WO2007052635A1 - 口腔細菌の迅速検出方法 - Google Patents

口腔細菌の迅速検出方法 Download PDF

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WO2007052635A1
WO2007052635A1 PCT/JP2006/321708 JP2006321708W WO2007052635A1 WO 2007052635 A1 WO2007052635 A1 WO 2007052635A1 JP 2006321708 W JP2006321708 W JP 2006321708W WO 2007052635 A1 WO2007052635 A1 WO 2007052635A1
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bacteria
cysteine
oral
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activity
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PCT/JP2006/321708
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Mamiko Yoshimura
Koji Nakayama
Naoya Ohara
Naomichi Takehara
Akihiro Yoshida
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Nagasaki University
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56955—Bacteria involved in periodontal diseases

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting oral bacteria, particularly oral infection-related bacteria, and a kit for diagnosis of oral malodor and periodontal disease.
  • Non-patent Document 2 Based on the above, several reports have been made on the ability of periodontal pathogenic bacteria to produce halitosis-causing substances. Among them, methyl mercaptan, which is prominently detected in the breath of periodontal disease patients, is Borphyromonas gingivalis (Porphyromonas). gingivalis) is reported to be a substance resulting from the degradation of the homocystin-degrading enzyme cathionine possessed by obligate anaerobes such as Fusobacterium nucleatum and Trepoma aentic ola, (Non-Patent Documents 3 to 5). These bacteria have been reported to show remarkable cysteine resolution in addition to homocysteine resolution.
  • Loop-mediated Isothermal Am has been recently developed as a simpler, faster and more accurate genetic test than PCR.
  • the ability to develop the plification (LAMP) method Insufficient cost improvement and extremely high detection sensitivity.
  • sensory tests and gas chromatography methods are mainly used.
  • the sensory test determines the degree of odor by the tester, and the patient's satisfaction with the evaluation of results with poor quantitativeness is inferior to that using the device or test reagent.
  • the gas chromatography method directly quantifies substances that cause bad breath, and is reliable, but has high equipment and maintenance costs and is not suitable for general clinics.
  • Periodonas ginginoris (formerly Batatheroides gindinoris) and Treponema denticola (patent document) 1).
  • Periodontopathic bacteria such as Porphyromonas ginginoris (formerly Batatheroides gindinoris) and Treponema denticola (patent document) 1).
  • Porphyromonas ginginoris formerly Batatheroides gindinoris
  • Treponema denticola (patent document) 1).
  • some periodontal pathogens do not have the same peptidase activity, the expiry date is short because the detection reagent contains another enzyme, and the reagent is expensive. There are still many problems for practitioners to use for testing purposes.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 1-144997
  • Non-patent literature l Miyazaki, H et al., ⁇ J. Periodontol '' 1995, 66, 679-684.
  • Non-Patent Document 2 Coil, J. M. et al., ⁇ J. Clin. Dent. '', 1992, III, 97-103.
  • Non-Patent Document 3 Yoshimura, M. et al., “Infect. Immun.”, 2000, No. 68, 6912-6916.
  • Non-Patent Document 4 Yoshimura, M. et al., “FEBS Lett. J, 2002, No. 523 ⁇ , 119-122.
  • Non-Patent Document 5 Fukamachi, H. et al., “Biochem. Biophys. Res. Commun.” 2005, No. 331, 127-131.
  • Non-Patent Document 6 Yoshida, Y. et al., ⁇ Biochem. Biophys. Res. Commun.J, 2002, No. 300, 55-60.
  • Non-Patent Document 7 Yoshida, Y. et al., “Microbiology.”, 2002, No. 148, 3961-3970. Disclosure of Invention
  • An object of the present invention is to provide a rapid, specific, inexpensive and simple rapid detection system for oral bacteria, preferably oral infection-related bacteria, which can be practically used in dental clinical settings.
  • the present inventors have completed the present invention by paying attention to a homocystin-degrading enzyme and a cysteine-degrading enzyme that are frequently found in oral bacteria, particularly oral infection-related bacteria.
  • the present invention is as follows.
  • a method for detecting oral bacteria comprising measuring homocystin and Z or cysteine-degrading enzyme activity in a specimen.
  • oral bacteria are periodontal pathogenic bacteria, halitosis-causing substance-producing bacteria, root canal infection bacteria, or apical foci bacteria.
  • a method for identifying periodontopathic bacteria characterized by measuring the activity of homocystin degrading enzyme in a sample collected from the oral cavity.
  • a method for detecting oral bacteria comprising a step of identifying a group of oral bacteria present in the oral cavity based on the measurement result.
  • the high-to-medium homocystin-degrading activity group power is Borhuiromonas' gingivalis, Fusovaterium 'Nucleatum, Prevotella' intermedia, Treponema 'Dendikola and Tanerella' Forsycia.
  • a reagent for detecting oral bacteria by measuring the activity of homocystine or cysteine-degrading enzyme in a sample, which contains bismuth and homocystine or cysteine.
  • a diagnostic kit for bad breath, periodontal disease, pulpitis or root canal infection comprising a collecting means for collecting a sample from the oral cavity and the reagent according to (12) or (13).
  • the method for detecting oral bacteria according to the present invention is performed by heating a collected specimen or sample in a reaction solution for a certain period of time, and the presence or absence of oral bacteria is determined by visual observation or absorbance using a spectrophotometer. Therefore, it is much simpler and quicker than conventional methods.
  • the method for identifying a pathogenic bacterium of periodontal disease, pulpitis or root canal infection according to the present invention can similarly determine whether or not a pathogenic bacterium exists.
  • the method for detecting periodontal disease, pulpitis, root canal infection or bad breath according to the present invention can similarly detect the presence or absence of the disease in a simple and rapid manner.
  • the reagents necessary for the detection method and the identification method of the present invention are very inexpensive and have a very high application value as a detection agent that is widely used in general. Therefore, the detection method, identification method, reagent and kit of the present invention provide a quick, simple, inexpensive and accurate diagnosis for patients suffering from oral infections such as periodontal disease, pulpitis, root canal infection and bad breath. Can be provided and is very useful for early detection of the infection Brief Description of Drawings
  • FIG. 1 is a diagram in which oral bacteria are arranged in a group having a high enzyme activity, a middle group, and a group having a low enzyme activity using the respective homocystine and cysteine-degrading enzyme activities as coordinates.
  • FIG. 2 is a graph showing the correlation between the detection result of enzyme activity using a bismuth reaction solution and the number of bacteria in the reaction solution.
  • FIG. 3 shows the change in absorbance of the reaction solution over time with respect to the reaction time.
  • FIG. 4 shows the results of measuring the homocystin and cysteine-degrading enzyme activities of each oral bacterium after 30 minutes and 60 minutes, respectively.
  • FIG. 5 shows the results of measuring the homocystin and cysteine-degrading enzyme activities of each oral bacterium after 30 minutes and 60 minutes, respectively.
  • FIG. 6 shows the results of measuring the homocysteine and cysteine degrading enzyme activities of each oral bacterium after 30 minutes and 60 minutes, respectively.
  • FIG. 7 shows the results of measuring the homocysteine and cysteine degrading enzyme activities of each oral bacterium after 30 minutes and 60 minutes, respectively.
  • FIG. 8 shows the results of measuring the homocysteine and cysteine-degrading enzyme activities of each oral bacterium after 30 minutes and 60 minutes, respectively.
  • FIG. 9 is a graph showing the absorbance at 405 nm of a reaction solution with respect to each temperature condition over time.
  • the horizontal axis represents temperature, and the vertical axis represents absorbance.
  • FIG. 10 is a graph showing the absorbance at 405 nm of the reaction solution with respect to each pH condition over time.
  • the horizontal axis represents pH, and the vertical axis represents absorbance.
  • FIG. 11 is a graph showing the absorbance at 405 nm of the reaction solution over time when Triton X-100 of each concentration is added.
  • the horizontal axis represents the concentration of Triton X-100, and the vertical axis represents the absorbance.
  • FIG. 12 is a graph showing the reproducibility of a sample collected using paper points.
  • the horizontal axis represents pH, and the vertical axis represents absorbance.
  • FIG. 13 is a graph showing the absorbance at 405 nm of the reaction solution over time when sodium hydroxide was added to a final concentration of 0.1, 0.15, and 0.2N. It is.
  • FIG. 14 is a graph showing the effects of human-derived tissue on the detection method of the present invention in Reference Example 1.
  • FIG. 15 is a graph showing the correlation between the collected periodontal pocket depth and the absorbance, based on the homocystin degrading enzyme activity of the sample collected using paper points.
  • the horizontal axis indicates the depth of the periodontal pocket, and the vertical axis indicates the absorbance.
  • FIG. 16 is a graph showing the correlation between the collected periodontal pocket depth and absorbance of cystein-degrading enzyme activity of samples collected using paper points.
  • the horizontal axis indicates the depth of the periodontal pocket, and the vertical axis indicates the absorbance.
  • the method for detecting an oral bacterium of the present invention is a method for measuring oral bacterium or cystine-degrading enzyme activity in a sample, whereby oral bacteria contained in the sample, preferably oral infections. It detects related bacteria.
  • Homocystine and cysteine are decomposed by homocysteine-degrading enzyme and cystine-degrading enzyme, respectively, to produce hydrogen sulfide.
  • Homocystine-degrading enzyme is an enzyme generally known as L-methionine mono-deamino-1 ⁇ -mercaptomethane lyase, and is known to produce methyl mercaptan using methionine as a substrate, but recently it is more homologous than methionine. It has been reported that cysteine is well resolved.
  • the reaction formula is as follows.
  • Cysteine degrading enzyme is an enzyme known as ⁇ C-S lyase, and its reaction formula is as follows.
  • the detection method of the present invention uses the above-mentioned enzymatic properties to measure homocystin and soot or cysteine-degrading enzyme activity in a sample by measuring hydrogen sulfate produced by the enzyme reaction. Is what you do.
  • the method for measuring the generated hydrogen sulfide is not particularly limited, and a known method can be employed.
  • the method for measuring hydrogen sulfide includes a method in which improvement is added to the method of Claesson et al. (See Claesson, R. et al., Oral Microbiol. Immunol. 1990, Vol. 5, 137-142). It is done.
  • a specimen (sample collected from the oral cavity) is added to the bismuth reaction solution.
  • hydrogen sulfide is generated by an enzymatic reaction
  • bismuth reacts with hydrogen sulfide and turns to black bismuth sulfate.
  • the target oral bacteria preferably those related to oral infections, can be detected by observing the blackening of the reaction solution or measuring the absorbance at 405 nm.
  • the detection method of the present invention may be performed by measuring methyl mercabtan produced using methionine as a substrate.
  • a gas chromatograph can be mentioned.
  • a reagent containing 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone is used to detect the formation of a-ketobutyric acid, a byproduct of the methyl mercaptan formation reaction, by measuring the absorbance at 335 nm. There is.
  • oral bacteria refer to bacteria that are widely present in the oral cavity.
  • Oral infection-related bacteria refer to bacteria that cause oral infections among pathogenic bacteria (pathogenic bacteria). For example, periodontal pathogenic bacteria, bacteria producing halitosis, root canal infection bacteria And apical foci bacteria.
  • oral bacteria include: Borphyromonas' Porphyromonas gingivalis', Fusobata trum 'Nucletum (Fusobactenum nucleatum), Prehotella intermed ia, Prevotella denticola (Prevotella denticola) -Prev otella melaninogenica, Prevotella pallens, Prevotella loescheii, Prevotella veroralis, Prevotella biorali, Prevotella bivia, Prevotella nigressen Prevotella nigrescens), Streptococcus sanguinis, Streptococcus sanguinis, Streptoco ecus mnleri, S gleich.
  • Fig. 1 shows these oral bacteria divided into a group having high homocystine and cysteine-degrading enzyme activities, an intermediate group, and a low group.
  • Borphyromonas gingivalis and Fusobaterium nucleatum which showed high homocystin-degrading enzyme activity and high cysteine-degrading enzyme activity, are known as periodontopathic bacteria.
  • hydrogen sulfide produced by the homocystine cysteine-degrading enzyme of these bacteria and methyl mercabtan produced by methionine by the enzyme are correlated with the intensity of bad breath (Persson, S. et al. Oral Microbiol. Immunol. 1990, 5th, 1 95-201).
  • Prevotera intermedia with moderate homocystin-degrading enzyme activity and Prevotera nigres sense with moderate cystine-degrading enzyme activity are also frequently detected in the pockets of periodontal patients.
  • Streptococcus anginasus which showed high cysteine-degrading enzyme activity is a bacterium that is frequently detected from the abscess site (Whitworth, JM et al., J. Med. Microbiol. 1990, 33rd, 135-151), It has been implicated in abscess formation.
  • the present invention provides a method for identifying periodontal disease pathogenic bacteria by measuring the homocystin-degrading enzyme activity in a sample collected from the oral cavity in the same manner as in the above detection method.
  • the activity of cysteine-degrading enzyme in a sample collected from the oral cavity is increased. Measurement can be performed in the same manner as in the detection method described above to provide a method for identifying pathogenic bacteria of pulpitis, apical periodontitis or endodontic infection.
  • An existing method can be used as a method for collecting a sample from the oral cavity.
  • gingival crevicular fluid and saliva in the periodontal pocket are commercially available paper points (stiff bar-like ones) and Filter paper can be used, and plaque can be collected using cotton swabs and curettes.
  • Filter paper can be used, and plaque can be collected using cotton swabs and curettes.
  • filter paper and spatula may be used.
  • the collected sample may be used for the detection method of the present invention as it is, or after culturing as described in the Examples, the culture solution (bacterial solution) may be used for the detection method of the present invention.
  • the former is preferred for shortening the detection time.
  • the reaction solution most basically contains bismuth and homocystine or cystine.
  • a compound that can react with hydrogen sulfide in a solution can be used without limitation, and examples thereof include bismuth chloride, bismuth acetate, bismuth phosphate, and bismuth fluoride.
  • L form For homocystine, it is desirable to use L form, but DL form may also be used. As for cysteine, it is desirable to use L form, but DL form may also be used.
  • the buffer may contain a buffer in the reaction solution as long as it is normally used.
  • triethanolamine buffer eg, triethanolamine hydrochloride
  • tris A hydrochloric acid buffer e.g., trisulfate buffer, etc. are mentioned.
  • reaction solution preferably further contains a surfactant in order to dissolve the bacterial cell membrane and release the enzyme outside the cells.
  • a surfactant examples include Triton X-100, Nodette P40, Tween 20, and the like. Triton X-100 is preferably used.
  • Ethylenediamine tetraacetic acid is used to adjust the pH of the reaction solution.
  • Add two types of reaction solutions by adding either homocysteine or cysteine to the reaction solution. prepare.
  • a reaction solution is selected according to each decomposing enzyme activity of oral bacteria. Preferably, it is in the range of pH 8 to pH 9.5 for the reaction solution for detecting homocysteine-degrading enzyme activity, and in the range of pH 8.0 to pH 9.0 for the reaction solution for detecting cysteine-degrading enzyme activity.
  • the final concentration of bismuth is usually 0.1-5. OmM, preferably 0.5-2. OmM, and the final concentration of homocystine or cysteine is usually 10-40 mM, preferably. It is preferably 15-25 mM. Below these concentrations, the reaction does not take place sufficiently, and above this, background increases. Within these concentration ranges, the reaction between the enzyme and substrate of the bacteria in the sample and the color reaction of hydrogen sulfide and bismuth, which are reaction products, proceed quantitatively. When the reaction solution contains a surfactant, the concentration is usually 0.1 to 2.0%, preferably 0.2 to 0.5%.
  • the contact between the sample and the reaction solution is performed in, for example, a test tube, a microtube, a cell, or a vial.
  • the culture solution (bacterial solution) of the sample When adding the culture solution (bacterial solution) of the sample to the reaction solution, it is preferable to suspend the sample so that the number of bacteria is about 0.3 to 2.5 ⁇ 10 8 in the reaction solution 5001.
  • the reaction solution used in one measurement is usually 0.5 to 1 ml.
  • a relatively high temperature range of 35 ° C to 50 ° C is suitable for the incubation temperature, and the reaction is usually performed for 30 minutes or more, preferably about 60 minutes.
  • a temperature of about 30 ° C to 40 ° C is suitable, and the reaction is usually allowed to proceed for 30 minutes or longer, preferably about 60 minutes.
  • the reaction is allowed to proceed for 30 minutes or more, preferably about 60 minutes under the above conditions, and then the absorbance of the reaction solution is measured, or the reaction solution is visually observed for blackening. Measure the color of the fluid to identify the presence of oral bacteria and periodontal pathogens.
  • the measurement method is not particularly limited, and the measurement is performed using an existing method such as a spectrophotometer. Specifically, for example, the reaction has progressed sufficiently Thereafter, the absorbance of the reaction solution at 405 nm is measured using a spectrophotometer.
  • the absorbance of the reaction solution rises over time in the same state. It is preferable to keep the absorbance for a long time.
  • sodium hydroxide is added to stop the reaction.
  • the final concentration of sodium hydroxide added is 0.1 to 0.3N, preferably 0.15 to 0.2N.
  • the degree of blackening of the reaction solution can be determined by, for example, standard color charts issued by the Japanese Standards Association or other color sheets conforming to the Japanese Industrial Standard CilS Z 8721). You can make a comparison! /
  • the reaction solution containing homocystin is colored, it is assumed that the infection is obligate anaerobic bacteria, which are periodontal pathogenic bacteria. If the reaction liquid containing cysteine is colored, it is determined that there is a bacterial infection that causes pulpitis, apical periodontitis, and endodontic infection. The degree of bad breath can be objectively evaluated by the degree of coloration of the reaction liquid containing homocystine and cysteine, but the degree of coloration of the reaction liquid containing homocystin is stronger, but the bad smell is more severe. It is determined that there is.
  • the present invention provides a reagent for detecting oral bacteria, preferably oral infection-related bacteria, by measuring homocysteine or cysteine-degrading enzyme activity in a specimen.
  • the reagent of the present invention contains bismuth and homocystine or cysteine.
  • the reagent of the present invention may contain a surfactant.
  • the reagent of the present invention is prepared and used in a buffer solution (solvent) when it is desired to store the homocystine and cysteine as substrates in a dry powder form or granulated solid form by a known method. I hope to do it.
  • the present invention provides a collecting means for collecting each specimen from the oral cavity and the above-mentioned Provide a kit for diagnosis of bad breath, periodontal disease, pulpitis or root canal infection, including detection reagents.
  • the affected part includes periodontal pockets, tongue surface, tooth surface, and the like, and specimens include gingival crevicular fluid, saliva, plaque, tongue coating, etc. Examples include paper points, filter paper, cotton swabs and curettes.
  • the present invention further provides a kit for determining the therapeutic effect in root canal treatment by detecting the presence or absence of oral bacteria, including a paper point for collecting fungal bodies from the root canal and the detection reagent. I will provide a. These kits may contain a color sheet used for observing the blackening of the reagent.
  • the detection method and kit of the present invention are oral infections, Specifically, periodontitis (chronic periodontitis, necrotizing ulcerative periodontitis, gestational periodontitis, apical periodontitis, etc.), pulpitis (acute purulent pulpitis, chronic ulcerative pulp) Diagnosis of intra-root canal infections), very useful for prevention.
  • periodontitis chronic periodontitis, necrotizing ulcerative periodontitis, gestational periodontitis, apical periodontitis, etc.
  • pulpitis acute purulent pulpitis, chronic ulcerative pulp
  • Diagnosis of intra-root canal infections very useful for prevention.
  • the detection method and kit of the present invention address problems related to various diseases in the oral cavity, such as the force used as an index for treatment of the above-mentioned diseases, determination of therapeutic effects in root canal treatment, measurement of the degree of bad breath It is also possible to do.
  • Porphyromonas gingival is ATCC 33277
  • Enterococcus faecal is JCM5803
  • the bismuth reaction solution used in the examples of the present invention was a 200 mM triethanolamine containing 0.5 mM bismuth chloride, 10 mM EDTA, and 20 mM DL-homocystine or 20 mM L-cysteine.
  • the hydrochloride salt was a 200 mM triethanolamine containing 0.5 mM bismuth chloride, 10 mM EDTA, and 20 mM DL-homocystine or 20 mM L-cysteine.
  • the hydrochloride salt was a 200 mM triethanolamine containing 0.5 mM bismuth chloride, 10 mM EDTA, and 20 mM DL-homocystine or 20 mM L-cysteine.
  • Example 1 Correlation between detection result of enzyme activity and number of bacteria in reaction solution
  • Example 2 Measurement of Homocystine and Cysteine Degrading Enzyme Activities of Each Oral Bacterium
  • Each homocystin and cysteine degrading enzyme activity of each oral bacterium was compared.
  • Each bacterium was anaerobic at 37 ° C using medium containing 5 g Yeast Extract, lg L-cystine hydrochloride, 5 mg hemin and 1 mg vitamin K (enriched B HI broth) per liter of Brain Heart Inlusion. After cultivating all day and night, the bacterial solution that reached the stationary phase was transferred to a fresh medium and cultured until the logarithmic growth phase was reached.
  • the culture broth was centrifuged to remove the supernatant, and the fresh medium was used to adjust the absorbance at 600 nm to 1.0.
  • the bacterial solution 500 1 thus obtained was centrifuged to remove the supernatant, and the cells were suspended in bismuth reaction solution (pH 8.0) 500 1 containing l% Triton X-100 and incubated at 37 ° C for 30 minutes. After reacting for 60 minutes or 60 minutes, the absorbance at 405 nm was measured.
  • Borphyromonas gingivalis (ATCC33277) was cultured anaerobically overnight at 37 ° C using enriched BHI broth, and then the bacterial solution that reached the stationary phase was transferred to a fresh medium and cultured until the logarithmic growth phase was reached. . Thereafter, the culture medium was centrifuged to remove the supernatant, and the absorbance at 600 nm was adjusted to 1.0 using a fresh medium. The supernatant was removed by centrifuging 500 ⁇ l of the above bacterial solution, and then the cells were suspended in a 500 ⁇ l bismuth reaction solution ( ⁇ 8.0). Thereafter, the absorbance at 405 nm was observed over time while heating under different conditions in the range of 25 ° C to 50 ° C.
  • Centrifuge 500 ⁇ 1 of the bacterial solution prepared by the method described in (1) remove the supernatant, and then suspend the cells in bismuth reaction solution 500 1 up to ⁇ 7.0 force ⁇ 9.5.
  • the force at 405 nm without heating at 37 ° C was observed over time.
  • the bacterial cells were suspended in a 500 / zl bismuth reaction solution ( ⁇ 8.0). And warmed at 37 ° C for 20 minutes. Thereafter, sodium hydroxide was added with a final concentration of 0.1, 0.15, and 0.2 N, and the absorbance at 405 nm was observed over time at room temperature.
  • Periodontal pockets of patients suffering from periodontal disease are easy to bleed and are likely to be contaminated with blood when specimens are collected. Therefore, in order to investigate whether human-derived cells affect the detection of enzyme activity, cell lines derived from peripheral blood and human gingival fibroblasts were added to the reaction solution, and the case of no addition was determined. The absorbance was compared.
  • gingival crevicular fluid was collected to examine the relationship between the periodontal pocket depth and the activity of homocystin and cysteine-degrading enzymes.
  • the method for collecting human gingival crevicular fluid was as follows. First, the oral cavity was divided into 6 fractions, and the deepest pockets of each fraction were sampled. Next, after removing the surrounding saliva from the periodontal pocket to be sampled, insert a paper point and let stand for 10 seconds, then place it in a bismuth reaction solution containing 0.5% TritonX-100, and homocysteine degradation For detection of enzyme activity, reaction was performed at 45 ° C. for 60 minutes, and for detection of cysteine-degrading enzyme activity, reaction was performed at 37 ° C. for 60 minutes, and the absorbance at 405 nm was measured.
  • Figures 15 and 16 show the analysis results for 69 sites of 12 outpatients at Kyushu Dental University Hospital.
  • Fig. 15 shows the results of analysis of homocystin degradation activity and periodontal pocket depth
  • Fig. 16 shows the results of analysis of systemine degradation activity and periodontal pocket depth.
  • the enzyme activity of V and shear it became clear that the enzyme activity increases as the pocket depth increases. In particular, it has been clarified that the tendency is strong for the homocystine-degrading activity.
  • a rapid detection system for oral bacteria that can be used in a dental clinical field.
  • Oral infection-related bacteria can be detected quickly, specifically, inexpensively and easily.
  • This application is based on Japanese Patent Application No. 2005-318312 filed in Japan (filing date: November 1, 2005), the contents of which are incorporated in full herein.

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Abstract

迅速、特異的、安価かつ簡便な、歯科臨床現場で実用可能な口腔細菌、特に口腔感染症関連細菌の迅速検出系を提供する。 検体中のホモシステインおよび／またはシステイン分解酵素活性を測定することを特徴とする、口腔細菌の検出方法。前記酵素活性の測定は、硫化水素とビスマスとの反応により生じた呈色の測定が好ましい。

Description

明 細 書
口腔細菌の迅速検出方法
技術分野
[0001] 本発明は、口腔細菌、特に口腔感染症関連の細菌を検出する方法および口臭'歯 周病診断キットに関する。
背景技術
[0002] 近年、歯科の 2大疾患であるう蝕と歯周病は、口腔感染症関連細菌による感染症と 考えられている。これまで、これらの疾患に対して、感染症に対する基本的な検査で ある細菌検査はあまり行われてこな力つた力 当該疾患が細菌感染症である以上、 当然行われるべきである。また、治療効果の判定や評価、疾患予後の判定などにお いて、細菌検査は極めて重要な役割を担っている。これまで歯科医療において、細 菌検査が積極的に導入されてこな力つた経緯の 1つとして、簡便かつ正確な細菌検 查法が無力つたことが挙げられる。保険診療において、歯内治療における細菌簡易 検査として細菌培養法が唯一認められているが、一般歯科医院で普及しているとは 言!ヽ難 、。これは細菌培養検査の操作性および迅速性に問題があるためと考えられ る。
[0003] 歯科領域では、歯周病、口臭、力！]えて、う蝕の続発症である歯髄炎は、患者が病院 を訪れる主要な理由であり、その患者数は非常に多い。また、衛生意識の向上により 口臭についての関心が高まっており、口臭を主訴とする歯科受診患者が近年増加傾 向にある。厚生省の「平成 11年度保健福祉動向調査」によると、男性の 15. 8%、女 性の 13. 2%、総数で 14. 5%の人が口臭があるという悩みを持っている。口腔保健 関係者は、口臭に対して積極的に取り組むべき時代を迎えているといえる。これらの 疾患は共通して口腔内細菌群による感染症といえる。よって、前記細菌群の簡便、 安価な検出方法は病気の診断'治療に必須であり、そのニーズは高い。
[0004] 歯周病患者が口臭を有する割合が高 、ことから、歯周病と口臭の関係が以前から 指摘されてきた。 Miyazakiらは、 18〜64歳の 2, 672名の被験者について、歯および 歯周組織の健康状態や清掃状態などを調べるのと同時に、呼気中に含まれる揮発 性硫化物を、ポータブルサルファイドモニターを用いて測定している。その結果、呼 気中の揮発性硫化物量は、歯周組織の健康状態と舌苔の付着量に相関することが 明らかになった (非特許文献 1)。また歯周ポケットが深い群 (プロ一ビングデブス、 4m m以上)やプロ一ビング時出血が認められる群は、そうでない群と比較して、高濃度 の揮発性硫ィ匕物が歯肉溝力も検出されることも明らかになつている (非特許文献 2)。 以上のことから、歯周病原細菌による口臭原因物質の産生能についていくつかの報 告がなされており、なかでも歯周病患者の呼気に顕著に検出されるメチルメルカプタ ンは、ボルフイロモナス ·ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis)ゃフソバタテリゥム · ヌクレ タム (Fusobacterium nucleatum)、トレポ不マアンアイコフ (Treponema aentic ola)などの偏性嫌気性菌の有するホモシスティン分解酵素カ^チォニンを分解した 結果生じる物質であることが報告されて 、る (非特許文献 3〜5)。これらの菌はホモシ スティン分解能以外にも顕著なシスティン分解能を示すことが報告されている。
[0005] 一方で、歯周病原細菌以外の細菌にお 、ても顕著なシスティン分解能を有する細 菌の存在も報告されている。 Yoshidaらは、グラム陽性細菌であるストレプトコッカス 'ァ ンギノーサス（Streptococcus anginosus)が高いシスティン分解能を示すことを明らか にして!/ヽる (非特許文献 6)。この菌の有するシスティン分解酵素が赤血球に含まれる ヘモグロビンを修飾し溶血に到らせること (非特許文献 7)、さらに本菌が膿瘍部位力も 高頻度に検出されることなどから、膿瘍形成の有力な原因菌として注目されている。
[0006] 口腔感染症の診断は臨床症状、画像診断、細菌学的検査を効果的に組み合わせ て行う必要があるが、実際に菌を分離 ·同定する細菌培養法は、部位により検体採取 が容易でないこと、細菌の種類によっては検出率が必ずしも高くないこと、培養にあ る程度時間が力かることなどから限界がある。これらのデメリットを解消するために開 発されたのが口腔感染症関連細菌の遺伝子検査法であり、なかでもポリメラーゼ連 鎖反応 (PCR)法を用いた検出方法にっ 、ての研究が数多く報告されて 、る。しかし ながら、サーマルサイクラ一などの高額な装置が必要であること、検出過程が別途必 要であること、またチェアサイドで行えるような簡便性に欠くこと、さらに 1試験あたりの コストが高価であること等のデメリットについては解決されないままである。そこで、 PC R法より簡易、迅速、精確な遺伝子検査法として近年 Loop- mediated Isothermal Am plification (LAMP)法が開発された力 コスト面の改善が不十分であること、また検出 感度が極めて高いため、ごく微量に菌の DNAが残存している病変部位と、菌が活発 に増殖して 、る状態の部位との区別がかえって困難であると!/、う問題がある。口臭の 検査については、官能試験とガスクロマトグラフィー法が主に用いられている。官能 試験は臭いの程度を試験者によって判定するものであり、定量性に乏しぐ結果の評 価に対する患者の満足度は装置や検査試薬を使用するものと比較して劣る。一方、 ガスクロマトグラフィー法は直接口臭原因物質を定量するものであり、信頼性は高い が設備や維持費が高額であり、一般診療所向きではない。
菌の有する酵素活性を指標とした検査試薬としては、サンスター株式会社の「ペリ ォチェック (登録商標）」がすでに商品化されて 、る。これは歯周病原細菌であるポル フイロモナス .ジンジノ リス（旧名バタテロイデス ·ジンジノ リス）やトレポネマデンティコ ラなどの有するぺプチダーゼ活性を検出することで菌の存在を判定するというもので ある（特許文献 1)。しかし、歯周病原細菌のなかには同様のぺプチダーゼ活性を有 さないものもあることや、検出試薬に別の酵素が含まれるために使用期限が短いこと 、さらに試薬が高価であることなど、一般開業医が検査目的で利用するにはまだまだ 多くの問題点がある。
特許文献 1：特開平 1― 144997号公報
非特許文献 l : Miyazaki, Hら、「J. Periodontol」 1995年、第 66卷、 679-684.
非特許文献 2 : Coil, J. M.ら、「J. Clin. Dent.」、 1992年、第 3卷、 97-103.
非特許文献 3 :Yoshimura, M.ら、「Infect. Immun.」、 2000年、第 68卷、 6912-6916. 非特許文献 4 :Yoshimura, M.ら、「FEBS Lett. J , 2002年、第 523卷、 119-122.
非特許文献 5 : Fukamachi, H.ら、「Biochem. Biophys. Res. Commun.」2005年、第 331 卷、 127-131.
非特許文献 6 :Yoshida, Y.ら、「Biochem. Biophys. Res. Commun.J、 2002年、第 300 卷、 55-60.
非特許文献 7 :Yoshida, Y.ら、「Microbiology.」、 2002年、第 148卷、 3961-3970. 発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0008] 本発明の課題は、迅速、特異的、安価かつ簡便な、歯科臨床現場で実用可能な口 腔細菌、好ましくは口腔感染症関連細菌の迅速検出系を提供することである。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは、上記課題に鑑み、口腔細菌、特に口腔感染症関連細菌に高頻度 にみられるホモシスティン分解酵素およびシスティン分解酵素に着目し、本発明を完 成させた。
[0010] 即ち、本発明は下記の通りである。
(1)検体中のホモシスティンおよび Zまたはシスティン分解酵素活性を測定すること を特徴とする、口腔細菌の検出方法。
(2)前記口腔細菌が、歯周病原細菌、口臭原因物質産生細菌、根管内感染細菌ま たは根尖病巣細菌である、（1)記載の検出方法。
(3)前記酵素活性の測定が硫ィ匕水素とビスマスとの反応により生じた呈色の測定で ある（1)または（2)に記載の検出方法。
(4)口腔内から採取した試料中のホモシスティン分解酵素活性を測定することを特 徴とする、歯周病原細菌の同定方法。
(5)口腔内から採取した試料中のシスティン分解酵素活性を測定することを特徴とす る、歯髄炎、根尖性歯周炎または根管内感染の病原細菌の同定方法。
(6)前記酵素活性の測定が硫ィ匕水素とビスマスとの反応により生じた呈色の測定で ある (4)または（5)に記載の同定方法。
(7)口腔内から試料を採取する工程、
前記採取した試料を、ビスマスとホモシスティンまたはシスティンとを含む反応液にカロ えて保温する工程、
前記保温工程後の反応液の呈色を測定する工程、ならびに
前記測定結果に基づいて、口腔内に存在する口腔細菌群を識別する工程 を含む、口腔細菌の検出方法。
(8)前記口腔細菌群が高ホモシスティン分解活性群、中ホモシスティン分解活性群 、高システィン分解活性群および中システィン分解活性群力も構成されるものである 、（7)に記載の検出方法。 (9)前記高ないし中ホモシスティン分解活性群力、ボルフイロモナス'ジンジバリス、 フソバタテリゥム 'ヌクレアタム、プレボテラ'インターメディア、トレポネマ'デンディコラ およびタネレラ 'フォーサイシァである（7)に記載の検出方法。
( 10)前記高ないし中システィン分解活性群力 ストレプトコッカス'アンギノーサス、 プレボテラ 'ニグレスセンスおよびェンテロコッカス'フエカーリスである（7)に記載の 検出方法。
(11)口臭、歯周病、歯髄炎または根管内感染の治療の指標として用いられる（1)〜 (3)、 (7)〜（10)のいずれか 1つに記載の検出方法または (4)〜（6)のいずれか 1つ に記載の同定方法。
(12)検体中のホモシスティンまたはシスティン分解酵素活性を測定することにより口 腔細菌を検出するための試薬であって、ビスマスとホモシスティンまたはシスティンを 含む試薬。
(13)さらに界面活性剤を含む（12)に記載の試薬。
(14)口腔内から試料を採取するための採取手段と、（12)または（13)に記載の試薬 とを含む、口臭、歯周病、歯髄炎または根管内感染の診断用キット。
発明の効果
本発明による口腔細菌の検出方法は、採取した検体または試料を反応液中で一定 時間加温することにより行われ、口腔細菌の存否の判定は肉眼での観察もしくは分 光光度計を用いた吸光度の測定によって可能であることから、従来の方法と比較して もはるかに簡便かつ迅速である。また、本発明による歯周病、歯髄炎または根管内感 染の病原細菌の同定方法も、同様に簡便かつ迅速に病原細菌の存否を判定できる 。また、本発明による歯周病、歯髄炎、根管内感染または口臭の検出方法も、同様に 簡便かつ迅速に当該疾患の有無を検出できる。さらに、本発明の検出方法及び同 定方法に必要な試薬は非常に安価であり、広く一般に用いられる検出薬として応用 価値が非常に高い。よって、本発明の検出方法、同定方法、試薬およびキットは、歯 周病、歯髄炎、根管内感染、口臭などの口腔感染症を患う患者に、迅速、簡便、安 価かつ精確な診断を提供でき、該感染症の早期発見 '治療などに非常に有用である 図面の簡単な説明
[図 1]図 1は、口腔細菌について、それぞれのホモシスティンおよびシスティン分解酵 素活性を座標として、それぞれ酵素活性が高い群、中間の群、低い群に配置した図 である。
[図 2]図 2は、ビスマス反応液を用 ヽた酵素活性の検出結果と反応液中の菌数との相 関性を示すグラフである。
[図 3]図 3は、反応時間に対する、反応液の吸光度の経時的変化を示す。
[図 4]図 4は、各口腔細菌の有するホモシスティンおよびシスティン分解酵素活性を それぞれ 30分後および 60分後に測定した結果を示す。
[図 5]図 5は、各口腔細菌の有するホモシスティンおよびシスティン分解酵素活性を それぞれ 30分後および 60分後に測定した結果を示す。
[図 6]図 6は、各口腔細菌の有するホモシスティンおよびシスティン分解酵素活性を それぞれ 30分後および 60分後に測定した結果を示す。
[図 7]図 7は、各口腔細菌の有するホモシスティンおよびシスティン分解酵素活性を それぞれ 30分後および 60分後に測定した結果を示す。
[図 8]図 8は、各口腔細菌の有するホモシスティンおよびシスティン分解酵素活性を それぞれ 30分後および 60分後に測定した結果を示す。
[図 9]図 9は、各温度条件に対する反応液の 405nmにおける吸光度を経時的に示し たグラフである。横軸は温度を、縦軸は吸光度を示す。
[図 10]図 10は、各 pH条件に対する反応液の 405nmにおける吸光度を経時的に示 したグラフである。横軸は pHを、縦軸は吸光度を示す。
[図 11]図 11は、各濃度の Triton X— 100を添カ卩した場合の、反応液の 405nmにお ける吸光度を経時的に示したグラフである。横軸は Triton X— 100の濃度を、縦軸 は吸光度を示す。
[図 12]図 12は、ペーパーポイントを用いて採取した検体についての再現性を示した グラフである。横軸は pHを、縦軸は吸光度を示す。
[図 13]図 13は、水酸ィ匕ナトリウムを最終濃度が 0. 1、0. 15、 0. 2Nになるように添加 した場合の、反応液の 405nmにおける吸光度を経時的に示したグラフである。 [図 14]図 14は、参考例 1において、本発明の検出方法に及ぼすヒト由来組織の影響 につ 、て調べたグラフである。
[図 15]図 15は、ペーパーポイントを用 、て採取した検体のホモシスティン分解酵素 活性にっ 、て、採取した患者の歯周ポケットの深さと吸光度の相関性を示したグラフ である。横軸は歯周ポケットの深さを、縦軸は吸光度を示す。
[図 16]図 16は、ペーパーポイントを用いて採取した検体のシスティン分解酵素活性 につ 、て、採取した患者の歯周ポケットの深さと吸光度の相関性を示したグラフであ る。横軸は歯周ポケットの深さを、縦軸は吸光度を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0013] (口腔細菌の検出方法）
本発明の口腔細菌の検出方法 (以下、本発明の検出方法ともいう）は、検体中のホ モシスティンまたはシスティン分解酵素活性を測定することにより、検体中に含まれる 口腔細菌、好ましくは口腔感染症関連細菌を検出するものである。
[0014] ホモシスティンおよびシスティンは、それぞれホモシスティン分解酵素及びシスティ ン分解酵素により分解され硫化水素を生じる。
ホモシスティン分解酵素は一般には L—メチォニン一ひ一デァミノ一 γ—メルカプト メタン リアーゼとして知られる酵素であり、メチォニンを基質としてメチルメルカプタ ンを産生することが知られて 、るが、最近ではメチォニンよりホモシスティンをよく分 解することが報告されている。反応式は以下の通りである。
L ホモシスティン→硫化水素 + a—ケト酪酸 +アンモニア
L—メチォニン→メチルメルカプタン + aーケト酪酸 +アンモニア
また、システィン分解酵素は β C— Sリアーゼとして知られる酵素であり、その反応 式は以下の通りである。
L システィン→硫ィ匕水素 +ピノレビン酸 +アンモニア
[0015] 本発明の検出方法は、上記の酵素学的性質を利用して、検体中のホモシスティン および Ζまたはシスティン分解酵素活性を、酵素反応によって生じる硫ィ匕水素を測 定すること〖こより行うものである。生じた硫ィ匕水素を測定する方法は特に限定されず、 公知の方法を採用することができる。 好ましい態様として、硫化水素の測定方法としては、 Claessonら (Claesson, R.ら、 Or al Microbiol. Immunol. 1990年、第 5卷、 137- 142参照)の方法に改良をカ卩えたものが 挙げられる。具体的には、まず、検体（口腔内から採取した試料)をビスマス反応液に 加える。酵素反応により硫化水素が生じると、ビスマスが硫化水素と反応して黒色の 硫ィ匕ビスマスに転じる。一定時間加温後、反応液の黒変を観察するか、あるいは 405 nmにおける吸光度を測定することにより、目的の口腔細菌、好ましくは口腔感染症 関連細菌を検出できる。
本発明の検出方法は、基質としてメチォニンを用いて生成したメチルメルカブタン を測定することにより行ってもよい。メチルメルカブタンの検出としては、直接検出する 方法としてガスクロマトグラフがあげられる。また、間接的に検出する方法として、 3— メチルー 2—べンゾチアゾリノン ヒドラゾンを含む試薬を用い、メチルメルカプタン生 成反応の副産物である aーケト酪酸の生成を 335nmにおける吸光度を測定すること で検出する方法がある。
(口腔細菌）
本発明において、口腔細菌とは広く口腔内に存在する細菌のことを指す。また口腔 感染症関連細菌とは、口腔細菌のなかでも特に口腔感染症を引き起こす原因となる 細菌 (病原細菌）のことをいい、例えば、歯周病原細菌、口臭原因物質産生細菌、根 管内感染細菌、根尖病巣細菌などが挙げられる。口腔細菌の具体的な例示としては 、ボルフイロモナス 'ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis)、フソバタテリゥム'ヌクレ タム (Fusobactenum nucleatum)、プレホアフ'インタ ~~メアイァ (Prevotella intermed ia)、プレボテラ'デンティコラ (Prevotella denticola)、プレボテラ'メラ-ノゲ-力 (Prev otella melaninogenica)、プレボテラ'ノ、レンス (Prevotella pallens)、プレボテラ'ロシェ ィ (Prevotella loescheii)、プレボテラ'ベロラリス (Prevotella veroralis)、プレボテラ'ビ ビア (Prevotella bivia)、プレボテラ'ニグレスセンス (Prevotella nigrescens)、ストレプト コッカス'サングイ-ス (Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス 'ミレリ (Streptoco ecus mnleri)、ストレフ。トコッ《7ス' Zンキノ ~~サス (Streptococcus anginosus)、ストレフ。 トコッカス .ミュータンス (Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス ·ソブリナス (Strept ococcus sobrinus)、ストレフ。トコッ <7ス'サリノ リウス (Streptococcus salivanus)、ストレ プトコッカス 'ゴノレドニ (Streptococus gordonii)、ェンテロコッカス'フエカーリス (Entero coccus faecalis)などが挙げられる。
[0017] これらの口腔細菌について、ホモシスティンおよびシスティン分解酵素活性が高い 群、中間の群、低い群に分けて表にしたものを図 1に示す。高ホモシスティン分解酵 素活性および高システィン分解酵素活性を示したボルフイロモナス ·ジンジバリスおよ びフソバタテリゥム 'ヌクレアタムは、歯周病原細菌として知られている菌である。また 、これらの菌の有するホモシスティン'システィン分解酵素によって生じる硫ィ匕水素や 同酵素によってメチォニン力 生じるメチルメルカブタンが口臭の強度と相関があると いう報告もなされている (Persson, S.ら、 Oral Microbiol. Immunol. 1990年、第 5卷、 1 95-201参照)。同様に、中等度のホモシスティン分解酵素活性を示したプレボテラ'ィ ンターメディアおよび中等度のシスティン分解酵素活性を示したプレボテラ ·ニグレス センスも歯周病患者のポケットから高頻度に検出されることが知られている。一方、高 システィン分解酵素活性を示したストレプトコッカス ·アンギノーサスは膿瘍部位から 頻繁に検出される菌であり (Whitworth, J. M.ら、 J. Med. Microbiol. 1990年、第 33卷 、 135-151参照)、膿瘍形成との関与が示唆されている。また、中等度のシスティン分 解酵素活性を示したェンテロコッカス 'フエカーリスは根尖病巣を有する歯牙のうち、 およそ 40%の根管内力 検出されることが報告されている (Pinheiro, E.T.ら、 Oral Mi crobiol. Immunol.2003年、第 18卷、 100- 103参照)。歯髄炎は、ストレプトコッカス 'ァ ンギノーサスゃフゾバタテリゥム ·ヌクレアタム、ボルフイロモナス ·ジンジバリスやトレポ ネマ ·デンティコラなどの複合感染によって引き起こされるという報告がある（奥田克 爾、最新口腔微生物学、一世出版、 2005年、 402-404参照)。本発明は、ホモシステ イン分解活性とシスティン分解活性の測定を組み合わせることにより、口腔細菌を上 述の群に簡便に分類することもできる。
[0018] (歯周病、歯髄炎または根管内感染の病原細菌の同定方法）
本発明によって、口腔内から採取した試料中のホモシスティン分解酵素活性を、上 記の検出方法の場合と同様に測定して、歯周病の病原細菌を同定する方法が提供 される。
さらに、本発明により、口腔内から採取した試料中のシスティン分解酵素活性を上 記の検出方法の場合と同様に測定して、歯髄炎、根尖性歯周炎または根管内感染 の病原細菌を同定する方法を提供することができる。
[0019] 口腔内より試料を採取する方法としては既存の方法を用いることができ、例えば、 歯周ポケットの歯肉溝滲出液や唾液は市販のペーパーポイント (紙蹉りの硬い棒状 のもの）およびろ紙などを用いて、また歯垢は綿棒およびキュレットなどを用いて採取 できる。さらに、舌表面から舌苔を採取する場合は、ろ紙およびへらなどを用いてもよ い。
採取した試料はそのまま本発明の検出方法に供してもよいし、実施例に説明するよ うにして培養した後、その培養液 (菌液)を本発明の検出方法に供してもよいが、検 出時間短縮のためには前者が好まし 、。
[0020] 以下、硫化水素検出系につ!/、て詳述する。
(反応液）
本発明において、反応液とは、最も基本的にはビスマスとホモシスティンまたはシス ティンとを含むものである。
ビスマスとしては、溶液中で硫ィ匕水素と反応しうる化合物を限定なく用いることがで き、例えば、塩化ビスマス、酢酸ビスマス、リン酸ビスマス、フッ化ビスマスなどが挙げ られる。
ホモシスティンについては、 L体を用いるのが望ましいが、 DL体を用いてもよい。ま たシスティンについても、 L体を用いるのが望ましいが、 DL体を用いてもよい。
反応液には緩衝剤が含まれていてもよぐ緩衝剤としては、通常用いるものであれ ば特に限定はなぐ例えば、トリエタノールァミン緩衝液 (例：トリエタノールァミン塩酸 塩など）、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液などが挙げられる。
また、反応液には、細菌の細胞膜を溶解して酵素を菌体外に放出させるため、さら に界面活性剤が含まれていることが好ましい。界面活性剤としては、例えば、 Triton X— 100、ノ-デット P40、 Tween 20、などが挙げられ、好ましくは Triton X— 100 を用いる。
反応液の pH調整にはエチレンジァミン四酢酸 (EDTA)などを用いる。 反応液に、ホモシスティンとシスティンのどちらかを含有させて、 2種類の反応液を 準備する。口腔細菌の有するそれぞれの分解酵素活性に応じて反応液を選択する。 好ましくは、ホモシスティン分解酵素活性検出用反応液では pH8〜pH9. 5の範囲 、システィン分解酵素活性検出用反応液では pH8. 0〜pH9. 0の範囲である。
[0021] 反応液中、ビスマスの最終濃度は、通常 0. 1〜5. OmM、好ましくは 0. 5〜2. Om Mであり、ホモシスティンまたはシスティンの最終濃度は、通常 10〜40mM、好まし くは 15〜25mMである。これらの濃度を下回ると反応が十分に起こらず、上回るとバ ックグラウンドの上昇が見られる。またこれらの濃度の範囲であれば、試料中の細菌 が有する酵素と基質の反応、及び反応産物である硫化水素とビスマスの呈色反応が 定量的に進行する。反応液が界面活性剤を含む場合、その濃度は、通常 0. 1〜2. 0%、好ましくは 0. 2〜0. 5%である。
[0022] (保温工程）
次に、試料を反応液に加える場合の最適条件について述べる。
検体と反応液の接触は、例えば、試験管、マイクロチューブ、セル、バイアル瓶など の中で行う。
検体の培養液 (菌液)を反応液に加える場合、反応液 500 1に対し、菌数がおよ そ 0. 3〜2. 5 X 108個となるように懸濁するのが好ましい。
また、検体を採取したペーパーポイントを直接反応液に浸して接触させる場合、 1 回の測定で用いる反応液は、通常 0. 5〜lmlである。
ホモシスティン分解酵素活性にっ 、て見る場合は、保温温度は 35°C〜50°Cの範 囲の比較的高温条件が適しており、通常 30分以上、好ましくは 60分程度反応を進 行させる。これに対し、システィン分解酵素活性について見る場合は、 30°C〜40°C 程度が適しており、通常 30分以上、好ましくは 60分程度反応を進行させる。
[0023] (測定工程）
本発明の検出方法では、上記条件で 30分以上、好ましくは 60分程度、反応を進 行させた後、反応液の吸光度を測定するか、あるいは反応液の黒変を目視により観 察して反応液の呈色を測定し、口腔細菌 ·歯周病原菌群の存在を識別する。
反応液の吸光度を測定する場合、その測定方法は特に限定されず、分光光度計 などの既存の方法を用いて測定する。具体的には、例えば、反応が十分に進行した 後、分光光度計を用いて、 405nmにおける反応液の吸光度を測定する。
また、反応液の吸光度を測定する場合、反応液の吸光度はそのままの状態では経 時的に上昇するため、反応終了直後に測定が行えな力つた場合を想定し、反応を停 止させ、一定時間、吸光度を安定な状態に保つことが好ましい。この場合、水酸化ナ トリウムを添加して反応を停止させる。添加する水酸ィ匕ナトリウムの濃度は、最終濃度 として 0. 1〜0. 3N、好ましくは、 0. 15〜0. 2Nである。
また、肉眼で反応液の黒変を観察する場合、反応液の黒変の度合を、例えば日本 工業規格 CilS Z 8721)に準拠した日本規格協会発行の標準色票やその他のカラ 一シートなどと比較して判定してもよ!/、。
[0024] 判定の方法としては、ホモシスティンを含む反応液が呈色していれば、歯周病原細 菌である偏性嫌気性菌感染であるとされる。また、システィンを含む反応液が呈色し ていれば、歯髄炎、根尖性歯周炎および根管内感染の原因となる細菌感染があると 判定される。ホモシスティンおよびシスティンを含む反応液の呈色の度合によって、 口臭の度合も客観的に評価することができるが、ホモシスティンを含む反応液の呈色 の度合が強 、方が、口臭が重度であると判定される。
[0025] このようにして検体中のホモシスティンおよびシスティン分解酵素活性を測定するこ とにより、歯周病、歯髄炎、根尖性歯周炎および根管内感染の有無を簡便に診断す ることがでさる。
[0026] (検出用試薬）
さらに、本発明により、検体中のホモシスティンまたはシスティン分解酵素活性を測 定することにより口腔細菌、好ましくは口腔感染症関連細菌を検出するための試薬が 提供される。本発明の試薬は、ビスマスとホモシスティンまたはシスティンを含むもの である。さら〖こ、本発明の試薬には界面活性剤が含まれていてもよい。
本発明の試薬は基質となるホモシスティンおよびシスティンに関しては公知の方法 により乾燥粉末ィ匕または顆粒ィ匕した固形の形態で保存するのが望ましぐ用時に緩 衝液 (溶媒)で調製して使用するのが望まし 、。
[0027] (キット）
またさらに、本発明は、口腔内から検体をそれぞれ採取するための採取手段と上記 検出用試薬とを含む、口臭、歯周病、歯髄炎または根管内感染の診断用キットを提 供する。ここで、患部としては上述した通り、歯周ポケット、舌表面、歯表面などが挙 げられ、検体としては歯肉溝滲出液、唾液、歯垢、舌苔などが挙げられ、採取手段と してはペーパーポイント、ろ紙、綿棒およびキュレットなどが挙げられる。また、本発明 は、さらに根管内から菌体を採取するためのペーパーポイントと、上記検出用試薬と を含む、口腔細菌の有無を検出することにより根管治療における治療効果判定用キ ットを提供する。これらのキットには、試薬の黒変を観察する場合に用いるカラーシー トが含まれていてもよい。
[0028] (用途）
本発明の検出方法およびキットを用いることにより、多様な口腔細菌、とりわけ歯周 病原細菌などの口腔感染症関連細菌を検出することができるため、本発明の検出方 法およびキットは口腔感染症、具体的には、歯周炎 (慢性歯周炎、壊死性潰瘍性歯 周炎、妊娠性歯周炎、根尖性歯周炎など)、歯髄炎 (急性化膿性歯髄炎、慢性潰瘍 性歯髄炎、歯根嚢胞など)、根管内感染の診断 '予防に対し非常に有用である。また 、本発明の検出方法およびキットは、前記疾患の治療の指標として用いられるほ力、 根管治療における治療効果の判定、口臭の程度の測定など、口腔内の様々な疾患 に係る問題に対応することも可能である。
実施例
[0029] 以下、実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、実施例は本発明の説明の ために記載するものであり、本発明を限定するものではない。
本発明の実施例に用いた各菌株を表 1に示す。
[0030] [表 1] 名称 株名
Porphyromonas gingival is ATCC 33277
W83
Fusobac terium nuc lea turn ATCC 10953
Prevotella intermedia ATCC 25611
Prevotella dent i col a ATCC 33185
Prevotella melaninogenica ATCC 25845
Prevotella pallens ATCC 700821
Prevotella loeschei 1 ATCC 15930
Prevotella veroralis JCM6291
Prevotella bivia JCM6331
Prevotella nigrescens ATCC 33563
Streptococcus sanguinis ATCC 10556
Streptococcus miiieri NCTC 10707
Streptococcus anginosus FW73
Streptococcus /nutans Xc
Streptococcus sobrinus 0MZ176
Streptococcus sal i van' us HT9R
Streptococcus gordonn Chal lis
Enterococcus faecal is JCM5803
JCM7783
[0031] また、本発明の実施例で用いたビスマス反応液は、 0. 5mMの塩化ビスマス、 10m Mの EDTA、および 20mMの DL -ホモシスティンもしくは 20mMの L -システィン を含む 200mMトリエタノールァミン塩酸塩である。
[0032] 実施例 1：酵素活性の検出結果と反応液中の菌数との相関性
ビスマス反応液を用いた酵素活性の検出結果が反応液中の菌数と相関することを 確認するために、ボルフイロモナス'ジンジノ リス（ATCC33277株）の菌液を段階希 釈し、 10 X 108、 5 X 108、 2. 5 X 108、 1. 25 X 108、 0. 63 X 108、 0. 31 X 108、 0. 16 X 108および 0. 07 X 108 CFUZmlになるようにホモシスティンを含むビスマス 反応液 (PH8. 0)で懸濁し、 37°Cで 60分加温したのち 405nmにおける吸光度を測 し 7こ。
その結果、図 2に示すように、反応液中の菌数に相関して吸光度が上昇することが 明らかになった。また、吸光度の上昇は、図 3に示すように反応時間に相関すること がわかった。
[0033] 実施例 2：各口腔細菌の有するホモシスティンおよびシスティン分解酵素活性の測定 各口腔細菌について、それぞれのホモシスティンおよびシスティン分解酵素活性を 比較した。各菌は Brain Heart Inlusion 1リットルあたりに 5gの Yeast Extract, lgの L —システィン塩酸塩、 5mgのへミンおよび lmgのビタミン Kを含む培地（enriched B HIブロス)を用いて、 37°Cで嫌気的に一昼夜培養した後、定常期に達した菌液を新 鮮な培地に植え継ぎ、対数増殖期に達するまで培養した。その後、培養液を遠心分 離して上清を取り除き、新鮮な培地を用いて 600nmにおける吸光度が 1. 0になるよ うに調整した。こうして得られた菌液 500 1を遠心分離して上清を取り除いたのち、 菌体を l%Triton X— 100を含むビスマス反応液（pH8. 0) 500 1で懸濁し、 37°C で 30分または 60分反応させたのち 405nmにおける吸光度を測定した。
結果を図 4〜図 8に示す。この結果により、ホモシスティンおよびシスティン分解酵 素活性の検出が口腔細菌の存在を知る指標として有用であることが明らかになった。
[0034] 実施例 3 :反応条件の検討
(1)反応温度
ボルフイロモナス.ジンジバリス（ATCC33277株）を enriched BHIブロスを用いて 3 7°Cで嫌気的に一昼夜培養した後、定常期に達した菌液を新鮮な培地に植え継ぎ、 対数増殖期に達するまで培養した。その後、培養液を遠心分離して上清を取り除き、 新鮮な培地を用いて 600nmにおける吸光度が 1. 0になるように調整した。上記の菌 液 500 μ 1を遠心分離して上清を取り除 、たのち、菌体を 500 μ 1のビスマス反応液（ ρΗ8. 0)で懸濁した。その後 25°Cから 50°Cの範囲で条件を変えて加温しつつ、 40 5nmにおける吸光度を経時的に観察した。
結果を図 9に示す（図中、縦軸は吸光度を表す)。これより、ホモシスティン分解酵 素活性については、反応温度が 35°Cから 50°Cの範囲の、比較的高温条件下での 反応が適していることがわ力つた。これに対し、システィン分解酵素活性は 30°Cから 40°C程度が適して 、ることがわかった。
(2)反応 pH
(1)で記した方法で調製した菌液 500 μ 1を遠心分離して上清を取り除 、たのち、 菌体を ΡΗ7. 0力 ρΗ9. 5までのビスマス反応液 500 1で懸濁し、 37°Cで加温しな 力 405nmにおける吸光度を経時的に観察した。
結果を図 10に示す（図中、縦軸は吸光度を表す)。これより、ホモシスティン分解酵 素活性は pH8から pH9. 5の範囲が反応に適していることが明らかになった。これに 対して、システィン分解酵素活性の検出に適した反応液の pHは、 pH8. 0から pH9 . 0であった。
(3)界面活性剤
ホモシスティン分解酵素は菌体内酵素であるため、何らかの方法で菌を溶菌させ て、細胞内の酵素が基質と直接接触できるようにした方が検出効率が良いと考えられ る。そこで、等量の菌体を含む反応液中に界面活性剤等を添加した場合と添加しな い場合とで、吸光度の上昇を比較することにした。（1)で記載した方法で調製した菌 液 500 1を遠心分離して上清を取り除いたのち、 0. 1%力 2%の Triton X— 100 を含むビスマス反応液もしくは含まな!/、ビスマス反応液 500 μ 1 (ρΗ8. 0)で懸濁し、 37°Cで加温し 405nmにおける吸光度を経時的に観察した。
結果を図 11に示す（図中、縦軸は吸光度、横軸は Triton X— 100濃度を表す)。 反応液に Triton X— 100を添カロした場合において、添カ卩しない場合より検出効率が 改善されることが明らかになった。
実施例 4：ペーパーポイントを用いて採取した検体にっ 、ての再現性の確認
実際に患者力 検体を採取する際にはペーパーポイントなどの採取手段を用いて 行う。そこで、ペーパーポイントに付着した菌体を反応液に浸した場合でも、直接菌 体を反応液に懸濁した場合と同じ結果が得られることを確認するために以下の実験 を行った。まず、 600nmにおける吸光度が 1. 0になるように調整した菌液 10mlを遠 心分離し、菌体を回収したのち新鮮な培地 500 1で懸濁した。この菌液にペーパー ポイントを 10秒浸したのち、直ちに 0. 5%の Triton X— 100を含む pH7. 0力ら pH 9. 5までのビスマス反応液 500 1に浸した。その後 37°Cでカ卩温しながら 405nmに おける吸光度を経時的に観察した。
結果を図 12に示す（図中、縦軸は吸光度を表す)。この結果より、ペーパーポイント に菌を吸着させたのちビスマス反応液に浸すという方法でも酵素活性が検出できるこ とを確認した。また、ペーパーポイントを用いて採取した検体についても、反応液に T riton X— 100を添加することによって検出効率を倍近く向上させることができること が明らかになった。
[0036] 実施例 5：反応停止条件の検討
実施例 3の（1)で記した方法で調製した菌液 500 μ 1を遠心分離して上清を取り除 いたのち、菌体を 500 /z lのビスマス反応液 (ρΗ8. 0)で懸濁し、 37°Cで 20分間加温 した。その後水酸ィ匕ナトリウムを最終濃度が 0. 1、0. 15、 0. 2規定になるように添カロ し、室温で 405nmにおける吸光度を経時的に観察した。
結果を図 13に示す。図 13によれば、最終濃度 0. 1Nでは反応は停止せず、 0. 15 Nでは値は小さいものの、ゆるやかな吸光度の上昇がみられた。これに対し、最終濃 度 0. 2Nの水酸ィ匕ナトリウムを添加した場合では、 3日間にわたり安定した測定値を 得ることができた。
[0037] 参考例 1：ヒト由来組織による影響についての検討
歯周ポケットなどの実際に患者からの検体を採取する部位では、しばしば炎症によ る出血や剥離した上皮細胞などの存在が認められる。歯周病に罹患した患者の歯周 ポケットは易出血性であり、検体を採取する際に血液で汚染される可能性が高い。そ こで、ヒト由来の細胞が酵素活性の検出に影響を与えるかをしらべるため、末梢血お よびヒト歯肉線維芽細胞由来細胞株を反応液に添加し、添加しなカゝつた場合との吸 光度の比較を行った。
まず、ボルフイロモナス ·ジンジバリス（ATCC33277株）を enriched BHIブロスを 用いて 37°Cで嫌気的に一昼夜培養した後、定常期に達した菌液を新鮮な培地に植 え継ぎ、対数増殖期に達するまで培養した。その後、培養液を遠心分離して上清を 取り除き、新鮮な培地を用いて 600nmにおける吸光度が 1. 0になるように調整した。 上記の菌液 500 1を遠心分離して上清を取り除いた。こうして得られた菌体を、ヒト 末梢血を 0. 5もしくは 1 1、またはヒト歯肉線維芽細胞由来細胞株である HSC— 2 1 X 104個をあらかじめ加えたビスマス反応液（1 % Triton X— 100を含む） 500 μ 1 で懸濁した。その後 37°Cで 30分間加温し、 405nmにおける吸光度を測定した。な お、末梢血は健康な成人よりへパリン存在下で採血し、 HSC— 2は 10%牛血清、 2 mM L—グルタミン、 100 g/mlストレプトマイシンおよび 6 g/mlペニシリンを 含む RPMI 1640培地にて培養したものを用いた。
結果を図 14に示す。この結果により、反応液中に 1Z500量の血液が含まれる場 合では、血液自体の色により全体に数値が底上げされた状態になった力 1/1000 量の血液および 1 X 104個の細胞が含まれる場合においては、血液および細胞の混 在がな 、場合の値と比較して、硫ィ匕ビスマス生成を指標とするホモシスティンおよび システィン分解酵素活性の検出に影響を与えないことがわ力つた。
[0038] 実施例 6：歯周ポケットの深さとビスマス反応の吸光度の相関性の検討
本検出系と歯周病の病態との関連を検討するため、歯肉溝浸出液を採取して、歯 周ポケットの深さとホモシスティンおよびシスティン分解酵素活性との関係を検討した 。ヒト歯肉溝浸出液の採取方法は以下の通りであった。まず、口腔内を 6画分に分け 、各画分の最も深いポケットをサンプル採取対象とした。次に、サンプル採取対象と なる歯周ポケットについて、周囲の唾液を除去した後、ペーパーポイントを挿入し 10 秒間静置後、 0. 5% TritonX— 100を含むビスマス反応液に入れ、ホモシスティン 分解酵素活性の検出にっ ヽては 45°Cで 60分、システィン分解酵素活性の検出に っ ヽては 37°Cで 60分反応させ、 405nmにおける吸光度を測定した。
[0039] 九州歯科大学附属病院外来患者 12名 69部位についての解析結果を図 15、 16に 示す。図 15はホモシスティン分解活性と歯周ポケットの深さについて、図 16はシステ イン分解活性と歯周ポケットの深さにっ 、ての解析結果である。 V、ずれの酵素活性 についてもポケット深さが深くなるほど、酵素活性が高いことが明らかになった。特に 、ホモシスティン分解活性について、その傾向が強いことが明らかになった。
産業上の利用可能性
[0040] 本発明によれば、歯科臨床現場で実用可能な口腔細菌の迅速検出系を提供し、 迅速、特異的、安価かつ簡便に口腔感染症関連細菌を検出することができる。 本出願は、日本で出願された特願 2005— 318312 (出願日： 2005年 11月 1日）を 基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲
[1] 検体中のホモシスティンおよび Zまたはシスティン分解酵素活性を測定することを特 徴とする、口腔細菌の検出方法。
[2] 前記口腔細菌が、歯周病原細菌、口臭原因物質産生細菌、根管内感染細菌または 根尖病巣細菌である、請求項 1記載の検出方法。
[3] 前記酵素活性の測定が硫ィ匕水素とビスマスとの反応により生じた呈色の測定である 請求項 1または 2に記載の検出方法。
[4] 口腔内から採取した試料中のホモシスティン分解酵素活性を測定することを特徴と する、歯周病原細菌の同定方法。
[5] 口腔内から採取した試料中のシスティン分解酵素活性を測定することを特徴とする、 歯髄炎、根尖性歯周炎または根管内感染の病原細菌の同定方法。
[6] 前記酵素活性の測定が硫ィ匕水素とビスマスとの反応により生じた呈色の測定である 請求項 4または 5に記載の同定方法。
[7] 口腔内から試料を採取する工程、
前記採取した試料を、ビスマスとホモシスティンまたはシスティンとを含む反応液に加 えて保温する工程、
前記保温工程後の反応液の呈色を測定する工程、ならびに
前記測定結果に基づいて、口腔内に存在する口腔細菌群を識別する工程 を含む、口腔細菌の検出方法。
[8] 前記口腔細菌群が高ホモシスティン分解活性群、中ホモシスティン分解活性群、高 システィン分解活性群および中システィン分解活性群力も構成されるものである、請 求項 7に記載の検出方法。
[9] 前記高ないし中ホモシスティン分解活性群力 ボルフイロモナス'ジンジバリス、フソ バタテリゥム 'ヌクレアタム、プレボテラ'インターメディア、トレポネマ'デンディコラおよ びタネレラ ·フォーサイシァである請求項 7に記載の検出方法。
[10] 前記高ないし中システィン分解活性群力 ストレプトコッカス'アンギノーサス、プレボ テラ .ニグレスセンスおよびェンテロコッカス ·フエカーリスである請求項 7に記載の検 出方法。
[11] 口臭、歯周病、歯髄炎または根管内感染の治療の指標として用いられる請求項 1〜 3、請求項 7〜10のいずれか 1つに記載の検出方法または請求項 4〜6のいずれか 1 つに記載の同定方法。
[12] 検体中のホモシスティンまたはシスティン分解酵素活性を測定することにより口腔細 菌を検出するための試薬であって、ビスマスとホモシスティンまたはシスティンを含む 試薬。
[13] さらに界面活性剤を含む請求項 12に記載の試薬。
[14] 口腔内から試料を採取するための採取手段と、請求項 12または 13に記載の試薬と を含む、口臭、歯周病、歯髄炎または根管内感染の診断用キット。
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