KR0140216B1

KR0140216B1 - 치주질환 검사용 조성물

Info

Publication number: KR0140216B1
Application number: KR1019890000615A
Authority: KR
Inventors: 히로히사 스이도; 아키라 미이케; 겐지 하세가와; 노리히코 가야하라; 도루 에구치; 도시오 다다노; 고이치 나카시마
Original assignee: 가네다 히로오; 산스타 가부시키가이샤; 사메지마 히로도시; 교와메덱스 가부시키가이샤
Priority date: 1988-01-20
Filing date: 1989-01-20
Publication date: 1998-06-01
Also published as: JPH02499A; KR890011580A; JPH0650995B2

Abstract

요약서 없음.

Description

치주질환 검사용 조성물

본 발명은 치주질환 검사용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 치주질환을 일으키는 병원성 구강미생물을 검출할 수 있어서, 그러한 질병의 발생이나 진행상태를 진단 또는 예측하거나 치료효과를 진단하는데 사용되는 조성물에 관한 것이다.

최근, 치주질환에 대한 세균학적 연구가 진행되고 있는 바, 치주질환 병소부위에서 스피로헤타가 다량 검출되며 이는 임상적 지표와 밀접한 상관관계를 갖는다는 사실이 밝혀졌다. 또한, 혐기성의 그람 음성 박테리아가 치주질환의 주된 원인균이라는 사실도 밝혀졌고 그들 중에서도 박테로이드 긴기발리스(Bacteroides gingivalis)와 같은 검은 색소생산 박테로이드(Bacteroids)가 특히 주목되고 있으며 그들의 병원서에 대한 많은 논문들이 제출되어 있다.

이와 더불어, 상기와 같은 구강내의 병원성 세균을 검출하려는 시도가 있었으며, 그 결과를 임상적으로 실용화하여 질병의 발생 또는 질환상태를 예측하거나 진단함으로써 치주질환을 예방 또는 치료하고자 하는 노력이 있었다.

그러나, 이러한 병원성 구강세균을 세균학적 방법으로 검출하는 데에는 문제점이 있다. 예를 들면, 암시야 현미경을 사용해야 하고, 혐기성 조건하에서 취급해야 하는 고도의 기술과 특수장치가 필요하며, 또한 복잡한 조작이 요구된다. 더우기, 배양과 결과분석을 위해서 장시간이 소요되며 숙련된 기술이 필요하다. 따라서, 임상실험에 적용하기에는 아직 어려운 점이 있다.

한편, 면역학적 방법으로 병원성 미생물을 검출하려는 시도가 있었다. 즉, 병원성 미생물에 대해 체액성면역을 갖는 혈액에서 항체가 측정되거나 또는 세포성면역을 갖는 임파아구 약화반응을 측정하여, 병원성 미생물을 검출하였다. 그러나 표본을 준비하는 데 있어서 복잡한 조작이 필요하여 실제적으로 실용화하기에는 역시 어려움이 있다.

이에 본 발명자들은 치주질환을 일으키는 병원성 구강미생물을 검출하는데 있어서 임상에 실제로 적용할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구한 결과, 구강내에 존재하는 일부의 스피로헤타가 특이성의 매우 강한 펩티다아제-유사 효소활성을 갖으며 박테로이드 긴기발리스 및 박테로이드 인터메디어스(Bacteroides intermedius) 등과 같은 검은 색소생산 박테로이드 또한 유사한 활성을 갖고 있어서, 특정 기질을 이용하여 색반응을 시키게 되면 병원성 구강미생물을 정확하고도 신속하고 편리하게 검출할 수 있을 뿐 아니라 치주질환의 증상이 정확히 반영됨을 알게 되었는 바, 이 발명에 대해 이미 특허출원하였다(일본특허출원 소61-179716호, 소61-233848호, 소62-113122호).

한편, 본 발명자들은 펩티다아제-유사효소의 발색반응을 촉진시킬 수 있는 특정한 화합물을 이용함으로써 매우 편리하고도 신속하게 측정할 수 있음을 알게 되었는 바, 이 발명에 대애 히미 특허출원 하였다(일본특허출원소 62-286559호).

또한, 본 발명자들은 더욱 더 연구한 결과, 그러한 발색반응을 촉진시키는 화합물은 치주질환을 진단 또는 예측하기 위해 상기 병원성 구강 미생물을 검출하는데 적용가능하며, 그러한 적용에 의해 검출을 보다 편리하고 신속하게 달성할 수 있음을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주 목적은, 표본에서의 펩티다아제-유사효소활성을 신속하게 결정하여 치주질환의 발생 또는 진행상태를 진단 또는 예측하거나 치료효과를 진단하는데 사용되는 개선된 치주질환 검사용조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 이러한 목적과 그 밖의 다른 목적 및 이용은 다음의 설명으로부터 이 분야에서 숙련된 자들에게 명확해 질 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 표본에서의 펩티다아제-유사 효소 활성을 신속하게 결정하여 치주질환의 발생 또는 진행상태를 진단 또는 예측하거나 치료효과를 진단하는 등의 치주질환 검사에 사용되는 조성물로서, 다음 일반식( I )의 화합물이나 다음 일반식( II )의 다음 일반식( II )의 화합물 또는 다음 일반식( I ) 및 ( II ) 화합물의 혼합물과, 색소원 및 산화효소의 조합물을 함유하는 치주질환 검사용 조성물을 특징으로 한다.

X - T Pro - Y( I )

여기서, Pro는 프롤린 잔기이고 ; X 는 수소원자 또는 아미노보호기 이고 ; Y는 색소원을 산소존재하에서 산화효소로 산화시키는데 있어서 그 반응속도를 증가시킬 수있는 화합물(이하 증강제라 칭함)이며 Pro의 C-말단에 결합되어 있고 ; T는 0 내지 4개의 아미노산 또는 그들의 보호된 유도체로 구성된 단일 아미노산 또는 펩타이드이며, 그의 C-말단이 Pro의 N-말단에 결합되어 있다.

X' - Z' - Arg - Y'( II )

여기서, Arg은 아르기닌 잔기이고 ; X'은 수소원자 또는 아미노 보호기이고 ; Y'은 증강제 잔기이며 Arg의 C-말단에 결합되어 있고 ; Z'은 0 내지 4 개의 아미노산 또는 그들의 보호된 유도체로 구성된 단일 아미노산 또는 펩타이드이며 그의 C-말단이 Arg의 N-말단에 결합되어 있다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 조성물을 이용하여 치주질환을 검사하는 데에는 2가지의 반응계를 포함한다. 즉, 첫번째는 표본내의 펩티다아제-유사 효소에 상기 일반식( I ) 및 ( II ) 의 기질을 반응시켜서 증강제를 유리하는 것이고, 두번째는 상기의 유리된 증강제 존재하에서 산소존재하에 색소원을 산화시킬 수 있는 효소를 이용하여 색소원을 산화반응 시켜서 색소를 생산하는 것이다. 이때, 첫번째 반응에서 증강제는 표본에서의 펩티다아제-유사 효소 활성과 비례하여 생성되며, 두번째 반응에서의 색소는 상기 증강제의 양에 비례하여 생성된다. 즉, 색소원은 산화효소의 작용에 의해 산화되며, 이와 더불어 색소가 생성되게 되고, 색소의 생산속도는 증강제 존재하에서 증폭될 수 있다. 임의의 기간 이후에 생성된 색소의 양은 증강제의 양에 비례한다.

그러므로 2가지의 반응을 조합하고 생성된 색소를 측정하는 바에 따라, 증강제의 양이 측정되며, 따라서 표본내에서 펩티다아제 활성을 결정할 수 있다.

본 발명의 조성물을 이용함으로써, 즉 타액, 치구 또는 치육구침출액 등의 표본과 상기 일반식( I ) 및 ( II )의 기질을, 바람직하게는 최적 조건(pH 5 내지 9)하에서, 반응시킨 다음 색소원을 산화효소와 반응시키거나, 또는 표본과 일반식( I ) 및 ( II )의 기질을 색소원 및 산화효소 존재하에서 반응시켜서 생성된 색소의 양을 결정함으로써, 치주질환의 발생 또는 진행상태를 신속하고도 간편하게 진단 또는 예측하거나 치료효과를 진단할 수 있다.

본 발명에서 기질로 사용되는 상기 일반식( I ) 및 ( III )의 화합물은 공지되어 있거나 적어도공지된 펩타이드 합성법에 의해 제조될 수 있다.

상기 일반식 ( I ) 및 ( II )에 있어서, X 및 X'으로 표시되는 아미노 보호기는 펩타이드 합성에서 공지되어 있는 어떤 아미노 보호기이어도 좋으며, 예를 들면 포르밀, 아세틸, 석시닐, t-부톡시-카보닐, 벤조일, 카보벤족시 및 p-톨루엔설포닐 등이 있다.

한편, T는 0 내지 4개의 아미노산 또는 그들이 보호된 유도체로 이루어진 단일 아미노산 또는 펩타이드로써 그의 C-말단이 프롤린 잔기의 N-말단에 결합되어 있는 것이면 어떤 것이어도 좋다. 이때 C-말단 아미노산으로는 글리신, 알라닌, 리신, 페닐알라닌 또는 그들의 보호된 유도체가 바람직하며, 보호된 유도체로는, 세린의 OH, 시스테인의 SH, 아스파라긴산 또는 글루타민산의 β-또는 γ-COOH가 예컨대 벤질로 보호된 기인 것이 포함된다.

Z'은 0 내지 4개의 아미노산 또는 그들의 보호된 유도체로 이루어진 단일 아미노산 또는 펩타이드로서 그의 C-말단이 아르기닌 잔기의 N-말단에 결합되어 있는 것이면 어떤 것이어도 좋다. 이때 C-말단아미노산으로는 글리신, 리신, 아르기닌, 페닐알라닌 또는 그들의 보호된 유도체가 바람직하며, 보호된 유도체로는, 세린의 OH, 시스테인의 SH, 아스파라긴산의 또는 글루타민산의 β- 또는 γ-COOH, 예컨대 벤질로 보호된 기인 것이 포함된다.

Y 및 Y'의 증강제 잔기로는 색소원의 산화반응 속도를 증가시킬 수 있는 것이라면 어느 것이어도 좋으며, 그러한 증강제의 대표적인 예로는 다음 일반식( II )으로 표시된 알라닌유도체를 들 수 있다.

여기서, R₁내지 R₄는 같거나 다르며, 수소원자, 할로겐원자, 탄소원수 1 내지 4의 알킬기, 설폰기 또는 하이드록실기이고 ; R₅는 하이드록실기, 아미노기, 탄소원자수 1 내지 4의 알킬이나 탄소원자수 1 내지 4의 설포알킬 또는 탄소원자수 1 내지 4의 하이드록시알킬이 치환된 아미노기, 또는 3, 3'-디아미노스틸벤-4, 4'-디설폰산(DSDA)과 같은 디아미노스틸벤-디설폰산 이다.

상기 일반식 ( III )의 화합물의 대표적인 예로는, 3, 5-디브로모-4-하디록시알라닌(DBHA), 3,5-디클로로-4-하이드록시아닐닌(DCHA), 3, 5-디아이오도-4-하이드록시아닐린(DIHA), P-N, N-디설폰프로필아미노아닐린(SPA), P-페닐렌디아민(PPD), 4-아미노아닐린-3-설폰산(DAS), 2-메틸-3,5-디브로모-4-하이드록시아닐린(MDBHA), 2, 6 - 디메틸-3, 5 -디클로로-4-하이드록시아닐린(DMDCHA), 4-N, N-디설포프로필아미노-3, 5-디브로모아닐린(SDBA), 4-(N-에틸-N-하이드록시에틸아미노-3, 5-디브로모아닐린(EHDBA), 및 4-N, N-디에틸아미노-3, 4-디하이드록시아닐린(DEDHA)등을 들 수 있다.

상기 일반식 ( I ) 및 ( II )의 화합물에서 각 아미노산잔기의 배치는 펩티다아제-유사효소의 기질로서 이용될 수 있는 한, 특정하게 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용된 산화효소로는, 산소존재하에서 색소원을 산화시켜서 색소를 생성시킬 수 있는 효소면 어떤 것이어도 좋으며, 예를 들면 빌리루빈 옥시다아제(BLOD, EC1, 3, 3, 5), 모노페놀 옥시게나아제(MPO, EC1, 14, 18, 1), 아스코르베이트 옥시다아제(AOD, EC1, 10, 3, 3), 카테콜 옥시다아제 (EC1, 10, 3, 1), 락카아제(EC1, 10, 3, 2), O-아미노페놀 옥시다아제 (EC1, 10, 3, 4), 3-하이드록시안트라닐레이트 옥시다아제(EC1, 10, 3, 5) 및 페놀-2-모노옥시게나아제(EC1, 14, 13, 7) 등이 있다.

색소원으로서는, 산화되어 발색될 수 있는 것이면 어떤 것이여도 좋다. 감도를 개선시키기 위해서는 흡광계수가 높은 것이 바람직하다. 또한, 증강제부재(블랭크시험에 상응)하에는 발색이 덜되는 한편 증강제 존재하에는 발색이 뚜렷한 화합물이 바람직한 바, 그러한 색소원으로서는 예컨대 다음과 같은 화합물질들이 있다.

이러한 화합물의 최대 흡광도는 다음에 나타낸 바와 같다.

색 소 최대흡광도

P-1630

P-2630

P-3755

P-4630

P-5630

P-6 630

P-7666

P-8655

P-9668

P-10670

P-11 435

P-12650

P-13520

P-14590

본 발명의 조성물은, 상기 일반식( I ) 및 ( II )의 화합물이 표본내의 펩티다아제-유사 효소를 위한 기질로서 작용할 수 있으며 유리된 증강제가 산화효소에 의한 색소원의 산화축합반응을 증강시키도록 작용할 수 있는 한 어떤 조제형태로 사용되어도 좋다.

기본적으로, 본 발명의 조성물은, 상기 일반식 ( I ) 의 화합물이나 상기 일반식 ( II)의 화합물 또는 상기 일반식 ( I ) 및 ( II ) 화합물의 혼합물을 함유하는 수용액과 산화효소 및 색소원을 모두 함유하는 수용액과의 조합물이나, 혹은 상기 일반식 ( I ) 의 화합물이나 상기 일반식 ( II )의 화합물 또는 그들의 혼합물과 산화효소 및 색소원을 함유하는 수용액과의 조합물일 수 있다. 바람직하게는, 조성물에 완충용액을 함유시켜서 pH 5 내지 9의 범위에서 측정을 수행할 수 있도록 한다. 그러한 완충용액으로 통상적으로 사용되는 것을 사용할 수 있는 바, 예컨대, Good 완충용액, Tris-HCl완충용액, 인산 완충용액, 붕산 완충용액, 초산 완충용액, Veronal 완충용액 또는 HEPES 완충용액등이 있다.

반응에 있어서, 각 시약들은, 상기 일반식 ( I ) 및/또는 ( II )의 화합물을 10mM~10mM의 농도로 색소원을 0.01~10mg/㎖의 농도로, 산화효소를 0.001~1,000U/㎖의 농도로, 완충용액을 1mM~1M의 농도로 사용하며, 상기 일반식 ( I ) 및 ( II ) 화합물은 혼합사용할 때는 그 비율을 1:10~10:1로 하는 것이 바람직하다.

상기에서 언급한 수용액은 상기 일반식 ( I ) 및/또는 ( II )의 화합물, 색소원, 산화효소 및 그 존재에 따라서는 완충용액을 상술한 농도로 함유시켜 검사에 직접 적용할 수 있는 형태로 제조될 수 있다. 경우에 따라서, 상기 용액은 농축된 형태로 제조되어, 사용하기 전에 선택적으로 증류수로 희석시켜 원하는 농도로 만들어 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 상술한 수용액으로부터 공지된 방법에 따라 제조된 건조분말 또는 과립이나 분말 성분들을 혼합시켜서 된 분말 혼합물 또는 그러한 분말 혼합물로부터 제조된 과립 등과 같은 고형제나, 또는 여과지, 페이퍼디스크, 시이트, 필름, 스틱, 스폰지 및 중합체 등과 같은 운반체에 침지시킨 액형제로 제조될 수 있으며, 또한 한벌로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물을 이용하여 검사할 때, 첫단계는 표본을 채취하는 것이다. 표본은 공지된 방법에 따라 채취될 수 있는 바, 예컨대, 치육구침출액 및 타액은 여과지, 모세관 및 페이퍼포인트등으로 수집할 수 있고, 치구는 면봉, 큐렛 및 치석제거제 등으로 수집할 수 있다.

본 발명의 조성물은 예컨대, 시험관, 미세적정판, 셀, 바이알, 또는 플라스틱구베트등에서 표본과 접촉시켜서 반응을 수행할 수 있다. 이때 반응은 pH5 내지 9에서 바람직하게 수행될 수 있으며, 일반적으로 20 내지 45℃의 온도에서 수행되어진다. 반응시간은 특정표본과 반응온도에 따라 다양하며, 바람직하게는 5분 내지 24시간 동안 반응을 수행한다.

반응이 종료된 후, 발색의 여부나 그 정도를 육안 또는 분광광도계로 평가하여, 표본에서의 펩티다아제-유사 효소활성의 여부나 그 정도를 결정함으로써, 치주질환의 발생 또는 진행상태를 진단 또는 예측할 수 있으며 치료 효과를 진단할 수 있다.

이하 본 발명을 실험 및 실시예에 의하거여 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

실험 1 : 다양한 구강 혐기균에서의 펩티다아제-유사 효소 활성

구강 혐기균으로서의 다음의 표1에 열거한 균주, 즉 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) 4주와 박테로이드 긴기발리스(Bacteroid ingivalis) 5주, 악티노바실러스 악티노마세템코미턴스(Actinobacillus actinomycetemcomitans) 4주, 악티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israelii) 2주 및 푸소박테리엄 뉴클리텀(Fusobacterium nucleatum) 3주를 이용하여, 각 균주에서 다음의 표 1에 열거한 펩티다아제-유사효소의 기질에 대한 가수분해 활성을 시험하였다.

트레포네아 균주를 TYGVS 배지를 이용하여 37℃에서 7일동안 혐기성 조건하에서 배양하고, 한편 다른 세균의 균주들도 뇌 심장 침출액 배지를 이용하여 37℃에서 48 내지 72 시간 동안 혐기성 조건하에서 배양하였다. 각 배양액을 희석하여, 660nm에서 흡광도가 0.5인 세균현탁액을 얻었다.

증강제로서 DBHA를 갖는 펩티다아제-효소의 기질화합물을 0.1M Tris-HCl 완충용액을 이용하여 0.2mM의 농도로 희석시켜서 기질 용액을 얻었다.

5mg/㎖의 Dispanol M-32A를 함유하는 0.1M DIPSO 완충용액(ph7.5)을 화합물P-2 및 AOD와 혼합하여 0.2mg/㎖ 및 50U/㎖의 농도로 만들고, 그 결과물을 시약A라 하였다.

상기 기질용액(1.0㎖)에 상기 시약A(1.5㎖)와 상기 세균현탁액(0.2㎖)을 첨가하여, 37℃에서 30분동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 분광광도계를 이용하여 630nm에서 생성된 색소의한 흡광도를 결정하였다.

그 결과를 다음의 표1에 나타내었다. 각 세균현탁액에서의 펩티다아제-유사효소 활성은 △OD630의 평균값에 따라 다음과 같이 표시하였다.

- :△OD630 0.01

± : 0.05 △OD630 0.5

+ : 0.1 △OD630 0.5

++ : 0.5 △OD630 1.0

+++ : 1.0 △OD630 2.0

++++ : 2.0 △OD630

다음의 표1에서 사용된 약자는 각각 다음 기질화합물을 의미한다.

GR : 글리실 - 아르기닌 - DBHA

Bz - Gr : N-벤조일-글리실-아르기닌-DBHA

Z-VGR : N-카르벤족시-발릴-글리실-아르기닌-DBHA

GP : 글리실-프롤린-DBHA

Z-KP : N-카보벤족시-리실-프롤린-DBHA

Bz-RGFP : N-벤조일-아르기닐-글리실-페닐알라닐-프롤린-DBHA

방법에 따라 효소 활성을 결정하였다.?gt;

다음의 표1에 나타난 바와 같이, 구강 혐기균중에서 치주질환을 일으키는 병원성 스피로헤다(트레포네마 텐티콜라)와 박테로이드 긴기발리스가 특이성 펩티다아제-유사효소 활성을 나타내었으며, C-말단에 Arg를 갖는 기질과 C-말단에 Pro를 갖는 기질을 동시에 사용할 경우에는 둘중 하나만을 사용한 경우와 비교할 때 효소활성이 2배 또는 3배로 증가하였다.

실험 2 : 본 발명의 방법과 종래방법과의 감도 비교

트레포네마 덴티콜라 ATCC 35405 및 박테로이드 긴기발리스 ATCC33277의 펩티다아제-유사 효소 활성을 본 발명의 방법 중 종래의 방법에 따라 결정하고, 두 방법의 감도를 비교하였다.

세균을 실험1의 방법에 따라 배양한 후 그 배양액을 희석시켜서, 660mm에서 흡광도가 0.5 내지 0.1인 세균 세포현탁액을 제조하였다.

기질로서, N-벤조일-아르기닐-글리실-페닐알라닐-프롤린-DBHA(Bz-Arg-Gly-Phe-Pro-DBHA) 및 N-카보벤족시-글리실-글리실-아르기닌-DBHA(Z-Gly-Gly-Arg-DBHA)를 이용하여 이를 0.1M의 인산완충용액(pH 7.0)으로 희석시켜서, 0.2mM의 기질용액을 제조하였다.

본 발명의 방법으로서, 색소원으로 화합물 P-2 대신에 화합물 P-1을 사용하는 것을 제외하고는 실험 1의 방법에 따라 효소 활성을 결정하였다.

한편, 종래 방법으로서, 세균현탁액(0.2ml)을 0.2mM 기질용액(1.0ml)에 첨가하여 37℃에서 30분동안 반응시키고 여기에 12mg/ml의 N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-석시닐에틸렌디아민(EMSE) (1.01ml)과 0.5mg/ml의 포타슘페리시아나이드(0.5ml)를 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시킨 다음, 분광광도계를 이용하여 710nm에서 생성된 색소에 의한 흡광도를 결정하였다.

그 결과를 다음의 표 2에 나타내었다. 제시된 자료는 종래의 방법과 그 방법의 방법에 의해 결정된 OD 값이다.

평가

다음 표 2에 나타난 바와 같이, 2가지의 기질 및 2가지의 세포현탁액의 어떤 조합에 있어서도, 본 발명의 방법에 딸 얻어진 OD값이 종래방법에 따라 얻어진 OD값에 비해 15내지 20배 컸으며, 더우기 세균이 소량 존재하므로 인해 종래방법에서 검출되지 않았던 경우에도 본 발명의 방법에서는 검출되었다.

실험 3

실험 2에서 제조된 박테로이드 긴기발리스의 세균액중 660mm에서 흡광도가 0.5인 것을 사용하며, 색소원으로서 화합물 P-2를 사용하고, AOD대신에 다양한 산화효소를 사용하는 것을 제외하고는 실험2의 방법에 따라 본 발명의 방법과 종래방법의 감도를 비교하였다. 감도는 OD710(종래 방법)에 대한 OD660(본 발명의 방법)의 비로 표시하였다.

그 결과는 표 3에 나타내었다.

평가

AOD 대신에 다양한 산화효소를 사용한 경우에도 종래의 방법에 비해 높은 감도를 나타내었다.

[표 3]

실험 4

산화효소로서 AOD를 사용하고, 증강제로서 DBHA 대신에 SPA, DIHA, DSDA, PPD, DAS, MDBHA, DMDCHA, SDBA, EHDBA 및 DEDHA를 사용하는 것을 제외하고는, 실험 4의 방법에 따라 본 발명의 방법과 종래 방법의 감도를 비교하였다.

그 결과로서 감도의 비를 다음의 표 4에 나타내었다.

[표 4]

실험 5 : 임상상태와의 상호관계(1)

임상상태가 건강하다고 여겨지는 환자 5명과 치육염에 걸린 환자 6명 및 치주염에 걸린 환자 6명으로 부터 페이퍼포인트로 치육구침출액의 표본을 채취한 후, 각 표본을 링거 용액(Ringer's solution)에 분산시켰다. 위상차 현미경을 이용하여 다음의 식에 따라 총 세균에 대한 스피로헤타의 상대적인 양을 결정하였다.

또한, 이 링거용액(0.2ml)에서 실험1의 방법에 따라 제조된 기질용액을 이용하여 가수분해 활성을 시험하였다. 기질로서는, 상기 일반식( I )의 화합물, 즉 글리실-프롤린-DBHA(GP) 및 N-벤조일-아르기닐-글리실-페닐알라닐-프롤린-DBHA(Bz-RGEP)과, 상기 일반식 ( II ) 의 화합물, 즉 N-카보벤족시-발릴-글리실-아르기닌-DBHA(Z-VGR), N-벤조일-글리실아르기닌-DBHA(Bz-GR)을 단독 또는 조합하여 사용하였다.

그 결과는 다음의 표 5에 나타내었다. 표 5에서 효소활성은 실험1에서와 같은 방법으로 나타내었다.

평가

표 5에서 나타난 바와 같이, 효소활성은 스피로헤타 및 임상상태와 상호 관계를 가지며, 기질을 조합하여 이용한 경우 단독으로 이용한 경우에 비해 효소활성이 증가되었다.

[표 5]

실험예 6 : 임상상태와의 상호관계(2)

건강한 환자 10명으로 이루어진 집단과 치주염이 만연된 환자 10명으로 이루어진 집단 및 초기 치주염이 국부적으로 나타나는 환자 10명으로 이루어진 집단에서 채취된 타액 혼합물을 원심분리하여 상등액을 얻었다. 이 상등액을 표본으로 이용하여 실험2의 방법에 따라 본 발명의 방법과 종래방법의 감도를 비교하였다. 본 실험에서, 반응신간은 15분이었으며, 기질로서 N-카보벤족시-글리실-아르기닌-DIHA(Z-GR), N-벤조일-아르기닐-글리실-페닐알라닐-프롤린-DIHA(BZ-RGEP)를 단독 조합하여 사용하였다.

실험결과를 표 6에 나타내었다. 결과는 실험 2에서와 마찬가지로 OD630 및 OD 710 의 값으로 표시하였다.

평가

표 6에 나타낸 바와 같이, 치주염이 만연된 환자집단과 초기 치주염의 국부적으로 나타나는 환자집단 모두가 건강한 환자의 집단에 대비 높은 효소활성을 보였으며, 그 차이도 통계적으로 중요한 의미를 갖는다. 또한 본 발명의 방법에 따른 OD값이 종래 방법에 비해 10배 높았으며, 환자집단과 건강한 잡단간의 OD값이 매우 큰 차이를 보였다. 특히, C-말단에 아르기닌을 갖는 기질과 C-말단에 프롤린을 갖는 기질을 병용할 경우,환자집단에서 1.5배 이상의 활성이 나타났다. 그러므로, 본 발명의 방법에 따라 효소활성을 측정함으로써 치주질환을 신속하게 진단 및 예측할 수 있으며, 치료효과도 객관적으로 평가할 수 있다.

[표6]

실시예 1

기질용액으로서, N-카보벤족시-발릴-글리실-아르기닌-DBHA를 증류수에 용해시켜서 된 용액(2mM)을 사용하였다. 0.1M Tris-HCl 완충용액(pH 7.0)을 제조하여 이를 완충용액 A 로 사용하였다. Dispanol M-32A(5mg/ml)을 함유하는 1M DIPSO 완충용액(pH 7.5)을 완충용액B로 사용하였다. AOD를 그 농도가 200U/ml가 되도록 완충용액B에 첨가하여 이를 산화효소용액으로 사용하였다. 화합물 P-3을 그 농도가 0.4mg/ml가 되도록 완충용액에 첨가하여 이를 색수원용액으로 사용하였다.

상기 시약들을 조합하여, 치주질환 검사를 위해 한벌로서 사용하였다.

이러한 한벌의 시약은 다음의 방법에 따라 치주질환을 진단 또는 예측하는데 이용될 수 있다.

환자의 치육구에 페이퍼포인트를 30초동안 삽입하여 표본을 채취하였다. 상기 기질용액(0.1ml)에 상기 완충용액A(0.9ml)를 혼합하고, 여기에 표본을 첨가한 후 그 혼합물을 37℃에서 30분동안 반응시켰다. 얻어진 결과물에 다시 상기 산화효소용액(0.5ml)과 상기 색소원용액(0.5ml)을 첨가한 후, 그 혼합물을 37℃에서 30분동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후 발색정도를 육안으로 관찰하였다. 청색의 정도를 블랭크와 비교하여 평가하였다. 짙은 청색은 환자가 치주질환에 걸렸음을 나타낸다.

켰다2

N-카보벤족시-글리실-아르기닌-SPA(500nmol)과 N-벤조일-프롤릴알라닐-글리실-프롤린-SPA(500nmol)를 페이퍼디스크(직경:0.6cm)에 침지시켜서 기질시약을 제조하였다. Triton X-100을 5mg/ml의 농도로 함유하는 0.1M인산완충용액(pH7.0)을 완충용액C로 이용하였다. BLOD(0.02U)와 화합물P-4(1mg) 로 침지시킨 페이퍼디스크(직경 0.6cm)를 발색시약으로 이용하였다.

상기 시약들을 조합하여 본 발명에 따른 치주질환검사를 위해 한벌로서 사용하였다.

이러한 한벌의 시약들은 다음의 방법에 따라 치주질환을 진단 또는 예측하였는데 이용될 수 있다.

상기 완충용액 C(400μl)를 바이알에 담고, 환자로부터 채취한 살리바 혼합물(100μl)과 상기 기질시약의 페이퍼디스크를 첨가한 후, 그 혼합물을 37℃에서 15분동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 발색정도를 실시예 1의 방법에 따라 육안으로 평가하였다.

실시예 3

N-카르벤조일-아르기닌-DIHA(500nmol)과 N-벤조일-알라닐-프롤린-DIHA(250nml), HAO(2.5U) 및 화합물P-5를 혼합하고 앰플(내경 : 5mm, 길이 : 3cm)내에서 동결건조시켜서 반응시약을 제조하였다. Tirton X-100을 함유하는 0.1M DIPSO 완충용액(pH 7.5)을 제조하여 완충용액으로 사용하였다.

이러한 한벌의 시약들은 다음의 방법에 따라 치주질환을 진단 또는 예측하는데 이용될 수 있다.

환자의 치육구에 페이퍼스트립을 30초동안 삽입하여 표본을 채취하였다.

상기 시약들을 함유하는 앰플에 상기 완충용액(1ml)을 쏟아서 용해시킨 후, 이 용액에 표본을 첨가하여 37℃에서 30분동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 발색의 정도를 실시예 1의 방법에 따라 육안으로 평가하였다.

실시예 4

N-t-부톡시카보닐-발릴-루이실-글리실-아르기닌-DBHA와 MPO 및 화합물 P-8(5mg/ml)을 Dispanol M-32A을 함유하는 0.1M DIPSO 완충용액에 각각 200nmol/ml, 0.2U/ml, 0.2mg/ml의 농도로 용해시키고, 이 용액을 원형의 여과지(직경 : 1cm)에 함침 건조시켜서 시험종이를 제조하였다.

이러한 시험종이는 다음의 방법에 따라 치주질환을 진단 또는 예측하는 데 이용될 수 있다.

환자로 부터 채취한 타액 혼합물(100μl) 을 상기 시험종이에 적가하여, 실온에서 20분동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 시험종이의 발색정도를 육안으로 평가하였다. 표본 대신 물을 적가하여 제조된 대조용 샘플과 비교하여 그 청색의 정도를 평가하였다. 짙은 청색은 환자가 치주질환에 걸렸음을 나타낸다.

실시예 5

AOD(3,000U)를 바이알(외경: 30mm, 길이: 60mm)에서 동결건조시켜서 시약 A1으로 이용하였다(30개 표본용).

N-카보벤족시-글리실-글리실-아르기닌-DIHA(50nmol)과 화합물P-7(0.5mg)을 혼합하고 바이알(외경: 18mm, 길이: 33mm)에서 동결건조시켜서 시약A2로서 이용하였다(1개 표본용). 1mg/㎖의 Dispanal(30㎖)을 함유하는 0.1MPIPES 완충용액(pH 7.0)을 작은병(75㎖ 용량)에 채우고 이를 시약B로서 사용하였다(30개 표본용).

소듐디에틸디티오카바메이트(5mg/㎖)소듐니트라이드(2mg/㎖)를 함유하는 수용액(pH 9.5)을 점안용기(50㎖ 용량)에 채우고 이를 반응종료시약으로서 이용하였다.

상기 시약들을 조합하여 본 발명에 따른 치주질환검사를 위해 한벌로 사용하였다.

이러한 한벌의 시약은 다음의 방법에 따라 치주질환을 진단 또는 예측하는데 사용될 수 있다.

상기 시약A1의 병을 상기 시약B1의 병에 용해시켜서 AOD 용액을 제조하였다. 환자의 치육구에 페이퍼포인트를 30초동안 삽입시켜서 표본을 채취하였다. 이 표본을 상기 시약 A2을 함유하는 바이알에 쏟고, 여기서 상기 AOD용액을 첨가하였다.

15분후에 상기 반응종료시약(한방울)을 첨가하고 혼합물을 교반시켜서 반응을 종료시켰다. 반응종료시약 첨가후, 발색의 정도를 실시예 1의 방법에 따라 육안으로 평가하였다.

Claims

표본에서의 펩티다아제-유사 효소 활성을 결정하여 치주 질환을 검사하기 위한 조성물에 있어서,

다음 일반식( I )의 화합물,

X - T - B - Y( I )

(여기서, B는 프롤린 또는 아르기닌의 잔기이고,

X는 수소 또는 아미노 보호기이고,

Y는 B의 C-말단에 결합되어 있고, 다음 식( III )의 아닐린 유도체의 잔기이고,

여기에서, R1 - R4 는 같거나 다르고, 수소원자, 할로겐, 1 내지 4의 탄소원자를 갖는 알킬기, 설폰기 또는 하이드록실기이고, R5는 하이드록실기, 아미노기 또는 탄소원자수 1 내지 4개의 알킬이나 탄소원자수 1 내지 4개의 설포알킬 또는 탄소원자수 1 내지 4개의 하이드록시알킬이 치환된 아미노기, 또는 디아미노스틸벤-디설폰산기이고,

T는 단일결합 아미노산 또는 4개 까지의 아미노산 또는 그들의 보호된 유도체로 이루어진 펩티드 잔기이며, C-의 말단이 B의 N-말단에 결합되어 있다.

다음 식들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 산화에 의해 색소를 전개하는 색소원, 및

산화효소로 이루어지되,

산화효소에 의해 색소원의 산화 반응 속도를 증가시키는 것이 가능한 증강제인 아닐린 유도체, 시편중 펩티다아제의 존재시 색소원의 산화를 얻기에 충분한 양으로 존재하는 상기 화학식(1)의 화합물과 산화효소, 상기에서 산화되는 경우 감지가능한 색소 변경을 일으키기에 충분한 양으로 존재하는 색소원으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 치주 질환 검사용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 B는 프롤린이고, 기 T의 C-말단 아미노산 잔기가 글리신, 리신, 알라닌, 페닐알라닌의 잔기인 것을 특징으로 하는 치주 질환 검사용 조성물.
제 1 항에 있어서, B는 아르기닌 이고, 기 T의 C-말단 아미노산 잔기가 글리신, 리신, 아르기닌, 페닐알라닌의 잔기인 것을 특징으로 하는 치주 질환 검사용 조성물.
제 1 항에 있어서, 산화효소는 빌리루빈 옥시다아제(BLOD, EC 1,3,3,5), 모노페놀 옥시게나아제(MPO, EC 1, 14, 18, 1), 아스코르베이트 옥시다아제(AOD, EC 1, 10, 3, 3), 카테콜 옥시다아제(EC 1, 10, 3, 1), 락카아제(EC 1, 10, 3, 2), o-아미노페놀 옥시다아제(EC 1, 10, 3, 4), 3-하이드록시안트 라닐레이트 옥시다아제(EC 1, 10, 3, 5) 및 페놀-2-모노옥시게나아제(EC 1, 14, 13, 7)로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 치주 질환 검사용 조성물.
산소와 다음식( III )의 아닐린 유도체의 존재하 색소원을 산화시킬 수 있는 효소로

다음식들로 구성된 기로부터 선택되는 산화로 색을 일으키는 색소원을 산화시킴으로써 색소를 발생시키고 색소 양을 결정하는 것으로 이루어지되,

상기 아닐린 유도체는 다음식( I )의 화합물의 기질과 표본내의 펩티다아제-유사 효소를 반응시켜서 유리되고,

X - T - B - Y( I )

(여기서, B는 프롤린 또는 아르기닌의 잔기이고,

X는 수소 또는 아미노 보호기이고,

Y는 B의 C-말단에 결합되어 있고, 아닐린 유도체의 잔기이고,

T는 단일결합 아미노산 또는 4개 까지의 아미노산 또는 그들의 보호된 유도체로 이루어진 펩티드 잔기이며, C-의 말단이 B의 N-말단에 결합되어 있다),

산화효소에 의해 색소원의 산화 반응 속도를 증가시키는 것이 가능한 증강제인 아닐린 유도체, 표본에서 펩티다아제의 존재시 색소원의 산화를 얻기에 충분한 양으로 존재하는 상기 화학식(1)의 화합물과 산화효소, 상기에서 산화되는 경우 감지가능한 색소 변경을 일으키기에 충분한 양으로 존재하는 색소원으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 표본에서 펩티다아제-유사 효소 활성의 측정 방법.
제 5 항에 있어서, B는 프롤린이고, 기 T의 C-말단 아미노산 잔기가 글리신, 알라닌, 리신 또는 페닐알라닌의 잔기인 것을 특징으로 하는 표본에서 펩티다아제-유사 효소 활성의 측정 방법.
제 5 항에 있어서, B는 아르기닌 이고, 기 T의 C-말단 아미노산 잔기가 글리신, 리신, 아르기닌, 페닐알라닌의 잔기인 것을 특징으로 하는 표본에서 펩티다아제-유사 효소 활성의 측정방법.
제 5 항에 있어서, 산화효소는 빌리루빈 옥시다아제(BLOD, EC 1, 3, 3, 5), 모노페놀 옥시게나아제(MPO, EC 1, 14, 18, 1), 아스코르베이트 옥시다아제(AOD, EC 1, 10, 3, 3), 카테콜 옥시다아제(EC 1, 10, 3, 1), 락카아제(EC 1, 10, 3, 2), o-아미노페놀 옥시다아제(EC 1, 10, 3, 4), 3-하이드록시안트 라닐레이트 옥시다아제(EC 1, 10, 3, 5) 및 페놀-2-모노옥시게나아제(EC 1, 14, 13, 7)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 표본에서 펩티다아제-유사 효소 활성의 측정방법.