; y un segundo sistema indicador diferencial que comprende un segundo compuesto indicador diferencial que es convertido por la actividad de la enzima ureasa a un segundo producto detectable; en donde el primer compuesto indicador diferencial es capaz de ser convertido por una pluralidad de miembros del género Salmonella a un primer producto detectable; en donde el primer compuesto indicador diferencial no puede ser convertido por una pluralidad de géneros de microorganismos entéricos Gramnegativos , no Salmonella, que forman colonias detectables en y/o sobre el medio de cultivo .

La modalidad 17 es una composición, que consiste esencialmente de: un medio de cultivo semisólido que incluye: un agente de gelificación; un nutriente para facilitar el crecimiento de un microorganismo Salmonella ; al menos un primer agente selectivo que inhibe el crecimiento de microorganismos Grampositivos ; un primer sistema indicador diferencial que comprende al menos un primer compuesto indicador diferencial ; un segundo sistema indicador diferencial que comprende un segundo compuesto indicador diferencial que es convertido por la actividad de la enzima ureasa a un segundo producto detectable; y un tercer sistema indicador diferencial que comprende un tercer compuesto indicador diferencial que es convertido por una actividad de enzima ß-galactosidasa a un tercer producto detectable; en donde el primer compuesto indicador diferencial es capaz de ser convertido por una pluralidad de miembros del género Salmonella a un primer producto detectable; en donde el primer compuesto indicador diferencial no puede ser convertido por una pluralidad de géneros de microorganismos entéricos Gramnegativos , no Salmonella que forman colonias detectables en y/o sobre el medio de cultivo.

La Modalidad 18 es un método de detección de un microorganismo Salmonella, el método comprende: proporcionar una muestra de prueba, un dispositivo de cultivo, y la composición de cualquiera de las modalidades 1 a la 17; poner en contacto en el dispositivo de cultivo la composición y la muestra de prueba para formar un dispositivo de cultivo inoculado; incubar el dispositivo de cultivo inoculado por un primer periodo de tiempo; y observar el dispositivo de cultivo para detectar un primer producto detectable, en donde el primer producto detectable es una primera indicación de una presencia de un microorganismo Salmonella.

La modalidad 19 es el método de la Modalidad 18, en donde la detección del primer producto detectable comprende la observación de una reacción del indicador de pH con un compuesto ácido producido por una bacteria.

La Modalidad 20 es el método de la Modalidad 18 o la Modalidad 19, que comprende además la observación del medio nutritivo para detectar un segundo producto detectable, en donde el segundo producto detectable indica una presencia de un microorganismo no Salmonella.

La Modalidad 21 es el método de la Modalidad 20, en donde la detección de un segundo producto detectable comprende la observación de una reacción del indicador de pH con un compuesto básico producido por una bacteria.

La Modalidad 22 es el método de cualquiera de las Modalidades 18 a la 21, que comprende además la observación del medio nutritivo para detectar un tercer producto detectable, en donde el tercer producto detectable indica una presencia de un microorganismo no Salmonella .

La modalidad 23 es el método de la Modalidad 22, en donde la detección del tercer producto detectable comprende la detección de un producto coloreado, producido por la actividad de la enzima ß-galactosidasa .

La modalidad 24 es el método de cualquiera de las Modalidades 18 a la 21, que comprende además: la provisión de un artículo con un compuesto indicador confirmatorio que puede ser metabolizado por un microorganismo Salmonella a un cuarto producto detectable, en donde el cuarto producto detectable puede ser distinguido del primer producto detectable, el segundo producto detectable, y el tercer producto detectable, si está presente; poner en contacto el artículo con el medio de culti o; incubar el dispositivo por un segundo periodo de tiempo; y observar el dispositivo de cultivo para detectar el cuarto producto detectable; en donde la detección del cuarto producto detectable yuxtapuesto con el primer producto detectable es una segunda indicación de la presencia en la muestra de un microorganismo Salmonella.

La Modalidad 25 es el método de la Modalidad 24, en donde la incubación del dispositivo que comprende la incubación del dispositivo por aproximadamente 2 horas a aproximadamente 5 horas .

La Modalidad 26 es el método de cualquiera de las Modalidades 18 a la 25, que comprende además el conteo de un número de colonias de un primer tipo de microorganismos.

La Modalidad 27 es el método de la Modalidad 26, en donde la incubación del dispositivo que comprende además el conteo de un número de colonias de un segundo tipo de microorganismos .

La Modalidad 28 es el método de cualquiera de las Modalidades 18 a la 27, en donde la incubación del dispositivo de cultivo comprende la incubación del dispositivo de cultivo a una temperatura entre 41 y 44 °C, inclusive .

La Modalidad 29 es el método de cualquiera de las Modalidades 18 a la 28, en donde la observación del dispositivo de cultivo comprende la observación del dispositivo de cultivo visualmente.

La Modalidad 30 es el método de cualquiera de las Modalidades 18 a la 29, en donde la observación del dispositivo de cultivo comprende la creación de una imagen del dispositivo de cultivo utilizando un dispositivo formador de imágenes .

Modalidad 31 es el método de la Modalidad 30, que comprende además el análisis de la imagen utilizando un procesador .

EJEMPLOS Los objetivos y ventajas de esta invención son además ilustrados por los siguientes ejemplos, pero los materiales y cantidades particulares de los mismos indicados en estos ejemplos, así como otras condiciones y detalles, no deben ser considerados como indebidamente limitantes de esta invención. A no ser que se indique de otro modo, todas las partes y porcentajes están en una base en peso, toda el agua es agua destilada, y todos los pesos moleculares son peso molecular promedio en peso. Los cultivos bacterianos puros fueron preparados mediante la siembra por estría de los microorganismos seleccionados sobre placas de TSA (Placas de Agar de Soya Tripticaseína con 5 % de sangre de oveja; Hardy Diagnostics, Santa María, CA) e incubando las placas a 37°C toda la noche. Todas las cuentas de los microorganismos fueron realizadas de acuerdo a los procedimientos estándares de conteo microbiano para las unidades formadoras de colonias, y las cuentas son números aproximados .

Materiales. Los materiales, a no ser que se establezca de otro modo son comercialmente disponibles de Alfa Biosciences, Baltimore, MD . Los cultivos de microorganismos listados con un número de la ATCC fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA) . Los materiales utilizados en la preparación de los ejemplos son mostrados en la Tabla 1.

Tabla 1. Materiales EJEMPLO 1. Preparación de un Dispositivo de Cultivo de Película Delgada de Salmonella Un dispositivo de cultivo de película delgada fue preparado de acuerdo al procedimiento descrito en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No de Serie 61/488,492 (Caso del Abogado No. 67673US002) presentado el 20 de Mayo de 2011; la cual se incorpora por referencia en la presente en su totalidad. La composición en polvo utilizada para preparar el sustrato de papel recubierto con polvo fue elaborada al mezclar 2 partes en peso de 2-desoxi-D-ribosa (2DDR; Research Products International Corp.; Mt. Prospect, IL) y 98 partes de goma guar (goma MI50 guar MEYPROGAT, Meyhall Chemical AG) . Antes del recubrimiento de polvo, el papel fue recubierto con el adhesivo que contiene TTC.

La mezcla de recubrimiento en caldo fue preparada por la adición de los materiales listados en la Tabla 2 a un litro de agua desionizada en un recipiente, y se mezcló de acuerdo al método descrito en el Ejemplo 1 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,022,682.

Tabla 2. Ingredientes para la mezcla de recubrimiento en caldo.

Una mezcla del agente selectivo fue preparada por la adición de 0.1 gramo de IPTG, 2.0 gramos de urea, 5.0 gramos de Melibiosa (Sigma) , 0.005 g de Sal sódica de ácido nalidíxico, 0.005 gramos de Sal de sulfato de estreptomicina y 0.00075 gramos de Sal de sulfato de polimixina B a 30 mi de agua desionizada estéril en un tubo para centrífuga estéril de 50 mL y se agitó en torbellino para mezclar. La mezcla en caldo fue enfriada aproximadamente a 40°C y la mezcla del agente selectivo fue agregada con mezclado vigoroso. Fue preparado una película de cubierta al recubrir el caldo sobre el lado tratado en corona de una película de poliéster de 73.6 micrómetro (2.9 milésima de pulgada) .

El dispositivo de cultivo fue ensamblado de acuerdo a la Patente de los Estados Unidos No. 6,022,682; con el miembro base, un espaciador de espuma que tenía un círculo de 7.3 cm de diámetro cortado desde el centro para proporcionar un pozo, y la placa de cubierta adherida conjuntamente utilizando una cinta de transferencia de adhesivo. Las placas midieron aproximadamente 10.3 cm por 10.2 cm con un pozo circular que exponía la mezcla recubierta con caldo, seca aproximadamente en el centro de la placa.

EJEMPLO 2. Método de Detección de microorganismos Salmonella.

Cultivos puros de cepas bacterianas listadas en la Tabla 2, fueron cada uno inoculados dentro de Agua con Peptona Amortiguada (Merck, Darmstadt, Alemania) y se incubaron toda la noche a 37 °C. Las suspensiones bacterianas resultantes cada una tuvieron una concentración de aproximadamente lxlO9 unidades formadoras de colonia/ml (Ufc/ml) .

La placa de cultivo de película delgada del Ejemplo 1 fue preparada para la siembra por estrías por la adición de 1.5 mi de Diluyente de Fosfato Butterfields estéril (Edge Biologicals, Inc.; Memphis, TN) aproximadamente en la parte intermedia del pozo sobre el recubrimiento de polvo. La película de cubierta fue cerrada, el líquido fue dispersado utilizando un Dispersor Plano Petrifilm de 3M (3M Company; St . Paul, MN) y el gel se dejó hidratar por aproximadamente una hora. Cuando la película de cubierta fue abierta, el recubrimiento en caldo se había transferido a la superficie del gel en el miembro base. Un aza de 10 microlitros de la suspensión bacteriana fue colocado por estrías sobre la superficie del caldo sobre el gel. La cubierta fue cerrada y la placa fue incubada toda la noche a 42 °C. Las placas fueron preparadas para cada una de las especies bacterianas. Las placas fueron examinadas para el crecimiento de las colonias, el color de las colonias y el color de la zona de las colonias. Una colonia de color rojo a café (indicando oxidación del TTC) rodeada por una zona ácida amarilla (indicando fermentación de la 2-desoxi-D-ribosa y/o de la melibiosa por la colonia) indica un presunto resultado de prueba positivo para un microorganismo Salmonella. Una colonia rojo púrpura, con una zona púrpura que la rodea (debido a la hidrólisis de la urea) es un resultado de prueba negativo para un microorganismo Salmonella . Una colonia azul-verde (que indica hidrólisis de X-gal) con zona ácida amarilla que rodea la colonia indica que la colonia puede o no comprender un microorganismo Salmonella y que pueden ser indicadas pruebas adicionales. Las observaciones se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Cultivos bacterianos probados.

EJEMPLO 3. Uso de un Artículo de Detección para Detectar los Microorganismos Salmonella Un artículo de detección (disco) fue preparado como se describe en el Ejemplo 1 de la Solicitud Internacional de PCT No. WO2012/092181 ; la cual se incorpora por referencia en la presente en su totalidad.

Los dispositivos de cultivo de película delgada que contenían un presunto resultado positivo (es decir, las placas 1 y 2 del Ejemplo 2) fueron abiertas y un disco fue rodado (para reducir al mínimo las burbujas de aire) sobre la superficie del gel. Las placas fueron cerradas y fueron incubadas a 42 °C por 4 horas. El disco fue analizado para un cambio de color adyacente a las colonias, para confirmar si las colonias reaccionaron o no con el indicador (5-bromo-cloro-3 - indolil-a-D-galactopiranósido) presente en el artículo de detección. Un cambio en el color de la colonia de rojo o café a azul o azul obscuro indicó la presencia de un microorganismo Salmonella en las colonias. Los resultados de la prueba se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4.

La descripción completa de todas las patentes, solicitudes de patente, y las publicaciones, y el material electrónicamente disponible citado en la presente, son incorporados por referencia. En el caso en que exista cualquier inconsistencia entre la descripción de la presente solicitud y la o las descripciones de cualquier documento incorporado en la presente por referencia, la descripción de la presente solicitud gobernará. La descripción anteriormente detallada y los ejemplos han sido dados para claridad de entendimiento únicamente. No deben entenderse a partir de estas limitaciones innecesarias. La invención no está limitada a los detalles exactos mostrados y descritos, para variaciones obvias para una persona experta en la técnica que serán incluidas dentro de la invención definida por las reivindicaciones .

Todos los encabezados son para la conveniencia del lector y no deben ser utilizados para limitar el significado del texto que sigue al encabezado, a no ser que se especifique así.

Pueden ser realizadas diversas modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Estas y otras modalidades están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (10)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una composición, caracterizada porque comprende : un medio de cultivo semisólido, que incluye: un agente de gelificación: al menos un primer agente selectivo que inhibe el crecimiento de microorganismos Grampositivos ; un primer sistema indicador diferencial que comprende al menos un primer compuesto indicador diferencial; y un segundo sistema indicador diferencial que comprende un segundo compuesto indicador diferencial que es convertido por la actividad de la enzima ureasa a un segundo producto detectable; en donde el primer compuesto indicador diferencial es capaz de ser convertido por una pluralidad de miembros del género Salmonella a un primer producto detectable ,- en donde el primer compuesto indicador diferencial no puede ser convertido por una pluralidad de géneros de microorganismos entéricos Gramnegativos , no Salmonella, que forman colonias detectables en y/o sobre el medio de cultivo.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el primer compuesto indicador diferencial es un compuesto seleccionado del grupo que consiste de melibiosa, 2-desoxi-D-ribosa, manitol, L-arabinosa, dulcitol, maltosa, L-ramnosa, trehalosa, D-xilosa, sorbitol, y una combinación de cualquiera dos o más de los compuestos anteriores .

3. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además un tercer sistema indicador diferencial que comprende un tercer compuesto indicador diferencial que es convertido por una actividad de enzima ß-galactosidasa a un tercer producto detectable .

4. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además al menos un segundo agente selectivo que inhibe el crecimiento de al menos un microorganismo entérico Gram negativo que no es un miembro del género Salmonella.

5. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el primer agente selectivo comprende sales biliares; al menos uno del primer compuesto indicador diferencial comprende 2-desoxi-D-ribosa y melibiosa; el indicador de pH comprende rojo de fenol, el segundo compuesto indicador diferencial comprende 5-cloro-4-bromo-3-indoxil--D-galactopiranósido; y al menos un segundo agente selectivo comprende ácido nalidíxico, estreptomicina y poliraixina B.

6. Un método para detectar un microorganismo Salmonella, caracterizado porque comprende: proporcionar una muestra de prueba, un dispositivo de cultivo, y la composición de conformidad con la reivindicación 1; poner en contacto en el dispositivo de cultivo la composición y la muestra de prueba para formar un dispositivo de cultivo inoculado; incubar el dispositivo de cultivo inoculado por un primer periodo de tiempo; y observar el dispositivo de cultivo para detectar un primer producto detectable, en donde el primer producto detectable es una primera indicación de una presencia de un microorganismo Salmonella .

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque además comprende la observación del medio nutritivo para detectar un segundo producto detectable, en donde el segundo producto detectable indica una presencia de un microorganismo no Salmonella .

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque además la detección de un segundo producto detectable comprende la observación de una reacción del indicador de pH con un compuesto básico producido por una bacteria.

9. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque además la observación del medio nutritivo para detectar un tercer producto detectable, en donde el tercer producto detectable indica una presencia de un microorganismo no Salmonella .

10. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende además: la provisión de un artículo con un compuesto indicador confirmatorio que puede ser metabolizado por un microorganismo Salmonella a un cuarto producto detectable, en donde el cuarto producto detectable puede ser distinguido del primer producto detectable, el segundo producto detectable y el tercer producto detectable, si está presente; poner en contacto el artículo con el medio de cultivo; incubar el dispositivo por un segundo periodo de tiempo; y observar el dispositivo de cultivo para detectar el cuarto producto detectable; en donde la detección del cuarto producto detectable yuxtapuesto con el primer producto detectable es una segunda indicación de la presencia en la muestra de un microorganismo Salmonella.