JPH0650995B2 - 歯周疾患検査用組成物 - Google Patents
歯周疾患検査用組成物Info
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- JPH0650995B2 JPH0650995B2 JP63331988A JP33198888A JPH0650995B2 JP H0650995 B2 JPH0650995 B2 JP H0650995B2 JP 63331988 A JP63331988 A JP 63331988A JP 33198888 A JP33198888 A JP 33198888A JP H0650995 B2 JPH0650995 B2 JP H0650995B2
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- JP
- Japan
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- residue
- terminal
- periodontal disease
- formula
- group
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Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K6/00—Preparations for dentistry
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は歯周疾患検査用組成物、さらに詳しくは、検体
中のある種の歯周疾患原因菌を特異的に、かつ、簡便、
迅速に検出し、歯周疾患の罹患や進行を診断、予測し、
あるいは治療の効果を診断することのできる検査用組成
物に関する。
中のある種の歯周疾患原因菌を特異的に、かつ、簡便、
迅速に検出し、歯周疾患の罹患や進行を診断、予測し、
あるいは治療の効果を診断することのできる検査用組成
物に関する。
従来の技術および問題点 近年、歯周疾患に関する細菌学的研究が進み、歯周疾患
病巣部に多くのスピロヘータが検出され、種々の臨床的
指標と高い相関性を示すことが判明している。また、嫌
気性のグラム陰性桿菌が主要な歯周疾患の原因菌である
ことも判明しており、その中でも特に、バクテロイデス
・ジンジバリス(Bacteroides gingivalis)などの黒色色
素産生バクテロイデス(Black-pigmented Bacteroides)
が注目され、その病原性について多数の報告がなされて
いる。
病巣部に多くのスピロヘータが検出され、種々の臨床的
指標と高い相関性を示すことが判明している。また、嫌
気性のグラム陰性桿菌が主要な歯周疾患の原因菌である
ことも判明しており、その中でも特に、バクテロイデス
・ジンジバリス(Bacteroides gingivalis)などの黒色色
素産生バクテロイデス(Black-pigmented Bacteroides)
が注目され、その病原性について多数の報告がなされて
いる。
そこで、口腔内におけるこれらの原因菌の存在を検知
し、歯周疾患の罹患や進行を診断あるいは予測し、歯周
疾患の治療、予防に、臨床的に応用する試みがなされて
いる。
し、歯周疾患の罹患や進行を診断あるいは予測し、歯周
疾患の治療、予防に、臨床的に応用する試みがなされて
いる。
しかしながら、細菌学的方法によるこれらの原因菌の検
知には、暗視野顕微鏡の使用、嫌気性菌の取扱という高
度な技術、特殊な設備等を必要とし、操作が煩雑で、培
養や結果の判断にも長い時間や熟練を要するという欠点
があり、臨床的に実用化するには困難な点が多い。ま
た、免疫学的な面から、これらの原因菌に対する液性免
疫である血中の抗体価を測定したり、細胞性免疫である
リンパ球幼若化反応を測定し、原因菌の存在を検知する
試みもなされているが、検体試料の調整に煩雑な操作を
必要とする問題があり、やはり、実用化はなかなか困難
である。
知には、暗視野顕微鏡の使用、嫌気性菌の取扱という高
度な技術、特殊な設備等を必要とし、操作が煩雑で、培
養や結果の判断にも長い時間や熟練を要するという欠点
があり、臨床的に実用化するには困難な点が多い。ま
た、免疫学的な面から、これらの原因菌に対する液性免
疫である血中の抗体価を測定したり、細胞性免疫である
リンパ球幼若化反応を測定し、原因菌の存在を検知する
試みもなされているが、検体試料の調整に煩雑な操作を
必要とする問題があり、やはり、実用化はなかなか困難
である。
このような事情にかんがみ、本発明者らは、臨床的に実
用化できる歯周疾患原因菌の検知を可能とすべく、鋭意
研究を重ねた。その結果、口腔内スピロヘータが非常に
特異的なペプチダーゼ様酵素活性を有し、また、バクテ
ロイデス・ジンジバリス、バクテロイデス・インターミ
ーディアスなど黒色色素産生バクテロイデスも同様な活
性を有し、ある種の基質を用いる発色反応により、この
酵素活性を特異的に、かつ、簡便、迅速に検出でき、し
かも、歯周疾患の症状が正確に反映されることを見出
し、すでに特許出願した（特願昭６１−１７９７１６
号、同６１−２３３８４８号および同６２−１１３１２
２号）。
用化できる歯周疾患原因菌の検知を可能とすべく、鋭意
研究を重ねた。その結果、口腔内スピロヘータが非常に
特異的なペプチダーゼ様酵素活性を有し、また、バクテ
ロイデス・ジンジバリス、バクテロイデス・インターミ
ーディアスなど黒色色素産生バクテロイデスも同様な活
性を有し、ある種の基質を用いる発色反応により、この
酵素活性を特異的に、かつ、簡便、迅速に検出でき、し
かも、歯周疾患の症状が正確に反映されることを見出
し、すでに特許出願した（特願昭６１−１７９７１６
号、同６１−２３３８４８号および同６２−１１３１２
２号）。
一方、ペプチダーゼ様酵素の発色反応による測定におい
て、発色反応を促進させるある種の化合物を用いること
により、きわめて容易に、短時間に測定することができ
ることを知り、すでに特許出願した（特願昭６２−２８
６５５９号）。
て、発色反応を促進させるある種の化合物を用いること
により、きわめて容易に、短時間に測定することができ
ることを知り、すでに特許出願した（特願昭６２−２８
６５５９号）。
その後、さらに研究を重ねた結果、この発色反応を促進
させる化合物が前記の歯周疾患原因菌の検知に適用でき
ること、また、それにより、より容易に、短時間に検知
が行えることを見出し、本発明を完成するに至った。
させる化合物が前記の歯周疾患原因菌の検知に適用でき
ること、また、それにより、より容易に、短時間に検知
が行えることを見出し、本発明を完成するに至った。
問題点を解決するための手段 本発明は、検体中のペプチダーゼ様酵素活性を測定する
ことにより、歯周疾患の罹患や進行を診断、予測し、あ
るいは治療効果の診断をするための検査用組成物であっ
て、 (a)式：Ｘ−Ｔ−Pro−Ｙ ［１］ ［式中、Proはプロリン残基、Ｘは水素またはアミノ基
保護基、Ｙはプロリン残基のＣ末端に結合する酸素の存
在下に酸化酵素によって色源体の酸化反応の反応速度を
増加させる化合物（以下エンハンサーという）の残基、
ＴはそのＣ末端がプロリン残基のＮ末端と結合する０〜
４個のアミノ酸またはその保護誘導体からなるアミノ酸
またはペプチドの残基を意味する］ で示される化合物および (b)式：Ｘ′−Ｚ−Arg−Ｙ′ ［２］ ［式中、Argはアルギニン残基、Ｘ′は水素またはアミ
ノ基保護基、Ｙ′はアルギニン残基のＣ末端に結合する
エンハンサーの残基、ＺはそのＣ末端がアルギニン残基
のＮ末端と結合する０〜４個のアミノ酸またはその保護
誘導体からなるアミノ酸またはペプチドの残基を意味す
る］ で示される化合物あるいはこれらの混合物、色源体およ
び酸化酵素を組み合わせてなることを特徴とする歯周疾
患検査用組成物を提供するものである。
ことにより、歯周疾患の罹患や進行を診断、予測し、あ
るいは治療効果の診断をするための検査用組成物であっ
て、 (a)式：Ｘ−Ｔ−Pro−Ｙ ［１］ ［式中、Proはプロリン残基、Ｘは水素またはアミノ基
保護基、Ｙはプロリン残基のＣ末端に結合する酸素の存
在下に酸化酵素によって色源体の酸化反応の反応速度を
増加させる化合物（以下エンハンサーという）の残基、
ＴはそのＣ末端がプロリン残基のＮ末端と結合する０〜
４個のアミノ酸またはその保護誘導体からなるアミノ酸
またはペプチドの残基を意味する］ で示される化合物および (b)式：Ｘ′−Ｚ−Arg−Ｙ′ ［２］ ［式中、Argはアルギニン残基、Ｘ′は水素またはアミ
ノ基保護基、Ｙ′はアルギニン残基のＣ末端に結合する
エンハンサーの残基、ＺはそのＣ末端がアルギニン残基
のＮ末端と結合する０〜４個のアミノ酸またはその保護
誘導体からなるアミノ酸またはペプチドの残基を意味す
る］ で示される化合物あるいはこれらの混合物、色源体およ
び酸化酵素を組み合わせてなることを特徴とする歯周疾
患検査用組成物を提供するものである。
本発明の組成物を用いる検査は次の２つの反応系より成
り立っている。第１は検体中のペプチダーゼ様酵素と、
式［１］および式［２］の基質とを反応させエンハンサ
ーを遊離させる反応である。第２は、遊離したエンハン
サーの存在下、酸素の存在下に色源体を酸化する酵素の
作用によって色源体を酸化して色素を生成させる反応で
ある。第１の反応においてエンハンサーの生成は検体中
のペプチダーゼ様酵素活性に比例する。第２の反応にお
いては、エンハンサーの量と色素の生成速度とが比例す
る。すなわち、酸化酵素の作用によって色源体が酸化さ
れ、時間に比例して色素が生成し、エンハンサーが存在
すると色素の生成速度が増幅される。また、一定時間後
の色素の生成量はエンハンサーの量に比例することに基
づく。
り立っている。第１は検体中のペプチダーゼ様酵素と、
式［１］および式［２］の基質とを反応させエンハンサ
ーを遊離させる反応である。第２は、遊離したエンハン
サーの存在下、酸素の存在下に色源体を酸化する酵素の
作用によって色源体を酸化して色素を生成させる反応で
ある。第１の反応においてエンハンサーの生成は検体中
のペプチダーゼ様酵素活性に比例する。第２の反応にお
いては、エンハンサーの量と色素の生成速度とが比例す
る。すなわち、酸化酵素の作用によって色源体が酸化さ
れ、時間に比例して色素が生成し、エンハンサーが存在
すると色素の生成速度が増幅される。また、一定時間後
の色素の生成量はエンハンサーの量に比例することに基
づく。
従って、第１および第２の反応を組み合わせ、生成する
色素を定量することによってエンハンサーの量を定量
し、その結果、検体中のペプチダーゼ活性を測定するこ
とができる。
色素を定量することによってエンハンサーの量を定量
し、その結果、検体中のペプチダーゼ活性を測定するこ
とができる。
本発明の検査用組成物を用いれば、唾液、歯垢、歯肉溝
浸出液などのような検体を、好ましくは、至適条件下(p
H５〜９）、式［１］および式［２］の基質と反応さ
せ、その後色源体および酸化酵素と反応させることによ
り、あるいは検体を色源体および酸化酵素の存在下、式
［１］および式［２］の基質と反応させることにより、
生成する色素の量を測定し、簡便かつ迅速に、歯周疾患
の罹患や進行を診断、予測あるいは治療の効果を診断す
ることができる。
浸出液などのような検体を、好ましくは、至適条件下(p
H５〜９）、式［１］および式［２］の基質と反応さ
せ、その後色源体および酸化酵素と反応させることによ
り、あるいは検体を色源体および酸化酵素の存在下、式
［１］および式［２］の基質と反応させることにより、
生成する色素の量を測定し、簡便かつ迅速に、歯周疾患
の罹患や進行を診断、予測あるいは治療の効果を診断す
ることができる。
基質として用いる式［１］および［２］の化合物は公知
であるか、少なくとも、公知のペプチド合成法によって
容易に製造できるものであり、式［１］および式［２］
のＸおよびＸ′基で示されるアミノ基保護基はペプチド
合成に用いられる公知のアミノ基保護基のいずれのもの
でもよく、例えば、ホルミル基、アセチル基、スクシニ
ル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンゾイル基、カル
ボベンゾキシ基、ｐ−トルエンスルホニル基などが挙げ
られる。
であるか、少なくとも、公知のペプチド合成法によって
容易に製造できるものであり、式［１］および式［２］
のＸおよびＸ′基で示されるアミノ基保護基はペプチド
合成に用いられる公知のアミノ基保護基のいずれのもの
でもよく、例えば、ホルミル基、アセチル基、スクシニ
ル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンゾイル基、カル
ボベンゾキシ基、ｐ−トルエンスルホニル基などが挙げ
られる。
Ｔ基はそのＣ末端がプロリン残基のＮ末端と結合する０
〜４個のアミノ酸またはその保護誘導体からなるアミノ
酸またはペプチドであればいずれでもよいが、Ｔ基中の
Ｃ末端アミノ酸残基がグリシン、アラニン、リジン、フ
ェニルアラニンまたはこれらの保護誘導体残基であるこ
とが好ましい。該保護誘導体には、セリンのＯＨ基、シ
ステインのＳＨ基、アスパラギン酸やグルタミン酸のβ
−あるいは−ＣＯＯＨ基が保護基、例えば、ベンジル
基などで保護されたものが包含される。
〜４個のアミノ酸またはその保護誘導体からなるアミノ
酸またはペプチドであればいずれでもよいが、Ｔ基中の
Ｃ末端アミノ酸残基がグリシン、アラニン、リジン、フ
ェニルアラニンまたはこれらの保護誘導体残基であるこ
とが好ましい。該保護誘導体には、セリンのＯＨ基、シ
ステインのＳＨ基、アスパラギン酸やグルタミン酸のβ
−あるいは−ＣＯＯＨ基が保護基、例えば、ベンジル
基などで保護されたものが包含される。
Ｚ基はそのＣ末端がアルギニン残基のＮ末端と結合する
０〜４個のアミノ酸またはその保護誘導体からなるアミ
ノ酸またはペプチドであればいずれでもよいが、Ｚ基中
のＣ末端アミノ酸残基がグリシン、リジン、アルギニ
ン、フェニルアラニンまたはこれらの保護誘導体残基で
あることが好ましい。該保護誘導体には、セリンのＯＨ
基、システインのＳＨ基、アスパラギン酸やグルタミン
酸のβ−あるいは−ＣＯＯＨ基が保護基、例えば、ベ
ンジル基などで保護されたものが包含される。
０〜４個のアミノ酸またはその保護誘導体からなるアミ
ノ酸またはペプチドであればいずれでもよいが、Ｚ基中
のＣ末端アミノ酸残基がグリシン、リジン、アルギニ
ン、フェニルアラニンまたはこれらの保護誘導体残基で
あることが好ましい。該保護誘導体には、セリンのＯＨ
基、システインのＳＨ基、アスパラギン酸やグルタミン
酸のβ−あるいは−ＣＯＯＨ基が保護基、例えば、ベ
ンジル基などで保護されたものが包含される。
ＹおよびＹ′で示されているエンハンサー残基は色源体
を酸化する反応速度を増加させる化合物の残基であれば
いずれでもよく、かかるエンハンサーの具体例としては
式： ［式中、R1〜R4は、同一もしくは異なって、水素、ハロ
ゲン、アルキル、スルホンまたはヒドロキシルを示しR5
はヒドロキシル、アミノまた置換アミノ（該置換基はア
ルキル、スルホアルキルまたはヒドロキシアルキル）を
意味する］で示されるアニリン誘導体があげられる。
を酸化する反応速度を増加させる化合物の残基であれば
いずれでもよく、かかるエンハンサーの具体例としては
式： ［式中、R1〜R4は、同一もしくは異なって、水素、ハロ
ゲン、アルキル、スルホンまたはヒドロキシルを示しR5
はヒドロキシル、アミノまた置換アミノ（該置換基はア
ルキル、スルホアルキルまたはヒドロキシアルキル）を
意味する］で示されるアニリン誘導体があげられる。
式［３］の化合物の具体例としては、3,5−ジブロモ−
４−ヒドロキシアニリン（ＤＢＨＡ）、3,5−ジクロロ
−４−ヒドロキシアニリン（ＤＣＨＡ）、ｐ−N,N−ジ
スルホプロピルアミノアニリン（ＳＰＡ），3,5−ジヨ
ード−４−ヒドロキシアニリン（ＤＩＨＡ）、3,3−ジ
アミノスチルベン−4,4'−ジスルホン酸（ＤＳＤＡ）、
ｐ−フェニレンジアミン（ＰＰＤ）、４−アミノアニリ
ン−３−スルホン酸（ＤＡＳ）、２−メチル−3,5−ジ
ブロモ−４−ヒドロキシアニリン（ＭＤＢＨＡ）、2,6
−ジメチル−3,5−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリン
（ＤＭＤＣＨＡ）、４−N,N−ジスルホプロピルアミノ
−3,5−ジブロモアニリン（ＳＤＢＡ）、４−（Ｎ−エ
チル−Ｎ−ヒドロキシエチルアミノ）−3,5−ジブロモ
アニリン（ＥＨＤＢＡ）、４−N,N−ジエチルアミノ−
3,4−ジヒドロキシアニリン（ＤＥＤＨＡ）などがあげ
られる。
４−ヒドロキシアニリン（ＤＢＨＡ）、3,5−ジクロロ
−４−ヒドロキシアニリン（ＤＣＨＡ）、ｐ−N,N−ジ
スルホプロピルアミノアニリン（ＳＰＡ），3,5−ジヨ
ード−４−ヒドロキシアニリン（ＤＩＨＡ）、3,3−ジ
アミノスチルベン−4,4'−ジスルホン酸（ＤＳＤＡ）、
ｐ−フェニレンジアミン（ＰＰＤ）、４−アミノアニリ
ン−３−スルホン酸（ＤＡＳ）、２−メチル−3,5−ジ
ブロモ−４−ヒドロキシアニリン（ＭＤＢＨＡ）、2,6
−ジメチル−3,5−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリン
（ＤＭＤＣＨＡ）、４−N,N−ジスルホプロピルアミノ
−3,5−ジブロモアニリン（ＳＤＢＡ）、４−（Ｎ−エ
チル−Ｎ−ヒドロキシエチルアミノ）−3,5−ジブロモ
アニリン（ＥＨＤＢＡ）、４−N,N−ジエチルアミノ−
3,4−ジヒドロキシアニリン（ＤＥＤＨＡ）などがあげ
られる。
式［１］および式［２］の化合物における各アミノ酸残
基の立体配置は、ペプチダーゼ様酵素の基質となりうる
限り、特に限定するものではない。
基の立体配置は、ペプチダーゼ様酵素の基質となりうる
限り、特に限定するものではない。
本発明で用いられる酸化酵素としては酸素の存在下色源
体を酸化して色素を生成させる酵素いずれも使用でき、
例えば、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＬＯＤ、ＥＣ１、
３、３、５）、モノフエノール・オキシゲナーゼ（ＭＰ
Ｏ、ＥＣ１、１４、１８、１）、アスコルビン酸オキシ
ダーゼ（ＡＯＤ、ＥＣ１、１０、３、３、）カテコール
オキシダーゼ（ＥＣ１、１０、３、１）、ラッカーゼ
（ＥＣ１、１０、３、２）、Ｏ−アミノフェノールオキ
シダーゼ（ＥＣ１、１０、３、４）、３−ヒドロキシア
ンスラニレイトオキシダーゼ（ＥＣ１、１０、３、
５）、フェノール−２−モノオキシゲナーゼ（ＥＣ１、
１４、１３、７）などがあげられる。
体を酸化して色素を生成させる酵素いずれも使用でき、
例えば、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＬＯＤ、ＥＣ１、
３、３、５）、モノフエノール・オキシゲナーゼ（ＭＰ
Ｏ、ＥＣ１、１４、１８、１）、アスコルビン酸オキシ
ダーゼ（ＡＯＤ、ＥＣ１、１０、３、３、）カテコール
オキシダーゼ（ＥＣ１、１０、３、１）、ラッカーゼ
（ＥＣ１、１０、３、２）、Ｏ−アミノフェノールオキ
シダーゼ（ＥＣ１、１０、３、４）、３−ヒドロキシア
ンスラニレイトオキシダーゼ（ＥＣ１、１０、３、
５）、フェノール−２−モノオキシゲナーゼ（ＥＣ１、
１４、１３、７）などがあげられる。
色源体としては、酸化されて発色するものは何れも使用
でき、感度を向上させるには、分子吸光係数の高いもの
が好ましい。しかし、エンハンサーの非存在下の反応に
おいて発色（試薬盲検に相当）が少なく、一方、エンハ
ンサーの存在により著しく強い発色を示す化合物が好ま
しい。このような色源体としては、例えば、つぎの化合
物があげられる。
でき、感度を向上させるには、分子吸光係数の高いもの
が好ましい。しかし、エンハンサーの非存在下の反応に
おいて発色（試薬盲検に相当）が少なく、一方、エンハ
ンサーの存在により著しく強い発色を示す化合物が好ま
しい。このような色源体としては、例えば、つぎの化合
物があげられる。
これらの化合物の吸収極大値はつぎの表のとおりであ
る。
る。
本発明の検査用組成物は、式［１］および［２］の化合
物が検体由来のペプチダーゼ様酵素の基質として反応で
き、さらに遊離したエンハンサーが酸化酵素による色源
体の酸化縮合反応を増強する反応を行うことができる形
態のものであればいずれでもよい。
物が検体由来のペプチダーゼ様酵素の基質として反応で
き、さらに遊離したエンハンサーが酸化酵素による色源
体の酸化縮合反応を増強する反応を行うことができる形
態のものであればいずれでもよい。
もっとも基本的には式［１］あるいは式［２］の化合物
あるいは両者の混合物を含む水溶液と酸化酵素および色
源体が共存する水溶液の組み合わせであるか、あるいは
式［１］あるいは式［２］の化合物あるいは両者の混合
物および酸化酵素、色源体が共存する水溶液でよく、好
ましくは、測定時、pH５〜９となるような緩衝剤を含有
させる。用いる緩衝剤は通常用いられるものいずれでも
よく、例えばグッドバッファー、トリス塩酸緩衝剤、リ
ン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、ベロナール緩
衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤などを用いることができる。該
水溶液は、式［１］、式［２］の化合物、色源体、酸化
酵素および、所望により、緩衝剤を蒸留水に溶解するよ
うな公知の方法で製造することができ、要すればさら
に、界面活性剤、防腐剤、抗生物質などの他の添加物を
適宜配合することができる。
あるいは両者の混合物を含む水溶液と酸化酵素および色
源体が共存する水溶液の組み合わせであるか、あるいは
式［１］あるいは式［２］の化合物あるいは両者の混合
物および酸化酵素、色源体が共存する水溶液でよく、好
ましくは、測定時、pH５〜９となるような緩衝剤を含有
させる。用いる緩衝剤は通常用いられるものいずれでも
よく、例えばグッドバッファー、トリス塩酸緩衝剤、リ
ン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、ベロナール緩
衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤などを用いることができる。該
水溶液は、式［１］、式［２］の化合物、色源体、酸化
酵素および、所望により、緩衝剤を蒸留水に溶解するよ
うな公知の方法で製造することができ、要すればさら
に、界面活性剤、防腐剤、抗生物質などの他の添加物を
適宜配合することができる。
反応に際し、各試薬は式［１］および式［２］の化合物
１０nM〜１０mM、配合する場合の配合比率１：１０〜１
０：１の範囲で、色源体0.01〜１０mg/ml、酸化酵素0.0
01〜１０００Ｕ／ml、緩衝剤１mM〜１Ｍの範囲で使用す
ることが好ましい。
１０nM〜１０mM、配合する場合の配合比率１：１０〜１
０：１の範囲で、色源体0.01〜１０mg/ml、酸化酵素0.0
01〜１０００Ｕ／ml、緩衝剤１mM〜１Ｍの範囲で使用す
ることが好ましい。
前記の水溶液は、これらの濃度の式［１］および式
［２］の化合物、色源体、酸化酵素、所望により緩衝剤
を含有し、そのまま直接、検査に供することのできる形
態にすることができ、あるいは、使用時、適宜蒸留水で
所望の濃度に希釈する濃厚液の形態とすることもでき
る。
［２］の化合物、色源体、酸化酵素、所望により緩衝剤
を含有し、そのまま直接、検査に供することのできる形
態にすることができ、あるいは、使用時、適宜蒸留水で
所望の濃度に希釈する濃厚液の形態とすることもでき
る。
本発明の検査用組成物には、これらの水溶液の形態のも
のを、さらに、公知の方法により乾燥粉末化、粒化した
もののごとき固形の形態のもの、粉末成分を混合した粉
末、その顆粒化物のごとき固形の形態のもの、あるい
は、液状の形態のものをろ紙、ペーパーディスク、シー
ト、フィルム、スティック、スポンジ、高分子物などの
担体に含浸させるものも包含される。また、キットの形
態とすることもできる。
のを、さらに、公知の方法により乾燥粉末化、粒化した
もののごとき固形の形態のもの、粉末成分を混合した粉
末、その顆粒化物のごとき固形の形態のもの、あるい
は、液状の形態のものをろ紙、ペーパーディスク、シー
ト、フィルム、スティック、スポンジ、高分子物などの
担体に含浸させるものも包含される。また、キットの形
態とすることもできる。
本発明の検査用組成物を用いて検査を行なうには、ま
ず、検体を採取する。検体の採取は公知の方法で行なっ
てもよく、例えば、歯肉溝浸出液や唾液はろ紙、キャピ
ラリー、ペーパーポイントなどで採取でき、歯垢は綿
棒、キュレット、スケラーなどで採取できる。
ず、検体を採取する。検体の採取は公知の方法で行なっ
てもよく、例えば、歯肉溝浸出液や唾液はろ紙、キャピ
ラリー、ペーパーポイントなどで採取でき、歯垢は綿
棒、キュレット、スケラーなどで採取できる。
ついで、本発明の検査用組成物と検体を、例えば、試験
官、マイクロタイタープレート、セル、バイアル瓶、プ
ラスチック・キュベットなどの中で接触させ、好ましく
はpH５〜９で反応を行わせる。この反応は、通常２０〜
４５℃で行なわれ、反応時間は検体や反応温度により異
なるが、５分〜２４時間程度の反応が好ましい。
官、マイクロタイタープレート、セル、バイアル瓶、プ
ラスチック・キュベットなどの中で接触させ、好ましく
はpH５〜９で反応を行わせる。この反応は、通常２０〜
４５℃で行なわれ、反応時間は検体や反応温度により異
なるが、５分〜２４時間程度の反応が好ましい。
反応終了後、発色の有無、強弱を肉眼あるいは分光光度
計で判定し、これにより、検体中のペプチダーゼ様酵素
活性の有無、強弱を判断し、歯周疾患の罹患や進行を診
断、予測あるいは治療効果の判断を行なうことができ
る。
計で判定し、これにより、検体中のペプチダーゼ様酵素
活性の有無、強弱を判断し、歯周疾患の罹患や進行を診
断、予測あるいは治療効果の判断を行なうことができ
る。
実験および実施例 つぎに、実験および実施例を挙げて本発明をさらに詳し
く説明する。
く説明する。
実験１ 各種口腔内嫌気性細菌のペプチダーゼ様酵素活性 口腔内の嫌気性細菌であるトレポネーマ・デンティコー
ラ(Treponema denticoia)４株、バクテロイデス・ジン
ジバリス５株、アクチノバチルス・アクチノマイセテム
コミタンス(Actinobacillus actinomycetemcomitans)４
株、アクチノマイセス・イスラエリー(Actinomyces isr
aelli)２株およびフゾバクテリウム・ヌクレータム(Fus
obacterium nucleatum)３株のペプチダーゼ様酵素基質
に対する水解活性をつぎのとおり測定した。
ラ(Treponema denticoia)４株、バクテロイデス・ジン
ジバリス５株、アクチノバチルス・アクチノマイセテム
コミタンス(Actinobacillus actinomycetemcomitans)４
株、アクチノマイセス・イスラエリー(Actinomyces isr
aelli)２株およびフゾバクテリウム・ヌクレータム(Fus
obacterium nucleatum)３株のペプチダーゼ様酵素基質
に対する水解活性をつぎのとおり測定した。
トレポネーマ属の細菌はＴＹＧＶＳ培地を用い、３７℃
で７日間、他の細菌はブレイン・ハート・インフュージ
ョン・ブロスを用い、３７℃で４８〜７２時間嫌気的に
培養し、培養液を希釈して、各々、６６０nmにおける吸
光度が0.5の細菌懸濁液を調製した。
で７日間、他の細菌はブレイン・ハート・インフュージ
ョン・ブロスを用い、３７℃で４８〜７２時間嫌気的に
培養し、培養液を希釈して、各々、６６０nmにおける吸
光度が0.5の細菌懸濁液を調製した。
エンハンサーとしてＤＢＨＡを有するペプチダーゼ様酵
素の基質化合物を0.1Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.5)に0.2m
Mの濃度で溶解し、基質溶液を調整した。
素の基質化合物を0.1Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.5)に0.2m
Mの濃度で溶解し、基質溶液を調整した。
一方、５mg/mlディスパノールＭ−３２Ａを含む0.1Ｍ
ＤＩＰＳＯ緩衝液(pH7.5)に化合物Ｐ−２およびＡＯＤ
を各々0.2mg/ml、５０Ｕ／mlとなるよう混合調製したも
のを試薬液Ａとした。
ＤＩＰＳＯ緩衝液(pH7.5)に化合物Ｐ−２およびＡＯＤ
を各々0.2mg/ml、５０Ｕ／mlとなるよう混合調製したも
のを試薬液Ａとした。
基質溶液1.0mlに試薬液Ａ1.5mlおよび細菌懸濁液0.2ml
を加え、３７℃で３０分間反応させた。反応終了後、生
成した色素による６３０nmにおける吸光度の変化を分光
光度計にて測定した。
を加え、３７℃で３０分間反応させた。反応終了後、生
成した色素による６３０nmにおける吸光度の変化を分光
光度計にて測定した。
各細菌懸濁液のペプチダーゼ様酵素活性は、各菌種の△
ＯＤ630値の平均値を求め次のように表示した。
ＯＤ630値の平均値を求め次のように表示した。
△ＯＤ630 −：＜0.05 ±：0.05〜＜0.1 ＋：0.1〜＜0.5 ＋＋：0.5〜＜1.0 ＋＋＋：1.0〜＜2.0 ＋＋＋＋：≧2.0 結果を第１表に示す。第１表中、基質化合物の略号はつ
ぎのとおりである。
ぎのとおりである。
ＧＲ：グリシル−アルギニン−ＤＢＨＡ Bz−ＧＲ：Ｎ−ベンゾイル−グリシル−アルギニン−Ｄ
ＢＨＡ Ｚ−ＶＧＲ：Ｎ−カルボベンゾキシ−バリル−グリシル
−アルギニン−ＤＢＨＡ ＧＰ：グリシル−プロリン−ＤＢＨＡ Ｚ−ＫＰ：Ｎ−カルボベンゾキシ−リジル−プロリン−
ＤＢＨＡ Bz−ＲＧＦＰ：Ｎ−ベンゾイル−アルギニル−グリシル
−フェニルアラニン−プロリン−ＤＢＨＡ 第１表に示すごとく、口腔内嫌気性細菌のうち、歯周疾
患原因菌であるスピロヘータ（トレポネーマ・デンティ
コーラ）およびバクテロイデス・ジンジバリスが特異的
なペプチダーゼ様酵素活性を示した。また、Ｃ末端にア
ルギニンをもつ基質とプロリンをもつ基質とを併用する
ことにより各々単独のものにくらべ２〜３倍の活性を示
した。
ＢＨＡ Ｚ−ＶＧＲ：Ｎ−カルボベンゾキシ−バリル−グリシル
−アルギニン−ＤＢＨＡ ＧＰ：グリシル−プロリン−ＤＢＨＡ Ｚ−ＫＰ：Ｎ−カルボベンゾキシ−リジル−プロリン−
ＤＢＨＡ Bz−ＲＧＦＰ：Ｎ−ベンゾイル−アルギニル−グリシル
−フェニルアラニン−プロリン−ＤＢＨＡ 第１表に示すごとく、口腔内嫌気性細菌のうち、歯周疾
患原因菌であるスピロヘータ（トレポネーマ・デンティ
コーラ）およびバクテロイデス・ジンジバリスが特異的
なペプチダーゼ様酵素活性を示した。また、Ｃ末端にア
ルギニンをもつ基質とプロリンをもつ基質とを併用する
ことにより各々単独のものにくらべ２〜３倍の活性を示
した。
実験２ 本発明法と従来法との感度の比較 トレポネーマ・デンティコーラＡＴＣＣ３５４０５株お
よびバクテロイデス・ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７
株のペプチダーゼ様分解活性を本発明法および従来法に
より測定し、本発明法と従来法との感度の比較を行っ
た。
よびバクテロイデス・ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７
株のペプチダーゼ様分解活性を本発明法および従来法に
より測定し、本発明法と従来法との感度の比較を行っ
た。
細菌の培養は実験１の方法で行い、培養液を希釈して、
各々６６０nmにおける吸光度が0.5および0.1の細菌懸濁
液を調整した。
各々６６０nmにおける吸光度が0.5および0.1の細菌懸濁
液を調整した。
基質としてＮ−ベンゾイル−アルギニル−グリシル−フ
ェニルアラニン−プロリン−ＤＢＨＡ（Bz−Arg−Gly−
Phe−Pro−ＤＢＨＡ）およびＮ−カルボベンゾキシ−グ
リシル−グリシル−アルギニン−ＤＢＨＡ（Ｚ−Gly−G
ly−Arg−ＤＢＨＡ）を用い0.1Ｍリン酸緩衝液(pH7.0)
に0.2mM濃度で溶解し、基質溶液を調整した。
ェニルアラニン−プロリン−ＤＢＨＡ（Bz−Arg−Gly−
Phe−Pro−ＤＢＨＡ）およびＮ−カルボベンゾキシ−グ
リシル−グリシル−アルギニン−ＤＢＨＡ（Ｚ−Gly−G
ly−Arg−ＤＢＨＡ）を用い0.1Ｍリン酸緩衝液(pH7.0)
に0.2mM濃度で溶解し、基質溶液を調整した。
本発明法による酵素活性の測定は実験１で行った方法に
より行った。なお色源体としてはＰ−２の代わりにＰ−
１を用いた。
より行った。なお色源体としてはＰ−２の代わりにＰ−
１を用いた。
一方、従来法としては、0.2mM基質溶液1.0mlに細菌懸濁
液0.2ml加え、３７℃、３０分間反応後、１２mg/mlＮ−
エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−N'−サクシニル
・エチレンジアミン(EMSE)を1.0ml、0.5mg/mlフェリシ
アン化カリウム0.5mlを加え、３７℃、５分間反応後、
生成した色素による７１０nmにおける吸光度の変化を分
光光度計により測定した。
液0.2ml加え、３７℃、３０分間反応後、１２mg/mlＮ−
エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−N'−サクシニル
・エチレンジアミン(EMSE)を1.0ml、0.5mg/mlフェリシ
アン化カリウム0.5mlを加え、３７℃、５分間反応後、
生成した色素による７１０nmにおける吸光度の変化を分
光光度計により測定した。
結果を第２表に示す。値は従来法および本発明法で測定
したＯＤ値を示す。
したＯＤ値を示す。
このように両基質と菌液のいずれの組み合わせにおいて
も従来法に比べ本発明法では１５倍〜２０倍程度のＯＤ
値が得られ、菌量（酵素量）が少なく従来法では検出が
不可能であったものも検出可能である。
も従来法に比べ本発明法では１５倍〜２０倍程度のＯＤ
値が得られ、菌量（酵素量）が少なく従来法では検出が
不可能であったものも検出可能である。
実験３ 実験２で、６６０nmにおける吸光度が0.5になるよう調
製したバクテロイデス・ジンジバリス菌液を用い、実験
２のＡＯＤの代わりに種々の酸化酵素を用い、色源体と
して化合物Ｐ−２を用い実験２と同様の方法で本発明法
と従来法との感度を比較した。感度は本発明法における
ＯＤ630値と従来法におけるＯＤ710値の比で表わした。
製したバクテロイデス・ジンジバリス菌液を用い、実験
２のＡＯＤの代わりに種々の酸化酵素を用い、色源体と
して化合物Ｐ−２を用い実験２と同様の方法で本発明法
と従来法との感度を比較した。感度は本発明法における
ＯＤ630値と従来法におけるＯＤ710値の比で表わした。
結果を第３表に示す。ＡＯＤの替わりに種々の酸化酵素
を用いた場合でも従来法に比べ高い感度アップがはかれ
た。
を用いた場合でも従来法に比べ高い感度アップがはかれ
た。
実験４ 実験３で、酸化酵素としてＡＯＤを用い、エンハンサー
として、ＤＢＨＡの代わりに、ＳＰＡ、ＤＩＨＡ、ＤＳ
ＤＡ、ＰＰＤ、ＤＡＳ、ＭＤＢＨＡ、ＤＭＤＣＨＡ、Ｓ
ＤＢＡ、ＥＨＤＢＡ、ＤＥＤＨＡを用い、本発明法と従
来法との感度を比較した。
として、ＤＢＨＡの代わりに、ＳＰＡ、ＤＩＨＡ、ＤＳ
ＤＡ、ＰＰＤ、ＤＡＳ、ＭＤＢＨＡ、ＤＭＤＣＨＡ、Ｓ
ＤＢＡ、ＥＨＤＢＡ、ＤＥＤＨＡを用い、本発明法と従
来法との感度を比較した。
その結果、第４表に示した感度比が得られた。
実験５ 臨床所見との相関−１ 臨床所見上、健常であると認められる者５名、歯肉炎患
者６名および歯周炎患者６名から、各々、ペーパーポイ
ントにより歯肉溝浸出液検体を採取し、リンガー液1.5m
lに分散後、位相差顕微鏡を用い、全菌数に対するスピ
ロヘータの相対量 を測定した。また、このリンガー液0.2mlを、実験１に
けると同様にして調整した基質溶液を用い、同様にして
水解活性を測定した。基質としては、式［１］の化合物
であるグリシル−プロリン−ＤＢＨＡ(GP)、Ｎ−ベンゾ
イル−アルギニル−グリシル−フェニルアラニン−プロ
リン−ＤＢＨＡ(Bz-RGFP)および式［１］の化合物であ
るＮ−カルボベンゾキシ−バリル−グリシル−アルギニ
ン−ＤＢＨＡ(Z-VGR)、Ｎ−ベンゾイル−グリシル−ア
ルギニン−ＤＢＨＡ(Bz-GR)を各々単独、併用して用い
た。
者６名および歯周炎患者６名から、各々、ペーパーポイ
ントにより歯肉溝浸出液検体を採取し、リンガー液1.5m
lに分散後、位相差顕微鏡を用い、全菌数に対するスピ
ロヘータの相対量 を測定した。また、このリンガー液0.2mlを、実験１に
けると同様にして調整した基質溶液を用い、同様にして
水解活性を測定した。基質としては、式［１］の化合物
であるグリシル−プロリン−ＤＢＨＡ(GP)、Ｎ−ベンゾ
イル−アルギニル−グリシル−フェニルアラニン−プロ
リン−ＤＢＨＡ(Bz-RGFP)および式［１］の化合物であ
るＮ−カルボベンゾキシ−バリル−グリシル−アルギニ
ン−ＤＢＨＡ(Z-VGR)、Ｎ−ベンゾイル−グリシル−ア
ルギニン−ＤＢＨＡ(Bz-GR)を各々単独、併用して用い
た。
結果を第５表に示す。酸素活性の表示は実験１の表示に
従った。
従った。
第５表に示すごとく、酵素活性はスピロヘータ量および
臨床所見と相関し、基質を組み合わせることにより各々
単独で用いた場合より活性の増大が認められた。
臨床所見と相関し、基質を組み合わせることにより各々
単独で用いた場合より活性の増大が認められた。
実験６ 臨床所見との相関−２ 健常者群（１０名）、成人性歯周炎患者群（１０名）、
限局性若年性歯周炎患者群（４名）の各群の混合全唾液
遠心上清を検体として用い、実験２の方法でペプチター
ゼ様酵素活性を本発明法と従来法で比較した。なお、本
実験では反応時間は１５分間とした。基質として、Ｎ−
カルボベンゾキシ−グリシル−アルギニン−ＤＩＨＡ(Z
-GR)、Ｎ−ベンゾイル−アルギニル−グリシル−フェニ
ルアラニン−プロリン−ＤＩＨＡ(Bz-RGFP)を各々単独
および併用して用いた。
限局性若年性歯周炎患者群（４名）の各群の混合全唾液
遠心上清を検体として用い、実験２の方法でペプチター
ゼ様酵素活性を本発明法と従来法で比較した。なお、本
実験では反応時間は１５分間とした。基質として、Ｎ−
カルボベンゾキシ−グリシル−アルギニン−ＤＩＨＡ(Z
-GR)、Ｎ−ベンゾイル−アルギニル−グリシル−フェニ
ルアラニン−プロリン−ＤＩＨＡ(Bz-RGFP)を各々単独
および併用して用いた。
結果を第６表に示す。結果は実験２の如く、OD630,OD
710値で示した。
710値で示した。
第６表に示すごとく、成人性歯周炎患者群および限局性
若年性歯周炎患者群は、いずれの方法においても健常者
群に比べ高い活性を示し、統計的にも有意差が認めれ
る。しかも本発明法では従来法に比べＯＤ値が１０倍程
度高く、患者群と健常群のＯＤ値の差が明確である。特
にＣ末端にアルギニンをもつ基質とプロリンをもつ基質
とを併用することにより、患者群において約1.5倍の高
い値を示した。従って本発明法による酵素活性測定によ
り短時間に歯周疾患の診断、予測および治療効果の判定
を客観的に行うことができる。
若年性歯周炎患者群は、いずれの方法においても健常者
群に比べ高い活性を示し、統計的にも有意差が認めれ
る。しかも本発明法では従来法に比べＯＤ値が１０倍程
度高く、患者群と健常群のＯＤ値の差が明確である。特
にＣ末端にアルギニンをもつ基質とプロリンをもつ基質
とを併用することにより、患者群において約1.5倍の高
い値を示した。従って本発明法による酵素活性測定によ
り短時間に歯周疾患の診断、予測および治療効果の判定
を客観的に行うことができる。
実施例１ Ｎ−カルボベンゾキシ−バリル−グリシル−アルギニン
−ＤＢＨＡの２mM蒸留水溶液を基質溶液とした。0.1Ｍ
トリス−塩酸緩衝液(pH7.0)を調製し、緩衝液Ａとし
た。ディスパノールＭ−３２Ａ５mg/mlを含む0.1Ｍ Ｄ
ＩＰＳＯ緩衝液(pH7.5)を緩衝液Ｂとした。ＡＯＤを緩
衝液Ｂに２００Ｕ／mlとなるよう調製したものを酸化酵
素溶液とした。化合物Ｐ−３を緩衝液Ｂに0.4mg/mlとな
るよう調製したものを色源体溶液とした。
−ＤＢＨＡの２mM蒸留水溶液を基質溶液とした。0.1Ｍ
トリス−塩酸緩衝液(pH7.0)を調製し、緩衝液Ａとし
た。ディスパノールＭ−３２Ａ５mg/mlを含む0.1Ｍ Ｄ
ＩＰＳＯ緩衝液(pH7.5)を緩衝液Ｂとした。ＡＯＤを緩
衝液Ｂに２００Ｕ／mlとなるよう調製したものを酸化酵
素溶液とした。化合物Ｐ−３を緩衝液Ｂに0.4mg/mlとな
るよう調製したものを色源体溶液とした。
これらを組み合わせて、本発明の歯周疾患検査用組成物
キットとした。
キットとした。
このキットは、つぎのようにして歯周疾患の診断あるい
は予測に用いることができる。
は予測に用いることができる。
被験者の歯肉溝にペーパーポイントを３０秒間挿入して
検体を採取する。基質溶液0.1mlおよび緩衝液Ａ0.9mlを
混合し、これに検体を加え、３７℃で３０分間反応させ
る。さらに、これに酸化酵素溶液0.5mlおよび色源体溶
液0.5mlを加え、３７℃で３０分間反応させる。反応終
了後、色調を肉眼観察する。検体を添加しない対照と比
較し、青色の強弱を判定する。強い青色の呈色は歯周疾
患の罹患を示す。
検体を採取する。基質溶液0.1mlおよび緩衝液Ａ0.9mlを
混合し、これに検体を加え、３７℃で３０分間反応させ
る。さらに、これに酸化酵素溶液0.5mlおよび色源体溶
液0.5mlを加え、３７℃で３０分間反応させる。反応終
了後、色調を肉眼観察する。検体を添加しない対照と比
較し、青色の強弱を判定する。強い青色の呈色は歯周疾
患の罹患を示す。
実施例２ Ｎ−カルボベンゾキシ−グリシル−グリシル−アルギニ
ン−ＳＰＡ５００ナノモルおよびＮ−ベンゾイル−プロ
リル−アラニル−グリシル−プロリン−ＳＰＡ５００ナ
ノモルをペーパーディスク（径0.6cm）に含浸させて基
質試薬を調製した。0.1Ｍリン酸緩衝液(pH7.0)にトリト
ンＸ−１００を５mg/mlとなるよう調製したものを緩衝
液Ｃとした。ＢＬＯＤ0.02Ｕおよび化合物Ｐ−４ 1mg
をペーパーディスク（径0.6cm)に含浸させて発色用試薬
とした。これを組み合わせたものを本発明の歯周疾患検
査用組成物キットとした。
ン−ＳＰＡ５００ナノモルおよびＮ−ベンゾイル−プロ
リル−アラニル−グリシル−プロリン−ＳＰＡ５００ナ
ノモルをペーパーディスク（径0.6cm）に含浸させて基
質試薬を調製した。0.1Ｍリン酸緩衝液(pH7.0)にトリト
ンＸ−１００を５mg/mlとなるよう調製したものを緩衝
液Ｃとした。ＢＬＯＤ0.02Ｕおよび化合物Ｐ−４ 1mg
をペーパーディスク（径0.6cm)に含浸させて発色用試薬
とした。これを組み合わせたものを本発明の歯周疾患検
査用組成物キットとした。
このキットは、つぎのようにして歯周疾患の検査あるい
は予測に用いることができる。
は予測に用いることができる。
緩衝液Ｃ４００μｌをバイアル瓶に入れ、これに被験者
から採取した混合唾液１００μｌを加え、さらに基質試
薬のペーパーディスクを加え３７℃で１５分間反応させ
る。さらに発色用試薬のペーパーディスクを加え３７℃
で１５分間反応させる。反応終了後、実施例１と同様に
肉眼観察して判定する。
から採取した混合唾液１００μｌを加え、さらに基質試
薬のペーパーディスクを加え３７℃で１５分間反応させ
る。さらに発色用試薬のペーパーディスクを加え３７℃
で１５分間反応させる。反応終了後、実施例１と同様に
肉眼観察して判定する。
実施例３ Ｎ−ベンゾイル−アルギニン−ＤＩＨＡ５００ナノモ
ル,N−ベンゾイル−アラニル−プロリン−ＤＩＨＡ２５
０ナノモル、ＨＡＯ2.5Ｕ、化合物Ｐ−５を混合し、ア
ンプル（内径９mm、長さ３cm）内で凍結乾燥させたもの
を反応試薬とした。
ル,N−ベンゾイル−アラニル−プロリン−ＤＩＨＡ２５
０ナノモル、ＨＡＯ2.5Ｕ、化合物Ｐ−５を混合し、ア
ンプル（内径９mm、長さ３cm）内で凍結乾燥させたもの
を反応試薬とした。
トリトンＸ−１００ ５mg/mlを含有する0.1Ｍ ＤＩＰ
ＳＯ緩衝液(pH7.5)を調製し、緩衝液とした。
ＳＯ緩衝液(pH7.5)を調製し、緩衝液とした。
これらを組み合わせて、本発明の歯周疾患検査用組成物
キットとした。
キットとした。
このキットは、つぎのようにして歯周疾患の検査あるい
は予測に用いることができる。
は予測に用いることができる。
被験者の歯肉溝にペーパーストリップスを３０秒間挿入
して検体を採取する。緩衝液１mlを反応用試薬含有アン
プルに入れ試薬を溶解させる。これに検体を加え、３７
℃で３０分間反応させる。反応終了後、実施例１と同様
に肉眼観察して判定する。
して検体を採取する。緩衝液１mlを反応用試薬含有アン
プルに入れ試薬を溶解させる。これに検体を加え、３７
℃で３０分間反応させる。反応終了後、実施例１と同様
に肉眼観察して判定する。
実施例４ Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−バリル−ロイシル−グリ
シル−アルギニン−ＤＢＨＡ、ＭＰＯ、化合物Ｐ−８を
５mg/mlディスパノールＭ３２Ａを含む0.1Ｍ ＤＩＰＳ
Ｏ緩衝液(pH7.5)にそれぞれ２００ナノモル／ml、0.2Ｕ
／ml、0.2mg/mlとなるよう混合調製し、この１００μｌ
を円径ろ紙（径１cm）に含浸乾燥して試験紙を作成し
た。
シル−アルギニン−ＤＢＨＡ、ＭＰＯ、化合物Ｐ−８を
５mg/mlディスパノールＭ３２Ａを含む0.1Ｍ ＤＩＰＳ
Ｏ緩衝液(pH7.5)にそれぞれ２００ナノモル／ml、0.2Ｕ
／ml、0.2mg/mlとなるよう混合調製し、この１００μｌ
を円径ろ紙（径１cm）に含浸乾燥して試験紙を作成し
た。
この試験紙は次のようにして歯周疾患の検査あるいは予
測に用いることができる。
測に用いることができる。
被験者から採取した混合唾液１００μｌを試験紙に滴下
し、室温で２０分間反応させる。反応終了後、試験紙の
色調を肉眼観察する。検体のかわりに水を滴下した対照
と比較し、青色の強弱を判定する。強い青色の呈色は歯
周疾患の罹患を示す。
し、室温で２０分間反応させる。反応終了後、試験紙の
色調を肉眼観察する。検体のかわりに水を滴下した対照
と比較し、青色の強弱を判定する。強い青色の呈色は歯
周疾患の罹患を示す。
実施例５ ＡＯＤ３０００Ｕをバイアル瓶（胴径３０mm、長さ６０
mm）内で凍結乾燥させ、これを試薬Ａ１（３０検体用）
とした。
mm）内で凍結乾燥させ、これを試薬Ａ１（３０検体用）
とした。
Ｎ−カルボベンゾキシ−グリシル−グリシル−アルギニ
ン−ＤＢＨＡ５０ナノモルおよび化合物Ｐ−７ 0.5mg
混合し、バイアル瓶（胴径１８mm、長さ３３mm）内で凍
結乾燥させ、これを試薬Ａ２（１検体用）とした。
ン−ＤＢＨＡ５０ナノモルおよび化合物Ｐ−７ 0.5mg
混合し、バイアル瓶（胴径１８mm、長さ３３mm）内で凍
結乾燥させ、これを試薬Ａ２（１検体用）とした。
１mg/mlディスパノールを含む0.1Ｍ ＰＩＰＥＳ緩を衝
液(pH7.0)３０mlをペットボトル（７５ml容量）に入
れ、これを試薬Ｂ（３０検体用）とした。
液(pH7.0)３０mlをペットボトル（７５ml容量）に入
れ、これを試薬Ｂ（３０検体用）とした。
ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム５mg/ml、チッ
化ナトリウム２mg/mlを含む水溶液(pH9.5)を点眼瓶（５
０ml容量）に入れ、これを反応停止液とした。
化ナトリウム２mg/mlを含む水溶液(pH9.5)を点眼瓶（５
０ml容量）に入れ、これを反応停止液とした。
これらを組み合わせて、本発明の歯周疾患検査用組成物
キットとした。
キットとした。
このキットは、つぎのようにして歯周疾患の診断あるい
は予測に用いることができる。
は予測に用いることができる。
予め、試薬Ａ１ １本を試薬Ｂ１本の全量で溶解してＡ
ＯＤ溶液を調製する。被験者の歯肉溝にペーパーポイン
トを３０秒間挿入して検体を採取し、試薬Ａ２バイアル
に投入する。これにＡＯＤ溶液１mlを加え、攪拌後３７
℃で１５分間反応させる。１５分後に反応停止液を一滴
滴下し、攪拌し反応を停止させる。反応停止液添加後、
４時間以内に実施例１と同様に肉眼観察して判定する。
ＯＤ溶液を調製する。被験者の歯肉溝にペーパーポイン
トを３０秒間挿入して検体を採取し、試薬Ａ２バイアル
に投入する。これにＡＯＤ溶液１mlを加え、攪拌後３７
℃で１５分間反応させる。１５分後に反応停止液を一滴
滴下し、攪拌し反応を停止させる。反応停止液添加後、
４時間以内に実施例１と同様に肉眼観察して判定する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 江口 徹 大阪府高槻市津之江町１―45―２―508 (72)発明者 多々納 俊雄 静岡県沼津市大岡2297―６ (72)発明者 中島 光一 大阪府高槻市南大樋町１―１―413
Claims (4)
- 【請求項１】検体中のペプチダーゼ様酵素活性を迅速に
測定することにより、歯周疾患の罹患や進行を診断・予
測し、あるいは治療の効果を診断するための検査用組成
物であって、 (a)式：Ｘ−Ｔ−Pro−Ｙ ［１］ ［式中、Proはプロリン残基、Ｘは水素またはアミノ基
保護基、Ｙはプロリン残基のＣ末端に結合する、酸素の
存在下に酸化酵素によって色源体の酸化反応の反応速度
を増加させる化合物（以下エンハンサーという）の残
基、ＴはそのＣ末端がプロリン残基のＮ末端と結合する
０〜４個のアミノ酸またはその保護誘導体からなるアミ
ノ酸またはペプチドの残基を意味する］ で示される化合物および (b)式：Ｘ′−Ｚ−Arg−Ｙ′ ［２］ ［式中、Argはアルギニン残基、Ｘ′は水素またはアミ
ノ酸保護基、Ｙ′はアルギニン残基のＣ末端に結合する
エンハンサーの残基、ＺはそのＣ末端がアルギニン残基
のＮ末端と結合する０〜４個のアミノ酸またはその保護
誘導体からなるアミノ酸またはペプチドの残基を意味す
る］ で示される化合物あるいはこれらの混合物、色源体およ
び酸化酵素を組み合わせてなることを特徴とする歯周疾
患検査用組成物。 - 【請求項２】エンハンサーが式： ［式中、R1〜R4は、同一もしくは異なって、水素、ハロ
ゲン、アルキル、スルホンまたはヒドロキシル、R5はヒ
ドロキシル、アミノまたは置換アミノ（置換基はアルキ
ル、スルホアルキルまたはヒドロキシアルキル）を意味
する］で示されるアニリン誘導体である前記第(1)項の
歯周疾患検査用組成物。 - 【請求項３】Ｔ基中のＣ末端アミノ酸残基がグリシン、
アラニン、リジン、フェニルアラニンまたはこれらの保
護誘導体残基である前記第(1)項または第(2)項の歯周疾
患検査用組成物。 - 【請求項４】Ｚ基中のＣ末端アミノ酸残基がグリシン、
リジン、アルギニン、フェニルアラニンまたはこれらの
保護誘導体残基である前記第(1)項または第(2)項または
第(3)項の歯周疾患検査用組成物。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63331988A JPH0650995B2 (ja) | 1988-01-20 | 1988-12-28 | 歯周疾患検査用組成物 |
| DE8989300533T DE68906167T2 (de) | 1988-01-20 | 1989-01-20 | Zusammensetzung zur erkennung von paradontalen krankheiten. |
| ES89300533T ES2055029T3 (es) | 1988-01-20 | 1989-01-20 | Una composicion o equipo para realizar ensayos de enfermedades periodonticas. |
| KR1019890000615A KR0140216B1 (ko) | 1988-01-20 | 1989-01-20 | 치주질환 검사용 조성물 |
| EP89300533A EP0325472B1 (en) | 1988-01-20 | 1989-01-20 | Composition for testing periodontal diseases |
| AT89300533T ATE88759T1 (de) | 1988-01-20 | 1989-01-20 | Zusammensetzung zur erkennung von paradontalen krankheiten. |
| CA000588832A CA1332347C (en) | 1988-01-20 | 1989-01-20 | Composition for testing periodontal diseases |
| US07/639,742 US5223404A (en) | 1988-01-20 | 1991-01-11 | Composition for testing periodontal diseases |
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
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| JP1024188 | 1988-01-20 | ||
| JP63331988A JPH0650995B2 (ja) | 1988-01-20 | 1988-12-28 | 歯周疾患検査用組成物 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02499A JPH02499A (ja) | 1990-01-05 |
| JPH0650995B2 true JPH0650995B2 (ja) | 1994-07-06 |
Family
ID=11744809
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63331988A Expired - Lifetime JPH0650995B2 (ja) | 1988-01-20 | 1988-12-28 | 歯周疾患検査用組成物 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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| JPH0797395A (ja) * | 1993-09-28 | 1995-04-11 | Kyowa Medex Co Ltd | ポルフイロモナス・ジンジバリス線毛蛋白質の配列を含有するペプチド類及びその用途 |
-
1988
- 1988-12-28 JP JP63331988A patent/JPH0650995B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-01-20 KR KR1019890000615A patent/KR0140216B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02499A (ja) | 1990-01-05 |
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| KR890011580A (ko) | 1989-08-21 |
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