JP6589648B2 - 腸球菌検出用培地及び腸球菌検出法 - Google Patents
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Description
このような状況を鑑みて、本発明は、アジ化ナトリウムを実質的に含有せず、調製が簡便で、高い精度で選択的に腸球菌を検出できる、腸球菌検出用培地を提供することを目的とする。
し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
[1](a)イオン性界面活性剤、及び(b)ポリビニルアルコールを含有する、腸球菌検出用培地。
[2]さらに、(c)グラム陰性菌に対する抑制剤を含有する、[1]に記載の腸球菌検出用培地。
[3]さらに、(d)有色の色原体化合物を遊離し得るβ−グルコシダーゼ基質を含有する、[1]又は[2]に記載の腸球菌検出用培地。
[4](a)イオン性界面活性剤が、胆汁酸又はその塩、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、及びN−ラウロイルサルコシンナトリウムからなる群から選択される、[1]〜[3]の何れかに記載の腸球菌検出用培地。
[5](b)ポリビニルアルコールが、重量平均分子量5000〜200000かつ鹸化度75〜99%のものである、[1]〜[4]の何れかに記載の腸球菌検出用培地。
[6]アジ化ナトリウムを実質的に含有しない、[1]〜[5]の何れかに記載の腸球菌検出用培地。
[7][1]〜[6]の何れかに記載の培地に検体を接種する工程、前記検体に含まれる微生物を培養する工程、及び前記微生物の培養コロニーを検出する工程を含む、腸球菌の検出方法。
本発明において(a)イオン性界面活性剤は、腸球菌以外の微生物の発育を抑制し、そのコロニーを排除する役割を担う。特に、グラム陽性菌は細胞外膜を有さないため、界面活性作用によって細胞壁が破壊されやすく、好適にその発育が抑制される。
イオン性界面活性剤としては、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤のいずれでもよく、例えば、アニオン性界面活性剤として胆汁酸又はその塩、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、N−ラウロイルサルコシンナトリウムが、カチオン性界面活性剤として塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ジデシルジメチルアンモニウム塩、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム塩が、両性界面活性剤として塩化アルキルポリアミノエチルグリシン、N−ドデシル−N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホン酸、3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホン酸(CHAPS)が挙げられる。これらのうち、アニオン性界面活性剤がより好ましく、胆汁酸又はその塩、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)等がさらに好ましく、胆汁酸又はその塩が特に好ましい。なお、腸球菌は他のグラム陽性菌に比べて、胆汁酸に対する抵抗性がややあることが知られている。
胆汁酸としては、例えば、Bile salts No.3、コール酸、デオキシコール酸、タウロデオキシコール酸が挙げられる。胆汁酸の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩が挙げられる。
本発明の培地におけるイオン性界面活性剤の含有量は、培地を後述の検出方法に用いる時(細菌生育時、以降同じ)の濃度として、好ましくは1〜10g/L、より好ましくは1〜6g/Lである。このような含有量とすることにより、腸球菌以外の微生物、特に他のグラム陽性菌を好適に抑制することができる。
なるゲル化剤としての役割を担う。さらに、(a)イオン性界面活性剤の生育抑制作用を腸球菌に対してのみ無効にして、本発明の培地に腸球菌特異的な選択性を付与する役割をも担う。
ポリビニルアルコールは、重量平均分子量が好ましくは5000〜200000、また鹸化度が好ましくは75〜99%、より好ましくは85〜90%のものを用いる。
本発明の培地におけるポリビニルアルコールの含有量は、培地を後述の検出方法に用いる時の濃度として、好ましくは140〜300g/L、より好ましくは160〜220g/Lである。このような含有量とすることにより、培地を取扱いやすく成型でき、また腸球菌の選択性を向上させることができる。
また、(a)イオン性界面活性剤と(b)ポリビニルアルコールとの含有量の質量比は、好ましくは1:150〜5:70、より好ましくは1:150〜2:110とする。このような比率で含有させることにより、腸球菌の選択性をより向上させることができる。
グラム陰性菌に対する抑制剤としては、抗生物質が好ましく、例えば、硫酸ポリミキシンB、コリスチン硫酸塩、アズトレオナム、カルモナム、ナリジクス酸が挙げられ、とくに硫酸ポリミキシンB及びコリスチン硫酸塩が好ましい。
本発明の培地における前記抑制剤の含有量は、培地を後述の検出方法に用いる時の濃度として、好ましくは1mg〜100mg/L、より好ましくは10〜30mg/Lである。
そのようなβ−グルコシダーゼ基質としては、例えば、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドキシル−β−D−グルコピラノシド、5−ブロモ−3−クロロ−4−インドキシル−β−D−グルコピラノシド、5−ブロモ−6−クロロ−3−インドキシル−β−D−グルコピラノシド、3−インドキシル−β−D−グルコピラノシド、エスクリンが挙げられる。これらのうち、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドキシル−β−D−グルコピラノシド(X−GLUC)が、呈色性の点および腸球菌の発育に対する影響が小さい点からより好ましい。
本発明の培地における前記β−グルコシダーゼ基質の含有量は、培地を後述の検出方法に用いる時の濃度として、好ましくは0.01〜1.0g/L、より好ましくは0.2〜0.6g/Lである。
栄養成分としては、例えば、ペプトン、獣肉エキス、酵母エキス、魚肉エキスが好ましい。
無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム等の無機酸金属塩、ピルビン酸ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸ナトリウム等の有機酸金属塩が挙げられる。
糖類としては、例えば、ラクトース、スクロース、キシロース、セロビオース、マルト
ースが挙げられる。
増粘剤としては、例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース等のセルロース誘導体;デンプン及びその誘導体;ヒアルロン酸、グアーガム、キサンタンガム等の多糖類;ポリアクリル酸、ポリアクリル酸塩、アクリル酸−ビニルアルコール共重合体等のアクリル酸誘導体;ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のポリエーテル;コラーゲン等のタンパク質が挙げられる。
pH調整剤としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムが挙げられる。
グラム陽性菌に対する抗生物質としては、エリスロマイシン、クリンダマイシン等が挙げられる。
他の抗菌性物質としては、ポリリジン、プロタミン硫酸塩、グリシン、ソルビン酸等が挙げられる。また、真菌類の発育抑制のために、アンホテリシンB等の抗菌性化合物を含有してもよい。
シート状の乾燥簡易培地としては、国際公開97/24432号公報に記載の、多孔質材料を含む層とゲル化剤を含む層とフィルム層とを積層して含む構成のシート形態のものが挙げられ、ゲル化剤を含む層の構成を本発明の培地とすればよい。
本発明の培地は、腸球菌以外のグラム陽性菌の生育を抑制し、かつ腸球菌の生育は阻害しないので、本発明の検出方法によれば種々のグラム陽性菌が存在し得る中から腸球菌を容易に選択・検出することができる。さらに好ましい態様では、本発明の培地は、腸球菌以外のグラム陽性菌及びグラム陰性菌の生育を抑制し、かつ腸球菌の生育は阻害しないので、本発明の検出方法によれば、種々の細菌が存在し得る中から腸球菌を容易に選択・検出することができる。
本発明の培地により選択・検出できる腸球菌(Enterococcus)は、E. faecalis、E. faecium、E. durans、E. gallinarum、E. casseliflavus、E. avium、E. hirae、E. raffinosus等が好ましく挙げられる。
(1)培地の作製
表1に示す組成で1m2分の各成分を0.5リットルの精製水に加え、無水炭酸ナトリ
ウムでpH7.4に調整し、95℃で1分間加温溶解したものを、20μm厚1×1mポリエステルフィルム上に全量を均一に塗布し、65℃で完全に乾燥させた後、ナイロンメルトブローン不織布(90g/m2)を張り合わせた。その後、100μm厚の70×80mmポリエステルフィルムに接着し、45mm四方に裁断してシート状の簡易培地をそれぞれ作製した。シート状簡易培地の詳細な製造方法は、国際公開97/24432号公報を参照した。
また、対照として市販のViolet Red Bile Glucose寒天培地(VRBG;OXOID社製)、及び標準寒天培地(SPC;日水製薬製)も調製した。
表2に示す各菌株についてトリプトソイ寒天培地で24時間前培養したものを、滅菌綿棒を用いて、マクファーランド比濁#1相当(約3.0×108CFU/mL)になるように滅菌生理食塩水に懸濁し、菌原液とした。各菌原液を10−7CFU/mLまで、滅菌生理食塩水にて10倍段階希釈を繰り返し、10−7又は10−2CFU/mLの各菌液の1mLを各培地に供試した。35℃、24時間培養後、発育コロニー数を計測した。結果を表2に示す。
本発明の培地は、アジ化ナトリウムを含有せずとも腸球菌を選択的に検出できることが示された。
また、VRBG寒天培地は、ゲル化剤としてポリビニルアルコールではなく寒天を用いている点でのみ培地1と相違し、他の組成はほぼ同じである。培地の構成に、胆汁酸、SDS、クリスタルバイオレット等のグラム陽性菌に対する抑制剤と併用して、ポリビニルアルコールを含有させることによって、前記抑制剤が腸球菌に対してのみ抑制作用を示さなくなることは、従来の知見からは予測できない結果であった。
(1)培地の作製
表3に示す組成で1m2分の各成分を0.5リットルの精製水に加え、無水炭酸ナトリウムでpH7.0に調整し、実施例1と同様にシート状の簡易培地を作製した。
また、対照として市販の標準寒天培地(SPC;日水製薬製)も調製した。
表4に示す各供試菌株について、実施例1と同様に菌原液の調製、培地への供試、及び培養を行い、発育コロニー数を計測し、またコロニーの色を観察した。結果を表4に示す。
Claims (5)
- (a)胆汁酸又はその塩、(b)ポリビニルアルコール、及び(c)グラム陰性菌に対する抑制剤を含有する、腸球菌検出用培地。
- さらに、(d)有色の色原体化合物を遊離し得るβ−グルコシダーゼ基質を含有する、請求項1に記載の腸球菌検出用培地。
- (b)ポリビニルアルコールが、重量平均分子量5000〜200000かつ鹸化度75〜99%のものである、請求項1又は2に記載の腸球菌検出用培地。
- アジ化ナトリウムを実質的に含有しない、請求項1〜3何れか一項に記載の腸球菌検出用培地。
- 請求項1〜4の何れか一項に記載の培地に検体を接種する工程、前記検体に含まれる微生物を培養する工程、及び前記微生物の培養コロニーを検出する工程を含む、腸球菌の検出方法。
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