JP2010172325A - 口腔内細菌の検査用具、および口腔内細菌の検査方法 - Google Patents

Abstract

【課題】別途用意した色見本等と見比べる必要がなく、かつ判定者の主観に影響されることなく簡易に口腔内細菌の数を判定できる口腔内細菌の検査用具、および口腔内細菌の検査方法の実現。
【解決手段】板体１１と、板体１１に組み込まれた吸水性担体１２とからなる検査本体１０を備え、吸水性担体１２は、口腔内細菌に特有の酵素活性により発色する発色酵素基質と、口腔内細菌に特有の酵素とを保持し、板体１１は、口腔内細菌の数に応じて発色酵素基質が発色する所定の色に着色されていることを特徴とする口腔内細菌の検査用具１、および口腔内細菌の検査用具１の吸水性担体１２に、被験試料、発色酵素基質、および発色酵素基質を発色させる発色液を滴下し、発色酵素基質を発色させ、板体１１の色と比較して口腔内細菌の数を判定することを特徴とする口腔内細菌の検査方法。
【選択図】図１

Description

本発明は、被験者の口腔内細菌の数を簡易に判定できる口腔内細菌の検査用具、および口腔内細菌の検査方法に関する。

口腔内細菌は、歯周病、虫歯、口臭等の様々な疾患を引き起こすとされている。また、近年では、肺炎の原因としても問題となっている。
肺炎等の疾患の原因となる病原細菌は、口腔内に常在する細菌である。そこで、口腔ケアによって口腔内を清潔に保ち、肺に吸い込まれる口腔内細菌の数を減少させることが望まれている。

口腔内細菌の数は、培養法で確認するのが一般的である。すなわち、口腔内を滅菌綿棒等で拭い、これを培地中に拡散・希釈した後、これを接種して培養し、発育した菌集落の数を数える。
しかし、このような培養法は、多くの培地と日数を要し、操作が煩雑であり、さらに細菌の取り扱いが可能な特定の施設や技術が必要であった。

そこで、特定の施設や技術を必要としない細菌の分析方法として、例えば特許文献１には、口腔内微生物に特有の酵素活性に対する発色酵素基質を含ませた試験紙と、口腔内微生物を含む可能性のある試料とを直接接触させた後、発色液を滴下して、試験紙の発色度合いを肉眼で観察して口腔内微生物の数を判定する方法が開示されている。

特開２００５−７３６５０号公報

しかしながら、特許文献１に記載の方法は、発色度合いの強弱によって口腔内微生物の数を判定するものであるため、判定者の主観に影響を受けやすく、判定にバラツキが生じやすかった。
また、例えば肺炎は、口腔内細菌の数が１×１０^６個／ｍＬ以上であると発生率が高くなると言われているが、瞬時に口腔内細菌の数が１×１０^６個／ｍＬ以上であるか否かの判定をするのは困難であった。
判定を統一したり、瞬時に判定したりするためには、発色酵素基質の発色度合いと口腔内細菌の数との関係を示した色見本等を別途用意して見比べればよい。しかし、例えば被験者本人が判定をする場合などは、判定の際に色見本が手元になければならないため、各人が色見本を用意する必要があり実用的ではない。

本発明は上記事情を鑑みてなされたもので、別途用意した色見本等と見比べる必要がなく、かつ判定者の主観に影響されることなく簡易に口腔内細菌の数を判定できる口腔内細菌の検査用具、および口腔内細菌の検査方法の実現を目的とする。

本発明の口腔内細菌の検査用具は、板体と、該板体に組み込まれた吸水性担体とからなる検査本体を備えた口腔内細菌の検査用具であって、前記吸水性担体は、口腔内細菌に特有の酵素活性により発色する発色酵素基質と、口腔内細菌に特有の酵素とを保持し、前記板体は、口腔内細菌の数に応じて前記発色酵素基質が発色する所定の色に着色されていることを特徴とする。
ここで、前記検査本体の一方の面上に、透明基材が積層したことが好ましい。
また、前記検査本体の一方の面上に、粘着層と剥離紙が順次積層したことが好ましい。

さらに、前記発色酵素基質が、Ｌ−ロイシン−β−ナフチルアミド ハイドロクロライドおよび／またはＤＬ−アラニン−β−ナフチルアミド ハイドロクロライドであることが好ましい。
また、前記板体は、マクベス濃度計で測定されるマゼンタの濃度が０．３５〜０．４３となるように着色されていれば、肺炎の発生率が高くなると言われる口腔内細菌の数を判定できる。
さらに、前記吸水性担体は、前記発色酵素基質または該発色酵素基質を発色させる発色液を含んでいてもよい。

また、本発明の口腔内細菌の検査方法は、前記口腔内細菌の検査用具の吸水性担体に、被験試料、発色酵素基質、および該発色酵素基質を発色させる発色液を滴下し、発色酵素基質を発色させ、板体の色と比較して口腔内細菌の数を判定することを特徴とする。
また、本発明の口腔内細菌の検査方法は、前記口腔内細菌の検査用具の吸水性担体に、被験試料と、発色酵素基質および該発色酵素基質を発色させる発色液のうち前記吸水性担体に含まれていない方とを滴下し、発色酵素基質を発色させ、板体の色と比較して口腔内細菌の数を判定することを特徴とする。

本発明の口腔内細菌の検査用具、および口腔内細菌の検査方法によれば、別途用意した色見本等と見比べる必要がなく、かつ判定者の主観に影響されることなく簡易に口腔内細菌の数を判定できる。

本発明の口腔内細菌の検査用具の一例を示す斜視図である。 図１のＡ−Ａ’断面図である。 本発明の口腔内細菌の検査用具の他の例を示す断面図である。 本発明の口腔内細菌の検査用具の他の例を示す斜視図である。

以下、本発明について詳細に説明する。
［口腔内細菌の検査用具］
図１、２に本発明の口腔内細菌の検査用具（以下、単に「検査用具」という場合がある。）の一例を示す。この例の検査用具１は、板体１１と、該板体１１に組み込まれた吸水性担体１２とからなる検査本体１０を備えている。なお、図１は検査用具１の斜視図であり、図２は図１のＡ−Ａ’断面図である。また、図２〜４において、図１と同一の構成要素には同一の符号を付して、その説明を省略する。

吸水性担体１２は、口腔内細菌に特有の酵素活性により発色する発色酵素基質と、口腔内細菌に特有の酵素とを保持しうるものである。
吸水性担体１２は、吸水性を有し、後述する発色酵素基質および発色液を含むことが可能な担体である。このような担体としては、例えば紙、濾紙、吸水性ポリマー、セルロース、不織布、綿などが挙げられる。
吸水性担体１２の形状は図１に限定されない。また、吸水性担体１２の厚さは、後述する板体１１の厚さと同程度であればよい。

図１、２に示す板体１１は、略中心に貫通孔が設けられており、該貫通孔に吸水性担体１２が固定されるように嵌めこまれている。貫通孔の大きさや形状は特に制限されないが、円状の場合、円の直径は５〜２０ｍｍ程度が好ましい。
板体１１の材質としては、例えば発泡ポリスチレン、発泡ポリエチレン、発泡ポリプロピレン、発泡ウレタン樹脂、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ウレタン樹脂、ＡＢＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネートなどのプラスチック、紙、木材、金属などが挙げられる。
板体１１の厚さとしては特に制限されないが、０．５〜５．０ｍｍが好ましい。

板体１１は、口腔内細菌の数に応じて前記発色酵素基質が発色する所定の色に着色されている。
板体１１は、少なくともその表面が所定の色に着色されていればよいが、裏面も同色に着色されていることが望ましい。板体１１の両面が着色されていれば、検査用具１の両面から検査結果を目視できる。
なお、本発明において「所定の色」とは、例えば口腔内細菌が原因となる肺炎、歯周病、虫歯、口臭等の疾患の発生率が高くなるとされるときの口腔内細菌の数を基準値とし、該基準値に応じて発色酵素基質が発色する色（基準色）のことである。

発色酵素基質は、酵素の量（濃度）によって発色の度合いが異なる。通常、酵素の量が増えるほど強く、すなわち濃く発色する傾向にある。また、口腔内細菌の数は酵素の量に比例するので、発色酵素基質が強く発色するほど口腔内細菌の数は多い傾向にある。
従って、板体１１を所定の色に着色するに際しては、酵素濃度を変えて発色酵素基質を発色させたときの発色の度合い（色の濃度）と、酵素濃度（または口腔内細菌の数）との関係を求めておき、発色酵素基質の発色の度合いに見合った色合に着色すればよい。

例えば、肺炎の場合、上述したように口腔内細菌の数が１×１０^６個／ｍＬ以上であると発生率が高くなると言われている。従って、口腔内細菌の数が１×１０^６個／ｍＬに相当する酵素濃度のときに発色酵素基質が発色する色を基準色とし、該基準色に板体１１を着色する。具体的には、マクベス濃度計で測定されるマゼンタの濃度が０．３５〜０．４３となるように着色する。これにより、詳しくは後述するが、本発明の検査用具１を用いて口腔内細菌の数を検査したときに、発色酵素基質の発色の度合いが板体１１の色と比較して薄い場合は口腔内細菌の数が１×１０^６個／ｍＬ未満であり、発色の度合いが板体１１の色と同じ、または濃い場合は口腔内細菌の数が１×１０^６個／ｍＬ以上であることが分かるので、口腔内細菌の数が肺炎の発生率が高くなるとされる基準値以上であるか否かを瞬時に判定できる。

板体１１は、肺炎の場合のように基準色となる色を定め、該基準色に着色すればよいが、本発明はこれに限定されない。例えば各酵素濃度によって発色酵素基質が発色したときの各色に、１つの板体をグラデーションになるように着色してもよい。このように着色すれば、口腔内細菌の数をより詳細に判定できる。

板体１１の着色方法としては、特に制限されず、例えば板体１１を成形した後に、所定の色合になるように板体１１の表面や裏面に塗料を塗布して着色してもよいし、板体１１の原料中に、所定の色合になるように顔料等を添加して、板体１１を成形してもよい。

図１、２に示す検査用具１は、検査本体１０の一方の面上に透明基材２０が直接または接着層（図示略）を介して積層している。ただし、検査本体１０の一方の面上に透明基材２０が積層している場合は、板体１１の両面が所定の色に着色されているものとする。
透明基材２０の厚さとしては特に制限されないが、５０〜２００μｍが好ましい。
なお、本発明において「透明」とは、無着色で、かつ発色酵素基質が発色したときの発色の度合いを目視で確認できる状態を言う。

透明基材２０が検査本体１０上に直接積層している場合、透明基材２０の材質としては、例えばアクリル樹脂、ウレタン樹脂、エポキシ樹脂、ブチラール樹脂、繊維素系樹脂等の熱硬化性樹脂や、ウレタンアクリレート、エポキシアクリレート、ポリエステルアクリレート、ポリエーテルアクリレート等の光硬化性オリゴマーなどが挙げられる。
一方、透明基材２０が接着層を介して検査本体１０上に積層している場合、透明基材２０の材質としては、例えばガラス、プラスチックフィルム（例えばセロファン、ポリオレフィン、塩化ビニル樹脂等）などが挙げられる。また、接着層を構成する接着剤としては、透明なものであれば特に制限されないが、例えばエポキシ樹脂系、アクリル樹脂系、ウレタン樹脂系などの接着剤が挙げられる。接着層の厚さは５０〜２００μｍが好ましい。

口腔内細菌を検査する際には、滅菌綿棒等で口腔内を拭い、吸水性担体に被験試料（唾液等）を付着させる。吸水性担体にて被験試料中の細菌に特有の酵素と、発色酵素基質とを接触させ、さらに発色液により発色させて、その発色の度合いと板体１１の色とを比較する。
ところで、口腔内には食渣が残っている場合があるため、食渣が唾液等と共に採取され被験試料中に含まれることがある。食渣を含んだ被験試料を吸水性担体に付着させ、発色酵素基質と接触させて発色させると、食渣と接触した部分が強く発色しやすく、判定しにくくなることがある。

しかし、図１、２に示すように、検査本体１０の一方の面上に透明基材２０が積層していれば、被験試料に食渣が含まれていても透明基材２０側から目視することで均一に発色した状態を確認でき、より容易に判定できる。何故ならば、食渣は吸水性担体１２を浸透しにくいので、被験試料に食渣が含まれていても食渣は吸水性担体１２の表面に留まり、食渣以外の被験試料中の成分が吸水性担体１２に浸透していき、吸水性担体１２の裏面に達する。吸水性担体１２は発色酵素基質や発色液を含むこと、すなわち浸透させることが可能であるので、発色酵素基質や発色液も吸水性担体１２に浸透して裏面に達する。従って、発色酵素基質が吸水性担体１２の表面のみならず裏面でも発色している様子を確認できるが、特に裏面においては食渣が浸透していないので、均一に発色している様子を確認できる。検査本体１０の一方の面は、吸水性担体１２の裏面に相当するので、透明基材２０側から検査用具１を目視することで、発色酵素基質が均一に発色した状態を確認できる。
なお、検査本体１０の一方の面上に透明基材２０が積層していれば、板体１１の貫通孔に吸水性担体１２がより強固に固定される。

また、透明基材２０に代わって、例えば図３に示すように、検査本体１０の一方の面上に粘着層３０と剥離紙４０が順次積層していてもよい。ただし、検査本体１０の一方の面上に粘着層３０と剥離紙４０が順次積層している場合は、板体１１の両面が所定の色に着色されているものとする。
粘着層３０を構成する粘着剤としては、例えばアクリル系、ゴム系、ポリウレタン系、ポリエステル系、シリコーン系などの粘着剤が挙げられる。
粘着層３０の厚さとしては特に制限されないが、５０〜２００μｍが好ましい。

剥離紙４０としては、各種の紙（和紙、クラフト紙等）、織布、不織布、またはプラスチックフィルム（セロファン、ポリオレフィン、塩化ビニル樹脂等）などを用いることができる。なお、剥離紙４０は、粘着層３０に対する剥離力が、検査本体１０の粘着層３０に対する剥離力に比べて小さいものとする。
剥離紙４０の厚さとしては特に制限されないが、５０〜２００μｍが好ましい。
また、粘着層３０と剥離紙４０は、市販の両面テープで代用してもよい。

検査本体１０の一方の面上に粘着層３０と剥離紙４０が積層していれば、検査時において吸水性担体にて被験試料中の細菌に特有の酵素と、発色酵素基質とを接触させる際に、剥離紙４０を剥離して粘着層３０を露出させ、検査用具１を腕、手、胸、脇の下、足などの身体の一部に貼り付けて、３７℃前後の体温に温めることができる。その結果、酵素反応を促進させることができる。
なお、検査本体１０の一方の面上に粘着層３０が積層していれば、板体１１の貫通孔に吸水性担体１２がより強固に固定される。
さらに、透明な粘着剤や透明や剥離紙を用いれば、粘着層３０や剥離紙４０側から目視することで均一に発色した状態を確認できるので、被験試料に食渣が含まれていてもより容易に判定できる。

ここで、口腔内細菌および発色酵素基質について、具体的に説明する。
細菌はグラム鑑別により、グラム陰性菌とグラム陽性菌とに大別される。グラム陽性菌の中でも口腔内の常在菌として多く存在している細菌が、溶連菌である。
グラム陰性菌には、例えばバクテロイデス属（但し、バクテロイデス・ブルガタス及びバクテロイデス・フラジリスを除く）、プレボテータ属、ベイロネーラ属（但し、ベイロネーラ・パルブルを除く）、フソバクテリウム属、ナイセリア属、ブランハメーラ属、アシネトバクター属、キンゲラ属、モラキセラ属、ブルセラ属、ボルデテーラ属、アルカリゲネス属、シワネーラ属、シュードモナス属、アグロバクテリウム属、フラボバクテリウム属、アクチノバシルス属、パスツレラ属、アエロモナス属、カルディオバクテリウム属、プレシオモナス属、ビブリオ属、ヘモフィルス属、ガードネレーラ属、ブチアキセラ属、セデシア属、サイトロバクター属、エドワードジェラ属、エンテロバクター属、エルウィニア属、エッシエリヒア属、ハフニア属、クレブジェラ属、クルイベーラ属、モルガネーラ属、プロテウス属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、タツメーラ属、またはエルシニア属に属する各微生物が含まれる。
これらグラム陰性菌を分析する場合には、グラム陰性菌全般に特有の酵素として、例えばアラニンアミノペプチダーゼを利用することができる。

一方、溶連菌には、例えばストレプトコッカス・ピオジェネス、ストレプトコッカス・アガラクチィア、ストレプトコッカス・エクィ、ストレプトコッカス・ディスアガラクチィア、ストレプトコッカス・ズーピデミカス、ストレプトコッカス・エクイスイミリス、ストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・ポルシナス、ストレプトコッカス・ウベリス、ストレプトコッカス・スイス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・サンギス、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・モルビロラム、ストレプトコッカス・ボービス、ストレプトコッカス・エクィナス、ストレプトコッカス・ミュータンス、又はストレプトコッカス・サリバリウスが含まれる。
これら溶練菌を分析する場合には、溶連菌全般に特有の酵素として、例えばロイシンアミノペプチダーゼを利用することができる。

なお、グラム陽性菌を分析する場合には、グラム陽性菌全般に特有の酵素として、例えばホスファターゼを利用することができる。ホスファターゼは、多くのグラム陽性菌に存在し、グラム陰性菌の一部にも存在する酵素である。

発色酵素基質は、上述した酵素との反応前は発色せず、酵素活性により初めて発色する化合物である。なお、発色の際には発色液の存在が必要となる。このような発色酵素基質としては、特に限定されず、公知の発色物質をそのまま、あるいは発色物質を酵素基質に結合した合成酵素基質などを用いることができる。
発色物質としては、例えばｐ−ニトロフェノール、ｏ−ニトロフェノール、ｐ−ニトロアニリン、β−ナフチルアミン、またはこれらの誘導体などが挙げられる。

発色物質を結合させる酵素基質となる物質としては、例えばＬ−ロイシン、Ｌ−アラニンなどが挙げられる。
これらの酵素基質を発色物質と結合するには、公知の手段、例えば、共有結合（例えばペプチド結合、エステル結合、又はグリコシド結合等）により結合することができる。また、市販の合成酵素基質を用いることもできる。

このような発色酵素基質のうち、グラム陰性菌に特有の酵素（アラニンアミノペプチダーゼ）活性によって発色する発色酵素基質としては、例えばＬ−アラニンβ−ナフチルアミド、Ｌ−アラニンｐ−ニトロアニリド、Ｌ−アラニン−２−アミドアクリドン、Ｌ−アラニン ４−トリフルオロメチル−７−クマリンアミド アセテイト ソルト、ＤＬ−アラニン−β−ナフチルアミド ハイドロクロライドを用いることができる。

溶連菌に特有の酵素（ロイシンアミノペプチダーゼ）活性によって発色する発色酵素基質としては、例えばＬ−ロイシンβ−ナフチルアミド、Ｌ−ロイシンｐ−ニトロアニリド、Ｌ−ロイシン−２−アミドアクリドン、Ｌ−ロイシン −７−アミド−４−メチルクマリン ハイドロクロライド、Ｌ−ロイシン−β−ナフチルアミド ハイドロクロライドを用いることができる。

グラム陽性菌に特有の酵素（ホスファターゼ））活性によって発色する発色酵素基質としては、例えば４−メチルウンベリフェリル ホスフェ−ト、４−トリフルオロメチルウンベリフェリル−ホスフェート、７−（３−フェニルクマリニル）−ホスフェート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート、４−ニトロフェニル−ホスフェート、１−ナフチルホスフェート、ｐ−ニトロフェニル−ホスフェート、ピリジニウム−２−メトキシ−４−（２−ニトロビニル）−フェニルーホスフェートを用いることができる。

これら発色酵素基質は、１種単独で用いてもよく２種以上を併用してもよい。これら発色酵素基質の中でも、冷暗所（５℃程度）で１年放置しても変色しにくい点で、特にＬ−ロイシン−β−ナフチルアミド ハイドロクロライドおよび／またはＤＬ−アラニン−β−ナフチルアミド ハイドロクロライドが好ましい。

発色酵素基質を発色させる発色液としては、例えばｐ−ジメチルアミノシンナムアルデヒド、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン、１−ナフトール−２−スルホン酸塩などが挙げられる。

本発明の検査用具においては、吸水性担体に上述した発色酵素基質または発色液を含ませておいてもよい。
吸水性担体に発色酵素基質または発色液を含ませる方法としては、例えばこれらの物質を適当な溶媒に溶解させ、その溶液を吸水性担体に含ませる方法が挙げられる。この場合、発色酵素基質および発色液の性能に影響を与えない溶媒を用いる。具体的には、Ｎ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキシド、エタノール、メタノール、アセトン、ジエチルエーテル、ブタノール、リン酸緩衝液、トリス・マレイン酸塩緩衝液、精製水などを使用できる。
なお、吸水性担体に発色酵素基質と発色液の両方を含ませておくと、保存安定性が低下しやすくなり、発色酵素基質が発色することがある。

また、検査用具には、検査本体上に（ただし、検査本体の一方の面上に透明基材や粘着層等が積層している場合は、検査本体の他方の面上に）、剥離可能な保護フィルムが積層されていてもよい。保護フィルムが積層されていれば、検査本体に汚れ等が付着するのを防止できる。検査時には、保護フィルムを剥離して使用すればよい。また、保護フィルムに脱着機能を付与すれば、検査中や検査後において検査本体、特に吸水性担体に汚れ等が付着するのを防ぎつつ、保管できる。

本発明の検査用具は、上述したものに限定されない。例えば図４に示すように、吸水性担体１２が板体１１に隣接するように組み込まれていてもよい。

本発明の検査用具は、例えば以下のようにして製造できる。
例えば図１、２に示す検査用具１の場合、所望の形状になるように板体１１を成形し、所定の色合になるように板体１１の両面に塗料を塗布して着色する。ついで、板体１１の略中央に穿孔処理を施し、貫通孔を設ける。
別途、板体１１に設けた貫通孔の大きさに合わせた吸水性担体１２を用意し、板体１１の貫通孔に吸水性担体１２を固定するように嵌め込み、検査本体１０を作成する。
ついで、検査本体１０の一方の面上に、上述した透明な接着剤からなる接着層を介して透明基材２０を積層させ、検査用具１を得る。また、透明基材２０の材料として上述した熱硬化性樹脂や光硬化性オリゴマーを用い、検査本体１０の一方の面上にこれら樹脂を塗布し、加熱または光照射して樹脂を硬化させて透明基材２０を成形してもよい。

図３に示す検査用具１の場合、まず、上述した方法と同様にして検査本体１０を作成する。
ついで、検査本体１０の一方の面上に、粘着剤を塗布して粘着層３０を形成し、該粘着層３０上に剥離紙４０を積層させ、検査用具１を得る。また、剥離紙上に粘着剤を塗布して粘着層を形成したものを別途用意し、これと検査本体１０とを粘着層が内側になるように貼り合わせて検査用具１としてもよい。さらに、市販の両面テープを検査本体１０の一方の面上に貼り付けてもよい。ただし、この場合は両面テープの片面に剥離紙が付いているものとする。

図４に示す検査用具１の場合、所望の形状になるように板体１１を成形し、所定の色合になるように板体１１の両面に塗料を塗布して着色する。
ついで、板体１１に隣接するように、接着剤等を介して吸水性担体１２を貼り付けて、検査本体１０を作成する。
ついで、上述した方法と同様にして検査本体１０の一方の面上に、透明基材２０を積層させ、検査用具１を得る。

なお、吸水性担体に、発色酵素基質または発色液を含ませる場合は、例えば濃度が０．０１〜１０質量％になるように、適当な溶媒に発色酵素基質または発色液を溶解させた溶液中に吸水性担体を浸漬させて、吸水性担体に溶液を含ませる。ついで、自然乾燥、送風乾燥、減圧真空乾燥、凍結乾燥などにより乾燥させる。
吸水性担体に含ませる量は特に制限されないが、例えば濃度が０．０１〜１０質量％の溶液を用いる場合、吸水性担体１ｇに対して０．５〜３．０ｇの溶液が浸み込めば十分である。

以上説明したように本発明の検査用具は、吸水性担体と、口腔内細菌に特有の酵素活性により発色する発色酵素基質が発色したときの色に着色された板体とからなる検査本体を備えているので、検査時に色見本等を別途用意し、見比べることなく、かつ判定者の主観に影響されることなく簡易に口腔内細菌の数を判定できる。例えば、マゼンタの濃度が０．３５〜０．４３となるように着色された板体を用いれば、口腔内細菌の数が肺炎の発生率が高くなるとされる基準値以上であるか否かを瞬時に判定できる。

［口腔内細菌の検査方法］
以下、本発明の口腔内細菌の検査方法（以下、単に「検査方法」という場合がある。）について説明する。
本発明の検査方法は、上述した本発明の検査用具を用い、口腔内細菌の数を判定する方法である。具体的には、検査用具の吸水性担体（ただし、発色酵素基質または発色液は含まれていないものとする。）に、被験試料、発色酵素基質、および発色液を滴下し、発色酵素基質を発色させ、板体の色と比較して口腔内細菌の数を判定する。

被験試料としては、検査対象となる細菌を含む可能性のある試料であれば特に制限されないが、例えば口腔内由来の生体試料（唾液、歯垢等）や、口腔内の拭い液（咽頭、歯、歯間、歯茎、舌上、舌下、またはこれらの組み合わせの拭い液、口腔内全体の拭い液等）などが挙げられる。

被験試料は、例えば口腔内全体を滅菌綿棒等で４〜５周程度強く拭き取ることで採取できる。採取した被験試料は、検査用具の吸水性担体に直接塗布することで滴下してもよいし、被験試料を採取した滅菌綿棒等を、例えば滅菌リン酸緩衝液または滅菌生理食塩水０．５ｍＬ中に浸して口腔内の拭き取り物を洗い出し、この液をスポイト等で０．０２〜０．２ｍＬ採取して吸水性担体に滴下してもよい。
また、吸水性担体を直接舐めることで被験試料を採取してもよい。例えば図４に示すような検査用具１を用いれば、吸水性担体１２が板体１１に囲まれていないので口腔内に入れやすく、吸水性担体１２を舐めやすい。

発色酵素基質は、通常、濃度が０．０１〜１０質量％程度になるように、上述した適当な溶媒で希釈して用いる。吸水性担体に滴下する発色酵素基質の希釈液の滴下量は０．０２〜０．２ｍＬが好ましい。
発色酵素基質の滴下のタイミングは、被験試料を滴下する前でもよいし、被験試料を滴下した後でもよい。ただし、吸水性担体を直接舐めることで被験試料を採取する場合は、採取後に発色酵素基質を滴下する。

吸水性担体に被験試料および発色酵素基質を滴下した後は、５〜３０分放置して、酵素反応を進行させるのが好ましい。その際、３０〜４０℃に保たれた保温庫等に入れて放置すれば、酵素反応がより進行しやすくなる。また、例えば図３に示すような検査用具１を使用し、剥離紙４０を剥離して粘着層３０を露出させ、検査用具１を腕、手、胸、脇の下、足などの身体の一部に貼り付けて、体温にて温めてもよい。

発色液は、通常、濃度が０．０１〜１０質量％程度になるように、上述した適当な溶媒で希釈して用いる。吸水性担体に滴下する発色液の希釈液の滴下量は２０〜１００μＬが好ましい。
発色液の滴下のタイミングは特に制限されず、被験試料および発色酵素基質を滴下する前でもよいし、被験試料および発色酵素基質を滴下した後でもよい。また、被験試料と発色酵素基質の滴下の間に滴下してもよい。ただし、被験試料および発色酵素基質を滴下した後に発色液を滴下する場合は、被験試料および発色酵素基質を滴下した後５〜３０分放置して酵素反応を進行させてから、発色液を滴下するのが好ましい。

発色液を滴下すると、被験試料中の口腔内細菌に特有の酵素活性により発色酵素基質が発色するので、発色の度合いと板体の色とを比較して口腔内細菌の数を判定する。なお、発色液が揮発すると発色酵素基質の発色が弱まる恐れがあるので、発色後２〜１０分以内に判定するのが望ましい。
特に、図１、２に示す検査用具１を用いれば、透明基材２０側から目視することで均一に発色した状態を確認できるので、被験試料中に食渣が含まれていてもより容易に判定でいる。

また、例えばマゼンタの濃度が０．３５〜０．４３となるように着色された板体を備えた検査用具を用いて検査を行えば、口腔内細菌の数が肺炎の発生率が高くなるとされる基準値以上であるか否かを瞬時に判定できる。すなわち、発色酵素基質の発色の度合いが板体の色と比較して薄い場合は被験試料中の口腔内細菌の数が１×１０^６個／ｍＬ未満であり、発色の度合いが板体の色と同じ、または濃い場合は口腔内細菌の数が１×１０^６個／ｍＬ以上であることが瞬時に判定できる。

本発明の検査方法は上述したものに限定されず、例えば発色酵素基質または発色液を含ませた吸水性担体を備えた検査用具を用いる場合は、以下のようにして検査を行う。
すなわち、検査用具の吸水性担体に、被験試料と、発色酵素基質および発色液のうち吸水性担体に含まれていない方とを滴下し、発色酵素基質を発色させ、板体の色と比較して口腔内細菌の数を判定する。

具体的には、吸水性担体に発色酵素基質が含まれている場合、まず、滅菌綿棒等で採取した被験試料を吸水性担体に直接塗布したり、被験試料を採取した滅菌綿棒等を、滅菌リン酸緩衝液または滅菌生理食塩水に浸して口腔内の拭き取り物を洗い出し、この液を吸水性担体に滴下したりして、被験試料と発色酵素基質を接触させ、５〜３０分放置して酵素反応を促進させる。その際、３０〜４０℃に保たれた保温庫等に入れて放置するのが好ましい。
ついで、濃度が０．０１〜１０質量％程度になるように希釈した発色液を吸水性担体に滴下し、発色酵素基質を発色させて、発色の度合いと板体の色とを比較して口腔内細菌の数を判定する。なお、発色液は被験試料の滴下前に吸水性担体に滴下してもよい。

一方、吸水性担体に発色液が含まれている場合は、まず、上述した方法と同様にして被験試料を吸水性担体に直接塗布したり、口腔内の拭き取り物を洗い出した液を吸水性担体に滴下したりする。
ついで、濃度が０．０１〜１０質量％程度になるように希釈した発色酵素基質を吸水性担体に滴下し、被験試料と発色酵素基質を接触させ、５〜３０分放置して酵素反応を促進させる。酵素反応が進行するにつれて、発色酵素基質が発色してくるので、発色の度合いが変化しなくなった時点で板体の色と比較して口腔内細菌の数を判定する。なお、発色酵素基質は、被験試料の滴下前に吸水性担体に滴下してもよい。

以上説明したように本発明の検査方法は、上述した本発明の検査用具を用いるので、色見本等と見比べることなく、かつ判定者の主観に影響されることなく簡易に口腔内細菌の数を判定できる。例えば、マゼンタの濃度が０．３５〜０．４３となるように着色された板体を備えた検査用具を用いれば、口腔内細菌の数が肺炎の発生率が高くなるとされる基準値以上であるか否かを瞬時に判定できる。

１：口腔内細菌の検査用具、１０：検査本体、１１：板体、１２：吸水性担体、２０：透明基材、３０：粘着層、４０：剥離紙。

Claims (8)

1. 板体と、該板体に組み込まれた吸水性担体とからなる検査本体を備えた口腔内細菌の検査用具であって、
   前記吸水性担体は、口腔内細菌に特有の酵素活性により発色する発色酵素基質と、口腔内細菌に特有の酵素とを保持し、
   前記板体は、口腔内細菌の数に応じて前記発色酵素基質が発色する所定の色に着色されていることを特徴とする口腔内細菌の検査用具。
2. 前記検査本体の一方の面上に、透明基材が積層したことを特徴とする請求項１に記載の口腔内細菌の検査用具。
3. 前記検査本体の一方の面上に、粘着層と剥離紙が順次積層したことを特徴とする請求項１に記載の口腔内細菌の検査用具。
4. 前記発色酵素基質が、Ｌ−ロイシン−β−ナフチルアミド ハイドロクロライドおよび／またはＤＬ−アラニン−β−ナフチルアミド ハイドロクロライドであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の口腔内細菌の検査用具。
5. 前記板体は、マクベス濃度計で測定されるマゼンタの濃度が０．３５〜０．４３となるように着色されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の口腔内細菌の検査用具。
6. 前記吸水性担体は、前記発色酵素基質または該発色酵素基質を発色させる発色液を含んでいることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の口腔内細菌の検査用具。
7. 請求項１〜５のいずれかに記載の口腔内細菌の検査用具の吸水性担体に、被験試料、発色酵素基質、および該発色酵素基質を発色させる発色液を滴下し、発色酵素基質を発色させ、板体の色と比較して口腔内細菌の数を判定することを特徴とする口腔内細菌の検査方法。
8. 請求項６に記載の口腔内細菌の検査用具の吸水性担体に、被験試料と、発色酵素基質および該発色酵素基質を発色させる発色液のうち前記吸水性担体に含まれていない方とを滴下し、発色酵素基質を発色させ、板体の色と比較して口腔内細菌の数を判定することを特徴とする口腔内細菌の検査方法。

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