FR2924127A1 - Milieu reactionnel pour la detection et/ou l'identification de staphyloccocus aureus - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un milieu réactionnel pour la caractérisation de Staphylococcus aureus comprenant un indicateur métabolique qui est un substrat de beta ribosidase en combinaison avec au moins un autre indicateur métabolique et/ou au moins un régulateur métabolique.L'invention concerne également un procédé de détection et/ou d'identification de Staphylococcus aureus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :a) disposer d'un milieu réactionnel comprenant un indicateur métabolique qui est un substrat de beta-ribosidase en combinaison avec au moins un autre indicateur métabolique et/ou au moins un régulateur métabolique,b) ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester,c) laisser incuber, etd) caractériser la présence de Staphylococcus aureus
Description
La présente invention concerne un milieu réactionnel spécifique de Staphylococcus aureus. Elle concerne également un procédé de détection et/ou d'identification des Staphylococcus aureus qui utilise un tel milieu.
La plupart des espèces du genre Staphylococcus sont des pathogènes opportunistes chez l'homme présentant un risque élevé en cas de blessure cutanée par un traumatisme ou par implantation directe d'un produit médical. Parmi les staphylocoques, Staphylococcus aureus est incontestablement l'espèce la plus virulente, puisqu'elle produit un nombre important de toxines et d'enzymes extracellulaires. Elle peut être à l'origine de pathologies nombreuses et variées, allant du simple panaris, jusqu'aux infections les plus sévères comme les septicémies, endocardites, pneumopathies, infections ostéoarticulaires, dont le pronostic peut être très réservé. Elle se retrouve souvent chez des patients qui doivent recevoir des soins hospitaliers faisant intervenir des appareils tels que seringues, cathéters. Il y a donc un grand intérêt de détecter la présence de cette bactérie pathogène, de plus en plus impliquée dans les maladies nosocomiales. En bactériologie, il est classique d'opposer l'espèce Staphylococcus aureus, caractérisée par la production d'une coagulase, aux autres espèces dites à coagulase négative. Les méthodes traditionnelles pour différencier Staphylococcus aureus de Staphylococcus non aureus reposent sur la recherche de la coagulase libre, de la DNase et sur l'obtention d'une agglutination sur latex visant à mettre en évidence la présence du facteur d'affinité pour le fibrinogène, de la protéine A et d'antigènes capsulaires. Toutefois, d'autres espèces de staphylocoques, potentiellement pathogènes, sont capables d'exprimer une coagulase. Il existe également des techniques de culture sur milieux sélectifs pour permettre d'évaluer la présence de Staphylococcus aureus, tels que le milieu hypersalé de Chapman (à 7,5 % de NaCl), qui est généralement sélectif pour Staphylococcus aureus et les staphylocoques qui hydrolysent le Mannitol, et le milieu de Baird Parker (contenant du Tellurite de potassium et du Chlorure de lithium comme agents sélectifs), qui est utilisé pour isoler et dénombrer les staphylocoques à coagulase positive dans les produits alimentaires et permet de mettre en évidence une activité lécithinase. Toutefois, ces techniques manquent de sensibilité (pouvoir de mettre en évidence l'espèce recherchée lorsque celle-ci est présente en faible quantité dans un échantillon biologique à tester) et surtout de spécificité (pouvoir de détecter l'espèce recherchée dans l'échantillon biologique à tester contenant d'autres espèces) et, ne donnent qu'un diagnostic présomptif nécessitant d'autres tests de confirmation. Or, les manipulations supplémentaires, nécessaires à l'identification de Staphylococcus aureus, augmentent la durée et le coût des analyses. Elles nécessitent une multitude de réactifs et l'intervention d'un personnel qualifié. Il est également possible d'utiliser des milieux de culture comprenant des substrats enzymatiques, notamment des substrats de phosphatase et/ou de beta-glucosidase ou d'alpha-glucosidase. On peut citer par exemple le milieu de culture chromogénique CHROMagar (marque déposée) Staph. aureus qui permet l'isolement des staphylocoques et l'identification de Staphylococcus aureus à l'aide de substrats chromogéniques qui procurent une coloration mauve de cette dernière espèce (Gaillot O. et al. 2000. J. Clin. Microbiol. 38, 4,1587-1591). Les autres espèces du même genre sont alors détectées par la coloration bleue ou incolore, en théorie. L'identification est essentiellement basée sur les activités phosphatase, beta-glucosidase, beta-glucuronidase et beta-galactosidase, ainsi que sur la présence d'un inhibiteur, la Déféroxamine, qui permet la différenciation de Staphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis. Toutefois, la différenciation des Staphylococcus aureus et des Staphylococcus epidermidis est imparfaite car les deux espèces produisent des colonies de la même couleur sur le milieu CHROMagar (marque déposée). Ceci est dû au manque de spécificité des substrats de phosphatase qui sont positifs pour les Staphylococcus aureus et les Staphylococcus epidermidis et au fait que l'inhibition de ces derniers par la Déféroxamine n'est que partielle. Il est également possible d'utiliser des substrats d'alpha-glucosidase, tel que décrit dans la demande de brevet WO02079486. Ainsi, en détectant uniquement l'activité alphaglucosidase, il est possible de séparer Staphylococcus aureus de Staphylococcus epidermidis et Staphylococcus saprophyticus qui sont trois des principales espèces de staphylocoques isolées en clinique. Toutefois, si les substrats d'alpha-glucosidase avec un chromophore à noyau Indoxyl sont très adaptés à une utilisation en milieu solide, leur utilisation peut être problématique en milieu liquide, car la coloration ne diffuse pas dans le milieu liquide.
D'une manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que l'utilisation de substrat(s) enzymatique(s) de ribosidase permet une identification aisée et rapide de Staphylococcus aureus. En particulier, l'utilisation de substrat(s) enzymatique(s) de ribosidase en combinaison avec un régulateur et/ou un autre indicateur métabolique permet de distinguer les S. aureus des autres espèces de saphylocoques.
Avant de présenter l'invention, les définitions suivantes sont données pour permettre de mieux comprendre l'invention. Elles ne sont nullement limitatives. Par milieu réactionnel, on entend un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à l'expression d'un métabolisme et/ou à la croissance de microorganismes. Le milieu réactionnel peut être solide, semi-solide ou liquide. Par milieu solide, on entend par exemple un milieu gélifié. L' agar est l'agent gélifiant traditionnel en microbiologie pour la culture des microorganismes, mais il est possible d'utiliser de la gélatine ou de l'agarose. Un certain nombre de préparation sont disponibles dans le commerce, comme par exemple l'agar Columbia, la gélose Trypcase-soja, la gélose Mac Conkey, la gélose Sabouraud ou plus généralement celles décrites dans le Handbook of Microbiological Media (CRC Press). Le milieu réactionnel peut comprendre un ou plusieurs éléments en combinaison, tels que des acides aminés, des peptones, des hydrates de carbone, des nucléotides, des minéraux, des vitamines ... Le milieu peut comprendre également un colorant. A titre indicatif, on peut citer comme colorant le bleu d'Evans, du rouge neutre, du sang de mouton, du sang de cheval, un opacifiant tel que l'oxyde de Titane, de la nitroaniline, du vert malachite, du vert brillant, un ou plusieurs indicateurs métaboliques, un ou plusieurs régulateurs métaboliques... Le milieu réactionnel peut être un milieu de révélation, ou un milieu de culture et de révélation. Dans le premier cas, la culture des microorganismes est effectuée avant ensemencement et, dans le deuxième cas, le milieu de détection et/ou d'identification constitue également le milieu de culture. L'homme du métier peut également utiliser une bi-boite, permettant de comparer aisément deux milieux, comprenant différents substrats ou différents mélanges sélectifs, sur lequel on aura déposé un même échantillon biologique.
Par régulateur métabolique, on entend tout composé(s) qui régule la croissance d'un microorganisme. Ce régulateur métabolique peut être notamment un régulateur d'osidase, un composé sélectif, tel que notamment Chlorure de Lithium, Tellurite de Potassium, Chlorure de Sodium, ou un mélange de composés sélectifs, un antibiotique, un mélange d'antibiotique(s) et/ou antifongique(s) comprenant ou non une ou plusieurs betalactamines, un ou plusieurs aminosides, un ou plusieurs glycopeptides, une ou plusieurs quinolones, un ou plusieurs polypeptides, de l'Amphotéricine, un ou plusieurs azolés, ce qui permet de favoriser la détection des Staphylococcus aureus. Par régulateur métabolique d'osidase, on entend notamment les composés qui peuvent induire ou réprimer l'expression d'une ou plusieurs activités osidases dans le milieu réactionnel. Préférentiellement, la concentration en régulateur métabolique est comprise entre 0,5mg/l et 75 g/l. Par indicateur métabolique, on entend tout composé(s) qui permet de mettre en évidence la présence d'un microorganisme. Cet indicateur métabolique peut être notamment un substrat, tel qu'un substrat de ribosidase, ou un substrat autre qu'un substrat de beta ribosidase, tel que notamment un substrat d'osidase, d'estérase, de peptidase et plus particulièrement de beta glucosidase et/ou beta galactosidase et/ou beta glucuronidase et/ou phosphatase, ce qui favorise la détection des S. aureus. Le milieu peut comprendre également un ou plusieurs indicateurs métaboliques différent d'un substrat de beta ribosidase, tels qu'une combinaison de substrats. L'homme du métier adaptera la concentration en substrat(s) selon le microorganisme que l'on souhaite identifier. Préférentiellement, la concentration en substrat est comprise entre 5 et 1000 mg/1, préférentiellement entre 50 et 400 mg/l. Par substrat, on entend une molécule pouvant être hydrolysée par une enzyme, telle que la beta ribosidase en un produit permettant la détection, directe ou indirecte d'un microorganisme. Ce substrat comprend notamment une première partie spécifique de l'activité enzymatique à révéler et une seconde partie faisant office de marqueur, ci-après appelée partie marqueur. Cette partie marqueur peut être chromogène, fluorogène, luminescente... Par substrat de beta ribosidase, on entend notamment le 2-Hydroxyphenyl-(3-D-riboside (Catéchol-13-D-riboside); Magenta-(3-D-riboside (5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-(3-D- riboside); Dihydroxyflavone-13-D-riboside ; X-(3-D-riboside (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-13-D-riboside) ; Rose-(3-D-riboside (6-Chloro-3-indoxyl-13-D-riboside) ; 6-Bromo-3-indoxyl-13-D-riboside ; 5-Bromo-3-indoxyl-13-D-riboside ; 6-Fluoro-3-indoxyl-13-D-riboside ; Alizarine-(3-D-riboside ; (P)-Nitrophenyl-13-D-riboside ; 4-Méthylumbelliferyl-(3-D-riboside, Naphtol-B-D-riboside, Dichloro-aminophenyl- B-D-riboside. Préférentiellement, la concentration en substrat de beta ribosidase dans le milieu selon l'invention est comprise entre 25 et 1000 mg/1 et plus préférentiellement entre 50 et 400 mg/l. Par substrat de beta glucosidase, on entend notamment 2-Hydroxyphenyl-13-D-glucoside (Catéchol-(3-D-glucoside) ; Magenta-(3-D-glucoside (5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-(3-D-glucoside); Dihydroxyflavone-13-D-glucoside ; X-13-D-glucoside (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-13-D-glucoside) ; Rose-13-D-glucoside (6-Chloro-3-indoxyl-13-D-glucoside) ; 6-Bromo-3-indoxyl-13-D-glucoside ; 5-Bromo-3-indoxyl-13-D-glucoside ; 6-Fluoro-3-indoxyl-13-D-glucoside ; Alizarine-13-D-glucoside ; (P)-Nitrophenyl-13-D-glucoside ; 4-Méthylumbelliferyl-13-D-glucoside, Naphtholbenzein-B-D-glucoside, Indoxyl-N-méthyl- B-D-glucoside, 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-méthyl-B-D-glucoside, 8-Hydroxyquinoline-B-D-glucoside, Naphtol-B-D-glucoside. Préférentiellement, la concentration en substrat de beta glucosidase dans le milieu selon l'invention est comprise entre 25 et 1000mg/1 et plus préférentiellement entre 50 et 400mg/1. Par substrat de beta galactosidase, on entend notamment 2-Hydroxyphenyl-13-D-galactoside (Catéchol-13-D-galactoside); Magenta-13-D-galactoside (5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-13-D-galactoside); Dihydroxyflavone-13-D-galactoside ; X-13-D-galactoside (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-13-D-galactoside) ; Rose-13-D-galactoside (6-Chloro-3-indoxyl-13-D-galactoside) ; 6-Bromo-3-indoxyl-13-D- galactoside ; 5-Bromo-3-indoxyl-13-D-galactoside ; 6-Fluoro-3-indoxyl-13-D- galactoside ; Alizarine-13-D-galactoside ; (P)-Nitrophenyl-13-D-galactoside ; 4-Méthylumbelliferyl-13-D-galactoside, Naphtholbenzein- B-D-galactoside, Indoxyl-N-méthyl-B-D-galactoside, 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-méthyl-B-D-galactoside, 8-Hydroxyquinoline-B-D-galactoside, Naphtol-B-D-galactoside.
Préférentiellement, la concentration en substrat de beta galactosidase dans le milieu selon l'invention est comprise entre 25 et 1000 mg/1 et plus préférentiellement entre 50 et 400 mg/l. Par Staphylococcus aureus, on entend toute souche de Staphylococcus aureus, y compris les souches résistantes telles que les MRSA (Staphylococcus aureus résistante a la methicilline), les MSSA, les GISA, les VISA ou les VRSA (Staphylococcus aureus à résistance intermédiaire aux glycopeptides, intermédiaire à la Vancomycine ou résistante à la Vancomycine respectivement). Par échantillon biologique, on entend un échantillon clinique, issu d'un prélèvement de liquide biologique ou un échantillon alimentaire, issu de tout type d'aliment. Cet échantillon peut être ainsi liquide ou solide et on peut citer d'une manière non limitative, un échantillon clinique de sang, de plasma, d'urines, de fécès, de prélèvements de nez, de gorges, de peaux, de plaies, de liquide céphalo-rachidien, un échantillon alimentaire d'eau, de boissons tels que le lait, un jus de fruits, de yaourt, de viande, d'oeufs, de légumes, de mayonnaise, de fromage ; de poisson..., un échantillon alimentaire issu d'une alimentation destinée aux animaux, tel que notamment un échantillon issu de farines animales.
A ce titre, l'invention concerne un milieu réactionnel pour la caractérisation de Staphylococcus aureus comprenant un indicateur métabolique qui est un substrat de beta ribosidase en combinaison avec au moins un autre indicateur métabolique et/ou au moins un régulateur métabolique. L'invention concerne également l'utilisation d'un indicateur métabolique qui est un substrat de beta ribosidase en combinaison avec un autre indicateur métabolique et/ou un régulateur métabolique pour la caractérisation de Staphylococcus aureus. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit régulateur métabolique est choisi parmi un régulateur de l'activité d'osidase, un composé sélectif, tels que notamment Chlorure de Lithium, Tellurite de Potassium, Chlorure de Sodium, ou un mélange de composés sélectifs, un antibiotique ou un mélange d'antibiotique(s) et/ou antifongique(s), tel que notamment une ou plusieurs beta-lactamines, un ou plusieurs aminosides, un ou plusieurs glycopeptides, une ou plusieurs quinolones, un ou plusieurs polypeptides, de l'Amphotéricine, des azolés, seuls ou en combinaison avec un ou plusieurs composés sélectifs. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit autre indicateur métabolique est un substrat enzymatique, préférentiellement un substrat d'osidase, d'estérase, de peptidase, de beta glucosidase et/ou beta galactosidase. Selon un mode encore plus préféré, ledit autre indicateur métabolique est choisi parmi un substrat de beta glucosidase et/ou beta galactosidase. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit substrat de beta ribosidase est choisi parmi le 2-Hydroxyphényl-13-D-riboside (Catéchol-13-D-riboside); Magenta-13-D-riboside (5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-(3-D-riboside); Dihydroxyflavone-(3-D- riboside ; X-13-D-riboside (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-(3-D-riboside) ; Rose-13-D-riboside (6-Chloro-3-indoxyl-(3-D-riboside) ; 6-Bromo-3-indoxyl-(3-D-riboside ; 5-Bromo-3-indoxyl-13-D-riboside ; 6-Fluoro-3-indoxyl-(3-D-riboside ; Alizarine-13-D-riboside ; (P)-Nitrophenyl-13-D-riboside ; 4-Méthylumbelliferyl-13-D-riboside. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit substrat de beta ribosidase est le Catéchol-13-D-riboside). Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, ledit substrat de beta ribosidase est le X-13-D-riboside (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-(3-D-riboside). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit milieu réactionnel est un milieu solide. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, ledit milieu réactionnel est un milieu liquide. Dans ce cas, ledit substrat de beta ribosidase est préférentiellement le Catéchol-13-D-riboside car il permet la détection/identification des S. aureus en environ 18h. L'invention concerne également un procédé de détection et/ou d'identification de Staphylococcus aureus, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué par les étapes suivantes : a) disposer d'un milieu réactionnel tel que défini ci avant b) ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester, c) laisser incuber, et d) caractériser la présence de Staphylococcus aureus Ce procédé peut comprendre, en outre, une étape de confirmation Cette étape de confirmation peut être notamment une identification biochimique, immunologique ou moléculaire. L'ensemencement des microorganismes peut être réalisé par toutes les techniques d'ensemencement connues de l'homme du métier. Une étape d'incubation peut être réalisée à une température pour laquelle l'expression de l'activité enzymatique que l'on souhaite détecter est optimale, que l'homme du métier peut choisir aisément selon l'activité enzymatique à détecter. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on laisse incuber lors de l'étape c) entre 16 et 48h, préférentiellement entre 18 et 24h. L'étape d) peut s'effectuer par un examen visuel, par colorimétrie ou fluorimétrie. Les souches de S. aureus à résistance acquise à un ou plusieurs antibiotiques et notamment les MRSA (souches de S. aureus résistantes à la Méticilline), GISA (souches de S. aureus à résistance intermédiaire au glycopeptides), VISA (souches de S. aureus à résistance intermédiaire à la Vancomycine), VRSA (souches de S. aureus résistantes à la Vancomycine) et autres phénotypes résistants peuvent être détectés par ajout de l'antibiotique adapté, choisi notamment parmi les 13-lactamines, céphalosporines, glycopeptides, aminosides, quinolones, polypeptides...
Les exemples ci dessous sont donnés à titre explicatif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention.
Expérience 1 : Evaluation de substrats de 13-D-ribosidase pour la caractérisation de Saureus : Les milieux ci-après ont été préparés dans 200 ml d'une base columbia agar (Oxoid), en combinaison avec les substrats chromogéniques de 13-D-ribosidase. Les différents substrats ainsi que les concentrations et les additifs utilisés dans les milieux sont décrits dans le tableau 1 suivant : Substrats chromogéniques Abréviation utilisée Concentration Additifs et concentration en mg/L 2-Hydroxyphényl-beta-D-riboside Catéchol-f3-D-riboside 400 Citrate de fer ammoniacal 100 mg/L 5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-beta-D-riboside Magenta-f3-D-riboside 100 -Dihydroxyflavone-beta-D-riboside DHF-f3-D-riboside 400 Citrate de fer ammoniacal 100 mg/L 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-riboside X-f3-D-riboside 80 et 200 - 6-Chloro-3-indoxyl-beta-D-riboside Rose-f3-D-riboside 100 et 200 - 4-Méthylumbelliferyl-beta-D-riboside 4-MU-f3-D-riboside 50 - Tableaul: Abréviations et concentrations des substrats chromogéniques de (3-D-ribosidase utilisés.
Les substrats de (3-D-ribosidase sont solubilisés dans le DMSO et additionnés aux milieux pour obtenir les concentrations indiquées dans le tableau 1. 191 souches bactériennes ont été ensemencées sur chacun des milieux à partir d'une suspension à 0,5 MacFarland diluée au 1000e. Les boîtes ont été incubées à 37°C puis lues. Les milieux ont été répartis en boites de Petri puis inoculés avec approximativement 100 000 CFU puis incubés à 37°C pendant 48h. Les colonies formées ont été examinées visuellement après des temps d'incubation de 18, 24 et 48 heures. Le souchier de 191 souches comportait : 79 MRSA, 48 Staphylococcus spp, 61 Enterococcus spp et 3 Streptococcus alpha hémolytiques.
Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau ci dessous : X (3 riboside 4-MU-g- Magenta-g- Rose (3 riboside Catechol-(3- DHF-(3- riboside riboside riboside riboside 80mg/L 200 mg IL 50mg/L 100 mg/L 100 mg/L 200 mg/L 400 mg/L 400 mg/L % de souches produisant des colonies colorées ou fluorescentes Total 18h 24h 48h 18h 24h 48h 18h 24h 48h 18h 24h 48h 18h 24h 48h 18h 24h 48h 18h 24h 48h 18h 24h 48h S. aureus 79 84 92 97 82 87 95 97 97 97 71 85 95 91 96 100 84 94 100 100 100 100 100 100 100 (MRSA) S. aureus 14 64 100 100 64 64 100 100 100 100 64 64 100 64 64 100 57 64 100 100 100 100 100 100 100 (MSSA) Staphyloco 34 3 6 6 3 3 3 82 82 82 0 3 6 3 3 3 3 3 6 3 3 3 68 68 91 (lues à coagulase négative Micrococcu 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 s luteus Entérocque 61 2 2 2 2 2 2 57 57 49 0 2 2 0 0 2 0 0 0 2 2 2 30 30 48 s streptocoqu 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 es alpha hémolytiqu es Tableau 2 : évaluation des différents substrats de (3-D-ribosidase
Tous les milieux permettaient bien la détection de Staphylococcus aureus. Les milieux réactionnels comprenant les substrats Catéchol-13-D-riboside ou X-(3-riboside sont les plus spécifiques et les plus sensibles puisqu'ils permettaient une bonne détection des Staphylococcus aureus (MRSA et MSSA), et cela, après seulement 18h d'incubation pour le Catéchol-13-D-riboside et 24h d'incubation pour le X-(3-D-riboside avec seulement 3% de faux-positifs chez les staphylocoques à coagulase négative. Le milieu contenant le DHF-(3-D-riboside était aussi très sensible mais moins spécifique puisque le pourcentage de staphylocoques à coagulase négative (3-ribosidase positive était de 68 à 24 et 91% à 48 heures. Expérience 2 : Evaluation du Catéchol-13-D- riboside en milieu liquide Le milieu ci-après avait la même composition qu'une base chromID S. aureus (bioMérieux), sans agents sélectifs ni agar de façon à obtenir un milieu liquide. Les substrats et inducteurs ont été remplacés avant autoclavage par 300 mg/L de catéchol-13-D-riboside, solubilisé dans du DMSO, et avec du citrate de fer ammoniacal à 500 mg/L. Le milieu était ensuite réparti dans des tubes à raison de 1,5 ml/tube. Pour ce milieu, l'ensemencement était effectué à partir de pré-cultures de 24h à 37°C. Une suspension en eau physiologique à 0,5 McF était réalisée puis chaque tube est inoculé avec 10 !al de suspension bactérienne.
Les lectures étaient effectuées après 24 et 48 heures d'incubation à 37°C. Au total, 11 souches de staphylocoques ont été testées, 5 S. aureus et 6 d'autres espèces du genre Staphylococcus (coag neg). Les résultats obtenus ont été consignés dans le tableau 3 ci-après : Catéchol-f3-D-riboside Nb de souches produisant une coloration Souches Nombre total positifs à positifs à positifs à 18h 24h 48h S aureus (MRSA et MSSA) 5 5/5 I 5/5 5/5 Coag neg 6 0/6 0/6 1 /6 Tableau 3 : Evaluation du catéchol-(3-D-riboside en milieu liquide Les résultats obtenus en milieu solide et montrant la haute spécificité du Catéchol-13-D-riboside pour les S. aureus étaient confirmés en milieu liquide : 100 % de coloration pour les S.aureus était observé dès 18 heures alors qu'aucune des autres espèces du genre Staphylococcus n'était détectée.
Expérience 3 : Confirmation des résultats obtenus avec les substrats Catéchol-(3-D-riboside et X-(3-D-riboside sur un large panel de Staphylococcus spp.
Afin de confirmer la pertinence des milieux réactionnels comprenant le substrat Catéchol-13-D-riboside ou le substrat X-(3-D-riboside, les expériences suivantes ont également été réalisées : Catéchol-(3-D- riboside : Un milieu GTS (bioMérieux) supplémenté avec 300 mg/L de Catéchol-(3-riboside puis autoclavé et 500 mg/L de citrate de fer ammoniacal a été utilisé et réparti en boites de Petri de 55 mm de diamètre. X-(3-D-riboside : Un milieu Chapman modifié, sans NaCl, autoclavé et supplémenté avec 60 mg/L de X-(3-D-riboside a été utilisé et réparti en boîtes de Petri de 55 mm de diamètre. Pour les 2 milieux, l'ensemencement était effectué à partir de pré-cultures de 24h à 37°C. Une suspension en eau physiologique à 0,5 McF était réalisée puis chaque souche est ensemencée à l' oese calibrée 10p.l sur une boite.
Les lectures étaient effectuées après 24 et 48 heures d'incubation à 37°C. Au total, 90 Staphylocoques ont été testés, 34 S. aureus dont 25 MRSA et 46 autres espèces de Staphylococcus (incluant S. schleiferi ; S. capitis ; S. hyicus ; S. intermedius ; S. haemolyticus ; S. auricularis ; S. hominis ; S. warneri ; S. chromogenes ; S. cohnii ; S. epidermidis ; S. sciuri ; S. xylosus ; S. saprophyticus).
Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau 4. Catéchol-beta-D-riboside X-beta-D-riboside nombre de souches produisant une coloration / nombre total de souches Souches Couleur des positifs à 18h positifs à 24h positifs à 48h Couleur des positifs à 18h positifs à 24h positifs à 48h colonies colonies S aureus Grises 19/34 31/34 34/34 Vertes 17/34 29/34 33/34 (MRSA et a a MSSA) Noires Turquoise Coag neg 10/46 14/46 14/46 7/46 12/46 14/46 Tableau 4 : Evaluation des substrats Catéchol-13-D-riboside et X-(3-D-riboside sur un large panel de souches Staphylococcus spp.
Les résultas de cet essai montrent une bonne spécificité de ces 2 substrats pour S. aureus, et cela, dès 18h. En effet, sur les 13 autres espèces du genre Staphylococcus, seules 4 espèces très minoritaires donnaient une coloration. Il s'agissait des espèces Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus conhii et Staphylococcus sciuri, qui ne représentent à elles 4 que seulement 4,4% des souches de Staphylococcus retrouvées dans les prélèvements cliniques contre 23,3% pour les Staphylococcus aureus (Kawamura & al. 1998. Distribution of Staphylococcus species among human clinical specimens and emended description of Staphylococcus caprae. J. Clin Microbiol. 36:2038-2042).
Expérience 4: Différenciation des Staphylococcus aureus par rapport aux autres espèces du même genre par la détection directe de l'activité (3-D-ribosidase et d'une autre activité osidase dans un milieu gélifié. Les milieux ci-après ont été préparés dans un milieu Chapman modifié, sans NaCl, autoclavé et associent un substrat chromogénique de beta ribosidase avec une combinaison de un ou deux autres indicateurs métaboliques, c'est à dire un ou deux substrats chromogéniques autres que celui permettant de détecter une activité (3-ribosidase. Ces combinaisons de substrats sont présentées dans le tableau suivant : Abréviation Substrat b-D-ribosidase Substrat(s) associé(s) [concentration en mg/L] [concentration en mg/L] A X-(3-D riboside Rose-[3-glucoside [60 mg/L] [300 mg/L] B X-(3-D riboside Blue-(3-galactoside [60 mg/L] [600 mg/L] X-(3-D riboside Rose-[3- glucoside [100 mg/L] [150 mg/L] Blue-(3-galactoside [300 mg/L] Tableau 5 : Abréviation de différentes combinaisons de substrats chromogéniques de 13-ribosidase et de substrats chromogéniques spécifiques d'autres activités enzymatiques.
Les différents substrats sont solubilisés dans le DMSO et additionnés aux milieux. Pour les milieux contenant le substrat Blue-13-galactoside, de l'IPTG solubilisé dans de l'eau osmosée, est ajouté de façon à obtenir une concentration de 1 mg/L. Les milieux étaient répartis en boite de Petri de 55 mm et l'ensemencement était effectué à partir de pré-cultures de 24h à 37°C. Une suspension en eau physiologique à 0,5 McF était réalisée puis chaque souche est ensemencée, à l' oese calibrée 10 l, sur une boite. Les lectures étaient effectuées après 18, 24 et 48 heures d'incubation à 37°C. Au total, 28 souches de staphylocoques ont été testées : 5 MRSA et 3 S. aureus, 4 S. saprophyticus, 4 S. cohnii , 4 S. xylosus, 4 S. sciuri, 2 S. epidermidis et 2 S. haemolyticus.
Dans le tableau ci-dessous, C représente la coloration des colonies après incubation, I représente l'Intensité de cette coloration et TI défini les temps d'incubation. L'intensité de la coloration est une échelle arbitraire et peut être définie de la manière suivante : • Le symbole - correspond à une absence d'activité • 0,1 correspond à la présence d'une trace de coloration • 0,5 correspond à la présence d'une coloration très pâle • 1 correspond à la présence d'une coloration nette de faible intensité • 1,5 correspond à la présence d'une coloration intermédiaire aux colorations 1 et 2, • 2 correspond à la présence d'une coloration franche d'intensité moyenne, • 2,5 correspond à la présence d'une coloration intermédiaire aux colorations 2 et 3, • 3 correspond à la présence d'une coloration intense, • 3,5 correspond à la présence d'une coloration intermédiaire aux colorations 3 et 4, • 4 correspond à la présence d'une coloration très intense. Les résultats de l'essai sont présentés ci-après : A B C Souches TI C C C S. aureus MRSA 18h 2 Turquoise 3 Turquoise 2 Turquoise 040 24h 2 3 3 48h 3 3 3.5 MRSA 18h 1 Turquoise 2 Turquoise 1.5 Turquoise 007 24h 2 3 2 48h 3 4 3.5 MRSA 18h 2 Turquoise 1. 5 Turquoise 0.5 Turquoise 120 24h 2 3 1.5 48h 3 3 3 MRSA 18h 2.5 Turquoise 2 Turquoise 0.1 Turquoise 006 24h 2.5 2 2 48h 3 3 3 MRSA 18h 2 Turquoise 3 Turquoise 2 Turquoise 060 24h 2 3 2 48h 3 3 3 MSSA 18h 3 Turquoise 3 Turquoise 2 Turquoise 105 24h 3 3 2 48h 3 4 3 MSSA 18h 0.1 Turquoise 3 Turquoise 0.5 Turquoise 140 24h 1.5 3 1.5 48h 3 3 3 MSSA 18h 0.1 Turquoise 0.1 Turquoise 0.5 Turquoise 061 24h 1 2 2 48h 3 3 3 Coag neg S. sciuri 18h 0.1 Bleu foncé - - - - 051 24h 0.5 violet - - 48h 4 3 Turquoise 2 Bleu foncé S. sciuri 18h 3 violet 2.5 Turquoise 2.5 Bleu/Violet 016 24h 4 3 2. 5 48h 4 4 2.5 Bleu foncé S. sciuri 18h 3 violet 3 Turquoise 3 Bleu foncé 018 24h 4 4 3 48h 4 4 3 S. sciuri 18h 1.5 violet 0.1 Turquoise 0.1 Rose/Violet 141 24h 2 0.5 0.5 48h 2 3 1.5 S. saprophyticus 18h - - 3 Bleu foncé 2 Bleu foncé 153 24h - 3 2.5 48h 2 Turquoise 4 3 S. saprophyticus 18h - - 3 Bleu foncé 2 Bleu foncé 074 24h - 3 2 48h 1.5 Turquoise 4 3 S. saprophyticus 18h - - 3 Bleu foncé 2 Bleu foncé 152 24h 0.5 rose 3 2 48h 3 4 3 S. saprophyticus 18h 0.1 Turquoise - - - - 002 24h 0.1 - 0.1 Turquoise 48h 1.5 2 Turquoise 3 S. cohnii 18h - - 1 Bleu foncé 0.1 Bleu foncé 007 24h - 2 1 48h 0.5 Turquoise 4 4 S. cohnii 18h - - - - - Grise 039 24h - - - 48h 2 Turquoise 2 Vert 0.1 S. cohnii 18h - - - - 0.5 Rose 026 24h - - 1.5 48h - - 3 S. cohnii 18h - - 2 Bleu foncé - Rose 005 24h - 3 - 48h 2 Turquoise 4 0.1 S. xylosus 18h 1.5 Violet 2 Bleu foncé 0.5 Bleu foncé 038 24h 2 3 0. 75 48h 4 4 4 S. xylosus 18h 0.5 Violet 3 Bleu foncé 2 Bleu foncé 067 24h 1.5 4 3 48h 4 4 4 S. xylosus 18h 3 Violet 1 Bleu foncé 2 Rose/Violet 008 24h 3 1.5 2 48h 3 4 3 S. xylosus 18h 2 Rose - - - Rose/Violet 009 24h 3 -0.5 48h 4 Violet 4 Bleu foncé 3 S. epidermidis 18h - - - - - - 009 24h - -- 48h - 0.1 Bleu foncé 1 Bleu foncé S. epidermidis 18h - - - - - - 025 24h - - - 48h - 0.1 Bleu foncé - S. haemolyticus 18h 0.5 Bleu foncé 025 24h 1.5 1 Bleu foncé 48h 4 2 S. haemolyticus 18h 1.5 Rose 028 24h 2 1.5 Rose 48h 4 2 Tableau 6 : Evaluation de différentes combinaisons de substrats
Les résultats ci-dessus montrent qu'il est possible de distinguer les Staphylococcus aureus des autres espèces de staphylocoques exprimant une 13-D-ribosidase dès 18 heures d'incubation avec une combinaison de substrats. Seule une souche de Staphylococcus saprophyticus posait problème à 48 heures mais il n'y avait aucune ambiguïté à 24 heures d'incubation car les Staphylococcus aureus avaient déjà une bonne intensité de coloration.
Expérience 5 : Détection des MRSA par leur activité 13-ribosidase dans un milieu sélectif. Un milieu Chapman modifié, sans NaCl, autoclavé et supplémenté avec 100 mg/L de X-13-D-riboside et sélectif, c'est à dire comprenant des inhibiteurs métaboliques pour inhiber les MSSA et la plupart des autres espèces de Staphylocoques, a été utilisé et réparti en boîtes de Petri de 55 mm de diamètre. Le substrat a été solubilisé dans du DMSO avant d'être ajouté au milieu. L'ensemencement a été effectué à partir de pré-cultures de 24h à 37°C. Une suspension en eau physiologique à 0,5 McF a été réalisée puis chaque souche est ensemencée, à l'oese calibrée 101a.l, sur une boite. Les lectures ont été effectuées après 24 et 48 heures d'incubation à 37°C. Au total, 15 souches de staphylocoques ont été testées : 5 MRSA et 2 MSSA, 4 S. epidermidis, 1 S. cohnii, 4 S. sciuri et 2 S. saprophyticus. Les résultats sont consignés dans le tableau 7, ci-après : Souches Tl Croissance Intensité Coloration MRSA 24h - -Turquoise 060 48h + 3 MRSA 24h + 1 Turquoise 024 48h + 3 MRSA 24h + 2,5 Turquoise 08 060 48h + 3 MRSA 24h + 2,5 Turquoise 012 48h + 3 MRSA 24h + -Turquoise 023 48h + 3 MSSA 24h - - _ 049 48h - - MSSA 24h - - _ 061 48h -- S. epidermidis 24h - - _ 061 48h - - S. epidermidis 24h - - _ 164 48h -- S. epidermidis 24h + - _ 190 48h + - S. epidermidis 24h + - _ 175 48h + - S. saprophyticus 24h + - _ 004 48h + - S. saprophyticus 24h - - _ 061 48h + - S. sciuri 24h - - _ 029 48h - - S. cohnii 24h + - _ 040 48h + -Tableau 7 : Détection des MRSA sur un milieu sélectif par leur activité 13-ribosidase
Les résultats ci-dessus montrent que sur un milieu sélectif, inhibant les MSSA et la plupart des autres espèces de Staphylocoques, il est possible de distinguer les MRSA qui ont une coloration turquoise. Les autres espèces ayant une croissance sur ce milieu ne présentant pas de coloration dans ces conditions de culture.
Claims (15)
1) Milieu réactionnel pour la caractérisation de Staphylococcus aureus comprenant un indicateur métabolique qui est un substrat de beta ribosidase en combinaison avec au moins un autre indicateur métabolique et/ou au moins un régulateur métabolique.
2) Milieu réactionnel selon la revendication 1 selon laquelle ledit régulateur métabolique est choisi parmi un régulateur d'osidase, un composé sélectif, ou un mélange de composés sélectifs, un antibiotique ou un mélange d'antibiotique(s) et/ou antifongique(s)
3) Milieu réactionnel selon la revendication 1 ou 2 selon laquelle ledit autre indicateur métabolique est un substrat enzymatique, préférentiellement un substrat d'osidase, d'estérase, de peptidase, de beta glucosidase et/ou beta galactosidase.
4) Milieu réactionnel selon la revendication 3 selon laquelle ledit substrat enzymatique est choisi parmi un substrat de beta glucosidase et/ou beta galactosidase
5) Milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 selon laquelle ledit substrat de beta-ribosidase est un substrat de beta ribofuranosidase.
6) Milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 selon laquelle ledit substrat de beta-ribosidase est un substrat choisi parmi le 2-Hydroxyphenyl-13-D-ribofuranoside (Catéchol- 13 -D-rib o s ide) ; Magenta- (3-D-riboside (5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-(3-D-ribos ide) ; Dihydroxyflavone-(3-D-riboside ; X-(3-D-riboside (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-13-D-riboside) ; Rose-13-D-riboside (6-Chloro-3-indoxyl-(3-D-riboside) ; 6-Bromo-3-indoxyl-13-D-riboside ; 5-Bromo-3-indoxyl-13-D-riboside ; 6-Fluoro-3- indoxyl-13-D-riboside ; Alizarine-13-D-riboside ; (P)-Nitrophenyl-13-D-riboside ; 4-Méthylumbelliferyl-13-D-riboside, Naphtol-B-D-riboside, Dichloro-aminophenyl- B-D-riboside.
7) Milieu réactionnel selon la revendication 6 selon laquelle ledit substrat de beta ribofuranosidase est le 2 hydroxyphenyl beta D ribofuranoside
8) Milieu réactionnel selon la revendication 6 selon laquelle ledit substrat de betaribosidase est le 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-13-D-riboside
9) Utilisation d'un indicateur métabolique qui est un substrat de beta ribosidase pour la caractérisation de Staphylococcus aureus en combinaison avec au moins un autre indicateur métabolique et/ou au moins un régulateur métabolique
10) Utilisation selon la revendication 9 selon laquelle ledit substrat de beta-ribosidase est un substrat de beta ribofuranosidase.
11) Utilisation selon la revendication 9 ou 10 dans laquelle ledit substrat de betaribosidase est un substrat choisi parmi le 2-Hydroxyphenyl-13-D-ribofuranoside (Catéchol-13-D-riboside); Magenta-13-D-riboside (5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-13-D-riboside); Dihydroxyflavone-13-D-riboside ; X-(3-D-riboside (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-13-D-riboside) ; Rose-(3-D-riboside (6-Chloro-3-indoxyl-13-D-riboside) ; 6-Bromo-3-indoxyl-13-D-riboside ; 5-Bromo-3-indoxyl-13-D-riboside ; 6-Fluoro-3-indoxyl-13-D-riboside ; Alizarine-13-D-riboside ; (P)-Nitrophenyl-13-D-riboside ; 4-Méthylumbelliferyl-13-D-riboside, Naphtol-B-D-riboside, Dichloro-aminophenyl- B-D-riboside..
12) Utilisation selon la revendication 11 selon laquelle ledit substrat est le 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-13-D-ribo side
13) Utilisation selon la revendication 11 selon laquelle ledit substrat est le 2 hydroxyphenyl beta D ribofuranoside
14) Procédé de détection et/ou d'identification de Staphylococcus aureus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) disposer d'un milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 8,b) ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester, c) laisser incuber, et d) caractériser la présence de Staphylococcus aureus
15) Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, une étape de confirmation.
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