EP2225391A1 - Milieu réactionnel pour la détection et/ou l'identification de staphyloccocus aureus - Google Patents

Milieu réactionnel pour la détection et/ou l'identification de staphyloccocus aureus

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Publication number
EP2225391A1
EP2225391A1 EP08856622A EP08856622A EP2225391A1 EP 2225391 A1 EP2225391 A1 EP 2225391A1 EP 08856622 A EP08856622 A EP 08856622A EP 08856622 A EP08856622 A EP 08856622A EP 2225391 A1 EP2225391 A1 EP 2225391A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
riboside
substrate
beta
indoxyl
bromo
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08856622A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Diane Halimi
Sylvain Orenga
John Perry
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP2225391A1 publication Critical patent/EP2225391A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/045—Culture media therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56938—Staphylococcus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/305—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • G01N2333/31—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)

Definitions

  • the present invention relates to a specific reaction medium of Staphylococcus aureus. It also relates to a method for detecting and / or identifying Staphylococcus aureus which uses such a medium.
  • Staphylococcus are opportunistic pathogens in humans at high risk for skin injury through trauma or direct implantation of a medical product.
  • Staphylococcus aureus is undoubtedly the most virulent species, since it produces a large number of toxins and extracellular enzymes. It can cause many and varied pathologies, ranging from simple paronychia, to the most severe infections such as septicemia, endocarditis, pneumopathies, osteoarticular infections, whose prognosis can be very reserved. It is often found in patients who must receive hospital care involving devices such as syringes, catheters. There is therefore a great interest in detecting the presence of this pathogenic bacterium, which is increasingly involved in nosocomial diseases.
  • Staphylococcus aureus In bacteriology, it is conventional to oppose the species Staphylococcus aureus, characterized by the production of a coagulase, to other species called coagulase negative.
  • the traditional methods for differentiating Staphylococcus aureus from Staphylococcus non-aureus are based on the search for free coagulase, DNase and on obtaining a latex agglutination aiming to demonstrate the presence of affinity factor for fibrinogen, protein A and capsular antigens.
  • other potentially pathogenic staphylococci species are able to express coagulase.
  • Staphylococcus aureus there are also culture techniques in selective media to evaluate the presence of Staphylococcus aureus, such as Chapman's hypersaline medium (7.5% NaCl), which is generally selective for Staphylococcus aureus and Staphylococci that hydrolyze. Mannitol, and Baird Parker's medium (containing Potassium Tellurite and Lithium Chloride as selective agents), which is used to isolate and enumerate coagulase-positive staphylococci in products. and to demonstrate lecithinase activity.
  • Chapman's hypersaline medium (7.5% NaCl which is generally selective for Staphylococcus aureus and Staphylococci that hydrolyze.
  • Mannitol, and Baird Parker's medium containing Potassium Tellurite and Lithium Chloride as selective agents
  • culture media comprising enzymatic substrates, in particular substrates for phosphatase and / or beta-glucosidase or alpha-glucosidase.
  • enzymatic substrates in particular substrates for phosphatase and / or beta-glucosidase or alpha-glucosidase.
  • chromogenic culture medium CHROMagar (registered trademark) Staph. aureus which allows the isolation of staphylococci and the identification of Staphylococcus aureus using chromogenic substrates which provide a purple coloration of the latter species (Gaillot O. et al., 2000, J. Clin Microbiol., 38, 4, 1587-1591).
  • the other species of the same genus are then detected by the blue or colorless coloration, in theory.
  • the identification is essentially based on the activities phosphatase, beta-glucosidase, beta-glucuronidase and beta-galactosidase, as well as on the presence of an inhibitor, deferoxamine, which allows the differentiation of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis.
  • deferoxamine an inhibitor which allows the differentiation of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis.
  • the differentiation of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis is imperfect because both species produce colonies of the same color on the CHROMagar (trademark) medium. This is due to the lack of specificity of the phosphatase substrates that are positive for Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis and the fact that the inhibition of these by Deferoxamine is only partial.
  • alpha-glucosidase substrates As described in the patent application WO02079486. Thus, by detecting only the alpha-glucosidase activity, it is possible to separate Staphylococcus aureus from Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus saprophyticus which are three of the main species of staphylococci isolated in clinical practice.
  • the alpha-glucosidase substrates with an Indoxyl core chromophore are very suitable for use in a solid medium, their use can be problematic in liquid medium, because the color does not diffuse in the liquid medium.
  • enzymatic substrate (s) ribosidase allows easy and rapid identification of Staphylococcus aureus.
  • enzymatic substrate (s) ribosidase in combination with a regulator and / or another metabolic indicator makes it possible to distinguish S. aureus from other species of saphylococci.
  • reaction medium a medium comprising all the elements necessary for the expression of a metabolism and / or the growth of microorganisms.
  • the reaction medium may be solid, semi-solid or liquid.
  • solid medium is meant for example a gelled medium.
  • Agar is the traditional gelling agent in microbiology for the cultivation of microorganisms, but it is possible to use gelatin or agarose.
  • a number of preparations are commercially available, for example Columbia agar, Trypcase-soy agar, Mac Conkey agar, Sabouraud agar or more generally those described in the Handbook of Microbiological Media (CRC Press).
  • the reaction medium may comprise one or more elements in combination, such as amino acids, peptones, carbohydrates, nucleotides, minerals, vitamins, etc.
  • the medium may also comprise a dye.
  • dye of Evans blue, neutral red, sheep blood, horse blood, an opacifier such as titanium oxide, nitroaniline, malachite green, brilliant green , one or more metabolic indicators, one or more metabolic regulators ...
  • the reaction medium may be a revelation medium, or a culture and revelation medium.
  • the culture of the microorganisms is carried out before seeding, and in the second case, the detection and / or identification medium also constitutes the culture medium.
  • the detection and / or identification medium also constitutes the culture medium.
  • Those skilled in the art can also use a bi-box, to easily compare two media, comprising different substrates or different selective mixtures, on which the same biological sample will have been deposited.
  • metabolic regulator any compound (s) that regulates the growth of a microorganism.
  • This metabolic regulator can be in particular an osidase regulator, a selective compound, such as in particular Lithium Chloride, Potassium Tellurite, Sodium Chloride, or a mixture of selective compounds, an antibiotic, a mixture of antibiotic (s) and or antifungal (s) comprising or not one or more beta-lactamines, one or more aminoglycosides, one or more glycopeptides, one or more quinolones, one or more polypeptides, Amphotericin, one or more azoles, which allows to promote the detection of Staphylococcus aureus, inhibitors that favor the growth of Staphylococcus aureus bacteria, such as in particular Lithium Chloride (LiCl), Sodium Azide (NaN3), Colistin, Amphotericin, Aztreonam, Colimicine, Sodium Chloride (NaCl) , Deferoxamine
  • the medium according to the invention comprises a selective mixture for promoting the growth of Staphylococcus aureus and / or inhibiting the growth of other species of microorganisms.
  • This mixture preferably comprises lithium chloride, a static vibrio compound 0/129, aztreonam, and amphotericin.
  • metabolic regulator of osidase is meant in particular the compounds which can induce or repress the expression of one or more osidase activities in the reaction medium.
  • the metabolic regulator concentration is between 0.5 mg / l and 75 g / l.
  • Metabolic indicator means any compound (s) which makes it possible to demonstrate the presence of a microorganism.
  • This metabolic indicator can be in particular a substrate, such as a ribosidase substrate, or a substrate other than a beta ribosidase substrate, such as in particular a substrate of osidase, esterase, peptidase and more particularly beta-glucosidase. and / or beta galactosidase and / or beta glucuronidase and / or phosphatase, which promotes the detection of S. aureus.
  • the medium may also include one or more metabolic indicators different from a beta ribosidase substrate, such as a combination of substrates. The skilled person will adapt the concentration of substrate (s) according to the microorganism that one wishes to identify.
  • the concentration of substrate is between 5 and 1000 mg / l, preferably between 50 and 400 mg / l.
  • substrate a molecule that can be hydrolysed by an enzyme, such as beta ribosidase into a product for the direct or indirect detection of a microorganism.
  • This substrate comprises in particular a first specific part of the enzymatic activity to be revealed and a second part serving as a marker, hereinafter referred to as a marker part.
  • This marker part can be chromogenic, fluorogenic, luminescent, etc.
  • beta ribosidase substrate is meant in particular 2-hydroxyphenyl- ⁇ -D-riboside
  • Methylumbelliferyl- ⁇ -D-riboside Naphtol- ⁇ -D-riboside, Dichloro-aminophenyl- ⁇ -D-riboside.
  • the concentration of beta ribosidase substrate in the medium according to the invention is between 25 and 1000 mg / l and more preferably between 50 and 400 mg / l.
  • beta glucosidase substrate is meant in particular 2-hydroxyphenyl- ⁇ -D-glucoside
  • Methylumbelliferyl- ⁇ -D-glucoside Naphtholbenzein- ⁇ -D-glucoside, Indoxyl-N-methyl- ⁇ -D-glucoside, 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-methyl- ⁇ -D-glucoside,
  • the concentration of beta glucosidase substrate in the medium according to the invention is between 25 and 1000 mg / l and more preferably between 50 and
  • beta-galactosidase substrate is meant in particular 2-hydroxyphenyl- ⁇ -D-galactoside (catechol- ⁇ -D-galactoside); Magenta- ⁇ -D-galactoside (5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl- ⁇ -D-galactoside); Dihydroxyflavone- ⁇ -D-galactoside; X- ⁇ -D-galactoside (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl- ⁇ -D-galactoside); Rose- ⁇ -D-galactoside (6-chloro-3-indoxyl- ⁇ -D-galactoside); 6-Bromo-3-indoxyl- ⁇ -D-galactoside; 5-Bromo-3-indoxyl- ⁇ -D-galactoside; 6-fluoro-3-indoxyl- ⁇ -D-galactoside; Alizarin- ⁇ -D-galactoside; (P) - Nitrophenyl- ⁇ -D-galactoside
  • the concentration of beta-galactosidase substrate in the medium according to the invention is between 25 and 1000 mg / l and more preferably between 50 and 400 mg / l.
  • Staphylococcus aureus is any strain of Staphylococcus aureus, including resistant strains such as MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus), MSSA, GISA, VISA or VRSA (Staphylococcus aureus with intermediate resistance to glycopeptides, Vancomycin intermediate or Vancomycin resistant respectively).
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • MSSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • GISA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • VISA vancomycin intermediate resistance to glycopeptides
  • biological sample is meant a clinical sample, from a sample of biological fluid or a food sample, from any type of food.
  • This sample may thus be liquid or solid and may be mentioned in a nonlimiting manner, a clinical sample of blood, plasma, urine, faeces, nose samples, throats, skin, wounds, cerebrospinal fluid, a food sample of water, beverages such as milk, fruit juice, yoghurt, meat, eggs, vegetables, mayonnaise, cheese; fish ..., a food sample from a feed intended for animals, such as in particular a sample from animal meal.
  • the invention relates to a reaction medium for the characterization of Staphylococcus aureus comprising a metabolic indicator which is a beta ribosidase substrate in combination with at least one other metabolic indicator and / or at least one metabolic regulator.
  • the invention also relates to the use of a metabolic indicator which is a beta ribosidase substrate in combination with another metabolic indicator and / or a metabolic regulator for the characterization of Staphylococcus aureus.
  • said metabolic regulator is chosen from a regulator of the osidase activity, a selective compound, such as in particular lithium chloride, potassium tellurite, sodium chloride, or a mixture of selective compounds, an antibiotic or a mixture of antibiotic (s) and / or antifungal (s), such as in particular one or more beta-lactams, one or more aminoglycosides, one or more glycopeptides, one or more quinolones, one or more polypeptides, Amphotericin, azoles, alone or in combination with one or more selective compounds.
  • a selective compound such as in particular lithium chloride, potassium tellurite, sodium chloride, or a mixture of selective compounds
  • an antibiotic or a mixture of antibiotic (s) and / or antifungal (s) such as in particular one or more beta-lactams, one or more aminoglycosides, one or more glycopeptides, one or more quinolones, one or more polypeptides, Amphotericin, azoles, alone or
  • said other metabolic indicator is an enzymatic substrate, preferably a substrate of osidase, esterase, peptidase, beta-glucosidase and / or beta-galactosidase.
  • said other metabolic indicator is selected from a substrate of beta glucosidase and / or beta galactosidase.
  • said beta ribosidase substrate is chosen from 2-hydroxyphenyl- ⁇ -D-riboside (catechol- ⁇ -D-riboside); Magenta- ⁇ -D-riboside (5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl- ⁇ -D-riboside); Dihydroxyflavone- ⁇ -D-riboside;
  • Nitrophenyl- ⁇ -D-riboside 4-methylumbelliferyl- ⁇ -D-riboside.
  • said beta ribosidase substrate is the
  • said beta ribosidase substrate is X- ⁇ -D-riboside (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl- ⁇ -D-riboside).
  • said reaction medium is a solid medium.
  • said reaction medium is a liquid medium.
  • said beta ribosidase substrate is preferentially Catechol- ⁇ -D-riboside because it allows the detection / identification of S. aureus in approximately
  • the invention also relates to a method for detecting and / or identifying
  • Staphylococcus aureus characterized in that it comprises or consists of the following steps: a) having a reaction medium as defined above b) seeding the medium with a biological sample to be tested, c) incubating, and d ) characterize the presence of Staphylococcus aureus
  • This method may further comprise a confirmation step.
  • This confirmatory step can be in particular a biochemical, immunological or molecular identification.
  • the seeding of the microorganisms can be carried out by all the seeding techniques known to those skilled in the art.
  • An incubation step can be carried out at a temperature for which the expression of the enzymatic activity that it is desired to detect is optimal, which the person skilled in the art can easily choose according to the enzymatic activity to be detected.
  • step c) it is allowed to incubate during step c) between 16 and 48 h, preferably between 18 and 24 h.
  • Step d) can be carried out by visual examination, colorimetry or fluorimetry.
  • Strains of S. aureus with acquired resistance to one or more antibiotics and in particular MRSA strains of S. aureus resistant to Meticillin
  • GISA strains of S. aureus with intermediate resistance to glycopeptides
  • VISA strains of S. Vancomycin intermediate resistance aureus
  • VRSA S. aureus strains resistant to Meticillin
  • Vancomycin and other resistant phenotypes can be detected by adding the appropriate antibiotic, chosen in particular from ⁇ -lactams, cephalosporins, glycopeptides, aminoglycosides, quinolones, polypeptides, etc.
  • the following media were prepared in 200 ml of a base columbia agar (Oxoid), in combination with the chromogenic substrates of ⁇ -D- ⁇ bosidase.
  • the different substrates as well as the concentrations and the additives used in the media are decon the following table 1:
  • ⁇ -D-ribosidase substrates are solubilized in DMSO and added to the media to obtain the concentrations indicated in Table 1.
  • 191 bacterial strains were seeded on each of the media from a suspension at 0.5 MacFarland diluted to 1000 e .
  • the dishes were incubated at 37 ° C. and then read.
  • the media were divided into Petri dishes then inoculated with approximately
  • the strain of 191 strains included: 79 MRSA, 48 Staphylococcus spp, 61
  • reaction media comprising the Catechol- ⁇ -D-riboside or X- ⁇ -riboside substrates are the most specific and the most sensitive since they allowed a good detection of Staphylococcus aureus (MRSA and MSSA), and this, after only 18h of incubation for Catechol- ⁇ -D-riboside and 24h incubation for X- ⁇ -D-riboside with only 3% false-positives in coagulase-negative staphylococci.
  • MRSA and MSSA Staphylococcus aureus
  • the medium containing the DHF- ⁇ -D-riboside was also very sensitive but less specific since the percentage of coagulase-negative staphylococci ⁇ -ribosidase positive was 68 to 24 and 91% at 48 hours.
  • the medium below had the same composition as a S. aureus chromlD base (bioMérieux), without selective agents or agar so as to obtain a liquid medium.
  • the substrates and inductors were replaced before autoclaving with 300 mg / L of catechol- ⁇ -D-riboside, solubilized in DMSO, and with 500 mg / l of ammoniacal iron citrate.
  • the medium was then distributed in tubes at a rate of 1.5 ml / tube. For this medium, seeding was carried out from pre-cultures of 24 h at 37 ° C. A suspension in 0.5 McF physiological saline was carried out then each tube was inoculated with 10 ⁇ l of bacterial suspension.
  • Catechol- ⁇ -D-riboside a GTS medium (bioMérieux) supplemented with 300 mg / L of
  • X- ⁇ -D-riboside Modified Chapman medium, without NaCl, autoclaved and supplemented with 60 mg / L of X- ⁇ -D-riboside was used and divided into 55 mm diameter Petri dishes.
  • Table 4 Evaluation of Catechol- ⁇ -D-riboside and X- ⁇ -D-riboside substrates on a large panel of Staphylococcus spp.
  • Table 5 Abbreviation of different combinations of chromogenic ⁇ -ribosidase substrates and chromogenic substrates specific for other enzymatic activities.
  • the different substrates are solubilized in DMSO and added to the media.
  • IPTG solubilized in osmosis water is added so as to obtain a concentration of 1 mg / l.
  • the media were distributed in a 55 mm petri dish and inoculation was carried out starting from pre-cultures for 24 hours at 37 ° C. A suspension in physiological saline at 0.5 McF was carried out then each strain was seeded, at 1 ° C. 'oese calibrated lO ⁇ l, on a box.
  • the readings were carried out after 18, 24 and 48 hours of incubation at 37 ° C.
  • a total of 28 strains of staphylococci were tested: 5 MRSA and 3 S. aureus, 4 S. saprophyticus, 4 S. cohnii, 4 S. xylosus, 4 S. sciuri, 2 S. epidermidis and 2 S. haemolyticus.
  • C colony staining after incubation
  • I the Intensity of this staining
  • TI defines the incubation times.
  • the intensity of the coloration is an arbitrary scale and can be defined as follows:
  • MSSA and most other species of Staphylococci was used and divided into 55 mm diameter Petri dishes.
  • the substrate was solubilized in DMSO before being added to the medium.
  • Seeding was carried out from pre-cultures of 24 h at 37 ° C. A suspension in 0.5 McF physiological saline was carried out then each strain was sown, at the calibrated level 10 ⁇ l, on a box.
  • the readings were carried out after 24 and 48 hours of incubation at 37 ° C.

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Abstract

L'invention concerne un milieu réactionnel pour la caractérisation de Staphylococcus aureus comprenant un indicateur métabolique qui est un substrat de beta ribosidase en combinaison avec au moins un autre indicateur métabolique et/ou au moins un régulateur métabolique. L'invention concerne également un procédé de détection et/ou d'identification de Staphylococcus aureus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) disposer d'un milieu réactionnel comprenant un indicateur métabolique qui est un substrat de beta-ribosidase en combinaison avec au moins un autre indicateur métabolique et/ou au moins un régulateur métabolique; b) ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester; c) laisser incuber, et; d) caractériser la présence de Staphylococcus aureus.

Description

Milieu réactionnel pour la détection et/ou l'identification de Staphyloccocus aureus
La présente invention concerne un milieu réactionnel spécifique de Staphylococcus aureus. Elle concerne également un procédé de détection et/ou d'identification des Staphylococcus aureus qui utilise un tel milieu.
La plupart des espèces du genre Staphylococcus sont des pathogènes opportunistes chez l'homme présentant un risque élevé en cas de blessure cutanée par un traumatisme ou par implantation directe d'un produit médical.
Parmi les staphylocoques, Staphylococcus aureus est incontestablement l'espèce la plus virulente, puisqu'elle produit un nombre important de toxines et d'enzymes extracellulaires. Elle peut être à l'origine de pathologies nombreuses et variées, allant du simple panaris, jusqu'aux infections les plus sévères comme les septicémies, endocardites, pneumopathies, infections ostéoarticulaires, dont le pronostic peut être très réservé. Elle se retrouve souvent chez des patients qui doivent recevoir des soins hospitaliers faisant intervenir des appareils tels que seringues, cathéters. Il y a donc un grand intérêt de détecter la présence de cette bactérie pathogène, de plus en plus impliquée dans les maladies nosocomiales.
En bactériologie, il est classique d'opposer l'espèce Staphylococcus aureus, caractérisée par la production d'une coagulase, aux autres espèces dites à coagulase négative. Les méthodes traditionnelles pour différencier Staphylococcus aureus de Staphylococcus non aureus reposent sur la recherche de la coagulase libre, de la DNase et sur l'obtention d'une agglutination sur latex visant à mettre en évidence la présence du facteur d'affinité pour le fibrinogène, de la protéine A et d'antigènes capsulaires. Toutefois, d'autres espèces de staphylocoques, potentiellement pathogènes, sont capables d'exprimer une coagulase.
Il existe également des techniques de culture sur milieux sélectifs pour permettre d'évaluer la présence de Staphylococcus aureus, tels que le milieu hypersalé de Chapman (à 7,5 % de NaCl), qui est généralement sélectif pour Staphylococcus aureus et les staphylocoques qui hydrolysent le Mannitol, et le milieu de Baird Parker (contenant du Tellurite de potassium et du Chlorure de lithium comme agents sélectifs), qui est utilisé pour isoler et dénombrer les staphylocoques à coagulase positive dans les produits alimentaires et permet de mettre en évidence une activité lécithinase. Toutefois, ces techniques manquent de sensibilité (pouvoir de mettre en évidence l'espèce recherchée lorsque celle-ci est présente en faible quantité dans un échantillon biologique à tester) et surtout de spécificité (pouvoir de détecter l'espèce recherchée dans l'échantillon biologique à tester contenant d'autres espèces) et, ne donnent qu'un diagnostic présomptif nécessitant d'autres tests de confirmation. Or, les manipulations supplémentaires, nécessaires à l'identification de Staphylococcus aureus, augmentent la durée et le coût des analyses. Elles nécessitent une multitude de réactifs et l'intervention d'un personnel qualifié.
Il est également possible d'utiliser des milieux de culture comprenant des substrats enzymatiques, notamment des substrats de phosphatase et/ou de beta-glucosidase ou d'alpha-glucosidase. On peut citer par exemple le milieu de culture chromogénique CHROMagar (marque déposée) Staph. aureus qui permet l'isolement des staphylocoques et l'identification de Staphylococcus aureus à l'aide de substrats chromogéniques qui procurent une coloration mauve de cette dernière espèce (Gaillot O. et al. 2000. J. Clin. Microbiol. 38, 4,1587-1591). Les autres espèces du même genre sont alors détectées par la coloration bleue ou incolore, en théorie. L'identification est essentiellement basée sur les activités phosphatase, beta-glucosidase, beta-glucuronidase et beta-galactosidase, ainsi que sur la présence d'un inhibiteur, la Déféroxamine, qui permet la différenciation de Staphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis. Toutefois, la différenciation des Staphylococcus aureus et des Staphylococcus epidermidis est imparfaite car les deux espèces produisent des colonies de la même couleur sur le milieu CHROMagar (marque déposée). Ceci est dû au manque de spécificité des substrats de phosphatase qui sont positifs pour les Staphylococcus aureus et les Staphylococcus epidermidis et au fait que l'inhibition de ces derniers par la Déféroxamine n'est que partielle.
Il est également possible d'utiliser des substrats d'alpha-glucosidase, tel que décrit dans la demande de brevet WO02079486. Ainsi, en détectant uniquement l'activité alpha- glucosidase, il est possible de séparer Staphylococcus aureus de Staphylococcus epidermidis et Staphylococcus saprophyticus qui sont trois des principales espèces de staphylocoques isolées en clinique. Toutefois, si les substrats d'alpha-glucosidase avec un chromophore à noyau Indoxyl sont très adaptés à une utilisation en milieu solide, leur utilisation peut être problématique en milieu liquide, car la coloration ne diffuse pas dans le milieu liquide.
D'une manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que l'utilisation de substrat(s) enzymatique(s) de ribosidase permet une identification aisée et rapide de Staphylococcus aureus. En particulier, l'utilisation de substrat(s) enzymatique(s) de ribosidase en combinaison avec un régulateur et/ou un autre indicateur métabolique permet de distinguer les S. aureus des autres espèces de saphylocoques.
Avant de présenter l'invention, les définitions suivantes sont données pour permettre de mieux comprendre l'invention. Elles ne sont nullement limitatives.
Par milieu réactionneL on entend un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à l'expression d'un métabolisme et/ou à la croissance de microorganismes. Le milieu réactionnel peut être solide, semi-solide ou liquide. Par milieu solide, on entend par exemple un milieu gélifié. L'agar est l'agent gélifiant traditionnel en microbiologie pour la culture des microorganismes, mais il est possible d'utiliser de la gélatine ou de l'agarose. Un certain nombre de préparation sont disponibles dans le commerce, comme par exemple l'agar Columbia, la gélose Trypcase-soja, la gélose Mac Conkey, la gélose Sabouraud ou plus généralement celles décrites dans le Handbook of Microbiological Media (CRC Press).
Le milieu réactionnel peut comprendre un ou plusieurs éléments en combinaison, tels que des acides aminés, des peptones, des hydrates de carbone, des nucléotides, des minéraux, des vitamines ... Le milieu peut comprendre également un colorant. A titre indicatif, on peut citer comme colorant le bleu d'Evans, du rouge neutre, du sang de mouton, du sang de cheval, un opacifiant tel que l'oxyde de Titane, de la nitroaniline, du vert malachite, du vert brillant, un ou plusieurs indicateurs métaboliques, un ou plusieurs régulateurs métaboliques...
Le milieu réactionnel peut être un milieu de révélation, ou un milieu de culture et de révélation. Dans le premier cas, la culture des microorganismes est effectuée avant ensemencement et, dans le deuxième cas, le milieu de détection et/ou d'identification constitue également le milieu de culture. L'homme du métier peut également utiliser une bi-boite, permettant de comparer aisément deux milieux, comprenant différents substrats ou différents mélanges sélectifs, sur lequel on aura déposé un même échantillon biologique.
Par régulateur métabolique, on entend tout composé(s) qui régule la croissance d'un microorganisme. Ce régulateur métabolique peut être notamment un régulateur d'osidase, un composé sélectif, tel que notamment Chlorure de Lithium, Tellurite de Potassium, Chlorure de Sodium, ou un mélange de composés sélectifs, un antibiotique, un mélange d'antibiotique(s) et/ou antifongique(s) comprenant ou non une ou plusieurs beta- lactamines, un ou plusieurs aminosides, un ou plusieurs glycopeptides, une ou plusieurs quinolones, un ou plusieurs polypeptides, de l'Amphotéricine, un ou plusieurs azolés, ce qui permet de favoriser la détection des Staphylococcus aureus, des inhibiteurs qui privilégient la croissance des bactéries Staphylococcus aureus, tel que notamment le Chlorure de Lithium (LiCI), Azide de sodium (NaN3), Colistine, Amphotéricine, Aztréonam, Colimicine, Chlorure de Sodium (NaCl), Déféroxamine, composé vibrio statique 0/129.
Préférentiellement, le milieu selon l'invention comprend un mélange sélectif pour favoriser la croissance des Staphylococcus aureus et/ou inhiber la croissance des autres espèces de microorganismes. Ce mélange comprend préférentiellement du Chlorure de Lithium, un composé vibrio statique 0/129, l'Aztréonam, et l'Amphotéricine. Par régulateur métabolique d'osidase, on entend notamment les composés qui peuvent induire ou réprimer l'expression d'une ou plusieurs activités osidases dans le milieu réactionnel.
Préférentiellement, la concentration en régulateur métabolique est comprise entre 0,5mg/l et 75 g/1.
Par indicateur métabolique, on entend tout composé(s) qui permet de mettre en évidence la présence d'un microorganisme. Cet indicateur métabolique peut être notamment un substrat, tel qu'un substrat de ribosidase, ou un substrat autre qu'un substrat de beta ribosidase, tel que notamment un substrat d'osidase, d'estérase, de peptidase et plus particulièrement de beta glucosidase et/ou beta galactosidase et/ou beta glucuronidase et/ou phosphatase, ce qui favorise la détection des S. aureus. Le milieu peut comprendre également un ou plusieurs indicateurs métaboliques différent d'un substrat de beta ribosidase, tels qu'une combinaison de substrats. L'homme du métier adaptera la concentration en substrat(s) selon le microorganisme que l'on souhaite identifier.
Préférentiellement, la concentration en substrat est comprise entre 5 et 1000 mg/1, préférentiellement entre 50 et 400 mg/1.
Par substrat, on entend une molécule pouvant être hydrolysée par une enzyme, telle que la beta ribosidase en un produit permettant la détection, directe ou indirecte d'un microorganisme. Ce substrat comprend notamment une première partie spécifique de l'activité enzymatique à révéler et une seconde partie faisant office de marqueur, ci-après appelée partie marqueur. Cette partie marqueur peut être chromogène, fluorogène, luminescente...
Par substrat de beta ribosidase, on entend notamment le 2-Hydroxyphenyl-β-D-riboside
(Catéchol-β-D-riboside); Magenta-β-D-riboside (5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-β-D- riboside); Dihydroxyflavone-β-D-riboside ; X-β-D-riboside (5-Bromo-4-chloro-3- indoxyl-β-D-riboside) ; Rose-β-D-riboside (6-Chloro-3-indoxyl-β-D-riboside) ; 6-
Bromo-3-indoxyl-β-D-riboside ; 5-Bromo-3-indoxyl-β-D-riboside ; 6-Fluoro-3-indoxyl- β-D-riboside ; Alizarine-β-D-riboside ; (P)-Nitrophenyl-β-D-riboside ; A-
Méthylumbelliferyl-β-D-riboside, Naphtol-β-D-riboside, Dichloro-aminophenyl- β-D-riboside.
Préférentiellement, la concentration en substrat de beta ribosidase dans le milieu selon l'invention est comprise entre 25 et 1000 mg/1 et plus préférentiellement entre 50 et 400 mg/1.
Par substrat de beta glucosidase, on entend notamment 2-Hydroxyphenyl-β-D-glucoside
(Catéchol-β-D-glucoside); Magenta-β-D-glucoside (5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-β-D- glucoside); Dihydroxyflavone-β-D-glucoside ; X-β-D-glucoside (5-Bromo-4-chloro-3- indoxyl-β-D-glucoside) ; Rose-β-D-glucoside (6-Chloro-3-indoxyl-β-D-glucoside) ; 6-
Bromo-3-indoxyl-β-D-glucoside ; 5-Bromo-3-indoxyl-β-D-glucoside ; 6-Fluoro-3- indoxyl-β-D-glucoside ; Alizarine-β-D-glucoside ; (P)-Nitrophenyl-β-D-glucoside ; A-
Méthylumbelliferyl-β-D-glucoside, Naphtholbenzein-β-D-glucoside, Indoxyl-N-méthyl- β-D-glucoside, 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-méthyl-β-D-glucoside,
8-Hydroxyquinoline-β-D-glucoside, Naphtol-β-D-glucoside.
Préférentiellement, la concentration en substrat de beta glucosidase dans le milieu selon l'invention est comprise entre 25 et 1000mg/l et plus préférentiellement entre 50 et
400mg/l. Par substrat de beta galactosidase, on entend notamment 2-Hydroxyphenyl-β-D- galactoside (Catéchol-β-D-galactoside); Magenta-β-D-galactoside (5-Bromo-6-chloro-3- indoxyl-β-D-galactoside); Dihydroxyflavone-β-D-galactoside ; X-β-D-galactoside (5- Bromo-4-chloro-3-indoxyl-β-D-galactoside) ; Rose-β-D-galactoside (6-Chloro-3- indoxyl-β-D-galactoside) ; 6-Bromo-3-indoxyl-β-D-galactoside ; 5-Bromo-3-indoxyl-β- D-galactoside ; 6-Fluoro-3-indoxyl-β-D-galactoside ; Alizarine-β-D-galactoside ; (P)- Nitrophenyl-β-D-galactoside ; 4-Méthylumbelliferyl-β-D-galactoside, Naphtholbenzein- β-D-galactoside, Indoxyl-N-méthyl-β-D-galactoside, 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl- N-méthyl-β-D-galactoside, 8-Hydroxyquinoline-β-D-galactoside, Naphtol- β-D-galactoside.
Préférentiellement, la concentration en substrat de beta galactosidase dans le milieu selon l'invention est comprise entre 25 et 1000 mg/1 et plus préférentiellement entre 50 et 400 mg/1.
Par Staphylococcus aureus, on entend toute souche de Staphylococcus aureus, y compris les souches résistantes telles que les MRSA (Staphylococcus aureus résistante a la methicilline), les MSSA, les GISA, les VISA ou les VRSA (Staphylococcus aureus à résistance intermédiaire aux glycopeptides, intermédiaire à la Vancomycine ou résistante à la Vancomycine respectivement).
Par échantillon biologique, on entend un échantillon clinique, issu d'un prélèvement de liquide biologique ou un échantillon alimentaire, issu de tout type d'aliment. Cet échantillon peut être ainsi liquide ou solide et on peut citer d'une manière non limitative, un échantillon clinique de sang, de plasma, d'urines, de fécès, de prélèvements de nez, de gorges, de peaux, de plaies, de liquide céphalo-rachidien, un échantillon alimentaire d'eau, de boissons tels que le lait, un jus de fruits, de yaourt, de viande, d'œufs, de légumes, de mayonnaise, de fromage ; de poisson..., un échantillon alimentaire issu d'une alimentation destinée aux animaux, tel que notamment un échantillon issu de farines animales.
A ce titre, l'invention concerne un milieu réactionnel pour la caractérisation de Staphylococcus aureus comprenant un indicateur métabolique qui est un substrat de beta ribosidase en combinaison avec au moins un autre indicateur métabolique et/ou au moins un régulateur métabolique. L'invention concerne également l'utilisation d'un indicateur métabolique qui est un substrat de beta ribosidase en combinaison avec un autre indicateur métabolique et/ou un régulateur métabolique pour la caractérisation de Staphylococcus aureus.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit régulateur métabolique est choisi parmi un régulateur de l'activité d'osidase, un composé sélectif, tels que notamment Chlorure de Lithium, Tellurite de Potassium, Chlorure de Sodium, ou un mélange de composés sélectifs, un antibiotique ou un mélange d'antibiotique(s) et/ou antifongique(s), tel que notamment une ou plusieurs beta-lactamines, un ou plusieurs aminosides, un ou plusieurs glycopeptides, une ou plusieurs quinolones, un ou plusieurs polypeptides, de l'Amphotéricine, des azolés, seuls ou en combinaison avec un ou plusieurs composés sélectifs.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit autre indicateur métabolique est un substrat enzymatique, préférentiellement un substrat d'osidase, d'estérase, de peptidase, de beta glucosidase et/ou beta galactosidase. Selon un mode encore plus préféré, ledit autre indicateur métabolique est choisi parmi un substrat de beta glucosidase et/ou beta galactosidase.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit substrat de beta ribosidase est choisi parmi le 2-Hydroxyphényl-β-D-riboside (Catéchol-β-D-riboside); Magenta- β-D- riboside (5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-β-D-riboside); Dihydroxyflavone-β-D-riboside ;
X-β-D-riboside (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-β-D-riboside) ; Rose-β-D-riboside (6-
Chloro-3-indoxyl-β-D-riboside) ; 6-Bromo-3-indoxyl-β-D-riboside ; 5-Bromo-3-indoxyl- β-D-riboside ; 6-Fluoro-3-indoxyl-β-D-riboside ; Alizarine-β-D-riboside ; (P)-
Nitrophenyl-β-D-riboside ; 4-Méthylumbelliferyl-β-D-riboside.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit substrat de beta ribosidase est le
Catéchol-β-D-riboside).
Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, ledit substrat de beta ribosidase est le X-β-D-riboside (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-β-D-riboside).
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit milieu réactionnel est un milieu solide.
Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, ledit milieu réactionnel est un milieu liquide. Dans ce cas, ledit substrat de beta ribosidase est préférentiellement le Catéchol-β-D-riboside car il permet la détection/identification des S. aureus en environ
18h.
L'invention concerne également un procédé de détection et/ou d'identification de
Staphylococcus aureus, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué par les étapes suivantes : a) disposer d'un milieu réactionnel tel que défini ci avant b) ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester, c) laisser incuber, et d) caractériser la présence de Staphylococcus aureus
Ce procédé peut comprendre, en outre, une étape de confirmation Cette étape de confirmation peut être notamment une identification biochimique, immunologique ou moléculaire.
L'ensemencement des microorganismes peut être réalisé par toutes les techniques d'ensemencement connues de l'homme du métier. Une étape d'incubation peut être réalisée à une température pour laquelle l'expression de l'activité enzymatique que l'on souhaite détecter est optimale, que l'homme du métier peut choisir aisément selon l'activité enzymatique à détecter.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on laisse incuber lors de l'étape c) entre 16 et 48h, préférentiellement entre 18 et 24h.
L'étape d) peut s'effectuer par un examen visuel, par colorimétrie ou fluorimétrie.
Les souches de S. aureus à résistance acquise à un ou plusieurs antibiotiques et notamment les MRSA (souches de S. aureus résistantes à la Méticilline), GISA (souches de S. aureus à résistance intermédiaire au glycopeptides), VISA (souches de S. aureus à résistance intermédiaire à la Vancomycine), VRSA (souches de S. aureus résistantes à la
Vancomycine) et autres phénotypes résistants peuvent être détectés par ajout de l'antibiotique adapté, choisi notamment parmi les β-lactamines, céphalosporines, glycopeptides, aminosides, quinolones, polypeptides...
Les exemples ci dessous sont donnés à titre explicatif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention. Expérience 1 : Evaluation de substrats de β-D-ribosidase pour la caractérisation de S aureus :
Les milieux ci-après ont été préparés dans 200 ml d'une base columbia agar (Oxoid), en combinaison avec les substrats chromogéniques de β-D-πbosidase Les différents substrats ainsi que les concentrations et les additifs utilisés dans les milieux sont décnts dans le tableau 1 suivant :
Tableau 1 : Abréviations et concentrations des substrats chromogéniques de β-D- ribosidase utilisés
Les substrats de β-D-ribosidase sont solubilisés dans le DMSO et additionnés aux milieux pour obtenir les concentrations indiquées dans le tableau 1
191 souches bactériennes ont été ensemencées sur chacun des milieux à partir d'une suspension à 0,5 MacFarland diluée au 1000e. Les boîtes ont été incubées à 370C puis lues.
Les milieux ont été répartis en boites de Pétri puis inoculés avec approximativement
100 000 CFU puis incubés à 370C pendant 48h. Les colonies formées ont été examinées visuellement après des temps d'incubation de 18, 24 et 48 heures.
Le souchier de 191 souches comportait : 79 MRSA, 48 Staphylococcus spp, 61
Enterococcus spp et 3 Streptococcus alpha hémolytiques
Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau ci dessous
Tableau 2 : évaluation des différents substrats de β-D-ribosidase
Tous les milieux permettaient bien la détection de Staphylococcus aureus.
Les milieux réactionnels comprenant les substrats Catéchol-β-D-riboside ou X-β-riboside sont les plus spécifiques et les plus sensibles puisqu'ils permettaient une bonne détection des Staphylococcus aureus (MRSA et MSSA), et cela, après seulement 18h d'incubation pour le Catéchol-β-D-riboside et 24h d'incubation pour le X-β-D-riboside avec seulement 3% de faux-positifs chez les staphylocoques à coagulase négative.
Le milieu contenant le DHF-β-D-riboside était aussi très sensible mais moins spécifique puisque le pourcentage de staphylocoques à coagulase négative β-ribosidase positive était de 68 à 24 et 91% à 48 heures.
Expérience 2 : Evaluation du Catéchol-β-D-riboside en milieu liquide
Le milieu ci-après avait la même composition qu'une base chromlD S. aureus (bioMérieux), sans agents sélectifs ni agar de façon à obtenir un milieu liquide. Les substrats et inducteurs ont été remplacés avant autoclavage par 300 mg/L de catéchol-β- D-riboside, solubilisé dans du DMSO, et avec du citrate de fer ammoniacal à 500 mg/L. Le milieu était ensuite réparti dans des tubes à raison de 1,5 ml/tube. Pour ce milieu, l'ensemencement était effectué à partir de pré-cultures de 24h à 370C. Une suspension en eau physiologique à 0,5 McF était réalisée puis chaque tube est inoculé avec 10 μl de suspension bactérienne. Les lectures étaient effectuées après 24 et 48 heures d'incubation à 370C. Au total, 11 souches de staphylocoques ont été testées, 5 S. aureus et 6 d'autres espèces du genre Staphylococcus (coag neg). Les résultats obtenus ont été consignés dans le tableau 3 ci-après :
Tableau 3 : Evaluation du catéchol-β-D-riboside en milieu liquide
Les résultats obtenus en milieu solide et montrant la haute spécificité du Catéchol-β-D- riboside pour les S. aureus étaient confirmés en milieu liquide : 100 % de coloration pour les S.aureus était observé dès 18 heures alors qu'aucune des autres espèces du genre Staphylococcus n'était détectée.
Expérience 3 : Confirmation des résultats obtenus avec les substrats Catéchol-β-D- riboside et X-β-D-riboside sur un large panel de Staphylococcus spp.
Afin de confirmer la pertinence des milieux réactionnels comprenant le substrat Catéchol- β-D-riboside ou le substrat X-β-D-riboside, les expériences suivantes ont également été réalisées :
Catéchol-β-D-riboside : Un milieu GTS (bioMérieux) supplémenté avec 300 mg/L de
Catéchol-β-riboside puis autoclave et 500 mg/L de citrate de fer ammoniacal a été utilisé et réparti en boites de Pétri de 55 mm de diamètre. X-β-D-riboside : Un milieu Chapman modifié, sans NaCl, autoclave et supplémenté avec 60 mg/L de X-β-D-riboside a été utilisé et réparti en boîtes de Pétri de 55 mm de diamètre.
Pour les 2 milieux, l'ensemencement était effectué à partir de pré-cultures de 24h à 370C. Une suspension en eau physiologique à 0,5 McF était réalisée puis chaque souche est ensemencée à l'oese calibrée lOμl sur une boite. Les lectures étaient effectuées après 24 et 48 heures d'incubation à 37°C. Au total, 90 Staphylocoques ont été testés, 34 S. aureus dont 25 MRSA et 46 autres espèces de Staphylococcus (incluant S. schleiferi ; S. capitis ; S. hyicus ; S. intermedius ; S. haemolyticus ; S. auήculaήs ; S. hominis ; S. warneri ; S. chromogenes ; S. cohnii ; S. epidermidis ; S. sciun ; S. xylosus ; S. saprophyticus).
Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau 4.
Tableau 4 : Evaluation des substrats Catéchol-β-D-riboside et X-β-D-riboside sur un large panel de souches Staphylococcus spp.
Les résultas de cet essai montrent une bonne spécificité de ces 2 substrats pour S. aureus, et cela, dès 18h. En effet, sur les 13 autres espèces du genre Staphylococcus, seules 4 espèces très minoritaires donnaient une coloration. Il s'agissait des espèces Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus conhh et Staphylococcus sciuri, qui ne représentent à elles 4 que seulement 4,4% des souches de Staphylococcus retrouvées dans les prélèvements cliniques contre 23,3% pour les Staphylococcus aureus (Kawamura & al. 1998. Distribution of Staphylococcus species among human clinical spécimens and emended description of Staphylococcus caprae. J. Clin Microbiol. 36:2038-2042).
Expérience 4 : Différenciation des Staphylococcus aureus par rapport aux autres espèces du même genre par la détection directe de l'activité β-D-ribosidase et d'une autre activité osidase dans un milieu gélifié
Les milieux ci-après ont été préparés dans un milieu Chapman modifié, sans NaCl, autoclave et associent un substrat chromogénique de beta ribosidase avec une combinaison de un ou deux autres indicateurs métaboliques, c'est à dire un ou deux substrats chromogéniques autres que celui permettant de détecter une activité β- ribosidase. Ces combinaisons de substrats sont présentées dans le tableau suivant :
Tableau 5 : Abréviation de différentes combinaisons de substrats chromogéniques de β- ribosidase et de substrats chromogéniques spécifiques d'autres activités enzymatiques.
Les différents substrats sont solubilisés dans le DMSO et additionnés aux milieux.
Pour les milieux contenant le substrat Blue-β-galactoside, de l'IPTG solubilisé dans de l'eau osmosée, est ajouté de façon à obtenir une concentration de 1 mg/L.
Les milieux étaient répartis en boite de Pétri de 55 mm et l'ensemencement était effectué à partir de pré-cultures de 24h à 370C. Une suspension en eau physiologique à 0,5 McF était réalisée puis chaque souche est ensemencée, à l'oese calibrée lOμl, sur une boite.
Les lectures étaient effectuées après 18, 24 et 48 heures d'incubation à 370C.
Au total, 28 souches de staphylocoques ont été testées : 5 MRSA et 3 S. aureus, 4 S. saprophyticus, 4 S. cohnii , 4 S. xylosus, 4 S. sciuri, 2 S. epidermidis et 2 S. haemolyticus.
Dans le tableau ci-dessous, C représente la coloration des colonies après incubation, I représente l'Intensité de cette coloration et TI défini les temps d'incubation. L'intensité de la coloration est une échelle arbitraire et peut être définie de la manière suivante :
• Le symbole « - » correspond à une absence d'activité
• 0,1 correspond à la présence d'une trace de coloration
• 0,5 correspond à la présence d'une coloration très pâle 1 correspond à la présence d'une coloration nette de faible intensité
1,5 correspond à la présence d'une coloration intermédiaire aux colorations 1 et 2,
2 correspond à la présence d'une coloration franche d'intensité moyenne,
2,5 correspond à la présence d'une coloration intermédiaire aux colorations 2 et 3,
3 correspond à la présence d'une coloration intense,
3,5 correspond à la présence d'une coloration intermédiaire aux colorations 3 et 4,
4 correspond à la présence d'une coloration très intense.
Les résultats de l'essai sont présentés ci-après
Tableau 6 : Evaluation de différentes combinaisons de substrats
Les résultats ci-dessus montrent qu'il est possible de distinguer les Staphylococcus aureus des autres espèces de staphylocoques exprimant une β-D-ribosidase dès 18 heures d'incubation avec une combinaison de substrats.
Seule une souche de Staphylococcus saprophyticus posait problème à 48 heures mais il n'y avait aucune ambiguïté à 24 heures d'incubation car les Staphylococcus aureus avaient déjà une bonne intensité de coloration.
Expérience 5 : Détection des MRSA par leur activité β-ribosidase dans un milieu sélectif.
Un milieu Chapman modifié, sans NaCl, autoclave et supplémenté avec 100 mg/L de X- β-D-riboside et sélectif, c'est à dire comprenant des régulateurs inhibiteurs métaboliques
(LiCl, composé vibriostatique 0/129, Aztréonam, et. Amphotéricine) pour inhiber les
MSSA et la plupart des autres espèces de Staphylocoques, a été utilisé et réparti en boîtes de Pétri de 55 mm de diamètre.
Le substrat a été solubilisé dans du DMSO avant d'être ajouté au milieu.
L'ensemencement a été effectué à partir de pré-cultures de 24h à 370C. Une suspension en eau physiologique à 0,5 McF a été réalisée puis chaque souche est ensemencée, à l'oese calibrée lOμl, sur une boite.
Les lectures ont été effectuées après 24 et 48 heures d'incubation à 370C.
Au total, 15 souches de staphylocoques ont été testées : 5 MRSA et 2 MSSA, 4 S. epidermidis, 1 S. cohnii, 4 S. sciuri et 2 S. saprophyticus.
Les résultats sont consignés dans le tableau 7, ci-après :
Tableau 7 : Détection des MRSA sur un milieu sélectif par leur activité β-ribosidase
Les résultats ci-dessus montrent que sur un milieu sélectif, inhibant les MSSA et la plupart des autres espèces de Staphylocoques, il est possible de distinguer les MRSA qui ont une coloration turquoise. Les autres espèces ayant une croissance sur ce milieu ne présentant pas de coloration dans ces conditions de culture.

Claims

REVENDICATIONS
1) Milieu réactionnel pour la caractérisation de Staphylococcus aureus comprenant un indicateur métabolique qui est un substrat de beta ribosidase en combinaison avec au moins un autre indicateur métabolique et/ou au moins un régulateur métabolique.
2) Milieu réactionnel selon la revendication 1 selon laquelle ledit régulateur métabolique est choisi parmi un régulateur d'osidase, un composé sélectif, ou un mélange de composés sélectifs, un antibiotique ou un mélange d'antibiotique(s) et/ou antifongique(s)
3) Milieu réactionnel selon la revendication 1 ou 2 selon laquelle ledit autre indicateur métabolique est un substrat enzymatique, préférentiellement un substrat d'osidase, d'estérase, de peptidase, de beta glucosidase et/ou beta galactosidase.
4) Milieu réactionnel selon la revendication 3 selon laquelle ledit substrat enzymatique est choisi parmi un substrat de beta glucosidase et/ou beta galactosidase
5) Milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 selon laquelle ledit substrat de beta-ribosidase est un substrat de beta ribofuranosidase.
6) Milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 selon laquelle ledit substrat de beta-ribosidase est un substrat choisi parmi le 2-Hydroxyphenyl-β-D- ribofuranoside (Catéchol-β-D-riboside); Magenta-β-D-riboside (5-Bromo-6-chloro-3- indoxyl-β-D-riboside); Dihydroxyflavone-β-D-riboside ; X-β-D-riboside (5-Bromo-4- chloro-3-indoxyl-β-D-riboside) ; Rose-β-D-riboside (6-Chloro-3-indoxyl-β-D-riboside) ; 6-Bromo-3-indoxyl-β-D-riboside ; 5-Bromo-3-indoxyl-β-D-riboside ; 6-Fluoro-3- indoxyl-β-D-riboside ; Alizarine-β-D-riboside ; (P)-Nitrophenyl-β-D-riboside ; 4- Méthylumbelliferyl-β-D-riboside, Naphtol-β-D-riboside, Dichloro-aminophenyl- β-D-riboside. 7) Milieu réactionnel selon la revendication 6 selon laquelle ledit substrat de beta ribofuranosidase est le 2 hydroxyphenyl beta D ribofuranoside
8) Milieu réactionnel selon la revendication 6 selon laquelle ledit substrat de beta- ribosidase est le 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-β-D-riboside
9) Utilisation d'un indicateur métabolique qui est un substrat de beta ribosidase pour la caractérisation de Staphylococcus aureus en combinaison avec au moins un autre indicateur métabolique et/ou au moins un régulateur métabolique
10) Utilisation selon la revendication 9 selon laquelle ledit substrat de beta-ribosidase est un substrat de beta ribofuranosidase.
11) Utilisation selon la revendication 9 ou 10 dans laquelle ledit substrat de beta- ribosidase est un substrat choisi parmi le 2-Hydroxyphenyl-β-D-ribofuranoside (Catéchol-β-D-riboside); Magenta-β-D-riboside (5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-β-D- riboside); Dihydroxyflavone-β-D-riboside ; X-β-D-riboside (5-Bromo-4-chloro-3- indoxyl-β-D-riboside) ; Rose-β-D-riboside (6-Chloro-3-indoxyl-β-D-riboside) ; 6- Bromo-3-indoxyl-β-D-riboside ; 5-Bromo-3-indoxyl-β-D-riboside ; 6-Fluoro-3-indoxyl- β-D-riboside ; Alizarine-β-D-riboside ; (P)-Nitrophenyl-β-D-riboside ; A- Méthylumbelliferyl-β-D-riboside, Naphtol-β-D-riboside, Dichloro-aminophenyl- β-D-riboside..
12) Utilisation selon la revendication 11 selon laquelle ledit substrat est le 5-Bromo-4- chloro-3-indoxyl-β-D-riboside
13) Utilisation selon la revendication 11 selon laquelle ledit substrat est le 2 hydroxyphenyl beta D ribofuranoside
14) Procédé de détection et/ou d'identification de Staphylococcus aureus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) disposer d'un milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, b) ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester, c) laisser incuber, et d) caractériser la présence de Staphylococcus aureus
15) Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, une étape de confirmation.
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