CN109251957A - 金黄色葡萄球菌选择性显色培养基测试片 - Google Patents
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Abstract
一种金黄色葡萄球菌选择性显色培养基测试片，属于微生物检测技术领域其特征是：制取金黄色葡萄球菌显色培养基，每1000mL培养基中含有胰蛋白胨6~14g，酵母浸粉4~8g，甘油1~10mL，氯化钠65~100g，磷酸二氢钾1~10g，磷酸氢二钾5~15g，琼脂粉7~20g，抑菌剂混合物10~40g，显色剂0.001~1g；制取测试片，在涂有压敏胶的医用透明pu膜上摆放贴附有四块培养基试纸片，再贴附纯棉脱脂纱布，再贴附固定用离型纸。有益效果是：本发明阳性结果显色明显，检测结果准确。本发明所选用试剂均无毒性，可与皮肤直接接触。本发明所用试剂价格低廉且常见，研制成本低。本发明所利用的是培养基显色，而非以往专利的菌落显色，更易于观察，更易于应用在测试片上。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域。
背景技术
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）广泛分布于自然界，是人类的一种重要的致病菌。它既是造成伤口感染的最常见致病菌，能产生凝固酶等多种致病物质，可引起化脓性炎症、葡萄球菌性肠炎等疾病，严重时可导致瘫痪，乃至死亡；同时还是一种重要的食源性致病菌，其产生的耐热肠毒素可引起食物中毒，造成的危害仅次于沙门氏菌和副溶血性弧菌。为确保食品安全，满足人们对生活中致病微生物的检测需求，改善人们的医疗卫生条件，保护人民身体健康，世界各国对不同食品中的金黄色葡萄球菌均做出明确规定，我国颁布食品微生物检测标准GB4789.10-2016，明确规定食品中不得检出金黄色葡萄球菌。目前，对于金黄色葡萄球菌的定性检测，以选择性培养基为主。其中，最常用的是Baird.parker琼脂平板，菌落呈黑色，周围产生透明圈。共需经过富集培养，分离纯化，卵磷脂酶、凝固酶实验、镜检观察等多个步骤，检测周期3-5d，时间长，费用高。同时，因为其菌落的显色面积小，肉眼观察下很容易误判，导致假阴性。此外，非金黄色葡萄球菌，如腐生金黄色葡萄球菌也可造成培养基显色，导致假阳性。另外，存在其他检测方法，如特异性抗原抗体检测、荧光PCR技术、核酸探针技术以及直接药敏实验等新兴的分子生物学和免疫学的快速检测方法，虽然一定程度地缩短了检测时间，提高了检测结果的准确性，可对金黄色葡萄球菌进行定量分析。但由于专业技术人员的缺乏，昂贵的检测仪器，在应用方面存在很大的局限性。
近年来，随着特异性酶显色技术的发展，显色培养基以及与其相关测试片法，已成为微生物定性检测的新的发展方向。测试片技术的问世，以其便携、快速、特异性高等优势深受人民青睐。法国生物梅里埃、科玛嘉等公司开发出金黄色葡萄球菌显色培养基及其测试片，市场上还有美国petrifilm测试片法，都已初具规模。但这些进口显色培养基和测试片培养基配方复杂，价格昂贵，导致检测成本高且购买不方便，使其推广应用受到限制，不便在国内一般基层单位和个人企业推广使用。另外，传统测试片法虽可对微生物进行定性分析，但易于出现假阴、假阳现象，且耗时费力；虽可对微生物进行定量分析，但存在较大的误差，往往还需要再用上述先进检测方法进一步定量。
发明内容
本发明的目的是：提供一种金黄色葡萄球菌选择性显色培养基测试片，达到廉价易得、准确快速、便携且使用简单。
本发明的技术方案是：
金黄色葡萄球菌显色培养基，每1000mL培养基中含有胰蛋白胨6~14g，酵母浸粉4~8g，甘油1~10mL，氯化钠65~100g，磷酸二氢钾1~10g，磷酸氢二钾5~15g，琼脂粉7~20g，抑菌剂混合物10~40g，显色剂0.001~1g。
优选的，每1000mL培养基中含有胰蛋白胨8~12g，酵母浸粉5~7g，甘油2~8mL，氯化钠75~95g，磷酸二氢钾1~5g，磷酸氢二钾8~12g，琼脂粉12~17g，抑菌剂混合物15~30g，显色剂0.005~0.1g。
所述抑菌剂混合物由氯化锂、丙酮酸钠、甘氨酸组成。氯化锂、丙酮酸钠、甘氨酸的质量比为（2.8~3.2）：1：（1.5~2）。
所述显色剂为苯酚红或溴麝香草酚蓝或中性红或树脂质酸中的一种。
金黄色葡萄球菌测试片，其结构由上至下依次为：固定用离型纸、四层纯棉脱脂纱布、压敏胶、四块培养基试纸片、医用透明pu膜（聚氨酯薄膜）。
制取测试片，在涂有压敏胶的医用透明pu膜上摆放贴附有四块培养基试纸片，再贴附四层纯棉脱脂纱布，再贴附固定用离型纸。
本发明的有益效果是：能有效抑制杂菌的生长，对金黄色葡萄球菌的选择性强。本发明利用高氯化钠浓度，对非金黄色葡萄球菌的抑制作用更为明显。本发明阳性结果显色明显，检测结果准确。本发明所选用试剂均无毒性，可与皮肤直接接触。本发明所用试剂价格低廉且常见，研制成本低。本发明所利用的是培养基显色，而非以往专利的菌落显色，更易于观察，更易于应用在测试片上。
本发明采用金黄色葡萄球菌显色培养基制备的测试片，将传统的多步培养检测步骤简化到一步完成，特别适用于对大通量样本中的金黄色葡萄球菌的准确快速检测和监控，特异性强、价格低廉、检测周期短、操作简单方便，对检测环境和检测人员的要求低。本发明创造性地使用了四层纱布，纱布层直接接触待检样液，如血液，食物样液等。可最大限度地去全血、去食物残渣，避免其对检测试纸的影响。同时还扩大了微生物生长代谢的空间，利于微生物的生长繁殖以及有氧呼吸、发酵甘油产生酸性物质，进一步加快了试纸显色的速度。本发明既可以和传统的测试片一样，直接滴加待测样液，又可以黏贴在伤口外周皮肤，直接检测伤口感染情况，简化了临床伤口处微生物检测的流程，进一步拓宽了测试片的使用领域。本发明的显色结果是整个试纸片显色，而非传统的菌落显色，虽不能对微生物进行定量分析，但其显色情况远远好过传统测试片的定性分析，提高了检测结果的准确性，可应用到伤口感染微生物检测领域和食品卫生微生物检测领域，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是本发明金黄色葡萄球菌测试片的3D结构示意图；
图2是本发明金黄色葡萄球菌测试片的仰视图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步描述：
如图1、2所示，其中：1是固定用离型纸、2是四层纯棉脱脂纱布、3是四块培养基试纸片、4是医用透明pu膜。
实施例1：
制取显色培养基：每1000mL培养基中含有胰蛋白胨8g，酵母浸粉5g，甘油6mL，氯化钠80g，磷酸二氢钾1.5g，磷酸氢二钾9.5g，琼脂粉15g，抑菌剂混合物23g，显色剂0.042g。其中，抑菌剂混合物由质量比为3.1:1:1.9的氯化锂、丙酮酸钠、甘氨酸组成；显色剂为苯酚红。
制取测试片：将上述成分溶于1000mL水中，加热煮沸后，调节pH为7.4±0.2。121℃灭菌20min，冷却至常温形成培养基溶液，将四块培养基试纸片浸润于上述培养基溶液内，培养基试纸片每片摆放贴附在涂有压敏胶的医用透明pu膜上，再贴附四层纯棉脱脂纱布，再贴附固定用离型纸，即可使用。
使用方法是：从上面（离型纸面）边缘处撕开，将待测样液滴在九块试纸上层的纱布上，然后将硬纸片重新黏贴上，常温（优选的，37℃恒温培养箱）下培养一段时间后，从下面（透明pu膜面）观察试纸的变色情况。或将上面（离型纸面）撕开后，黏贴在伤口外周皮肤处，覆盖伤口，一段时间后，从下面（透明pu膜面）观察试纸的变色情况。
实施例2：
制取显色培养基：每1000mL培养基中含有胰蛋白胨10g，酵母浸粉6g，甘油4mL，氯化钠95g，磷酸二氢钾2.5g，磷酸氢二钾10g，琼脂粉12g，抑菌剂混合物15g，显色剂0.034g。其中，抑菌剂混合物由质量比为2.9:1:1.7的氯化锂、丙酮酸钠、甘氨酸组成；显色剂为苯酚红。
其它与实施例1相同。
实施例3：
制取显色培养基： 每1000mL培养基中含有胰蛋白胨10g，酵母浸粉7g，甘油5mL，氯化钠80g，磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钾9g，琼脂粉12g，抑菌剂混合物26g，显色剂0.039g。其中，抑菌剂混合物由质量比为2.8:1:1.6的氯化锂、丙酮酸钠、甘氨酸组成；显色剂为苯酚红。
其它与实施例1相同。
实施例4：
制取显色培养基：每1000mL培养基中含有胰蛋白胨12g，酵母浸粉7g，甘油6mL，氯化钠75g，磷酸二氢钾2g，磷酸氢二钾12.8g，琼脂粉13g，抑菌剂混合物28g，显色剂0.068g。其中，抑菌剂混合物由质量比为2.9:1:1.8的氯化锂、丙酮酸钠、甘氨酸组成；显色剂为溴麝香草酚蓝。
其它与实施例1相同。
实施例5
制取显色培养基：每1000mL培养基中含有胰蛋白胨9g，酵母浸粉6g，甘油4mL，氯化钠90g，磷酸二氢钾3g，磷酸氢二钾15.6g，琼脂粉14g，抑菌剂混合物20g，显色剂0.073g。其中，抑菌剂混合物由质量比为2.7:1:1.9的氯化锂、丙酮酸钠、甘氨酸组成；显色剂为溴麝香草酚蓝。
其它与实施例1相同。
实施例6
制取显色培养基：每1000mL培养基中含有胰蛋白胨11g，酵母浸粉5g，甘油5mL，氯化钠85g，磷酸二氢钾2g，磷酸氢二钾14.3g，琼脂粉15g，抑菌剂混合物23g，显色剂0.07g。其中，抑菌剂混合物由质量比为3.1:1:1.8的氯化锂、丙酮酸钠、甘氨酸组成；显色剂为溴麝香草酚蓝。
其它与实施例1相同。
特异性实验：
将金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003，大肠杆菌CMCC(B)44103，铜绿假单胞菌CMCC(B)10104，枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501，睾丸酮丛毛单胞菌ATCC11996等5种标准菌株分别活化后制成适当浓度的标准菌悬液（浓度为102~103cfu/mL），每种菌分别用LB平板、实施例1的金黄色葡萄球菌显色培养基、由实施例1制备的金黄色葡萄球菌改良版测试片、实施例4的金黄色葡萄球菌显色培养基、由实施例4制备的金黄色葡萄球菌改良版测试片进行检测。每种方式均从以上5种菌悬液中分别吸取200uL菌液接种，37℃培养12~24h。结果如表1，“+”表示阳性结果，“-”表示阴性结果。
由表1可知，各种标准菌株在本发明所述的金黄色葡萄球菌显色培养基检查结果和金黄色葡萄球菌改良版测试片检测结果完全正确，特异性好。
实施例1（显色剂为苯酚红）中，培养基呈现橙黄色为阳性，培养基呈现红色（培养基原色）为阴性。实施例4（显色剂为溴麝香草酚蓝）中，培养基呈现淡黄色为阳性，培养基呈现蓝绿色（培养基原色）为阴性。
将上述金黄色葡萄球菌标准菌悬液（浓度为102~103cfu/mL），用实施例1~6的金黄色葡萄球菌显色培养基、由实施例1~6 制备的金黄色葡萄球菌改良版测试片进行检测。每种方式均从金黄色葡萄球菌菌悬液中吸取200uL菌液接种，37℃培养12h。在培养基、试纸片上不同时间点记录显色结果，结果如表2，“+”表示阳性结果，“-”表示阴性结果,“p”表示试纸片未完全显色。
Claims (4)
1.一种金黄色葡萄球菌选择性显色培养基测试片，其特征是：
制取金黄色葡萄球菌显色培养基，每1000mL培养基中含有胰蛋白胨6~14g，酵母浸粉4~8g，甘油1~10mL，氯化钠65~100g，磷酸二氢钾1~10g，磷酸氢二钾5~15g，琼脂粉7~20g，抑菌剂混合物10~40g，显色剂0.001~1g；
制取测试片，在涂有压敏胶的医用透明pu膜上摆放贴附有四块培养基试纸片，再贴附纯棉脱脂纱布，再贴附固定用离型纸。
2.如权利要求1所述的一种金黄色葡萄球菌选择性显色培养基测试片，其特征是：每1000mL培养基中含有胰蛋白胨8~12g，酵母浸粉5~7g，甘油2~8mL，氯化钠75~95g，磷酸二氢钾1~5g，磷酸氢二钾8~12g，琼脂粉12~17g，抑菌剂混合物15~30g，显色剂0.005~0.1g。
3.如权利要求1、2所述的一种金黄色葡萄球菌选择性显色培养基测试片，其特征是：所述抑菌剂混合物由氯化锂、丙酮酸钠、甘氨酸组成；氯化锂、丙酮酸钠、甘氨酸的质量比为2.8~3.2：1：1.5~2。
4.如权利要求1、2所述的一种金黄色葡萄球菌选择性显色培养基测试片，其特征是：所述显色剂为苯酚红或溴麝香草酚蓝或中性红或树脂质酸中的一种。
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