JP2662227B2 - 歯周病原性菌検査薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は歯周病原性菌検査薬、さらに詳しくは、歯周
病巣から採取した検体中の歯周病原性菌である、バクテ
ロイデス・ジンジバリスを特異的に、かつ、簡便、迅速
に検出できる検査薬に関する。 従来の技術および問題点 近年、歯周疾患に関する細菌学的研究が進み、歯周疾
患病巣部に多くのスピロヘータが検出され、種々の臨床
的指標と高い相関性を示すことが判明している。また、
嫌気性のグラム陰性桿菌が主要な歯周疾患の原因菌であ
ることも判明しており、その中でも特に、バクテロイデ
ス・シンジバリス（Bacteroides gingivalis）などの
黒色色素産生バクテロイデス（Black−pigmented Bacte
roides）が注目され、その病原性について多数の報告が
なされている。 そこで、口腔内におけるこれらの原因菌の存在を検知
し、歯周疾患の罹患や進行を診断あるいは予測し、歯周
疾患の治療、予防に、臨床的に応用する試みがなされて
いる。 しかしながら、細菌学的方法によるこれらの原因菌の
検知には、暗視野顕微鏡の使用、嫌気性菌の取扱という
高度な技術、特殊の設備等を必要とし、操作が煩雑で、
培養や結果の判断にも長い時間や熟練を要するという欠
点があり、臨床的に実用化するには困難な点が多い。ま
た、免疫学的な面から、これらの原因菌に対する液性免
疫である血中の抗体価を測定したり、細胞性免疫である
リンパ球幼若化反応を測定し、原因菌の存在を検知する
試みもなされているが、検体試料の調整に煩雑な操作を
必要とする問題があり、やはり、実用化はなかなか困難
である。 このような事情にかんがみ、本発明者らは、臨床的に
実用化できる歯周疾患原因菌の検知を可能とすべく鋭意
研究を重ねた。その結果、バクテロイデス・ジンジバリ
スが非常に特異的なペプチダーゼ様酵素活性を有し、あ
る種の基質に用い、これにチオール化合物およびジイソ
プロピルフルオルリン酸を添加することにより、この酵
素活性を特異的に、かつ、簡便、迅速に検出することを
見出した。 これまで、口腔内のスピロヘータやバクテロイデス・
ジンジバリスがトリプシン様酵素やフィブリン分解酵素
を産生することは知られているが［ジャーナル・オブ・
クリニカル・マイクロバイオロジー（Journal of Clini
cal Microbiology）,97〜102,1982年１月；マイクロバ
イオス・レターズ（Microbios Letters），25,157〜16
0,1984年；ジャーナル・オブ・ペリオドンタル・リサー
チ（Journal of Periodontal Research），21,95〜100,
1986年］、臨床症状との相関性や検出の特異性の点でこ
れらの酵素を指標とすることは困難である。 問題点を解決するための手段 本発明は、液体中のペプチダーゼ様酵素活性を測定す
ることにより、歯周病原性菌を検出するための検査薬で
あって、 式:X−Arg−Ｙ ［１］ ［式中、Argはアルギニン残基、Ｘはフェニル骨格を持
つアミノ酸保護基、Ｙはアルギニン残基のＣ末端に結合
する発色基を意味する］ で示される化合物を該酵素の基質とし、これにチオール
化合物およびジイソプロピルフルオルリン酸を添加して
なることを特徴とする歯周病原性菌検査薬を提供するも
のである。 本発明の検査薬を用いれば、唾液、歯垢、歯肉溝浸出
液などのような検体を、好ましくは、pH6.9〜9.0の条件
下、式［１］の基質と反応させ、その水解活性の強弱を
発色反応により測定することにより、簡便かつ迅速に、
歯周病原性菌を検出することができる。 基質として用いる式［１］の化合物は公知であるか、
少なくとも、公知のペプチド合成法によって容易に製造
できるものであり、式［１］のＸ基で示されるアミノ基
保護基はペプチド合成に用いられる公知のアミノ基保護
基のうちでフェニル骨格を持つものであればいずれのも
のでもよく、例えば、ベンゾイル基、カルボベンゾキシ
基、ｐ−トルエンスルホニル、ｐ−メトキシベンゾイル
オキシカルボニ基などが挙げられる。 Ｙ基の発色基は、発色による酵素活性の測定（紫外
線、可視部、赤外線の吸収、蛍光の測定によるものを包
含する）に用いられるものいずれでもよく、例えば、β
−ナフチルアミン、４−メトキシ−２−ナフツルアミ
ン、ｐ−ニトロアニリン、ｐ−ニトロフェノール、７−
アミノ−４−メトキシクマリン、５−アミノイソフタル
酸ジメチルエステル、７−アミノ−４−トリフルオロメ
チルクマリンなどから由来する基が挙げられる。特に、
適当な発色試薬により、肉眼的に判定可能な発色を示す
β−ナフチルアミン、４−メトキシ−２−ナフチルアミ
ン、ｐ−ニトロアニリン、ｐ−ニトロフェノール由来の
基が好ましい。 添加剤として用いるチオール化合物としては、分子構
造中に、チオール基を有するものであればいずれのもの
でもよいが、好ましくは、システイン、ジチオスレイト
ール、メルカプトエタノールなどが挙げられる。また、
他の添加剤として、ジイソプロピルフルオルリン酸を用
いる。 本発明の検査薬は、式［１］の化合物が検体由来のペ
プチダーゼ様酵素の基質として反応できる形態のもので
あればいずれでもよく、もっとも基本的には、式［１］
の化合物の水溶液にオチール化合物およびジイソプロピ
ルフルオルリン酸を添加したものでよく、好ましくは、
測定時、pH6.0〜9.0となるように緩衝剤を含有させる。
用いる緩衝剤は通常用いられるものであればいずれでも
よく、例えば、トリス塩酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ
酸緩衝剤、ベロナール緩衝剤、HEPES緩衝剤などを用い
ることができる。該水溶液は式［１］の化合物、チオー
ル化合物およびジイソプロピルフルオルソン酸、およ
び、所望により、緩衝剤を蒸留水に溶解するような公知
の方法で製造することができ、要すれば、さらに、防腐
剤、坑生物質などの他の添加物を適宜配合することがで
きる。 式［１］の化合物の最終濃度100nM〜100mMの範囲、チ
オール化合物の最終濃度1mM〜100mM、ジイソプロピルフ
ルオルリン酸の最終濃度0.1mM〜20mM、また、緩衝剤は
最終濃度1mM〜1Mの範囲で使用することが好ましく、前
記の水溶液は、これらの濃度の式［１］の化合物、チオ
ール化合物、ジイソプロピルフルオルリン酸および所望
により緩衝剤を含有し、そのまま直接、検査に供するこ
とのできる形態にすることができ、あるいは、使用時、
適宜蒸留水で所望の濃度に希釈する濃厚液の形態とする
ことができる。 本発明の検査薬には、これらの水溶液の形態のもの
を、さらに、公知の方法により乾燥粉末化、顆粒化した
もののごとき固形の形態のもの、粉末成分を混合した粉
末、その顆粒化物のごとき固形の形態のもの、あるい
は、液状の形態のものをろ紙、ペーパーディスク、スポ
ンジ、高分子物などの担体に含浸させるものも包含され
る。 さらに、本発明の検査薬には、式［１］の化合物、チ
オール化合物およびジイソプロピルフルオルリン酸を含
有する試薬と、緩衝剤、発色試薬などの他の試薬を組合
わせてなるキットも包含される。 発色試薬は、式［１］の化合物におけるＹ基に応じて
適宜選択でき、Ｙがβ−ナフチルアミン、４−メトキシ
−２−ナフチルアミン、ｐ−ニトロアニリン、ｐ−ニト
ロフェノール由来の基の場合、例えば、ファーストガー
ネットGBCやファーストブルーBBあるいはこれらのジア
ゾニム塩や塩化亜鉛との塩のごとき塩などを、水エタノ
ール、酢酸緩衝液、２−メトキシエタノールあるいはこ
れらの混合溶液などに0.01〜５重量％の濃度で溶解した
溶液や、0.5〜5Mの水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、酢酸などの水溶液が用いられる。これらの溶液また
はその濃厚液、さらには固形化物を式［１］の化合物、
チオール化合物およびジイソプロピルフルオルリン酸を
含有する試薬と組合わせてキットとして用いることがで
きる。 本発明の検査薬を用いて検査を行なうには、まず、検
体を採取する。検体の採取は公知の方法で行なってもよ
く、例えば、歯肉溝浸出液や唾液はろ紙、キャピラリ
ー、ペーパーポイントなどで採取でき、歯垢は綿棒、キ
ュレット、スケラーなどで採取できる。 ついで、式［１］の化合物最終混合濃度100nM〜100m
M,チオール化合物の最終濃度1mM〜100mMおよびジイソプ
ロピルフルオルリン酸の最終濃度0.1mM〜20mMに調整し
た本発明の検査薬と検体を、例えば、試験薬、マイクロ
タイタープレート、セル、バイアル瓶、プラスチック・
キュベットなどの中で接触させ、好ましくは、pH6.9〜
9.0で水解反応を行なわせる。この反応は、通常25〜45
℃でおこなわれ、反応時間は検体や反応温度により異な
るが、37℃で15分〜72時間程度の反応が好ましい。 反応終了後、必要であれば、発色試薬を添加し、発色
の有無・強弱を肉眼あるいは分光光度計や蛍光光度計で
判定し、これにより、検体中のペプチダーゼ様酵素活性
の有無・強弱を判断し、歯周疾患の罹患や進行を診断あ
るいは予測する。 実験および実施例 つぎに、実験および好ましい実施例を挙げて本発明を
さらに詳しく説明する。 実験１ 格種口腔内嫌気性細菌のペプチダーゼ様酵素活性 口腔内の嫌気性細菌であるトレポネーマ・デンティコ
ーラ（Treponema denticola）４株、バクテロイデス・
ジンジバリス５株、バクテロイデス・インターミーディ
アス（Bacteroides intermedius）３株、バクテロイデ
ス・コーポリス（Bacteroides corporis）２株、バクテ
ロイデス・メラニノジェニカス（Bacteroides melanino
genicus）３株、バクテロイデス・デンティコーラ（Bac
teroides denticola）２株、アクチノマイセス・イスラ
エリー（Actinomyces isralli）２株、アクチノバチル
ス・アクチノマイセテムコミタンス（Actinobacillus a
ctinomycetemcomitans）４株およびフソバクテリウム・
ヌクレータム（Fusobacterium nucleatum）３株のペプ
チダーゼ様酵素基質に対する水解活性をつぎのとおり測
定した。 トレポネーマ属の細菌はTYGVS培地を用い、37℃で７
日間、他の細菌はブレイン・ハート・インフュージョン
・ブロスを用い、37℃で48〜72時間嫌気的に培養し、培
養液を希釈して、各々、660nmにおける吸光度が1.0の細
菌懸濁液を調製した。 種々の発色基を有するペプチダーゼ様酵素の基質化合
物を、0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH7.0）に20mMの濃度で
溶解し、基質溶液を調製した。 この基質溶液1.5mlに、前記の細菌懸濁液0.5mlを加
え、37℃で60分間反応させた。反応終了後、β−ナフチ
ルアミン由来の発色基を有する基質には、発色試薬（10
％ツィーン20を含有するIM酢酸緩衝液（pH4.2）にジア
ゾニウム塩ガーネットGBCを0.5mg/mlの濃度で溶解して
調整）0.6mlを加え、15分後に525nmにおける吸光度を分
光光度計にて測定した。また、パラニトロアニリン由来
の発色基を有する基質は、そのままの状態で410nmにお
ける吸光度を分光光度計にて測定した。 水解活性は、各細菌のβ−ナフチルアミン遊離量およ
びパラニトロアニリン遊離量の平均値に基づき、つぎの
とおり表示した。 −：遊離量＜５ナノモル/ml ±：遊離量５〜＜10ナノモル/ml ＋：遊離量10〜＜20ナノモル/ml ＋＋：遊離量20〜＜40ナノモル/ml ＋＋＋：遊離量40〜＜80ナノモル/ml ＋＋＋＋：遊離量80ナノモル/ml以上 結果を第１表に示す。第１表中、基質化合物の略号は
つぎのとおりである。 BzAβna:ベンゾイル−アルギニン−β−ナフチルアミド CxAβNA:N−カルボベンゾキシ−アルギニン−β−ナフ
チルアミド BzApNA:ベンゾイル−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド CxApNA:N−カルボベンゾキシ−ｐ−ニトロアニリド BzApNP:ベンゾイル−アルギニン−ｐ−ニトロフェノー
ル CzApNP:N−カルボベンゾキシ−ｐ−ニトロフェノール 第１表に示すごとく、口腔内嫌気性細菌のうち、歯周
疾患原因菌であるスピロヘータ（トレポネーマ・デンテ
ィコーラ）およびバクテロイデス・ジンジバリスが特異
的にペプチダーゼ様酵素活性を示し、式［１］で示され
る化合物を特異的に水解する。 実験２ バクテロイデス・ジンジバリスおよびトレポネーマ・デ
ンティコーラの各種添加剤存在下での、ベンゾイル−ア
ルギニン−ｐ−ニトロアニリド水解活性−１ 歯周病原性菌であるバクテロイデス・ジンジバリス５
株およびトレポネーマ・デンティコーラ４株を用い、各
種添加剤存在下での、ベンゾイル−アルギニン−ｐ−ニ
トロアニリド水解活性を測定した。 ベンゾイル−アルギニン−ｐ−ニトロアニリドを0.1M
トリス塩酸緩衝液（pH7.0）に10mMの濃度で溶解し、基
質溶液を調製した。 添加剤は、10mMシステイン塩酸塩、2mMジイソプロピ
ルフルオルリン酸および10mMシステイン塩酸塩と2mMジ
イソプロピルフルオルリン酸を混合したものを調製し、
基質溶液1.5mlに対して、添加剤0.5mlおよび菌懸濁液0.
5mlを加えた後、37℃で24時間反応させた。該菌懸濁液
は、菌数をそれぞれ2.5、5.0、7.5、10.0×10⁶個/50μ
に調製したものを用いた。反応終了後、反応液の410n
mにおける吸光度を分光光度にて測定した。 結果を第１図に示す。図中の添加剤の略号はつぎのと
おりである。 n₀:添加剤無添加 Cys:システイン塩酸塩 DFP:ジイソプロピルフルオルリン酸 第１図に示すごとく、ある種の添加剤を加えることに
より、バクテロイデス・ジンジバリスを特異的に検出す
ることができる。 実験３ バクテロイデス・ジンジバリスおよびトレポネーマ・デ
ンティコーラの各種添加剤存在下での、ベンゾイル−ア
ルギニン−ｐ−ニトロアニリド水分解活性−２ 実験２と同様の反応系を用いて、添加剤の種類を変え
て、各種添加剤存在下での、ベンゾイル−アルギニン−
ｐ−ニトロアニリド水分解活性を測定した。 水解活性は、各細菌のパラニトロアニリン遊離量の平
均値に基づき、つぎのとおり表示した。 −：遊離量＜５ナノモル/ml ±：遊離量５〜＜10ナノモル/ml −：遊離量10〜＜20ナノモル/ml ＋＋：遊離量20〜＜40ナノモル/ml ＋＋＋：遊離量40〜＜80ナノモル/ml 結果を第２表に示す。表中の添加剤の略号はつぎのと
おりである。 n₀:添加剤無添加 Cys:システイン塩酸塩 DTT:ジチオスレイトール ME:2−メルカプトエタノール DFP:ジイソプロピルフルオルリン酸 第２表に示すごとく、チオール化合物とジイソプロピ
ルフルオルリン酸を併用することにより、バクテロイデ
ス・ジンジバリスを特異的に検出することができる。 実験４ 臨床所見との相関−１ 臨床所見上、健常であると認められる者15名および歯
周炎患者20名から、各々、滅菌スケーラーにより歯肉縁
下歯垢検体を採取し、リンガー液1.5mlに分散し菌懸濁
液を調製した。この菌懸濁液10μをスライドガラス上
におき、自然乾燥させたものをPBSにて材料表面を湿ら
せた後、FITC（蛍光色素）を結合させたウサギ抗バクテ
ロイデス・ジンジバリス381血清10μをのせ、１時間
室温でインキュベートした。その後、glycerol−PBS液
をおき、カバーガラスをのせ蛍光顕微鏡により発色する
バクテロイデス・ジンジバリス菌を10視野数え測定し
た。また、このリンガー液0.5mlを、実験２と同様の反
応系を用い、同様にして水解活性を測定した。 添加剤としては、システイン塩酸塩とジイソプロピル
フルオルリン酸との混合物を実験２と同様の濃度で用い
た。 結果を第２図に示す。 第２図に示すごとく、水解活性は添加剤を加えること
により、バクテロイデス・ジンジバリス量、臨床所見と
相関する。 実施例１ ベンゾイル−アルギニン−ｐ−ニトロアニリンの20mM
蒸留水溶液を調製し、基質溶液とした。 0.2Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.0）を調整し、緩衝液
として用いた。 20mMシステムイン塩酸塩と4mMジイソプロピルフルオ
ルリン酸を含有する蒸留水溶液を調製し、添加剤溶液と
した。 これらを組合せて、本発明の歯周病原性菌検査薬キッ
トとした。 このキットは、つぎのようにして歯周疾患の診断ある
いは予測に用いることができる。 被検者の歯肉溝にペーパーポイントを30秒間挿入して
検体を採取する。基質溶液0.1mlおよび緩衝液0.9mlを混
合し、これに検体を添加剤溶液で懸濁し20分間放置した
ものを1ml加え、37℃で一昼夜反応させる。。反応終了
後、色調を肉眼観察する。検体を添加しない対照と比較
し、褐色の強弱を判定する。黄色の呈色はバクテロイデ
ス・ジンジバリスの感染を意味する。 実施例２ Ｎ−ベンゾイル−アルギニン−４−メトキシ−２−ナ
フチルアミド５ミリモルをペーパーティスク（径0.6c
m）に含浸させて基質試薬を調整した。 0.1Mリン酸緩衝液（pH7.2）を調整し、緩衝液として
用いた。 10％ツィーン20を含有する1M酢酸緩衝液（pH4.0）に
ジアゾニウム塩ガーネットGBCを0.5mg/mlの濃度で溶解
し、発生試薬とした。 これらと、実施例１におけると同様に調製した添加剤
溶液を組合せて、本発明の歯周病原性菌検査薬キットと
した。 このキットは、つぎのようにして歯周疾患の検査ある
いは予測に用いることができる。 緩衝液400μと添加剤溶液400μをバイアル瓶に入
れ、これに被検者から採取した混合唾液100μを加
え、さらに基質試薬のペーパーディスクを加え、37℃で
４時間反応させる。反応終了後、発色試薬を加え、実施
例１と同様に肉眼観察して判定する。赤色の呈色はバク
テロイデス・ジンジバリスの感染を意味する。 実施例３ Ｎ−カルボベンゾキシ−アルギニン−β−ナフチルア
ミド５ミリモルをアンプル（内径5mm、長さ3cm）内で凍
結乾燥させて基質試薬とした。 0.05Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）を調製し、緩衝液
とした。 10％ツィーン20を含有する1M酢酸緩衝液（pH4.2）に
ジアゾニウム塩ファーストブルーＢを1mg/mlの濃度で溶
解し、発色試薬とした。これらと実施例１におけると同
様に調製した添加剤溶液を組合せて、本発明の歯周病原
性菌検査薬キットとした。 このキットは、つぎのようにして歯周疾患の検査ある
いは予測に用いることができる。 被検者の歯肉溝にペーパーストリップを30秒間挿入し
て検体を採取する。緩衝液1mlを基質含有アンプルに入
れ基質を溶解させる。これに検体を添加剤溶液で懸濁し
20分間放置したもをを1ml加え、37℃で一昼夜反応させ
る。反応終了後、発色試薬0.8mlを加え、実施例２と同
様に肉眼観察して判定する。 実施例４ ベンゾイル−アルギニン−ｐ−ニトロフェノールを0.
05Mリン酸緩衝液（pH7.2）で200ナノモル/mlとなるよう
に調整し、これに添加剤として200ナノモル２−メルカ
プトエタノールおよび40ナノモルジイソプロピルフルオ
ルリン酸を加え、その100μを円形ろ紙（径1cm）に含
浸乾燥させ、キュベット（内径1cm）底に挿入したもの
を、本発明の歯周病原性菌検査薬キットとした。 このキットは、つぎのようにして歯周疾患の検査ある
いは予測に用いることができる。 被検者から採取した混合唾液100μをキュベットに
加え、37℃で４時間反応させる。反応終了後、実施例１
と同様に肉眼観察して判定する。 発明の効果 本発明の検査薬を用いれば、特殊な設備や高度な技術
を必要とせずに、簡便かつ迅速に歯周疾患の罹患や進行
を観客的に診断あるいは予測することができ、これによ
り、歯周疾患の治療や予防を適切に行なうことができ
る。

【図面の簡単な説明】 第１図は、各種添加剤存在下でのベンゾイル−アルギニ
ル−ｐ−ニトロフェノールの水解活性を測定した結果を
示すグラフ、第２図は、ベンゾイル−アルギニル−ｐ−
ニトロフェノールの水解活性と細菌数の相関を示すグラ
フである。

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．検体中のペプチダーゼ様酵素活性を測定することに
   より、歯周病原性菌を検出するための検査薬であって、 式:X−Arg−Ｙ ［１］ ［式中、Argはアルギニン残基、Ｘはフェニル骨格を持
   つアミノ酸保護基、Ｙはアルギニン残基のＣ末端に結合
   する発色基を意味する］ で示される化合物を該酵素の基質とし、これにチオール
   化合物およびジイソプロピルフルオルリン酸を添加して
   なることを特徴とする歯周病原性菌検査薬。 ２．該チオール化合物がシステイン、ジチオスレイトー
   ルおよびメルカプトエタノールのうちから選ばれる１種
   または２種以上である前記第（１）項の歯周病原性菌検
   査薬。