FR2934604A1

FR2934604A1 - Procede de depistage d'agents pathogenes

Info

Publication number: FR2934604A1
Application number: FR0955378A
Authority: FR
Inventors: Alistair John Brown; Stephen Dimmer
Original assignee: Oxoid Ltd
Current assignee: Oxoid Ltd
Priority date: 2008-08-01
Filing date: 2009-07-31
Publication date: 2010-02-05
Also published as: GB0912992D0; US20100028938A1; GB2462186A; DE102009026285A1; GB0814099D0

Abstract

L'invention concerne un procédé de dépistage de la présence du SARM chez un sujet, le procédé comprenant les étapes consistant à : (a) obtenir un échantillon approprié du sujet en utilisant un écouvillon ou un autre dispositif de prélèvement approprié ; (b) presque immédiatement après avoir réalisé l'étape (a), à mettre l'écouvillon ou autre dispositif de prélèvement en contact avec un milieu d'identification, ledit milieu comprenant : (i) des nutriments pour permettre la croissance du SARM ; (ii) au moins une substance inhibitrice pour inhiber de préférence la croissance d'organismes autres que le SARM ; et (iii) une substance indicatrice visuelle qui produit une indication visuelle de la croissance du SARM s'il est présent ; (c) à incuber le milieu d'identification, typiquement pendant qu'il est encore en contact avec l'écouvillon ou autre dispositif de prélèvement, dans des conditions suffisantes pour lancer la croissance du SARM ; et, après une période suffisante : (d) à inspecter le milieu pour déterminer la présence ou l'absence d'une identification visuelle de la croissance du SARM.

Description

Procédé de dépistage d'agents pathogènes 5 Domaine de l'invention L'invention concerne un procédé de dépistage d'agents pathogènes, en particulier un procédé rapide de dépistage de la présence de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM), ainsi que des milieux et des trousses d'utilisation dans de tels 10 procédés.

Contexte de l'invention Une infection nosocomiale ou iatrogénique par le SARM représente un problème bien connu et très répandu au Royaume-Uni et ailleurs. Dans un effort pour aider à 15 contrôler l'incidence des infections à SARM au Royaume-Uni, on prévoit dépister chaque patient qui entre à l'hôpital afin d'identifier les personnes qui peuvent être des porteurs asymptomatiques. On évalue qu'entre 10 et 20 % de la population générale au Royaume-Uni peut être porteur du SARM.

20 Actuellement, des procédés traditionnels de dépistage supposent la prise d'un écouvillon (comme un écouvillon nasal) d'une personne au point d'intervention. On place ensuite l'écouvillon dans un récipient stérile et on l'envoie au laboratoire de microbiologie de l'hôpital, où il est déballé et utilisé pour inoculer une plaque de dépistage. La plaque contient un milieu solide qui comprend des ingrédients pour 25 stimuler la croissance de toute bactérie du SARM présente, mais elle contient également une certaine sorte de marqueur qui donne une indication visible si un SARM est présent.

Un des meilleurs milieux de dépistage actuellement offert est celui vendu sous le 30 nom commercial milieu de SARM Brilliance , disponible auprès d'Oxoid Limited. Il s'agit d'un milieu opaque qui incorpore un colorant chromogène qui donne une couleur bleue à la suite d'une activité de la phosphatase. L'enzyme phosphatase est présente dans de nombreuses staphylococcies, y compris S. aureus. Par conséquent, pour permettre au milieu de différencier le SARM d'autres staphylococcies, le milieu comprend également une combinaison de composés antibactériens choisis pour inhiber la croissance d'une grande variété d'organismes concurrents probables, y compris le Staph. aereus sensible à la méthicilline (SASM). Également incorporés dans le milieu, nous retrouvons des composés pour supprimer l'expression de l'activité de la phosphatase dans d'autres staphylococcies, offrant ainsi un niveau élevé de sensibilité et de spécificité. Le SARM, si présent, se différencie par sa couleur bleu clair distinctive sur le milieu.

Bien que le procédé et le milieu actuels soient satisfaisants, il reste nécessaire de transférer l'échantillon de l'écouvillon de prélèvement à un milieu de croissance et d'incuber les plaques à 37 °C pendant au moins 18 heures après l'inoculation avec les écouvillons. L'étape de transfert consomme le temps d'un technicien de laboratoire, plus particulièrement si le dépistage doit être mis en oeuvre sur une grande échelle, et elle augmente le risque de contamination ou d'un autre incident.

Rambach et al. (US2006/003503) décrivent un procédé de détection de microorganismes résistants à la méthicilline en utilisant un milieu solide qui comprend une céphalosporine et un agent chromogène qui libère un chromophore après une hydrolyse par une enzyme qui est produite par les microorganismes à détecter. Rambach et al. ne décrivent pas l'utilisation d'un milieu liquide ou semisolide ni l'utilisation d'un milieu approprié au point d'intervention.

Étant donné le très grand nombre d'individus que l'on prévoit maintenant devoir dépister, le laboratoire d'hôpital moyen devra utiliser plusieurs milliers de plaques par année et, en tout temps, il y aura vraisemblablement plusieurs centaines de plaques nécessitant une incubation ou une vérification, ce qui occupera un grand volume dans les incubateurs ou sur les bureaux.

Par conséquent, il existe un besoin urgent d'un procédé de dépistage pour le SARM qui élimine le transfert d'échantillons, très exigeant en main-d'oeuvre, de l'écouvillon de prélèvement au milieu de croissance (avec les risques associés à un tel transfert), qui est rentable même s'il est réalisé à grande échelle, et qui utilise moins d'espace.

Résumé de l'invention

Ainsi, l'invention propose également un procédé de dépistage de la présence du 5 SARM chez un sujet, le procédé comprenant les étapes consistant à : (a) obtenir un échantillon approprié du sujet en utilisant un écouvillon ou un autre dispositif de prélèvement approprié ; (b) presque immédiatement après avoir réalisé l'étape (a), mettre l'écouvillon ou autre dispositif de prélèvement en contact avec un milieu d'identification, 10 ledit milieu comprenant : (i) des nutriments pour permettre la croissance du SARM ; (ii) au moins une substance inhibitrice pour inhiber de préférence la croissance d'organismes autres que le SARM ; et (iii) une substance indicatrice visuelle qui produit une indication visuelle 15 de la croissance du SARM s'il est présent ; (c) incuber le milieu d'identification, typiquement pendant qu'il est encore en contact avec l'écouvillon ou autre dispositif de prélèvement, dans des conditions suffisantes pour causer la croissance du SARM ; et, après une période suffisante : 20 (d) inspecter le milieu pour déterminer la présence ou l'absence d'une indication visuelle de la croissance du SARM ; dans lequel à la fois les étapes (a) et (b) ont lieu au point d'intervention (par ex., typiquement en présence du sujet).

L'étape (b) a lieu essentiellement immédiatement après l'étape (a). C'est-à-dire, en 25 pratique, il est souhaitable que les deux étapes (a) et (b) aient lieu au point d'intervention, le travailleur de la santé effectuant un prélèvement avec un écouvillon sur le sujet et mettant ensuite pratiquement immédiatement l'écouvillon ou un autre dispositif de prélèvement en contact avec le milieu d'identification. Dans ce contexte, l'expression Pratiquement immédiatement signifie que, après 30 l'obtention d'un échantillon du sujet, l'écouvillon ou un autre dispositif de prélèvement est mis en contact avec le milieu d'identification typiquement en moins 3 de trois minutes, de préférence en moins de deux minutes et idéalement en moins d'une minute.

Ainsi, l'invention propose également un procédé de dépistage de la présence du 5 SARM chez un sujet, le procédé comprenant les étapes consistant à : (a) obtenir un échantillon approprié du sujet en utilisant un écouvillon ou un autre dispositif de prélèvement approprié ; (b) mettre l'écouvillon ou autre dispositif de prélèvement en contact avec un milieu d'identification, ledit milieu comprenant : 10 (i) des nutriments pour permettre la croissance du SARM ; (ii) au moins une substance inhibitrice pour inhiber de préférence la croissance d'organismes autres que le SARM ; et (iii) une substance indicatrice visuelle qui produit une indication visuelle de la croissance du SARM s'il est présent ; 15 (c) incuber le milieu d'identification, typiquement pendant qu'il est encore en contact avec l'écouvillon ou autre dispositif de prélèvement, dans des conditions suffisantes pour causer la croissance du SARM ; et, après une période suffisante : (d) inspecter le milieu pour déterminer la présence ou l'absence d'une indication 20 visuelle de la croissance du SARM ; dans lequel à la fois les étapes (a) et (b) ont lieu au point d'intervention (par ex., typiquement en présence du sujet).

La combinaison échantillon sur écouvillon/milieu sera ensuite typiquement transmise à un laboratoire de microbiologie où l'étape (c) d'incubation et l'étape (d) 25 d'inspection auront normalement lieu.

Il est préféré que, une fois l'écouvillon mis en contact avec le milieu (étape b), l'écouvillon soit maintenu en contact avec le milieu pendant au moins une partie de, et de préférence pendant toute, l'étape (c), bien que, si cela est souhaité pour 30 certaines raisons, l'écouvillon ou autre dispositif de prélèvement peut être retiré du contact avec le milieu après qu'une période appropriée se soit écoulée. En outre, une fois l'étape (b) réalisée, il est préféré que le milieu soit maintenu à une température située dans la plage de 16 à 40 °C, de préférence de 16 à 38 °C, dès que réalisable après avoir mis l'écouvillon en contact avec le milieu, et que l'étape (c) soit suivie dès que réalisable après avoir réalisé l'étape (b).

Dans un deuxième aspect, l'invention fournit une trousse pour utilisation dans les procédés du premier aspect, la trousse comprenant : un emballage stérile comprenant un écouvillon ou autre dispositif de prélèvement, et un milieu d'identification tel que défini dans le premier aspect ci-dessus.

L'écouvillon d'utilisation dans les divers aspects de l'invention peut être une conception essentiellement traditionnelle, et il est facilement disponible auprès de nombreuses sources. L'écouvillon peut être, par exemple, recouvert de coton, de rayonne, de nylon, de DacronTM ou floqué.

De manière avantageuse, l'écouvillon est fourni sous forme de composant complet, mais amovible, d'un récipient utilisé pour contenir le milieu d'identification. Lors de l'utilisation, le composant d'écouvillon est retiré du récipient, mis en contact avec la partie pertinente du sujet à écouvillonner, et est ensuite réintroduit dans le récipient d'une telle manière que l'écouvillon entre en contact avec le milieu qui s'y trouve.

Le récipient comprendra typiquement un tube, avec un volume situé dans la plage de 3 à 30 ml, de préférence de 5 à 25 ml, plus préférablement de 10 à 25 ml, lequel peut être logé dans un râtelier de laboratoire traditionnel pour tubes à essai.

Le milieu d'identification d'utilisation dans l'invention comprendra des nutriments suffisants pour la croissance de S. aureus, comme des peptones, de l'extrait de levure, divers sels et minéraux, et une source d'hydrates de carbone, comme du glucose, de la dextrine ou de l'amidon. Le milieu est de préférence liquide, ou semisolide, mais peut être solidifié. Aux fins actuelles, un milieu semi-solide en est un qui est quasi-solide (c.-à-d., qu'il peut supporter son propre poids et garder sa forme, mais qu'il a la capacité de s'écouler sous pression, et il prendra la forme d'une surface laquelle applique une pression sur celui-ci). Un milieu quasi solide peut être obtenu, par exemple, en utilisant une concentration d'un agent gélifiant (par ex., gélose, agarose, SephadexTM ou gélatine) inférieure à celle utilisée traditionnellement pour préparer un milieu solide. Comme illustration, une concentration d'agar-agar dans la plage de 1 à 8 g par litre, de préférence de 2 à 7 g par litre, idéalement de 3 à 6 g par litre, peut être utilisée pour obtenir un milieu quasi solide. Des milieux liquides et quasi solides sont préférés puisque, notamment, ils permettent un plus grand contact du milieu avec l'écouvillon que ne le fait un milieu solide.

10 Le milieu comprendra en outre au moins une substance inhibitrice pour inhiber la croissance d'organismes concurrents (c.-à-d., les organismes autres que le SARM). En pratique, le milieu comprendra probablement une pluralité de substances inhibitrices. Une telle pluralité de substances inhibitrices sera normalement requise en raison de la variété des organismes concurrents qui peuvent être présents dans 15 l'échantillon, lesquels peuvent comprendre, par exemple, des staphylocoques à coagulase négative (CoNS), des organismes Gram-négatifs, Enterococcus spp. et des levures. Par conséquent, le milieu comprendra typiquement un ou plusieurs, de préférence deux ou plus, idéalement trois ou plus, des inhibiteurs suivants : la polymyxine B, le sulfate de colistine, l'aztréonam, le chlorure de lithium, le mésylate 20 de déféroxamine et l'amphotéricine B, le fluconazole ou autre composé antifongique.

En outre, en raison du besoin d'inhiber, en particulier, la croissance de SASM, le milieu comprendra de préférence un ou plusieurs des inhibiteurs suivants : la méthicilline, l'oxacilline, une céphalosporine ou une céphamycine.

Les substances inhibitrices sont sélectionnées et sont présentes en une concentration telle qu'elles inhibent de préférence des organismes concurrents. C'est-à-dire qu'elles inhibent la croissance d'organismes concurrents à une échelle encore plus grande qu'elles inhibent la croissance de SARM.

En outre, le milieu d'identification comprendra au moins une substance indicatrice visuelle, qui produit, directement ou indirectement, un signal indicateur visuel de la 25 30 croissance de SARM. Typiquement, mais pas nécessairement, le signal visuel prendra la forme d'un changement de couleur. Ce pourrait être, par exemple, un changement d'une couleur à une couleur différente, un changement d'incolore à une couleur, ou vice versa. Dans un mode de réalisation, la substance indicatrice peut comprendre un indicateur d'un changement de pH ou de redox, de tels changements se produisant à la suite de la fermentation ou de l'altération d'un substrat dans le milieu, en raison de l'action d'une ou de plusieurs enzymes élaborées par le SARM. Des exemples de tels indicateurs comprennent, entre autres, du rouge de phénol, du rouge neutre ou du bleu d'aniline.

Toutefois, dans un mode de réalisation préféré, la substance indicatrice comprend un composé chromogène ou fluorogène. De préférence, la substance indicatrice est modifiée par l'action d'une phosphatase et/ou d'une ribosidase produite par le SARM. Des chromogènes préférés sont modifiés par l'action de la SARM phosphatase pour produire un produit coloré. Des chromogènes particulièrement préférés pour inclusion dans le milieu comprennent des phosphates d'indoxyle. Des fluorogènes préférés comprennent des fluorogènes de phosphate d'umbelliféryle, comme du phosphate de 4-méthylumbelliféryle.

Dans certains modes de réalisation, le milieu peut comprendre un indicateur de pH tel que la substance indicatrice visuelle , ou peut comprendre une substance indicatrice visuelle fluorogène, mais pas à la fois un indicateur de pH et un fluorogène, car l'utilisation de deux indicateurs n'augmente pas considérablement la facilité ou la sensibilité de la détection, mais plutôt ajoute aux coûts et à la complexité de préparation du milieu.

Finalement, le milieu peut comprendre un agent gélifiant tel qu'une gélose, du SephadexTM, de l'agarose ou de la gélatine, afin d'obtenir un milieu semi-solide, assurant ainsi que l'écouvillon ou autre dispositif de prélèvement reste en contact avec le milieu.

L'homme du métier pourra, avec l'avantage de la présente divulgation, déterminer les concentrations appropriées pour les divers ingrédients du milieu, et les formulations d'un échantillon sont données dans les exemples ci-dessous.

Le procédé de l'invention comporte l'obtention d'un échantillon approprié du sujet. Ceci entraîne généralement un prélèvement des narines et/ou des mains du sujet, lesquelles sont les sites les plus communément colonisés par le SARM, bien que d'autres parties de la peau du sujet puissent également ou en variante être prélevées. Le prélèvement est typiquement non invasif, c'est-à-dire typiquement à partir de la surface corporelle ou de fluides corporels, sans moyens ou intervention chirurgicaux.

Le procédé est réalisé de façon pratique en utilisant une trousse conforme au deuxième aspect de l'invention. Dans un mode de réalisation, la trousse est offerte sous forme d'emballage stérile, avec un emballage étanche tel qu'une feuille métallisée ou une pellicule ou un sac en plastique synthétique, dans lequel se trouve un tube en vitre ou en plastique synthétique, une bouteille ou un autre récipient logeant une aliquote du milieu de croissance/d'identification, scellé par un moyen de scellement amovible, comme un bouchon à vis ou autre dispositif. La trousse comprendra également une étiquette pour contenir des renseignements pertinents, comme le nom du sujet, la date du prélèvement, le site du prélèvement sur le sujet, et ainsi de suite. L'étiquette peut être fournie séparément ou être déjà fixée au tube, à la bouteille ou au récipient logeant le milieu. De préférence, une étiquette autocollante est utilisée.

L'emballage comprendra également un ou plusieurs écouvillons tels qu'un écouvillon en bois ou en plastique, un écouvillon à poignée, ou autre dispositif de prélèvement approprié. Ceux-ci seront stériles (par ex., irradiés par UV) et peuvent être emballés séparément du récipient qui contient le milieu. Dans un mode de réalisation alternatif, un écouvillon est fourni comme une partie intégrante du récipient. Par exemple, le récipient peut prendre la forme d'un tube avec un bouchon à vis. On trouve un écouvillon complètement formé qui se projette vers le haut à partir du bouchon. Pour obtenir un échantillon, le bouchon est dévissé du tube et l'écouvillon est mis en contact avec le sujet. On replace ensuite le bouchon dans le tube dans une orientation inverse, l'écouvillon se projetant vers le bas dans le milieu. Si souhaité, le bouchon peut être fourni avec une partie à capuchon vissé dans un sens opposé, afin d'aider à replacer le bouchon sur le tube avec une orientation inverse. En variante, lorsqu'inséré dans le récipient avec une orientation inverse, le bouchon peut former une fermeture étanche au moyen d'un effet de bouchon ou d'obstruction.

Une fois en contact avec le milieu, l'écouvillon peut en principe être retiré après agitation. Toutefois, il est préférable de maintenir l'écouvillon en contact avec le milieu pendant l'étape d'incubation pour s'assurer qu'au moins une partie des bactéries des bactéries de SARM présentes soit transférée au milieu.

Les conditions d'incubation seront évidentes à l'homme du métier et comprendront normalement une incubation à une température supérieure à la température ambiante, de préférence dans la plage de 30 à 40 °C, et idéalement à environ 37 °C. La durée requise pour produire un signal visuel indicatif de la présence de SARM variera selon les conditions précises de l'analyse, de la composition du milieu et de l'état physiologique des organismes au moment de l'échantillonnage (par ex., s'ils sont physiologiquement tendus ou non et à quel point). Typiquement, une incubation d'environ 18 à 24 heures est appropriée, mais dans certaines conditions, les inventeurs croient qu'il peut être possible d'obtenir un résultat présomptif après aussi peu que six heures d'incubation à l'étape (c).

Le milieu sera directement inspecté de façon pratique par un observateur humain, mais, si souhaité, un système automatisé peut être utilisé, le milieu étant interrogé par une machine telle qu'un spectrophotomètre ou un autre dispositif sensible à la couleur ou à la fluorescence.

Le procédé de l'invention offre quatre avantages principaux par rapport aux procédés de l'art antérieur traditionnel.

En premier lieu, dans l'art antérieur, un échantillon sur écouvillon est prélevé d'un patient et est ensuite transféré au laboratoire de l'hôpital soit dans un récipient stérile sans milieu ou dans un milieu de transfert stérile (comme une solution saline) qui ne favorise pas la croissance du SARM. Une fois l'écouvillon rendu au laboratoire, aucune action immédiate ne peut être prise : L'écouvillon peut être maintenu sur un comptoir et être groupé jusqu'à ce qu'un nombre suffisant ait été reçu pour justifier le temps d'un technicien pour l'utilisation des écouvillons pour inoculer des plaques.

Par contre, avec le procédé de l'invention, l'écouvillon est immédiatement placé en contact avec un milieu qui favorise et stimule la croissance du SARM, tout en inhibant simultanément de préférence la croissance d'organismes concurrents. Ceci donne aux organismes du SARM un avantage dès le départ par rapport au procédé de l'art antérieur, de sorte que des résultats peuvent être obtenus plus rapidement après qu'un prélèvement sur écouvillon du sujet a eu lieu.

En deuxième lieu, aucune manipulation des échantillons n'est nécessaire lorsqu'ils sont reçus dans le laboratoire et, par conséquent, le délai sera probablement moindre avant le traitement. Au lieu de cela, un technicien doit simplement placer le tube ou le récipient de l'échantillon dans un incubateur. Réduire le nombre de manipulations des échantillons réduit également le risque de contamination.

Troisièmement, les tubes ou récipients utilisés dans la présente invention occupent beaucoup moins de volume que les plaques traditionnelles, économisant ainsi de l'espace de comptoir et de l'espace dans l'incubateur, ce qui est très important lorsque de grands nombres d'échantillons sont en cause. Des boîtes de pétri, utilisées pour préparer des plaques de milieu de culture solide, mesurent normalement de 90 à 150 mm de diamètre, alors que les tubes ou récipients pour utilisation dans le présent procédé mesurent typiquement seulement de 10 à 20 mm de diamètre.

Quatrièmement, le procédé de la présente invention doit procurer une sensibilité supérieure à celle des procédés traditionnels. Lorsqu'un écouvillon est prélevé et envoyé au laboratoire en isolation (c.-à-d., sans contact avec un milieu liquide ou semi-solide), les organismes présents sur l'écouvillon se trouveront dans des conditions sous-optimales. Certains peuvent mourir et, même si les organismes ne meurent pas, ils deviendront physiologiquement tendus, ce qui peut signifier qu'ils sont dominés par des organismes concurrents plus résistants lorsque l'écouvillon est utilisé pour inoculer un milieu de croissance solide, menant à un faux résultat négatif.

Même si l'écouvillon est inséré dans un milieu de transport traditionnel (comme un milieu Amies), les conditions resteront encore sous-optimales. À titre d'explication, les milieux de transport visent à maintenir les microorganismes dans un état de stase relative, de sorte qu'un certain nombre de cellules viables récupérées par la suite reflète celles contenues dans l'échantillon au moment du prélèvement. Ceci signifie que tout délai entre le prélèvement et l'inoculation d'un milieu de croissance n'entraîne pas une augmentation du nombre d'organismes cibles. La sensibilité du milieu de croissance final dépend du nombre de cellules viables restant dans l'écouvillon de transport au point d'inoculation.

Par contre, le procédé de l'invention assure que le nombre de microorganismes dans le prélèvement commence à augmenter dès qu'il est placé dans le milieu de transport du SARM différentiel, à condition que le milieu reste à une température entre 16 et 40 °C, de préférence de 16 à 38 °C. Alors que les organismes cibles reçoivent les nutriments appropriés, le nombre de cellules viables augmentera probablement. De façon similaire, les organismes non ciblés seront inhibés dès que le prélèvement sera placé dans le milieu de transport du SARM, réduisant la probabilité d'une prolifération de la flore secondaire et entrainant l'inhibition compétitive du SARM. Ceci augmente la sensibilité du procédé.

Finalement, le procédé de l'invention permet d'économiser le travail. Les pratiques actuelles dans les laboratoires de microbiologie comportent l'inoculation d'un écouvillon de dépistage (normalement un écouvillon nasal prélevé sur un patient et contenu dans un milieu de transport) sur un milieu de croissance solide ou liquide. Le milieu de croissance est ensuite incubé pour stimuler la croissance du SARM. Cette pratique est réalisée par le personnel de laboratoire. Tous les jours, de nombreux écouvillons sont reçus par des laboratoires pour des dépistages du SARM, rendant la procédure très exigeante en main-d'oeuvre et en temps.

Dans un troisième aspect, l'invention propose un milieu d'identification approprié 5 pour le dépistage des échantillons d'un sujet pour la présence du SARM, le milieu étant liquide ou semi-solide et comprenant : (i) des nutriments pour permettre la croissance du SARM ; (ii) au moins une substance inhibitrice pour inhiber de préférence la croissance d'organismes autres que le SARM ; et 10 (iii) une substance indicatrice visuelle qui produit une indication visuelle de la croissance du SARM s'il est présent.

Le milieu est de préférence initialement incolore et translucide et devient coloré si des microorganismes du SARM croissent pendant l'incubation du milieu. D'autres 15 caractéristiques préférées du milieu sont citées ci-dessus dans le contexte des premier et deuxième aspects de l'invention.

L'invention sera maintenant davantage décrite au moyen d'un exemple illustratif et avec référence au dessin joint, la figure 1, qui est un schéma de traitement qui 20 compare le procédé de l'art antérieur au procédé de l'invention.

Exemple 1 û Une formulation de milieu liquide (bouillon) approprié pour utilisation dans les divers aspects de l'invention.

25 Le milieu liquide contiendra ce qui suit :

une base de bouillon nutritif, comme un bouillon de tryptone soja, un bouillon de nutriments ;

30 au moins une substance pour inhiber la croissance des microorganismes autres que le SARM, comme la méthicilline, l'oxacilline, diverses céphalosporines ou céphamycines ; au moins une substance pour inhiber la croissance d'organismes autres que Staphylococcus aureus. De telles substances comprennent la polymyxine B, le sulfate de colistine, l'aztréoname, le chlorure de lithium, le mésylate de déféroxamine et l'amphotéricine B, le fluconazole, l'anisomycine ou autres composés antifongiques ; et

au moins un composé indicateur pour différencier la croissance du SARM des autres organismes. Ceci peut être un indicateur changement de pH ou de redox découlant de la fermentation d'un hydrate de carbone contenu dans ledit milieu. De tels indicateurs peuvent comprendre du rouge de phénol, du rouge neutre, du pourpre de bromocrésol, du bleu de bromothymol ou du bleu d'aniline.

Dans un autre exemple, l'indicateur peut être substitué par au moins un composé chromogène pour détecter une activité enzymatique spécifique à Staphylococcus aureus. Des exemples de ceci sont les phosphates d'indoxyle, des chromogènes qui détectent l'activité de la phosphatase.

Dans une autre formulation, l'indicateur peut être substitué par au moins un composé fluorogène pour détecter une activité enzymatique spécifique à Staphylococcus aureus. Un exemple de ceci est le phosphate de 4-méthylumbelliféryle, un fluorogéne qui détecte l'activité de la phosphatase.

Une formulation d'un échantillon est : Composition typique Peptone Extrait de boeuf Mannitol Chlorure de sodium Rouge de phénol Oxacilline Polymixine B par litre de milieu : 10 à 15 g 1à5g 5 à 15 g 50 à 75 g 20 à 30 mg 4 à 6 mg 10 à 15 mg Aztréoname 10 à 25 mg

Exemple 2 ù Une formulation de milieu semi-solide appropriée pour utilisation dans les divers aspects de l'invention. Le milieu semi-solide contiendra ce qui suit :

une base de bouillon nutritif, comme un bouillon de tryptone soja ou un bouillon de nutriments, contenant au moins un agent gélifiant. De tels agents gélifiants peuvent 10 comprendre de la gélose, de l'agarose, du SephadexTM ou de la gélatine. Une plage de concentrations serait nécessaire pour procurer une force de gel qui empêche le déversement du milieu à partir du tube ou de la bouteille de culture et qui permet un contact optimal du milieu avec l'écouvillon. Un exemple est une concentration d'une gélose située entre 1 et 8 g par litre ; 15 au moins une substance pour inhiber la croissance des microorganismes autres que le SARM, comme la méthicilline, l'oxacilline, diverses céphalosporines ou céphamycines ;

20 au moins une substance pour inhiber la croissance d'organismes autres que Staphylococcus aureus. De telles substances comprennent la polymyxine B, le sulfate de colistine, l'aztréoname, le chlorure de lithium, le mésylate de déféroxamine et l'amphotéricine B, le fluconazole, l'anisomycine ou autres composés antifongiques ; et 25 au moins un composé indicateur pour différencier la croissance du SARM des autres organismes. Ceci peut être un indicateur changement de pH ou de redox découlant de la fermentation d'un hydrate de carbone contenu dans ledit milieu. De tels indicateurs peuvent comprendre du rouge de phénol, du rouge neutre, du pourpre de 30 bromocrésol, du bleu de bromothymol ou du bleu d'aniline.

Une formulation d'un échantillon est : 14 15 par litre de milieu : Peptone 10 à 15 g Extrait de boeuf 1à5g Mannitol 5 à 15 g Chlorure de sodium 50 à 75 g Gélose 2à8g Rouge de phénol 20 à 30 mg Oxacilline 4 à 6 mg Polymixine B 10 à 15 mg Aztréoname 10 à 25 mg Dans un autre exemple, l'indicateur peut être substitué par au moins un composé chromogène pour détecter une activité enzymatique spécifique à Staphylococcus aureus. Des exemples de ceci sont les phosphates d'indoxyle, des chromogènes qui 15 détectent l'activité de la phosphatase.

Dans un autre exemple, l'indicateur peut être substitué par au moins un composé fluorogène pour détecter une activité enzymatique spécifique à Staphylococcus aureus. Un exemple de ceci est le phosphate de 4-méthylumbelliféryle, un 20 fluorogène qui détecte l'activité de la phosphatase.

Exemple 3

Comme le montrent les schémas de traitement de la figure 1, le procédé de 25 l'invention (ligne du temps sur le côté droit) offre un procédé plus rationalisé que le procédé de l'art antérieur (ligne du temps sur le côté gauche) et, en pratique, donne un résultat présomptif plusieurs heures avant la technique de l'art antérieur traditionnel.

Claims

Revendications1. Procédé de dépistage de la présence du SARM chez un sujet, le procédé comprenant les étapes consistant à : (a) obtenir un échantillon approprié du sujet en utilisant un écouvillon ou un autre dispositif de prélèvement approprié ; (b) presque immédiatement après avoir réalisé l'étape (a), mettre l'écouvillon ou autre dispositif de prélèvement en contact avec un milieu d'identification, ledit milieu comprenant : (i) des nutriments pour permettre la croissance du SARM ; (ii) au moins une substance inhibitrice pour inhiber de préférence la croissance d'organismes autres que le SARM ; et (iii) une substance indicatrice visuelle qui produit une indication visuelle de la croissance du SARM s'il est présent ; (c) incuber le milieu d'identification, typiquement pendant qu'il est encore en contact avec l'écouvillon ou autre dispositif de prélèvement, dans des conditions suffisantes pour causer la croissance du SARM ; et, après une période suffisante ; (d) inspecter le milieu pour déterminer la présence ou l'absence d'une identification visuelle de la croissance du SARM.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le milieu d'identification est un liquide ou un semi-solide.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel les étapes (a) et (b) sont réalisées au point d'intervention, en présence du sujet.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le milieu comprend une source d'hydrates de carbone utilisable comme source d'énergie par le SARM, ainsi qu'une ou plusieurs des sourcessuivantes de nutriments : des peptones, un extrait de levure, des sels et des minéraux.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le milieu comprend deux des substances suivantes ou plus en une concentration suffisante pour inhiber de préférence la croissance d'organismes concurrents : la polymyxine B ; le sulfate de colistine ; l' aztréonam ; le chlorure de lithium ; le mésylate de déféroxamine ; et l'amphotéricine B, le fluconazole ou autre composé antifongique.
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel le milieu comprend trois des substances inhibitrices nommées dans la revendication 5 ou plus, en une concentration suffisante pour inhiber de préférence la croissance d'organismes concurrents.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le milieu comprend, en une concentration suffisante pour inhiber de préférence la croissance du SASM ou autres organismes concurrents si présents, un ou plusieurs parmi : la méthicilline, l'oxacilline, une céphalosporine ou une céphamycine.
8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel le milieu comprend, en une concentration suffisante pour inhiber de préférence la croissance du SASM ou autres organismes concurrents, deux des substances antibactériennes nommées dans la revendication 7 ou plus.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la substance indicatrice comprend un chromogène ou un fluorogène.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la substance indicatrice comprend un substrat chromogène ou fluorogène pour la SARM phosphatase.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape (c) comprend l'incubation du milieu, typiquement pendant qu'il est encore en contact avec l'écouvillon ou autre dispositif de prélèvement, à une température située dans la plage de 35 à 38 °C pendant une période située dans la plage de 16 à 24 heures.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la substance indicatrice visuelle produit un signal qui indique spécifiquement la croissance du SARM.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, qui comprend l'utilisation d'un milieu qui comprend un indicateur de pH ou un fluorogène, mais pas les deux.
14. Trousse appropriée pour utilisation dans la réalisation du procédé de l'une quelconque des revendications précédentes, la trousse comprenant : un emballage stérile comprenant un écouvillon ou autre dispositif de prélèvement, et un milieu d'identification suivant la revendication 1.
15. Trousse selon la revendication 14, dans laquelle le milieu d'identification est sous forme liquide ou semi-solide, et est contenu dans un récipient stérile comportant un moyen d'étanchéité amovible et réutilisable. 25
16. Trousse selon la revendication 15, dans laquelle le récipient comprend un bouchon à vis.
17. Trousse selon la revendication 15, dans laquelle l'écouvillon ou autre moyen de prélèvement fait partie intégrante du récipient. 20 30
18. Trousse selon l'une quelconque des revendications 14 à 17, qui comprend en outre des instructions pour réaliser le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 13.
19. Trousse selon l'une quelconque des revendications 14 à 18, comprenant un milieu qui comprend un indicateur de pH ou un fluorogène, mais pas les deux.
20. Milieu d'identification liquide ou semi-solide approprié pour utilisation dans la réalisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, le milieu étant selon la revendication 1.
21. Milieu selon la revendication 20, le milieu comprenant un indicateur de pH ou un fluorogène, mais pas les deux.15