JP2015503346A - サルモネラ微生物の検出方法 - Google Patents

Abstract

試料中のサルモネラ微生物を検出するための組成物が提供される。組成物は、グラム陽性微生物の増殖を阻害する少なくとも１つの第１の選択剤と、サルモネラ微生物によって第１の検出可能な生成物に変換される少なくとも１つの第１の識別指示化合物を含む第１の識別指示システムと、ウレアーゼ酵素活性により第２の検出可能な生成物に変換される第２の識別指示化合物を含む第２の識別指示システムと、を含む。所望により、上記組成物は更に、β−ガラクトシダーゼ酵素活性により第３の検出可能な生成物に変換される第３の識別指示化合物を含む第３の識別指示システムを含み得る。サルモネラ微生物を検出するために上記組成物を使用する方法もまた提供される。【選択図】図２

Description

発明の詳細な説明

（関連出願の相互参照）
［００１］本出願は、２０１１年１２月２８日に出願された米国特許仮出願第６１／５８０，８４９号の利益を主張し、その全体を参照として本明細書に組み込む。

（背景）
［００２］腸内細菌科は、糖（例えば、グルコース）を発酵させて乳酸及び／又は他の酸性最終生成物にする能力を有する代謝的に多様な、通性嫌気性微生物（bacteria）を数多く含む。この科は、大腸菌、サルモネラ属のいくつかの亜種、エルシニア菌、クレブシエラ属のいくつかの種、及びシゲラ属のいくつかの種のような、いくつかの周知のヒト病原体を含む。

［００３］サルモネラ属は、ヒトに病気を引き起こすことができる亜種を含む２つの種、Ｓ．エンテリカ及びＳ．ボンゴリを含む。病原性サルモネラのいくつかは、汚染された食物又は飲料の摂取を介してヒトに感染し得る。食物試料中のサルモネラ微生物の検出は、試料中のサルモネラ微生物（microorganisms）が比較的少数で存在すること、密接に関係する非サルモネラ腸内微生物が比較的多数存在すること、及び／又はサルモネラ微生物の増殖若しくは検出を邪魔し得る試料中の非微生物物質（例えば、食物粒子又は可溶性化学物質）の存在のために、困難であり得る。

［００４］試料中のサルモネラ微生物を検出するため及び１つ以上の非サルモネラ微生物からそれらを区別するために、様々な選択的及び／又は識別的な微生物培養培地が開発されてきた。典型的には、これらの培養培地は、非腸内微生物の増殖を阻害する選択剤を含んでいる。加えて、これらの培養培地の多くは、サルモネラと非サルモネラ微生物とを区別する１つ以上の識別指示システムに依存する。

［００５］試料中のサルモネラ微生物を検出するための様々な微生物培養培地があるものの、試料中のサルモネラ微生物を検出するための改善された方法は、なお必要とされている。

（要約）
［００６］概して、本開示は、試験試料中のサルモネラ微生物の有無を検出するための組成物及び方法に関する。具体的には、組成物は、サルモネラ微生物の増殖を促進するものであり、グラム陽性微生物の増殖を阻害する少なくとも１つの選択剤を含んでいる。更に、組成物は、少なくとも２つの識別指示システムを含む。識別指示システムの少なくとも１つは、非サルモネラ微生物からサルモネラ微生物を陽性に識別し、識別指示システムの少なくとも１つは、非サルモネラ微生物からサルモネラ微生物を陰性に識別する。

［００７］一態様において、本開示は、組成物を提供する。組成物は、ゲル化剤と、グラム陽性微生物の増殖を阻害する少なくとも１つの第１の選択剤と、少なくとも１つの第１の識別指示化合物を含む第１の識別指示システムと、ウレアーゼ酵素活性により第２の検出可能な生成物に変換される第２の識別指示化合物を含む第２の識別指示システムと、を含む、半固体の培養培地を含み得る。第１の識別指示化合物は、サルモネラ属に属する複数のメンバーにより第１の検出可能な生成物に変換され得る。第１の識別指示化合物は、培養培地の中及び／又は上に検出可能なコロニーを形成する複数の非サルモネラ属のグラム陰性腸内微生物により第１の検出可能な生成物に変換され得ない。

［００８］組成物の任意の実施形態において、第１の識別指示化合物は、メリビオース、２−デオキシ−Ｄ−リボース、マンニトール、Ｌ−アラビノース、ダルシトール、マルトース、Ｌ−ラムノース、トレハロース、Ｄ−キシロース、ソルビトール、及び前述の化合物の任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される化合物を含むことができる。上記の実施形態のいずれかにおいて、組成物は、緩衝試薬を更に含むことができる。緩衝試薬は、ＭＯＰＳ、リン酸塩、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。

［００９］上記実施形態のいずれかにおいて、組成物は、β−ガラクトシダーゼ酵素活性により第３の検出可能な生成物に変換される第３の識別指示化合物を含む第３の識別指示システムを更に有し得る。任意の実施形態において、第３の識別指示化合物は、発色酵素基質を含み得る。任意の実施形態において、第３の識別指示化合物は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、３，４−シクロヘキセノエスクレチン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、及び６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドからなる群から選択され得る。

［００１０］上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの第１の選択剤は、胆汁酸塩、コール酸、デオキシコール酸、クリスタルバイオレット、又は前述の化合物の任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択することができる。上記実施形態のいずれかにおいて、ｐＨ指示薬は、フェノールレッド、クロロフェノールレッド、ニュートラルレッド、ブロモチモールブルー、及びブロモチモールパープルからなる群から選択され得る。

［００１１］上記実施形態のいずれかにおいて、組成物は、サルモネラ属に属するものではない少なくとも１つのグラム陰性腸内微生物の増殖を阻害する少なくとも１つの第２の選択剤を更に含み得る。少なくとも１つの第２の選択剤は、β−ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、キノロン系抗生物質、サルファ系抗生物質、ポリミキシン系抗生物質、及び前述の抗生物質の任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択され得、少なくとも１つの第２の選択剤の濃度は、サルモネラ微生物の増殖を可能にするように選択される。上記の実施形態のいずれかにおいて、ゲル化剤は、寒天、アガロース、ペクチン、ゼラチン、グアーガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、アルギン、及び前述のゲル化剤の任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。

［００１２］別の態様では、本開示は、サルモネラ微生物の検出方法を提供する。方法は、試験試料、培養装置、及び上記の実施形態のいずれか１つに記載の組成物を準備することと、播種された培養装置を形成するために培養装置内で組成物と試験試料を接触させることと、第１の時間、播種された培養装置をインキュベートすることと、培養装置を観察して、第１の検出可能な生成物を検出することと、を含み、第１の検出可能な生成物はサルモネラ微生物の存在の第１の指示である。

［００１３］方法の任意の実施形態において、第１の検出可能な生成物を検出することは、微生物により産生された酸性化合物とｐＨ指示薬との反応を観察することを含み得る。任意の実施形態において、方法は、栄養培地を観察し、第２の検出可能な生成物を検出することを更に含み、第２の検出可能な生成物は非サルモネラ微生物の存在を示す。第２の検出可能な生成物を検出することは、微生物により産生された塩基性化合物とｐＨ指示薬との反応を観察することを含み得る。任意の実施形態において、方法は、栄養培地を観察し、第３の検出可能な生成物を検出することを更に含むことができ、第３の検出可能な生成物は非サルモネラ微生物の存在を示す。第３の検出可能な生成物を検出することは、β−ガラクトシダーゼ酵素活性により産生される、着色された生成物を検出することを含み得る。

［００１４］上記実施形態のいずれかにおいて、本方法は、サルモネラ微生物によって第４の検出可能な生成物に代謝され得る確定指示化合物を有する物品を提供することと、物品を培養培地と接触させることと、装置を第２の時間インキュベートすることと、培養装置を観察して、第４の検出可能な生成物を検出することと、を更に含み、第４の検出可能な生成物が存在する場合には、第１の検出可能な生成物、第２の検出可能な生成物、及び第３の検出可能な生成物から区別され得るものであり、第１の検出可能な生成物と並べて第４の検出可能な生成物を検出することは、試料中のサルモネラ微生物の存在の第２の指示である。

［００１５］上記の実施形態のいずれかにおいて、方法は、第１のタイプの微生物のコロニーの数を計数することを更に含み得る。任意の実施形態において、方法は、第２のタイプの微生物のコロニーの数を計数することを更に含み得る。方法の任意の実施形態において、培養装置を観察することは、培養装置を目視で観察することを含み得る。方法の任意の実施形態において、培養装置を観察することは、撮像装置を使用して培養装置の画像を作成することを含み得る。任意の実施形態において、方法は、プロセッサを使用して画像を分析することを更に含み得る。

［００１６］用語「好ましい」及び「好ましくは」とは、特定の状況下で、特定の利益をもたらすことができる、本発明の実施形態を指す。しかしながら、他の実施形態もまた、同じ状況又は他の状況下で、好ましい場合がある。更には、１つ以上の好ましい実施形態の詳細説明は、他の実施形態が有用ではないことを意味するものではなく、更に本発明の範囲から他の実施形態を排除することを意図するものでもない。

［００１７］本明細書で使用する「サルモネラ微生物」は、サルモネラ属に属する任意の微生物を指す。

［００１８］本明細書で使用する「識別指示システム」は、２種類の化合物の少なくとも１つ（本明細書では「識別指示化合物」と呼ぶ）を検出可能な生成物に変換する微生物のそれぞれの能力に基づいて、２種類の微生物を区別するために使用される１つ以上の化合物を指す。場合によっては、識別指示化合物（例えば、２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド）は、ある種の微生物によって、検出可能な生成物（例えば、２−ニトロフェノール）に直接変換され得る。場合によっては、例えば、識別指示化合物（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド）は、ある種の微生物によって空気の存在下で反応して検出可能な生成物（インディゴ染料の１種）を形成し得る中間生成物に変換され得る。場合によっては、例えば、識別指示化合物（例えば、メリビオースのような発酵性の炭水化物）は、ある種の微生物によって、その識別指示システム（例えば、クロロフェノールレッドのようなｐＨ指示薬）のもう一方の成分と反応して検出可能な色の変化を他方の成分に引き起こすことができる、検出可能な生成物（例えば、乳酸）に変換され得る。

［００１９］用語「含む」及びその変化形は、これらの用語が、本説明及び特許請求の範囲に現れる場合、限定する意味を有するものではない。

［００２０］本明細書で使用するところの「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、「少なくとも１つの」及び「１つ以上の」は、互換可能に使用される。したがって、例えば、微生物は、「１つ以上の」微生物を意味すると解釈され得る。

［００２１］用語「及び／又は」とは、列記される要素のうちの１つ若しくは全て、又は列記される要素のうちの任意の２つ以上の組み合わせを意味する。

［００２２］また本明細書では、端点による数値範囲の記載は、その範囲に含まれるすべての数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。

［００２３］上記の本発明の課題を解決するための手段は、本発明の開示されるそれぞれの実施形態、又は本発明のすべての実施を説明することを目的としたものではない。以下の説明は、例示的な実施形態をより具体的に例示するものである。本出願の全体にわたるいくつかの箇所で、実施例のリストを通じて指針が提供され、それらの実施例は、様々に組み合わせて使用することができる。いずれの場合も、記載されるリストは、あくまで代表的な群としてのみの役割を果たすものであって排他的なリストとして解釈するべきではない。

［００２４］これらの及び他の実施形態の更なる詳細が、添付の図面及び以下の説明に記載されている。他の特徴、目的、及び利点は、その説明と図面、及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。

［００２５］本開示によるサルモネラ微生物を検出する方法の一実施形態のブロック図を示す。 ［００２６］図１に示した方法を使用して得られた結果を解釈するために使用されるフローチャートの一実施形態のブロック図を示す。

（詳細な説明）
［００２７］サルモネラ属には、２つの種、サルモネラエンテリカ及びサルモネラボンゴリが含まれる。２つの種の遺伝的関係は、Ｆｏｏｋｅｓらによって研究されている（参照により本明細書にその全体が援用される「Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｂｏｎｇｏｒｉ Ｐｒｏｖｉｄｅｓ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅ」、ＰＬＯｓ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ａｔ ｗｗｗ．ｐｌｏｓｐａｔｈｏｇｅｎｓ．ｏｒｇ，２０１１，ｖｏｌ．７、記事番号ｅ１００２１９１、ｐ １〜１６）。Ｓ．エンテリカの亜種は、人に病気を感染させる及び病気を引き起こす能力のために、Ｓ．ボンゴリよりもよく知られているが、Ｓ．ボンゴリもまた人の感染を引き起こすことが示されている。したがって、潜在的な病原性を有するサルモネラ微生物を検出するように設計されたテストは、両方の種を検出する能力を有する必要がある。

［００２８］本開示は、広くは、試料中のサルモネラ微生物を検出する方法に関する。具体的には、本開示は、非サルモネラ微生物（例えば、大腸菌及び他の腸内細菌科の菌）からサルモネラ微生物を区別することができる組成物及び増殖に基づく検出方法に関する。本発明の方法は、複数の識別指示試薬を含む選択的増殖培地を組み合わせる。所望により、方法は、Ｓ．ボンゴリ微生物を非サルモネラβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ産生微生物から区別するために上げられたインキュベーション温度を使用することができる。

［００２９］サルモネラの増殖に基づく検出及び識別は、概して、非サルモネラ微生物の存在下でサルモネラ菌株を特異的に検出する生化学反応の使用を必要とする。残念ながら、従来の検出システムのほとんどは、試料中に存在し得る非サルモネラ腸内細菌微生物からサルモネラ微生物を十分に特異的に差別化するものではない。テストは、しばしば、試料中に見つかったサルモネラ微生物から非サルモネラ微生物を差別化するために追加的な試薬及び手順（例えば、免疫学的又は遺伝学的テスト）を必要とする。

［００３０］不運にも、非サルモネラ腸内微生物（例えば、コリフォーム菌）の群を検出するために一般に使用される反応のいくつかは、サルモネラ菌株の全てを陰性に識別しない。例えば、サルモネラ微生物のいくつかは、特定の化合物（例えば、メリビオース、２−デオキシ−Ｄ−リボース、ダルシトール、トレハロースなど）を炭素源及び／又はエネルギー源として使用する代謝能力を有する。これらの化合物を利用するプロセスにおいて、サルモネラ微生物は、検出可能な最終生成物（すなわち、有機酸）を生成することができる。したがって、これらの化合物の利用を検出する指示システムを使用して、試験試料中のサルモネラ微生物の存在を検出することができる。他のほとんどの微生物は、同じ代謝能力を持っていない。しかし、いくつかの非サルモネラのグラム陰性腸内微生物は、化合物を利用する能力を有し得る。したがって、非サルモネラ微生物をサルモネラ微生物から区別するために、少なくとも１つの他の指示システムを含めることが望ましい。他の指示システムは、非サルモネラ微生物からサルモネラ微生物を陽性に識別する（すなわち、サルモネラ微生物が指示システムと概して反応し、非サルモネラ微生物が指示システムと概して反応しない）ように機能するか、又はサルモネラ微生物を非サルモネラ微生物から陰性に識別する（すなわち、サルモネラ微生物が指示システムと概して反応せず、非サルモネラ微生物が指示システムと概して反応する）ように機能することができる。

［００３１］本開示の発明の組成物は、作業者がサルモネラ微生物を少なくとも２種類の非サルモネラのグラム陰性腸内微生物から区別（すなわち差別化）する方法を実行することを可能にする少なくとも２つの識別指示システムを含む。すなわち、本開示の組成物は、第１の指示化合物を代謝しない非サルモネラ微生物からサルモネラ微生物を陽性に識別し、同時に、この組成物は、第２の識別指示化合物を代謝する能力を有する非サルモネラ微生物から、第２の識別指示化合物を代謝することができないサルモネラ微生物を陰性に識別する。この方法及び組成物は、試験試料中のサルモネラ微生物の有無の推定証拠を提供する。更に、この組成物は、試験試料中のサルモネラ微生物の存在の確定証拠を提供するために、第３の識別指示システムを含むことができ、及び／又は第４の識別指示システムと共に方法において使用することができる。

［００３２］本開示は、サルモネラ微生物を検出する組成物を提供する。組成物は、ゲル化剤と、グラム陽性微生物の増殖を阻害する少なくとも１つの第１の選択剤と、少なくとも１つの第１の識別指示化合物を含む第１の識別指示システムと、ウレアーゼ酵素活性により第２の検出可能な生成物に変換される第２の識別指示化合物を含む第２の識別指示システムと、を含む、半固体の培養培地を含む。少なくとも１つの第１の識別指示化合物は、サルモネラ属に属する複数のメンバーにより第１の検出可能な生成物に変換され得る。加えて、少なくとも１つの第１の識別指示化合物は、培養培地の中及び／又は上に検出可能なコロニーを形成する複数の非サルモネラ属のグラム陰性腸内微生物によって変換され得ない。

［００３３］本開示の培養培地は、ゲル化剤を含む。ゲル化剤は、グラム陰性腸内微生物を培養するために使用される半固体の微生物培養培地での使用に適切な任意のゲル化剤を含み得る。適切なゲル化剤の非限定的な例としては、寒天、アガロース、ペクチン、ゼラチン、グアーガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、アルギン、及び前述のものの任意の２つ以上の組み合わせが挙げられる。

［００３４］本開示の培養培地は、グラム陰性腸内微生物の増殖を促進する栄養素を更に含み得る。このような栄養素は、当該技術分野で周知であり、例えば、１つ以上のペプトン（例えば、カゼインの膵臓消化物、動物組織のペプシン消化物、ペプトン、ゼラチンの膵臓消化物、プロテオースペプトンなど）及び／又は１つ以上の増殖補助剤（例えば、酵母エキス、肉エキス（ビーフ／ブタなど）、Ｍｇ、Ｍｎ及び／又はＣａの塩、糖など）が含まれる。培養培地は、他の栄養素（例えば、ミネラル又は他の成分）を含んでもよく、もし存在する場合には、それらは第１の識別指示システム、第２の識別指示システム及び／又は第３の識別指示システムの機能を実質的に干渉しない。

［００３５］本開示の培養培地は、少なくとも１つの第１の識別指示化合物を含む第１の識別指示システムを含む。第１の識別指示システムは、複数の非サルモネラのグラム陰性腸内微生物からサルモネラ微生物を陽性に識別する識別指示システムである。したがって、第１の識別指示化合物は、サルモネラ属に属する複数のメンバーにより第１の検出可能な生成物に変換され得る。更に、第１の識別指示化合物は、複数の非サルモネラ属のグラム陰性腸内微生物によって第１の検出可能な生成物に変換されない。

［００３６］好ましくは、第１の識別指示化合物は、サルモネラボンゴリ種に属する微生物により第１の検出可能な生成物に変換され得る。より好ましくは、第１の識別指示化合物はまた、Ｓ．ボンゴリ以外の種に属するサルモネラ微生物（例えばＳ．エンテリカ）によって第１の検出可能な生成物に変換される。いくつかの実施形態では、第１の識別指示システムは、少なくとも１つの非サルモネラ腸内微生物により第１の検出可能な生成物に変換され得る第１の識別指示化合物を含み得る。有利には、第２の識別指示システム、及び／又は存在する場合は、第３の識別指示システムを使用して、組成物中又は組成物上に増殖している非サルモネラ微生物をサルモネラ属の微生物から陰性に識別することができる。

［００３７］いくつかの実施形態では、第１の識別指示化合物は、微生物（例えば、サルモネラ属に属する微生物）によって（例えば、発酵を介して）第１の検出可能な生成物（例えば、乳酸のような１つ以上の酸性化合物、及び／又は例えば、二酸化炭素及び／又は水素のような気体）に変換され得る栄養素（例えば、炭水化物）である。当業者は、第１の検出可能な生成物が第１の識別指示化合物の発酵により産生される酸性化合物であるとき、２つの異なる微生物により産生される酸性化合物は同じ酸性化合物である場合もあり、又はそれらは異なる酸性化合物である場合もあることを理解するであろう。

［００３８］酸性化合物が第１の検出可能な生成物である実施形態において、第１の識別指示システムは、ｐＨ指示薬を更に含み得る。当該技術分野では、微生物により産生される酸性化合物を検出する多数のｐＨ指示薬が既知である。適したｐＨ指示薬の非限定的な例としては、フェノールレッド、クロロフェノールレッド、ニュートラルレッド、ブロモチモールブルー、及びブロモチモールパープルが挙げられる。第１の検出可能な生成物が気体を含むいくつかの実施形態では、気体は、例えば、気体を捕捉することによって（例えば、本明細書にその全体が参照により組み込まれるＰＥＴＲＩＦＩＬＭ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ Ｃｏｕｎｔ ＰｌａｔｅのＩｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅに記載のように、薄膜培養装置においてヒドロゲルにそれを捕捉することによって）検出され得る。

［００３９］好ましくは、第１の識別指示化合物が栄養素を含む実施形態において、第１の識別指示化合物は、複数のサルモネラ種及び／又は亜種によって、第１の検出可能な生成物に変換される。より好ましくは、第１の識別指示薬は、サルモネラ属に属さないグラム陰性腸内微生物の多くの種によって第１の検出可能な生成物に変換されない栄養素を含む。より好ましくは、第１の識別指示薬の栄養素は、非サルモネラ微生物によって第１の検出可能な生成物に変換されない栄養素を含む。適した第１の識別指示化合物の非限定的な例としては、メリビオース、２−デオキシ−Ｄ−リボース、マンニトール、Ｌ−アラビノース、ダルシトール、マルトース、Ｌ−ラムノース、トレハロース、Ｄ−キシロース、ソルビトール、及び前述の化合物の任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される化合物が挙げられる。

［００４０］いくつかの実施形態では、第１指示化合物は酵素基質を含み得る。適した酵素基質としては、サルモネラ属に属する微生物によって第１の検出可能な生成物（例えば、着色された生成物又は蛍光生成物）に（例えば、酵素による加水分解などにより）変換される発色酵素基質又は蛍光酵素基質が挙げられる。好ましくは、酵素基質は、サルモネラボンゴリ種に属する微生物によって、及びＳ．エンテリカ種に属する微生物によって、第１の検出可能な生成物に変換される。適した酵素基質の非限定的な例としては、カプリレートエステラーゼ酵素活性を検出する又はα−ガラクトシダーゼ酵素活性を検出する酵素基質が挙げられる。適した発色酵素基質としては、例えば、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルカプリレート、４−ニトロフェニルカプリレート、２−ナフチルカプリレート、４−メチルウンベリフェリルカプリレート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、１−ナフチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、２−ナフチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、レソルフィニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、４−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される酵素基質が挙げられる。

［００４１］本開示の培養培地は、ウレアーゼ酵素活性の指示薬を含む第２の識別指示システムを含む。第２の識別指示システムは、複数の非サルモネラのグラム陰性腸内微生物からサルモネラ微生物を陰性に差別化する識別指示システムである。したがって、第２の識別指示化合物は、複数の非サルモネラ属のグラム陰性腸内微生物によって第２の検出可能な生成物に変換され得る。更に、第２の識別指示化合物は、サルモネラ属に属する複数のメンバーによって第２の検出可能な生成物に変換されない。

［００４２］ウレアーゼは、特定の非サルモネラのグラム陰性腸内微生物に見出される酵素である（例えば、プロテウス属、クレブシエラ属、モルガネラ属、プロビデンシア属、及びセラチア属に属する特定の種）。これらの微生物のいくつか（例えば、プロテウス・ミラビリス。例えば、参照によりその全体が本明細書に援用されるＪＭ Ｍａｔｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７２，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２３，ｐｐ ５９２〜５９４を参照）は、１つ以上の第１の識別指示化合物（例えば、トレハロース、キシロース）を第１の検出可能な生成物に変換することができる。したがって、本明細書に記載の第１の識別指示システムのみを含有する識別培養培地において、これらの非サルモネラのグラム陰性腸内微生物の１つからサルモネラ微生物を区別することは不可能であり得る。有利には、サルモネラ微生物は、典型的には、ウレアーゼ酵素活性を有さないので、第２の識別指示システムを培養培地に加えることによって、サルモネラ微生物を非サルモネラ微生物から区別することができる。

［００４３］本開示の第２の識別指示システムは、尿素及び適したｐＨ指示薬（例えば、フェノールレッド、クロロフェノールレッド、ニュートラルレッド、ブロモチモールブルー、及びブロモチモールパープル、又はフタルヒドラジジルアゾアセチルアセトン）を含み得る。ウレアーゼ酵素活性は、尿素を二酸化炭素とアンモニアに加水分解し、水の存在下で水酸化アンモニウムを形成する。したがって、いくつかの実施形態では、第２の検出可能な生成物は、アンモニウム化合物を含む。ウレアーゼ活性を有し、尿素の存在下で増殖する微生物コロニーは、アンモニウム化合物を生成し、コロニーの周囲の培養培地のｐＨの上昇を引き起こす。培養培地に存在する適切なｐＨ指示薬は、結果として生じたｐＨの変化を、典型的には、微生物コロニーを包囲する領域又は光の輪として指示し得る（例えば、ｐＨ指示薬がフェノールレッドである場合、コロニーはバイオレットに染色される場合がある及び／又はコロニーはその周囲にバイオレットの領域を有する場合がある）。ウレアーゼ酵素活性の他の指示薬も好適な場合があり、例えば、蛍光ウレアーゼ酵素基質（例えば、３−（１−アセチルアセトニルアゾ）フタルヒドラジド）が含まれる。

［００４４］本開示の組成物は更に、グラム陽性微生物の増殖を阻害するために、少なくとも１つの第１の選択剤を含み、それにより、栄養素のための競争を減らし、サルモネラ属の微生物のようなグラム陰性微生物の増殖を促進する。好適な第１の選択剤の非限定的な例としては、抗生物質、胆汁酸塩、胆汁酸塩Ｎｏ．３、コール酸、デオキシコール酸、クリスタルバイオレット、塩化ナトリウム、ノボビオシン、ナリジクス酸、ストレプトマイシン、ポリミキシンＢ、及び前述の選択剤の任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される選択剤が挙げられる。

［００４５］本開示の組成物は、所望により、サルモネラ属に属するものではない少なくとも１つのグラム陰性腸内微生物の増殖を阻害するために、少なくとも１つの第２の選択剤を含み得る。いくつかの実施形態では、第２の選択剤はまた、少なくとも１つのグラム陽性微生物の増殖を阻害し得る。有利には、第２の選択剤は第１の選択剤と組み合わされて、微生物（グラム陰性及び／又はグラム陽性微生物）を更に阻害し、それにより、栄養素のための競争を減らし、サルモネラ微生物の増殖を促進する。加えて、少なくとも１つの第２の選択剤はまた、さもなければ第１の識別化合物及び／又は第３の識別化合物をそのそれぞれの検出可能な生成物に変換するであろう非サルモネラのグラム陰性微生物の増殖を、実質的に防ぐことができる。したがって、第２の選択剤は、非サルモネラ微生物が組成物中又は組成物上で増殖する可能性、及び可能なサルモネラ微生物として解釈される可能性を、低減し得る。好適な第２の選択剤の非限定的な例としては、β−ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、キノロン系抗生物質、サルファ系抗生物質、ポリミキシン系抗生物質、及び前述の抗生物質の任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される選択剤が挙げられる。一実施形態では、少なくとも１つの第２の選択剤は、ナリジクス酸、ストレプトマイシン、及びポリミキシンＢを含む。好ましくは、栄養培地における少なくとも１つの第２の選択剤のそれぞれの濃度は、サルモネラ微生物の増殖を可能にするように選択される。より好ましくは、栄養培地における少なくとも１つの第２の選択剤のそれぞれの濃度は、全てのサルモネラ微生物の増殖を可能にするように選択される。

［００４６］所望により、本開示の組成物は更に、β−ガラクトシダーゼ酵素活性により、第３の検出可能な生成物に変換される第３の識別指示化合物を含む第３の識別指示システムを含み得る。本開示の第３の識別指示システムは、β−ガラクトシダーゼ酵素活性により第３の検出可能な生成物に変換され得る第３の識別指示化合物を含む。したがって、第３の識別指示システムは、β−ガラクトシダーゼ酵素活性を生成する微生物と、β−ガラクトシダーゼ酵素活性を生成しない微生物と、を区別する。例えば、Ａ．Ｒａｍｂａｃｈ（本明細書に参照によりその全体が援用される「Ｎｅｗ ｐｌａｔｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．Ｆｒｏｍ Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐｐ．Ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｅｎｔｅｒｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ」，１９９０，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．５６，ｐｐ．３０１〜３０３）により開示されているように、多くのサルモネラは、β−ガラクトシダーゼ酵素活性を生成せず、β−ガラクトシダーゼ酵素活性の指示薬を使用することによって、腸内細菌科のラクトース利用微生物から差別化することができる。

［００４７］しかし、いくつかの報告書は、いくつかのサルモネラの種（例えば、Ｓ．ボンゴリ）及び亜種（例えば、Ｓ．エンテリカアリゾナエ及びＳ．エンテリカジアリゾナエ）からの単離された微生物の９０％以上がβ−ガラクトシダーゼ酵素活性を生成することを見出したことを示している（例えば、参照によりその全体が本明細書に援用されるＡ．Ｍ．Ｌｉｔｔｅｌｌの「Ｐｌａｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｒｉｚｏｎａｅ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅ」，１９７７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．３３，ｐｐ ４８５〜４８７を参照）。したがって、β−ガラクトシダーゼ酵素活性に基づいてサルモネラ微生物と非サルモネラ微生物とを区別するように設計された培養培地及び／又は対応する手順は、試料中にβ−ガラクトシダーゼ産生サルモネラが存在する場合に、試料中のサルモネラ微生物の数を誤って過小評価する可能性がある。本研究者らは、驚くべきことに、その方法に使用される培養培地がサルモネラ微生物と非サルモネラ微生物とを区別するためにβ−ガラクトシダーゼ酵素活性の指示薬に依存するときでさえも、いくつかのβ−ガラクトシダーゼ産生サルモネラ微生物を区別することができる方法を発見した。

［００４８］本開示に従った好適な第３の識別指示化合物の非限定的な例としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、３，４−シクロヘキセノエスクレチン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、及び４−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドが挙げられる。いくつかの実施形態では、第３の識別指示システムは、第３の識別指示化合物（例えば、ラクトース）及びｐＨ指示薬を含む。任意の実施形態において、所望により、組成物は更に、例えば、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）のようなβ−ガラクトシダーゼ酵素活性の誘導物質を含むことができる。

［００４９］試験試料中の微生物を検出するために、組成物の任意の実施形態を培養装置において使用し得る。好適な培養装置としては、例えば、試料中に存在する微生物を検出するプロセスにおいて栄養培地を保持するために使用される任意の培養装置が含まれる。好適な培養装置の非限定的な例としては、ペトリ皿、マルチウェルプレート、試験管、フラスコ、薄膜培養装置などが挙げられる。

［００５０］本開示の組成物は、米国特許第４，５６５，７８３号、同第５，６０１，９９８号、同第５，６８１，７１２号、同第６，２６５，２０３号、及び同第６，６３８，７５５号（これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されているような脱水された形態において薄膜培養装置に配置し得る。これらの実施形態において、試料（例えば、水性液体試料又は水性懸濁媒体中に懸濁された固体試料）は、例えば、培養装置に試料をピペッティングすることによって脱水成分と接触させることができる。この実施形態では、試料が培養装置内に堆積される前又は後に、組成物の成分の１つ以上が試料に溶解され得る又は懸濁され得る。

［００５１］所望により、本開示の組成物を含有する培養装置（例えば、薄膜培養装置）は、非識別指示システムを更に含むことができる。好適な非識別指示化合物は、増殖している微生物によって代謝されるか又はそれらと反応する指示化合物を含み、そうすることにより、微生物コロニー又はそのコロニーに隣接している栄養培地が可視化、撮像及び／又は定量化の容易さのために着色されること又は蛍光することを引き起こすことができる第４の検出可能な生成物を生成する。非識別指示薬、及びそれに由来する第４の検出可能な生成物は、第１の検出可能な生成物又は第２の検出可能な生成物及び／又は播種した培地中に存在する場合、第３の検出可能な生成物の検出を、実質的に妨害してはならない。好適な非識別指示化合物の非限定的な例としては、トリフェニルテトラゾリウムクロライド、ｐ−トリルテトラゾリウムレッド、テトラゾリウムバイオレット、ベラトリルテトラゾリウムブルー、及び５−ブロモ−４ークロロ−３−インドリル−リン酸二ナトリウム塩のような発色性レドックス指示薬が挙げられる。非識別指示システムは、所望により、米国特許第４，５６５，７８３号に記載されているように、薄膜培養装置の接着層に提供されてもよい。

［００５２］一実施形態では、組成物は、ゲル化剤（例えば、本明細書に記載のような任意の好適なゲル化剤）と、サルモネラ微生物の増殖を促進する栄養素（例えば、本明細書に記載のような任意の好適な栄養素）と、グラム陽性微生物の増殖を阻害する少なくとも１つの第１の選択剤（例えば、本明細書に記載のような任意の好適な第１の選択剤）と、少なくとも１つの第１の識別指示化合物を含む第１の識別指示システム（例えば、本明細書に記載のような任意の好適な第１の識別指示システム及び第１の指示化合物）と、ウレアーゼ酵素活性によって第２の検出可能な生成物に変換される第２の識別指示化合物を含む第２の識別指示システム（例えば、本明細書に記載のような、任意の好適な第２の識別指示システム及び第２の識別指示化合物）と、から本質的になる。この実施形態では、第１の識別指示化合物は、サルモネラ属に属する複数のメンバーにより第１の検出可能な生成物に変換され得る。この実施形態では、第１の識別指示化合物は、培養培地の中及び／又は上に検出可能なコロニーを形成する複数の非サルモネラ属のグラム陰性腸内微生物によって変換され得ない。

［００５３］一実施形態では、組成物は本質的に、ゲル化剤（例えば、本明細書に記載のような任意の好適なゲル化剤）と、サルモネラ微生物の増殖を促進する栄養素（例えば、本明細書に記載のような任意の好適な栄養素）と、グラム陽性微生物の増殖を阻害する少なくとも１つの第１の選択剤（例えば、本明細書に記載のような任意の好適な第１の選択剤）と、少なくとも１つの第１の識別指示化合物を含む第１の識別指示システム（例えば、本明細書に記載のような任意の好適な第１の識別指示システム及び第１の指示化合物）と、ウレアーゼ酵素活性によって第２の検出可能な生成物に変換される第２の識別指示化合物を含む第２の識別指示システム（例えば、本明細書に記載のような、任意の好適な第２の識別指示システム及び第２の識別指示化合物）と、β−ガラクトシダーゼ酵素活性によって第３の検出可能な生成物に変換される第３の識別指示化合物を含む第３の識別指示システム（例えば、本明細書に記載のような任意の好適な第３の識別指示システム及び第３の指示化合物）と、からなる。この実施形態では、第１の識別指示化合物は、サルモネラ属に属する複数のメンバーにより、第１の検出可能な生成物に変換され得る。この実施形態では、第１の識別指示化合物は、培養培地の中及び／又は上に検出可能なコロニーを形成する複数の非サルモネラ属のグラム陰性腸内微生物よって変換され得ない。

［００５４］本開示の組成物は、試料中のサルモネラ微生物を検出する方法に使用し得る。本開示の方法で試験した試料は、サルモネラ微生物を含有することが疑われ得る様々な試料を含む。特に関心のもたれる試料としては、食品加工作業又は飲料加工作業からの原材料、中間生成物、又は完成品が含まれる。他の好適な試料としては、水試料（例えば、地表水、処理水）、環境試料（例えば、空気試料、壁、床、ドレン、食品接触面、処理装置からの表面試料）、及び臨床試料が挙げられる。臨床試料の非限定的な例としては、血液、胆汁、胃腸試料、大腸試料、及び糞便試料が挙げられる。試験試料としては、液体、並びに液体媒質中に溶解又は懸濁した固体を挙げることができる。

［００５５］図１は、本開示に従って試料中のサルモネラ微生物を検出する方法１０の一実施形態を示す。方法１０は、試験試料、組成物の成分、及び培養装置を提供する工程４５を含む。組成物の成分は、培養装置内に準備してもよく（例えば、水和された成分としてペトリ皿に、実質的に無水の、再水和可能な１つ又は複数のコーティングとして薄膜培養装置に、など）、又は当該技術分野で既知の方法に従って培養装置に添加してもよい。

［００５６］方法１０は、組成物と試料とを接触させて、播種した培養装置を形成する工程５０を更に含む。試料は、様々な方法のいずれかにおいて、組成物を有する培養装置内で接触させることができる。例えば、方法の一実施形態では、組成物は、水和された形態（例えば、水和された半固体培養培地）の混合物として、培養装置内に配置し得る。この実施形態では、試料（例えば、液体サンプル、固体サンプル、フィルター上に捕捉された液体及び／又は固体試料、液体培地中に懸濁された固体試料）を、例えば、ピペッティング、拡散板播種法、及びストリークプレート播種法のような、当該技術分野で既知の技術によって、混合物の中又は上に堆積し、所望により、分配することができる。

［００５７］代替実施形態では、組成物を含む混合液（例えば、溶融し、焼戻した寒天溶液）に試料（例えば、液体及び／又は固体材料を含む）を接触させ、混合する。培養装置にまだ存在していない場合は、試料と組成物を含む混合液を培養装置に移動する。

［００５８］また別の代替実施形態では、組成物は、脱水された形態で、例えば、本明細書に記載の薄膜培養装置のような培養装置に配置される。好適な水性液（例えば、滅菌水、滅菌希釈剤などであり、所望により、組成物の１つ以上の成分を含む）を培養装置にピペッティングし、ゲル化剤を再び水和させる。その後、試料を、組成物と接触している培養装置に（例えば、ピペッティング、ストリーキング、試料を含むメンブレンフィルターの配置などにより）堆積することができる。

［００５９］当業者は、培養装置内の試料に組成物を接触させ得る様々な他の手順を認識するであろう。

［００６０］図１を再び参照し、方法１０は、播種した培養装置を第１の時間インキュベートする工程５５を更に含む。典型的には、播種した培養装置は、腸内微生物の増殖を促進するために、昇温（例えば、約３５〜４５℃）で（インキュベータ又は炉など）インキュベートされる。いくつかの実施形態では、播種した培養装置は、約３７℃の温度でインキュベートされる。いくつかの実施形態では、培養装置のインキュベーションは、４１℃〜４４℃の温度で培養装置をインキュベートすることを含み得る。いくつかの実施形態では、β−ガラクトシダーゼ酵素活性を検出する指示システムを含む組成物の場合、参照により本明細書にその全体が援用される米国特許出願第６１／５８０，８６０号（２０１１年１２月２８日出願）に記載されているように、播種した培養装置は、サルモネラボンゴリを試料中の他のグラム陰性腸内微生物から差別化するために、４０℃よりも高い温度でインキュベートされ得る。

［００６１］培養装置は、試料中に存在する腸内微生物の増殖及び増殖を可能にするために十分な第１の時間インキュベートされる。典型的には、培養装置は、少なくとも６時間の第１の時間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、培養装置は、少なくとも８時間の第１の時間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、培養装置は、少なくとも１０時間の第１の時間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、培養装置は、約１４〜約４８時間の第１の時間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、培養装置は、約１８〜４８時間の第１の時間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、培養装置は、約２４〜約３６時間の第１の時間インキュベートされる。好ましい実施形態では、培養装置は、約２４±２時間の第１の時間インキュベートされる。

［００６２］方法１０は、検出可能な生成物を検出するために培養装置を観察する工程６０を更に含む。検出可能な生成物は、本明細書に記載の第１の検出可能な生成物であり得る。第１の検出可能な生成物は、試験試料中にサルモネラ微生物が存在する可能性を示す指示である。サルモネラ微生物は、第１の識別指示化合物を（例えば、発酵により、代謝活性により、酵素活性により）第１の検出可能な生成物に変換する。典型的には、培養装置内の栄養培地は、第１のインキュベーション時間の後に観察する。任意の実施形態において、第１の検出可能な生成物を検出するために栄養培地を観察することは、第１の検出可能な色を検出するために培養装置を観察することを含み得る。いくつかの実施形態では、第１の検出可能な色は、（例えば、第１の識別指示化合物が４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドを含む実施形態において）蛍光により検出することができる。

［００６３］第１の識別指示システムが発酵性炭水化物及びｐＨ指示薬を含む実施形態では、第１の検出可能な色は、炭水化物を１つ以上の酸性生成物に変換することができる微生物のコロニーに近接する（例えば、隣接する）ｐＨ指示薬と関連付けられる着色された領域であり得る。いくつかの実施形態では、コロニーは、周囲の栄養培地中のｐＨ指示薬と同じ色を有する外観である場合がある。

［００６４］第１の識別指示化合物が発色酵素基質を含む実施形態では、第１の検出可能な色は、微生物コロニーに近接する着色された領域であり得る。例えば、着色された領域は、発色基質（例えば、４−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド）と反応する微生物酵素から生じる拡散性の水溶性生成物（例えば、４−ニトロフェノール）を含む場合がある。あるいは、着色された領域は、発色基質（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド）と反応する微生物酵素から生じる水不溶性の生成物（例えば、インジゴ）を含む場合がある。

［００６５］培養装置の観察（工程６０）は、本明細書に記載の第２の検出可能な生成物の有無を検出するために培養装置を観察することを含む。第２の検出可能な生成物は、微生物コロニーと関連付けられ得るウレアーゼ酵素活性によるウレアーゼ酵素基質の加水分解により産生される。いくつかの実施形態では、第２の検出可能な生成物は、水性液中のウレアーゼ酵素活性による尿素の加水分解により生成される生成物である、水酸化アンモニウムの存在下で色を変えるｐＨ指示薬を含み得る。例えば、第１の識別指示薬と反応するコロニーに隣接する培養培地のｐＨを下げる、発酵により酸性生成物になる炭水化物を含み得る第１の識別指示システムとは対照的に、第２の識別指示薬（例えば、尿素）と反応するコロニーは、たとえコロニーが第１の指示化合物を発酵させて酸性生成物にする能力を有する場合でさえも、コロニーに隣接する培養培地のｐＨを上げるように十分な水酸化アンモニウムを生成する。したがって、微生物コロニーに隣接する第２の検出可能な生成物（例えば、尿素の加水分解と関連付けられる着色領域）の観察は、そのコロニーがサルモネラ属に属していないことの指示である。

［００６６］第３の識別指示システムが、培養装置に存在する（例えば、組成物中に存在する）ときは、培養装置を観察すること（工程６０）は、本明細書に記載の第３の検出可能な生成物の有無を検出するために培養装置を観察することを含む。第２の検出可能な生成物の検出と同様に、第３の検出可能な生成物（例えば、着色又は蛍光微生物コロニー及び／又はそのコロニーに隣接する領域）の観察は、そのコロニーがサルモネラ属に属していないことの指示である。

［００６７］いくつかの実施形態では、方法１０は更に、播種した栄養培地を、第３の識別指示化合物を含む第４の識別指示システムと接触させる任意の工程６５を含み得る。サルモネラ微生物により第４の検出可能な生成物に変換され得、したがって第４の識別指示システムになり得る第３の識別指示化合物は、第１の識別指示システムの結果（すなわち、サルモネラ微生物の指示）を確定するように機能する。すなわち、第１の検出可能な生成物及び第４の検出可能な生成物の両方が、サルモネラ微生物の存在の指示を提供する。

［００６８］第４の識別指示化合物は、それに由来する第４の検出可能な生成物が、第１の識別指示システムの第１の検出可能な生成物、第２の識別指示システムの第２の検出可能な生成物、及び第３の識別指示システムの第３の検出可能な生成物から区別可能であること、好ましくは光学的に区別可能であること、より好ましくは目視で区別可能であることを条件として、サルモネラ微生物を検出する任意の好適な指示化合物であってよい。したがって、一実施形態では、第４の識別指示システムは、本明細書に記載のように、第１の検出可能な生成物（例えば、乳酸のような酸性化合物及び／又は例えば、二酸化炭素のような気体など）に（例えば、発酵を介して）変換され得る栄養素（例えば、炭水化物）と共にｐＨ指示薬を含み得る。別の実施形態では、第４の識別指示システムは、本明細書に記載のような発色酵素基質を含み得る。また別の実施形態では、第４の識別指示システムは、本明細書に記載のような発色酵素基質であり得る。本明細書に記載の第１の識別指示システムのいずれも、それが第１及び第２の識別指示システム及び／又は第４の指示システム（存在する場合）を実質的に干渉せず、それらから区別可能である限りは、第４の識別指示システムとしての使用に好適であり得る。

［００６９］有利には、第４の識別指示システムは、試料中のサルモネラ微生物の存在を「確定する」ための手段として使用され得る。すなわち、培養装置に第１の検出可能な生成物の存在が観察されたとき、その存在は、試料中のサルモネラ微生物の存在の可能性の指示であると推定され得る。しかし、第１の検出可能な生成物の存在と並んで第４の検出可能な生成物の存在が観察された（すなわち、第１及び第４の検出可能な生成物が、同じ微生物コロニーと関連付けられる）とき、その観察は、試料中のサルモネラ微生物の存在の可能性がより高い（例えば、有意により高い可能性である）ことを指示し得る。

［００７０］第１のインキュベーション時間の後、例えば、第４の指示システムを含む物品を栄養培地と接触させることによってなどを含む様々な手順を使用して、播種した培養装置内で第４の識別指示システムを栄養培地と接触させることができる。これは例えば、第４の識別指示システムを含むコーティングを有する物品を用いることにより実行され得る。例えば、第４の識別指示システムを含むコーティングを有する物品は、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許第６，０２２，６８２号に記載の方法と同様の方法を使用して作製し得る。

［００７１］第４の識別指示化合物を含む第４の識別指示システムを、播種した栄養培地と接触させた後、方法は、第２の時間プレートをインキュベートする任意の工程（図示せず）を含み得る。

［００７２］播種した培養装置を第２の時間インキュベートすることは、昇温で装置を保持することを含み得る（例えば、温度制御されたインキュベータ内で）。播種した培養装置を（例えば、２５℃より高いが約４４℃以下である）昇温でインキュベートすることは、腸内微生物（例えば、サルモネラ属の微生物）による第４の識別指示化合物の第４の検出可能な生成物への変換を促進し得る。好ましくは、播種した培養装置を第２の時間インキュベートすることは、３５℃〜４２℃の温度で培養装置をインキュベートすることを含む。好ましくは、播種した培養装置を第２の時間インキュベートすることは、４２℃±１℃の温度で培養装置をインキュベートすることを含む。

［００７３］いくつかの実施形態では、第４の識別指示システムを、第１のインキュベーション時間の後に、播種した栄養培地と接触させる。有利には、これは、第４の検出可能な生成物を検出するために要する第２のインキュベーション時間の長さを短縮することができる。したがって、いくつかの実施形態では、第２のインキュベーション時間は、１時間〜約６時間であり得る。いくつかの実施形態では、第２のインキュベーション時間は約２時間〜約５時間であり得る。好ましい実施形態では、第２のインキュベーション時間は４時間±１時間である。

［００７４］当業者は、任意の実施形態において、第１、第２、第３の、又は存在する場合は第４の検出可能な生成物のいずれか１つが、他の検出可能な生成物のいずれの検出をも（例えば、色のマスキング又は蛍光の消失によって）実質的に干渉してはならないことを理解するであろう。当業者は、第１、第２、第３、及び／又は第４の検出可能な生成物が、色及び／又は蛍光により検出される実施形態において、それぞれの検出可能な生成物が、他の検出可能な生成物と異なる（すなわち色彩により区別可能な）発色団及び／又はフルオロフォアを含むべきであることを理解するであろう。

［００７５］本開示の方法は、第１、第２、第３、及び／又は第４の検出可能な生成物を検出する培養装置を観察することを含む。方法の任意の実施形態において、培養装置を観察することは、培養装置内の栄養培地を観察することを含み得る。方法の任意の実施形態において、培養装置を観察することは、培養装置を目視で（例えば、１つ以上の人の目を使用して）観察することを含み得る。

［００７６］追加的に又は代替的に、任意の実施形態において、培養装置を観察することは、（例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許第６，２４３，４８６号、同第７，４９６，２２５号、及び同第７，３５１，５７４号に記載の撮像システムのような撮像システムを使用して）機械的に培養装置を観察することを含み得る。この実施形態において、培養装置を観察することは、撮像装置を使用して培養装置の画像を作成することを含み得る。培養装置の画像を作成することに加えて、方法は、所望により、プロセッサを使用して画像を分析することを含み得る。

［００７７］本開示の方法は、試料中の微生物を検出し、所望により計数するために使用することができる。例えば、培養装置における第１の検出可能な生成物の存在を観察することは、試料中のサルモネラ微生物（例えば、サルモネラボンゴリ種の仲間及び／又はサルモネラエンテリカ種の仲間）の存在の可能性を示すことができる。しかし、本開示による方法において、第２の検出可能な生成物と並べて第１の検出可能な生成物の存在を観察することは、サルモネラ微生物以外の微生物の存在を示す。

［００７８］本開示に従って微生物を計数する工程は、１つ以上のタイプの微生物を計数することを更に含み得る。タイプは、１つ以上の任意の指示システムとのそれらのそれぞれの反応によって又は反応の欠如によって区別され得る。本発明の方法で列挙できる微生物のタイプの非限定的な例としては、サルモネラ微生物、非サルモネラ微生物、β−ガラクトシダーゼ産生微生物、及びウレアーゼ産生微生物が挙げられる。

［００７９］本発明に従って使用されると、本方法は、試料中のサルモネラ微生物の有無を検出することができる。図２は、図１に示した方法から得られた結果と共に使用した分析フローチャートの一実施形態を示す。フローチャートは、任意の所与の微生物のコロニーが、実質的に純粋であり、空間的に他の微生物コロニーから分離されている場合に、サルモネラ属の微生物又は非サルモネラ属のグラム陰性腸内微生物を含むかどうかを決定するために使用することができる。

［００８０］上述した第１のインキュベーション時間の後、培養装置は、第１の検出可能な生成物の有無（ステップ１００）及び第２の検出可能な生成物の有無を検出する（ステップ１１０）ために観察される。第１及び／又は第２の検出可能な生成物は、本明細書に記載のように検出することができる。

［００８１］第１の検出可能な生成物がインキュベーション時間の後に検出された場合、試験試料はサルモネラ微生物を含有していないと推定される（すなわち、結果１０５は「推定陰性」であるとみなされる）。第１の検出可能な生成物が観察された場合、第１の検出可能な生成物と並べて第２の検出可能な生成物の存在を検出するために、更に培養装置を観察する。第１の検出可能な生成物及び第２の検出可能な生成物の両方が微生物コロニーと関連付けられることが観察された場合、微生物コロニーはサルモネラ微生物を含有しないと推定される（すなわち、結果１１５は「陰性」とみなされる）。

［００８２］第１の検出可能な生成物と微生物コロニーとの関連が観察され、第２の検出可能な生成物とそのコロニーとの関連が観察されない場合、結果１１７は、「推定陽性」とみなされる（すなわち、結果は、コロニーがサルモネラ属に属し得ることを示している）。この場合、作業者は、本明細書に記載の第４の識別指示システムを使用して、その微生物がサルモネラ属に属するものであるかどうかを確認することができる。このように、第１及び第２の検出可能な生成物を検出するために微生物コロニーを観察した後に、第４の検出可能な生成物の有無を検出するためにコロニーを観察する（工程１２０）。第４の検出可能な生成物が、第１の検出可能な生成物を生成するが第２の検出可能な生成物は生成しないコロニーと関連付けられることが観察された場合、そのコロニーに関する結果１２５は、「確定陽性」とみなされる（すなわち、コロニーに存在する微生物がサルモネラ属に属することを示す３つの独立した結果がある）。第４の検出可能な生成物が、第１の検出可能な生成物を生成するが第２の検出可能な生成物は生成しないコロニーと関連付けられることが観察されなかった場合、結果１３５は、その微生物コロニーがサルモネラ属に属する可能性も属さない可能性もあることを指示するものであり、追加の試験（例えば、遺伝子試験、生化学試験など）を使用して、その微生物の特定を助けることができる。

（実施形態）
［００８３］実施形態１は
ゲル化剤と、
グラム陽性微生物の増殖を阻害する少なくとも１つの第１の選択剤と、
少なくとも１つの第１の識別指示化合物を含む第１の識別指示システムと、
ウレアーゼ酵素活性により第２の検出可能な生成物に変換される第２の識別指示化合物を含む第２の識別指示システムと、を含む、半固体の培養培地を含み、
第１の識別指示化合物は、サルモネラ属に属する複数のメンバーにより第１の検出可能な生成物に変換され得るものであり、
第１の識別指示化合物は、上記培養培地の中及び／又は上に検出可能なコロニーを形成する複数の非サルモネラ属のグラム陰性腸内微生物によって変換され得ないものである、組成物である。

［００８４］実施形態２は、第１の識別指示化合物は、メリビオース、２−デオキシ−Ｄ−リボース、マンニトール、Ｌ−アラビノース、ダルシトール、マルトース、Ｌ−ラムノース、トレハロース、Ｄ−キシロース、ソルビトール、及び前述の化合物の任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される化合物である、実施形態１の組成物である。

［００８５］実施形態３は、緩衝試薬を更に含む、実施形態１又は実施形態２の組成物である。

［００８６］実施形態４は、上記緩衝試薬が、ＭＯＰＳ、リン酸塩、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態３の組成物である。

［００８７］実施形態５は、β−ガラクトシダーゼ酵素活性により第３の検出可能な生成物に変換される第３の識別指示化合物を含む第３の識別指示システムを更に含む、上記実施形態のいずれか１つの組成物である。

［００８８］実施形態６は、第３の識別指示化合物が発色酵素基質である、実施形態５に記載の組成物である。

［００８９］実施形態７は、第３の識別指示化合物は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、３，４−シクロヘキセノエスクレチン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、及び６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドからなる群から選択される、実施形態６に記載の組成物である。

［００９０］実施形態８は、少なくとも１つの第１の選択剤は、胆汁酸塩、コール酸、デオキシコール酸、クリスタルバイオレット、又は前述の化合物の任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、上記実施形態のいずれか１つの組成物である。

［００９１］実施形態９は、ｐＨ指示薬は、フェノールレッド、クロロフェノールレッド、ニュートラルレッド、ブロモチモールブルー、及びブロモチモールパープルからなる群から選択される、上記実施形態のいずれか１つの組成物である。

［００９２］実施形態１０は、サルモネラ属に属するものではない少なくとも１つのグラム陰性腸内微生物の増殖を阻害する少なくとも１つの第２の選択剤を更に含む、上記実施形態のいずれか１つの組成物である。

［００９３］実施形態１１は、少なくとも１つの第２の選択剤は、β−ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、キノロン系抗生物質、サルファ系抗生物質、ポリミキシン系抗生物質、及び前述の抗生物質の任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択され、少なくとも１つの第２の選択剤の濃度は、サルモネラ微生物の増殖を可能にするように選択される、実施形態１０の組成物である。

［００９４］実施形態１２は、少なくとも１つの第２の選択剤は、ナリジクス酸、ストレプトマイシン、及びポリミキシンＢの組み合わせを含み、その組み合わせにおける少なくとも１つの選択剤のそれぞれの濃度は、サルモネラ微生物の増殖を可能にするように選択される、実施形態１１の組成物である。

［００９５］実施形態１３は、第１の選択剤は胆汁酸塩を含み、少なくとも１つの第１の識別指示化合物は２−デオキシ−Ｄ−リボース及びメリビオースを含み、ｐＨ指示薬はフェノールレッドを含み、第２の識別指示化合物は尿素を含み、第３の識別指示化合物は５−クロロ−４−ブロモ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含み、少なくとも１つの第２の選択剤はナリジクス酸、ストレプトマイシン、及びポリミキシンＢを含む、実施形態５の組成物である。

［００９６］実施形態１４は、ゲル化剤は、寒天、アガロース、ペクチン、ゼラチン、グアーガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、アルギン、及び前述のもののいずれか２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、上記実施形態のいずれか１つの組成物である。

［００９７］実施形態１５は、本質的に、
ゲル化剤と、
複数のグラム陰性腸内微生物の増殖を促進する栄養素と、
グラム陽性微生物の増殖を阻害する少なくとも１つの第１の選択剤と、
少なくとも１つの第１の識別指示化合物を含む第１の識別指示システムと、
ウレアーゼ酵素活性により第２の検出可能な生成物に変換される第２の識別指示化合物を含む第２の識別指示システムと、を含む半固体の培養培地からなり、
第１の識別指示化合物は、サルモネラ属に属する複数のメンバーにより第１の検出可能な生成物に変換され得るものであり、
第１の識別指示化合物は、培養培地の中及び／又は上に検出可能なコロニーを形成する複数の非サルモネラ属のグラム陰性腸内微生物によって変換され得ないものである、組成物である。

［００９８］実施形態１６は、本質的に、
ゲル化剤と、
サルモネラ微生物の増殖を促進する栄養素と、
グラム陽性微生物の増殖を阻害する少なくとも１つの第１の選択剤と、
少なくとも１つの第１の識別指示化合物を含む第１の識別指示システムと、
ウレアーゼ酵素活性により第２の検出可能な生成物に変換される第２の識別指示化合物を含む第２の識別指示システムと、を含む半固体の培養培地を含み、
第１の識別指示化合物は、サルモネラ属に属する複数のメンバーにより第１の検出可能な生成物に変換され得るものであり、
第１の識別指示化合物は、培養培地の中及び／又は上に検出可能なコロニーを形成する複数の非サルモネラ属のグラム陰性腸内微生物によって変換され得ないものである、組成物である。

［００９９］実施形態１７は、本質的に、
ゲル化剤と、
サルモネラ微生物の増殖を促進する栄養素と、
グラム陽性微生物の増殖を阻害する少なくとも１つの第１の選択剤と、
少なくとも１つの第１の識別指示化合物を含む第１の識別指示システムと、
ウレアーゼ酵素活性により第２の検出可能な生成物に変換される第２の識別指示化合物を含む第２の識別指示システムと、
β−ガラクトシダーゼ酵素活性により第３の検出可能な生成物に変換される第３の識別指示化合物を含む第３の識別指示システムと、を含む半固体の培養培地を含み、
第１の識別指示化合物は、サルモネラ属に属する複数のメンバーにより第１の検出可能な生成物に変換され得るものであり、
第１の識別指示化合物は、培養培地の中及び／又は上に検出可能なコロニーを形成する複数の非サルモネラ属のグラム陰性腸内微生物によって変換され得ないものである、組成物である。

［００１００］実施形態１８は、
試験試料、培養装置、及び実施形態１〜１７のいずれか１つの組成物を提供することと、
播種した培養装置を形成するために培養装置内で組成物と試験試料を接触させることと、
第１の時間、播種された培養装置をインキュベートすることと、
培養装置を観察して、第１の検出可能な生成物を検出することと、を含み、第１の検出可能な生成物がサルモネラ微生物の存在の第１の指示である、サルモネラ微生物の検出方法である。

［００１０１］実施形態１９は、第１の検出可能な生成物を検出することが、ｐＨ指示薬と、微生物により産生された酸性化合物との反応を観察することを含む、実施形態１８の方法である。

［００１０２］実施形態２０は、栄養培地を観察して、第２の検出可能な生成物を検出することを更に含み、第２の検出可能な生成物は非サルモネラ微生物の存在を示す、実施形態１８又は実施形態１９の方法である。

［００１０３］実施形態２１は、第２の検出可能な生成物を検出することが、ｐＨ指示薬と、微生物により産生された塩基性化合物との反応を観察することを含む、実施形態２０の方法である。

［００１０４］実施形態２２は、栄養培地を観察して第３の検出可能な生成物を検出することを更に含み、第３の検出可能な生成物は非サルモネラ微生物の存在を示す、実施形態１８〜２１のいずれか１つの方法である。

［００１０５］実施形態２３は、第３の検出可能な生成物を検出することが、β−ガラクトシダーゼ酵素活性により産生される着色された生成物を検出することを含む、実施形態２２の方法である。

［００１０６］実施形態２４は、
サルモネラ微生物によって第４の検出可能な生成物に代謝され得る確定指示化合物を有する物品を提供することと、
物品を培養培地に接触させることと、
装置を第２の時間インキュベートすることと、
培養装置を観察して、第４の検出可能な生成物を検出することと、を更に含み、
第４の検出可能な生成物が、存在する場合には、第１の検出可能な生成物、第２の検出可能な生成物、及び、第３の検出可能な生成物から区別され得るものであり、第１の検出可能な生成物と並べて第４の検出可能な生成物を検出することが、試料中のサルモネラ微生物の存在の第２の指示である、実施形態１８〜２３のいずれか１つの方法である。

［００１０７］実施形態２５は、装置をインキュベートすることが、装置を約２時間〜約５時間インキュベートすることを含む、実施形態２４の方法である。

［００１０８］実施形態２６は、第１のタイプの微生物のコロニーの数を計数することを更に含む、実施形態１８〜２５のいずれか１つの方法である。

［００１０９］実施形態２７は、第２のタイプの微生物のコロニーの数を計数することを更に含む、実施形態２６の方法である。

［００１１０］実施形態２８は、培養装置をインキュベートすることが、４１℃〜４４℃の温度で培養装置をインキュベートすることを含む、実施形態１８〜２７のいずれか１つの方法である。

［００１１１］実施形態２９は、培養装置を観察することが、培養装置を目視で観察することを含む、実施形態１８〜２８のいずれか１つの方法である。

［００１１２］実施形態３０は、培養装置を観察することが、撮像装置を使用して培養装置の画像を作成することを含む、実施形態１８〜２９のいずれか１つの方法である。

［００１１３］実施形態３１は、プロセッサを使用して画像を分析することを更に含む、実施形態３０の方法である。

［００１１４］本発明の目的及び利点は、以下の実施例によって更に例示されるが、これらの実施例において列挙された特定の材料及びその量は、他の諸条件及び詳細と同様に本発明を過度に制限するものと解釈されるべきではない。特に指示がない限り、部及び百分率は全て重量基準であり、水は全て蒸留水であり、分子量は全て重量平均分子量である。ＴＳＡプレート（５％ヒツジ血液を有するトリプシン大豆寒天プレート；Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓａｎｔａ Ｍａｒｉａ，ＣＡ））上で、選択された微生物をストリーキングすることにより、純粋な細胞培養物を調整し、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。全ての微生物の計数は、標準的なコロニー形成単位の微生物計数方法に従って行われ、計数は概数である。

［００１１５］材料。特に記載しない限り、材料は、Ａｌｐｈａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）から市販で入手可能である。ＡＴＣＣ番号で記載されている微生物培養物は、Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。実施例の調整で利用される材料を表１に示す。

［００１１６］

［００１１７］実施例１．サルモネラ薄膜培養装置の調整
［００１１８］薄膜培養装置は、参照によりその全体が本明細書に援用される、２０１１年５月２０日出願された米国特許出願第６１／４８８，４９２号（代理人整理番号第６７６７３ＵＳ００２号）に記載の手順に従って調整した。粉末コーティングされた紙の基質を調整するために使用される粉末組成物は、２−デオキシ−Ｄ−リボース（２ＤＤＲ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｍｔ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔ，ＩＬ）２重量部とグアーガム（Ｍ１５０ ｇｕａｒ ＭＥＹＰＲＯＧＡＴ ｇｕｍ，Ｍｅｙｈａｌｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＡＧ）９８重量部とを混合して作製した。粉末コーティングする前に、紙を、ＴＴＣ含有接着剤でコーティングした。

［００１１９］容器中で、表２に列挙されている材料を１リットルの脱イオン水に添加することによってブロスコーティング混合物を調整し、米国特許第６，０２２，６８２号の実施例１に記載されている方法に従って混合した。

［００１２０］

［００１２１］選択剤混合物は、５０ｍＬの無菌遠心管内で滅菌脱イオン水３０ｍＬにＩＰＴＧ ０．１ｇ、尿素２．０ｇ、メリビオース（Ｓｉｇｍａ）５．０ｇ、ナリジクス酸ナトリウム０．００５ｇ、ストレプトマイシン硫酸塩０．００５ｇ、及びポリミキシンＢ硫酸塩０．０００７５ｇを添加し、ボルテックスして混合することにより調製した。ブロス混合物を約４０℃まで冷却し、激しく混合しながら選択剤混合物を添加した。２．９ミル（０．０７４ｍｍ）のポリエステルフィルムのコロナ処理した面をブロスでコーティングして、カバーフィルムを調製した。

［００１２２］培養装置は、米国特許第６，０２２，６８２号に従って組み立て、ベース部材（ウェルを提供するために直径７．３センチメートルの円が中央に切り抜かれている発泡体スペーサー）とカバープレートを、接着性移動テープを使用して共に貼り合わせた。プレートは約１０．３ｃｍ×１０．２ｃｍと測定され、円形のウェルが、乾燥したブロスでコーティングされた混合物をプレートのほぼ中央に露出している。

［００１２３］実施例２サルモネラ微生物の検出方法
［００１２４］表２に列挙された微生物株の純粋培養物をそれぞれ緩衝ペプトン水に播種し（Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ））、３７℃で一晩インキュベートした。得られた微生物懸濁液はそれぞれ、約１×１０^９コロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）の濃度を有していた。

［００１２５］実施例１の薄膜培養プレートは、ウェルのほぼ中央の粉末コーティング上に１．５ｍＬの滅菌リン酸塩希釈剤（Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮ））を添加することにより、ストリーキングのために準備した。カバーフィルムを閉じ、３Ｍ Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ Ｆｌａｔ Ｓｐｒｅａｄｅｒ（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））を使用して液体を拡げ、約１時間ゲルを含水させた。カバーフィルムを開いたとき、ブロスコーティングはベース部材のゲル表面に移動していた。微生物懸濁液の１０マイクロリットルのループを、ゲル上のブロス表面上にストリーキングした。カバーを閉じ、プレートを４２℃で一晩インキュベートした。プレートは、微生物種のそれぞれについて調製した。コロニーの増殖、コロニーの色及びコロニーの領域の色に関してプレートを調査した。黄色の酸性領域（コロニーによる２−デオキシ−Ｄ−リボース及び／又はメリビオースの発酵を示す）によって囲まれている赤色〜茶色のコロニー（ＴＴＣの酸化を示す）は、サルモネラ微生物に対する仮定陽性試験結果を示す。紫色の領域に囲まれている赤紫色のコロニー（尿素の加水分解による）は、サルモネラ微生物に対する陰性の試験結果である。黄色の酸性領域が、コロニーを囲んでいる青緑色のコロニー（Ｘ−ｇａｌの加水分解を示す）は、コロニーがサルモネラ微生物を含んでいる可能性又は含んでいない可能性があることを示し、追加の試験が指示される場合がある。観察結果を表３に示す。

［００１２６］

［００１２７］実施例３サルモネラ微生物の検出のための検出物品の使用
［００１２８］検出物品（ディスク）は、参照により本明細書にその全体が援用されるＰＣＴ国際特許第２０１２／０９２１８１号の実施例１に記載のように調製した。

［００１２９］仮定陽性結果を含有する薄膜培養装置（すなわち、実施例２のプレート１及び２）を開き、ディスクをゲル表面上で転がした（気泡を最小限にするため）。プレートを閉じ、４２℃で４時間インキュベートした。コロニーに隣接した色の変化についてディスクを分析して、検出物品に存在する指示薬（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド）にコロニーが反応したかどうかを確認した。赤又は茶色から青又は濃青色へのコロニーの色の変化が、コロニーにおけるサルモネラ微生物の存在を示した。試験結果を表４に示す。

［００１３０］

［００１３１］本明細書に引用するすべての特許、特許出願、及び公開公報、並びに電子的に入手可能な資料の開示内容の全体を援用する。本出願の開示内容と本明細書に援用されるいずれかの文書の開示内容との間になんらかの矛盾が存在する場合には、本出願の開示内容が優先するものとする。上記の詳細な説明及び実施例はあくまで理解を助ける明確さのために示したものである。これらによって不要な限定をするものと理解されるべきではない。本発明は、示され記載された厳密な詳細事項に限定されるべきではないが、それは当業者に対して明らかな変形が特許請求の範囲において規定された本発明の範囲に包含されるからである。

［００１３２］全ての見出しは、読者の利便性のためであり、指定のない限り、その見出しに続く本文の意味を限定するために使用するべきではない。

［００１３３］本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な修正を行ってもよい。これらの実施例及び他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に含まれるものである。

Claims (28)

1. ゲル化剤と、
   グラム陽性微生物の増殖を阻害する少なくとも１つの第１の選択剤と、
   少なくとも１つの第１の識別指示化合物を含む第１の識別指示システムと、
   ウレアーゼ酵素活性により第２の検出可能な生成物に変換される第２の識別指示化合物を含む第２の識別指示システムと、を含む、半固体の培養培地を含み、
   第１の識別指示化合物は、サルモネラ属に属する複数のメンバーにより第１の検出可能な生成物に変換され得るものであり、
   第１の識別指示化合物は、前記培養培地の中及び／又は上に検出可能なコロニーを形成する複数の非サルモネラ属のグラム陰性腸内微生物によって変換され得ないものである、組成物。
2. 第１の識別指示化合物が、メリビオース、２−デオキシ−Ｄ−リボース、マンニトール、Ｌ−アラビノース、ダルシトール、マルトース、Ｌ−ラムノース、トレハロース、Ｄ−キシロース、ソルビトール、及び前述の化合物の任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される化合物である、請求項１に記載の組成物。
3. 緩衝試薬を更に含む、請求項１又は２に記載の組成物。
4. 前記緩衝試薬が、ＭＯＰＳ、リン酸塩、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
5. β−ガラクトシダーゼ酵素活性により第３の検出可能な生成物に変換される第３の識別指示化合物を含む第３の識別指示システムを更に有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 第３の識別指示化合物が発色酵素基質である、請求項５に記載の組成物。
7. 第３の識別指示化合物が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、３，４−シクロヘキセノエスクレチン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、及び６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
8. 少なくとも１つの第１の選択剤が、胆汁酸塩、コール酸、デオキシコール酸、クリスタルバイオレット、又は前述の化合物の任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記ｐＨ指示薬が、フェノールレッド、クロロフェノールレッド、ニュートラルレッド、ブロモチモールブルー、及びブロモチモールパープルからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
10. 更に、サルモネラ属に属するものではない少なくとも１つのグラム陰性腸内微生物の増殖を阻害する少なくとも１つの第２の選択剤を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 少なくとも１つの第２の選択剤が、β−ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、キノロン系抗生物質、サルファ系抗生物質、ポリミキシン系抗生物質、及び前述の抗生物質の任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択され、少なくとも１つの第２の選択剤の濃度が、サルモネラ微生物の増殖を可能にするように選択される、請求項１０に記載の組成物。
12. 少なくとも１つの第２の選択剤が、ナリジクス酸、ストレプトマイシン、及びポリミキシンＢの組み合わせを含み、
    前記組み合わせにおける少なくとも１つの前記選択剤のそれぞれの濃度が、サルモネラ微生物の増殖を可能にするように選択される、請求項１１に記載の組成物。
13. 第１の選択剤が胆汁酸塩を含み、少なくとも１つの第１の識別指示化合物が２−デオキシ−Ｄ−リボース及びメリビオースを含み、前記ｐＨ指示薬がフェノールレッドを含み、第２の識別指示化合物が尿素を含み、第２の識別指示化合物が５−クロロ−４−ブロモ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含み、少なくとも１つの第２の選択剤がナリジクス酸、ストレプトマイシン、及びポリミキシンＢを含む、請求項５に記載の組成物。
14. 前記ゲル化剤が、寒天、アガロース、ペクチン、ゼラチン、グアーガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、アルギン、及び前述のもののいずれか２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
15. 試験試料、培養装置、及び請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物を準備することと、
    播種した培養装置を形成するために前記培養装置内で前記組成物と前記試験試料を接触させることと、
    第１の時間、播種された培養装置をインキュベートすることと、
    培養装置を観察して、第１の検出可能な生成物を検出することと、を含み、
    第１の検出可能な生成物がサルモネラ微生物の存在の第１の指示である、サルモネラ微生物の検出方法。
16. 第１の検出可能な生成物を検出することが、前記ｐＨ指示薬と、微生物により産生された酸性化合物との反応を観察することを含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記栄養培地を観察し、第２の検出可能な生成物を検出することを更に含み、
    第２の検出可能な生成物が非サルモネラ微生物の存在を示す、請求項１５又は１６に記載の方法。
18. 第２の検出可能な生成物を検出することが、前記ｐＨ指示薬と微生物により産生された塩基性化合物との反応を観察することを含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記栄養培地を観察し、第３の検出可能な生成物を検出することを更に含み、
    第３の検出可能な生成物が非サルモネラ微生物の存在を示す、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 第３の検出可能な生成物を検出することが、β−ガラクトシダーゼ酵素活性により産生される、着色された生成物を検出することを含む、請求項１９に記載の方法。
21. サルモネラ微生物によって第４の検出可能な生成物に代謝され得る確定指示化合物を有する物品を提供することと、
    前記物品を前記培養培地に接触させることと、
    前記装置を第２の時間インキュベートすることと、
    前記培養装置を観察して、前記第４の検出可能な生成物を検出することと、を更に含み、
    第４の検出可能な生成物が、存在する場合には、第１の検出可能な生成物、第２の検出可能な生成物、及び、第３の検出可能な生成物から区別され得るものであり、
    第１の検出可能な生成物と並べて第４の検出可能な生成物を検出することが、前記試料中のサルモネラ微生物の存在の第２の指示である、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記装置を培養することが、前記装置を２時間〜５時間インキュベートすることを含む、請求項２１に記載の方法。
23. 第１のタイプの微生物のコロニーの数を計数することを更に含む、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 第２のタイプの微生物のコロニーの数を計数することを更に含む、請求項２３に記載の方法。
25. 前記培養装置をインキュベートすることが、４１℃〜４４℃の温度で前記培養装置をインキュベートすることを含む、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記培養装置を観察することが、前記培養装置を目視で観察することを含む、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記培養装置を観察することが、撮像装置を使用して前記培養装置の画像を作成することを含む、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
28. プロセッサを使用して前記画像を分析することを更に含む、請求項２７に記載の方法。
    

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