CN117769603A - 通过向固体生长培养基直接添加荧光染料来检测微生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测和/或计数感兴趣的微生物或成组微生物的方法，所述方法包括：a)将怀疑含有所述微生物或成组微生物的样品与含有支持所述微生物或成组微生物生长的营养物的固体生长培养基并与至少一种荧光染料在容器中接触；b)将所述容器在足以形成所述微生物或成组微生物的微菌落的条件下温育足够的时间；和c)检测和/或计数发射所述至少一种荧光染料的荧光信号的微菌落，从而检测、鉴定和/或计数所述样品中包含的所述微生物或成组微生物。
Description
技术领域
本发明涉及微生物学领域，更具体来说涉及用于快速检测和任选地计数样品中感兴趣的微生物或成组微生物的方法。
背景技术
微生物可能污染任何环境、任何被设计用于人类和动物消费或使用的产品，例如食品、饮料、医疗器械、药品或化妆品。这些微生物的存在不仅会导致所述产品的变质或腐败，而且如果被人类或动物食用或给药到人类或动物，还会导致疾病。为了确保这些产品的安全性，需要进行微生物测试以检查在正常使用条件下的污染风险，从而防止中毒或感染爆发。特别是对于医疗器械、药品或化妆品行业来说，对无菌的需要是非常重要的，并且在整个供应链中检测产品和原材料的微生物质量都是重要的，因为在产品的每个生产阶段都可能出现缺陷。
当然，微生物也可能感染人类或动物，并且在临床诊断中需要检测和/或定量造成感染的微生物。例如，尿路感染(UTI)的诊断可以通过定量尿液培养来进行。传统上，认为尿液中存在1,000或更多个细菌/ml代表了显著的细菌尿，指示了UTI。
对于所有这些行业和临床应用来说，污染阈值和使用的方法可能有所不同。然而，在尽可能早的阶段发现相关微生物的存在总是至关重要的。
自19世纪以来，在皮氏培养皿上培养，即路易·巴斯德的方法，一直是鉴定和计数微生物的最有效方法。到目前为止，在许多行业中这项技术仍然是检测和计数微生物的参考方法。所述方法简单：从样品中提取微生物，将它们放置在含有适合的培养基的专用皮氏培养皿上，并在菌落变得肉眼可见时对它们进行计数。尽管可靠，但这种方法时间长(根据目标微生物的不同，可以长达几天)。
为了缩短测定的时长，建议了使用指示剂例如产色底物、产荧光底物或荧光或放射性标记的抗体来检测较小尺寸的微菌落(例如国际专利申请WO 96/14431、WO 2013/050598、WO 2008/118400)。然而，对于大多数这些方法来说，生长和指示阶段必须分开才能获得最佳结果：生长阶段用于快速细胞生长，其中没有阻碍生长的有害指示剂，而指示阶段用于专门着色和鉴定，其有效地允许检测较小尺寸的微菌落。
多年来，已进行了许多其他尝试来减少测定所需的时间，特别是使用基于免疫学方法、核酸扩增方法或使用荧光抗体或产荧光底物进行标记的流式细胞术方法的不依赖于培养的方法。然而，这些方法仍然昂贵，工作流程不容易，需要高技能的专家和/或浓缩的样品，而且对大多数方法来说，很难区分活微生物和死微生物。
因此，对快速、灵敏、用户友好和成本效益高的用于检测和计数样品中的微生物的方法，仍存在着需求。
发明内容
本发明人在本文中提供了一种满足这种需求的方法。
第一方面，本发明涉及一种用于检测或计数感兴趣的微生物或成组微生物的方法，所述方法包括：
a)将怀疑含有所述微生物或成组微生物的样品与含有支持所述微生物或成组微生物生长的营养物的固体生长培养基并与至少一种荧光染料在容器中接触；
b)将所述容器在足以形成所述微生物或成组微生物的微菌落的条件下温育足够的时间；和
c)检测或计数发射所述至少一种荧光染料的荧光信号的微菌落，
从而检测或计数所述样品中包含的所述微生物或成组微生物。
任选地，在步骤a)之前，将所述样品的微生物浓缩在膜滤器上，并且在步骤a)中，将所述膜和微生物与所述固体生长培养基和所述至少一种荧光染料接触。
步骤a)可以包括
a1)将怀疑含有所述微生物或成组微生物的样品与至少一种荧光染料接触，和
a2)将所述样品与含有支持所述微生物或成组微生物生长的营养物的固体生长培养基在容器中接触，
步骤a1)和a2)同时或以任何次序顺序进行。
优选地，步骤a1)在步骤a2)之前进行。
任选地，在步骤a2)之前，将所述样品的微生物浓缩在膜滤器上。具体而言，可以将所述样品在步骤a1)之前或之后，优选地在步骤a1)之后浓缩在膜滤器上。具体而言，在过滤所述样品之前或之后，可以将所述至少一种荧光染料在与所述样品相同的膜上过滤。可以在膜上过滤/浓缩之前将所述荧光染料添加到所述样品中，或者可以在过滤所述样品之前或之后，优选地在过滤所述样品之后将所述荧光染料过滤在同一个膜上。然后可以将所述膜滤器放置在所述生长培养基的表面上。
优选地，所述膜滤器由混合纤维素酯(MCE)、聚偏氟乙烯(PVDF)、硝酸纤维素、聚四氟乙烯、聚碳酸酯或尼龙制成，更优选地由MCE或PVDF制成。
所述固体生长培养基可以对所述微生物或成组微生物具有选择性。
所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料、吖啶染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料可以选自MB660R、吖啶橙、DRAQ5、Cytrak橙、Alexa Fluor 350、太平洋蓝、Cy5(优选为Sulfo-Cy5)、Cy5.5(优选为Sulfo-Cy5.5)、BODIPY 500/510、prodan、Alexa Fluor 405、瀑布蓝、Seta 650、Seta 375、Setau 647、SeTau 488、Alexa Fluor 488、ATTO 647和DAPI、其衍生物及其组合。更具体而言，所述至少一种荧光染料可以选自MB660R-DBCO、MB660R-酸、吖啶橙、DRAQ5、Cytrak橙、Alexa Fluor 350NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5酸、Sulfo-Cy5.5酸、BODIPY 500/510、prodan、Alexa Fluor 405-DBCO、瀑布蓝、Seta650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、ATTO 647-酸和DAPI、其衍生物及其组合。
在某些实施方式中，所述至少一种荧光染料可以选自基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料、基于呫吨的染料和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料选自DRAQ5TM、Alexa FluorTM350、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、BODIPYTM500/510、prodan、Alexa FluorTM405、SetaTM650、SetauTM647、MBTM660R、AlexaFluorTM488、ATTOTM647和DAPI、其衍生物及其组合。更优选地，所述至少一种荧光染料是DRAQ5TM、Alexa FluorTM350-NHS酯、Sulfo-Cy5酸、BODIPYTM500/510、prodan、AlexaFluorTM405-DBCO、SetaTM650-DBCO、SeTauTM647-马来酰亚胺、MBTM660R-酸、MBTM660R-DBCO、Alexa FluorTM488-酸、Alexa FluorTM488-DBCO、ATTOTM647-酸和DAPI及其组合。可选地，所述至少一种荧光染料可以选自DRAQ5TM、Alexa FluorTM350、太平洋蓝TM、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、BODIPYTM500/510、prodan、Alexa FluorTM405、瀑布蓝TM、SetaTM650、SetauTM647、SeTau488、MBTM660R、Alexa FluorTM488、ATTOTM647和DAPI、其衍生物及其组合。更优选地，所述至少一种荧光染料是DRAQ5TM、Alexa FluorTM350-NHS酯、太平洋蓝TM-NHS酯、Sulfo-Cy5酸、BODIPYTM500/510、prodan、Alexa FluorTM405-DBCO、瀑布蓝TM、SetaTM650-DBCO、SeTau488-NHS、SeTauTM647-马来酰亚胺、MBTM660R-酸、MBTM660R-DBCO、Alexa FluorTM488-酸、AlexaFluorTM488-DBCO、ATTOTM647-酸和DAPI及其组合。
可选地，所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合。具体而言，所述至少一种荧光染料可以选自MB660R、DRAQ5、Cytrak橙、Alexa Fluor 350、太平洋蓝、Cy5(优选为Sulfo-Cy5)、Cy5.5(优选为Sulfo-Cy5.5)、BODIPY 500/510、prodan、Alexa Fluor 405、瀑布蓝、Seta 650、Seta375、Setau 647、SeTau488、Alexa Fluor 488和ATTO 647、其衍生物及其组合。更具体而言，所述至少一种荧光染料可以选自MB660R-DBCO、MB660R-酸、DRAQ5、Cytrak橙、Alexa Fluor350NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5酸、Sulfo-Cy5.5酸、BODIPY 500/510、prodan、AlexaFluor 405-DBCO、瀑布蓝、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau488-NHS、Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO和ATTO 647-酸、其衍生物及其组合。
具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以
-属于嗜热嗜酸细菌，并且优选地选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius和Alicyclobacillus contaminans及其组合；和/或
-属于醋酸菌，并且优选地选自属于醋杆菌属(Acetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)和亚细亚菌属(Asaia)的细菌及其组合；和/或
-属于乳酸菌，并且优选地选自属于乳杆菌属(Lactobacillus)和魏斯氏菌属(Weissellas)的细菌及其组合；和/或
-属于厌氧细菌，并且优选地选自梭状芽孢杆菌属(Clostridium)和丙酸杆菌属(Cutibacterium)细菌及其组合，和/或
-属于好氧中温细菌，并且优选地选自甲基杆菌属(Methylobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、克罗诺杆菌属(Cronobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、肠球菌属(Enterococcus)、Listeria、志贺氏菌属(Shigella)、考克氏菌属(Kocuria)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)及其组合，和/或
-属于革兰氏阴性细菌，并且优选地选自埃希氏杆菌属(Escherichia)和假单胞菌属(Pseudomonas)及其组合，和/或
-属于酵母和霉菌，并且优选地选自假丝酵母属(Candida)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)、地霉属(Geotrichum)和青霉属(Penicillium)及其组合，和/或
-属于异养细菌，优选地选自属于不动杆菌属(Acinetobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、莫拉氏菌属(Moraxella)、泛菌属(Pantoea)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、罗尔斯通菌属(Ralstonia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)的细菌及其组合。
优选地，在本发明的方法中，
-所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于嗜热嗜酸细菌的微生物，优选地选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius和Alicyclobacilluscontaminans及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料，优选地选自Alexa Fluor 488、MB660R和ATTO647及其衍生物和组合，更优选地选自Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO和ATTO647-酸及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料，优选地选自MB660R和衍生物，更优选地选自MB660R-酸和MB660R-DBCO，甚至更优选为MB660R-DBCO；和/或
-所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于醋酸菌(AAB)的微生物，优选地选自属于醋杆菌属(Acetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)和亚细亚菌属(Asaia)的细菌及其组合，更优选地选自醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和暹罗亚细亚菌(Asaia siamensis)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料和DAPI及其组合，优选地选自Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自Alexa Fluor 488-酸、AlexaFluor488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647-酸和DAPI及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料，优选地选自Alexa Fluor 488、MB660R和ATTO647及其衍生物和组合，更优选地选自Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO和ATTO647-酸及其组合。更优选地，所述至少一种荧光染料选自MB660R和ATTO647及其衍生物和组合，优选地选自MB660R-酸、MB660R-DBCO和ATTO647-酸及其组合，更优选地选自MB660R-酸和ATTO647-酸及其组合；和/或
-所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于乳酸菌(LAB)的微生物，优选地选自属于乳杆菌属(Lactobacillus)和魏斯氏菌属(Weissellas)的细菌及其组合，并且更优选地选自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料和DAPI及其组合，优选地选自Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO和ATTO647-酸及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料选自Alexa Fluor 488、MB660R和DAPI及其衍生物和组合，特别是选自Alexa Fluor488-酸、MB660R-酸和DAPI及其组合，优选地选自基于呫吨的染料，更优选地选自Alexa Fluor 488-酸和MB660R-酸及其组合，甚至更优选为MB660R-酸；和/或
-所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于厌氧细菌的微生物，优选地选自梭状芽孢杆菌属(Clostridium)和丙酸杆菌属(Cutibacterium)细菌及其组合，更优选地选自生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes)和痤疮丙酸杆菌(Cutibacteriumacnes)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于花青的染料和DAPI及其组合，优选地选自MB660R、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自MB660R-DBCO、sulfo-Cy5酸和DAPI及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料和基于花青的染料，优选地选自MB660R和Cy5(优选为Sulfo-Cy5)及其衍生物和组合，更优选地选自MB660R-DBCO和sulfo-Cy5酸及其组合。更优选地，所述至少一种荧光染料包括MB660R-DBCO和sulfo-Cy5酸；和/或
-所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于好氧中温细菌(AMB)的微生物，优选地选自属于甲基杆菌属(Methylobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、克罗诺杆菌属(Cronobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、肠球菌属(Enterococcus)、李斯特菌属(Listeria)、志贺氏菌属(Shigella)、考克氏菌属(Kocuria)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的细菌及其组合，更优选地选自扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、宋内志贺氏菌(Shigellasonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和DAPI及其组合，优选地选自DRAQ5TM、AlexaFluorTM350、太平洋蓝TM、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、BODIPYTM染料(优选为BODIPY 500/510)、prodan、Alexa FluorTM405、瀑布蓝TM、Seta染料(优选为Seta 650)、SeTau染料(优选为SeTau 647和SeTau 488)、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自DRAQ5TM、Alexa FluorTM350-NHS酯、太平洋蓝TM-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、BODIPY500/510、prodan、Alexa FluorTM405-DBCO、瀑布蓝TM、Seta 650-DBCO、SeTau 488-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647-酸和DAPI及其组合；和/或
-所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于好氧中温细菌(AMB)的微生物，优选地选自属于甲基杆菌属(Methylobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、克罗诺杆菌属(Cronobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、肠球菌属(Enterococcus)、志贺氏菌属(Shigella)、考克氏菌属(Kocuria)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的细菌及其组合，更优选地选自扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、吖啶染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和DAPI及其组合，优选地选自吖啶橙、DRAQ5、Cytrak橙、Alexa Fluor 350、太平洋蓝、Cy5(优选为Sulfo-Cy5)、BODIPY染料(优选为BODIPY 500/510)、prodan、Alexa Fluor 405、瀑布蓝、Seta染料(优选为Seta650或Seta 375)、SeTau染料(优选为SeTau 647或SeTau 488)、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自吖啶橙、DRAQ5、Cytrak橙、AlexaFluor 350-NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、BODIPY 500/510、prodan、AlexaFluor405-DBCO、瀑布蓝、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau488-NHS、Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647-酸和DAPI及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合，优选地选自DRAQ5、Cytrak橙、Alexa Fluor 350、太平洋蓝、Cy5(优选为Sulfo-Cy5)、BODIPY染料(优选为BODIPY 500/510)、prodan、Alexa Fluor 405、瀑布蓝、Seta染料(优选为Seta 650或Seta 375)、SeTau染料(优选为SeTau 647或SeTau 488)、Alexa Fluor 488、MB660R和ATTO647及其衍生物和组合，更优选地选自DRAQ5、Cytrak橙、Alexa Fluor 350-NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、BODIPY 500/510、prodan、Alexa Fluor 405-DBCO、瀑布蓝、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO和ATTO647-酸及其组合。更优选地，所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料，优选地选自MB660R及其衍生物和组合，任选地与选自基于花青的染料的荧光染料、优选为Cy5、特别是Sulfo-Cy5组合，更优选为MB660R-DBCO，任选地与Sulfo-Cy5-酸组合；和/或
-所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于革兰氏阴性细菌的微生物，优选地选自属于埃希氏杆菌属(Escherichia)、变形杆菌属(Proteus)和假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌及其组合，更优选地选自大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)及其组合，并且所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料(优选为罗丹明染料)、基于花青的染料和DAPI及其组合，优选地选自Cy5(优选为Sulfo-Cy5)、MB660R和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自Sulfo-Cy5-酸、MB660R-DBCO和DAPI及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于花青的染料和DAPI及其组合，优选地选自Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、MB660R、DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自Sulfo-Cy5-酸、MB660R-DBCO和DAPI及其组合；和/或
-所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于革兰氏阴性细菌的微生物，优选地选自属于埃希氏杆菌属(Escherichia)和假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌及其组合，更优选地选自大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料(优选为罗丹明染料)、基于芘的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料和DAPI及其组合，优选地选自Cy5(优选为Sulfo-Cy5)、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、MB660R和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自Sulfo-Cy5-酸、Alexa Fluor 350-NHS酯、Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-DBCO和DAPI及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料(优选为罗丹明染料)、基于芘的染料、基于香豆素的染料和基于花青的染料及其组合，优选地选自Cy5(优选为Sulfo-Cy5)、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405和MB660R及其衍生物和组合，更优选地选自Sulfo-Cy5-酸、Alexa Fluor 350-NHS酯、Alexa Fluor 405-DBCO和MB660R-DBCO及其组合。更优选地，所述至少一种荧光染料选自基于芘的染料、基于香豆素的染料及其组合，优选地选自Alexa Fluor 350和Alexa Fluor 405及其衍生物和组合，更优选地选自Alexa Fluor 350-NHS酯、Alexa Fluor 405-DBCO及其组合。甚至更优选地，所述至少一种荧光染料是Alexa Fluor 350-NHS酯与Alexa Fluor 405-DBCO的组合；和/或
-所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于革兰氏阳性细菌的微生物，优选地选自属于葡萄球菌属(Staphylococcus)和肠球菌属(Enterococcus)的细菌及其组合，更优选地选自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于花青的染料和DAPI及其组合，优选地选自Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、MB660R、DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自Sulfo-Cy5-酸、MB660R-DBCO和DAPI及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料和基于花青的染料及其组合，优选地选自Cy5(优选为Sulfo-Cy5)和MB660R及其衍生物和组合，更优选地选自Sulfo-Cy5-酸和MB660R-DBCO及其组合；和/或
-所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于异养细菌的微生物，优选地选自属于不动杆菌属(Acinetobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、莫拉氏菌属(Moraxella)、泛菌属(Pantoea)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、罗尔斯通菌属(Ralstonia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)的细菌及其组合，更优选地选自鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumanii)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropic)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、滕黄微球菌(Micrococcus luteus)(嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于芘的染料和基于呫吨的染料及其组合，优选地选自Alexa FluorTM350、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、Alexa FluorTM405和MB660R及其衍生物和组合，更优选地选自Alexa FluorTM350-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、Alexa FluorTM405-DBCO和MB660R-DBCO及其组合，甚至更优选地选自(i)MB660R与Sulfo-Cy5、优选地MB660R-DBCO与Sulfo-Cy5-酸的混合物，和(ii)Alexa FluorTM350与Alexa FluorTM405、优选地AlexaFluorTM350-NHS酯与Alexa FluorTM405-DBCO的混合物；和/或
-所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于异养细菌的微生物，优选地选自属于不动杆菌属(Acinetobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、莫拉氏菌属(Moraxella)、泛菌属(Pantoea)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、罗尔斯通菌属(Ralstonia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)的细菌及其组合，更优选地选自鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropic)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、滕黄微球菌(Micrococcusluteus)(嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自吖啶染料、基于呫吨的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和DAPI及其组合，优选地选自吖啶橙、DRAQ5、Cytrak橙、Alexa Fluor 350、太平洋蓝、Cy5(优选为Sulfo-Cy5)、Cy5.5(优选为Sulfo-Cy5.5)、BODIPY染料(优选为BODIPY 500/510)、prodan、Alexa Fluor 405、瀑布蓝、Seta染料(优选为Seta 650或Seta 375)、SeTau染料(优选为SeTau 647或SeTau 488)、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自吖啶橙、DRAQ5、Cytrak橙、Alexa Fluor 350-NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、Sulfo-Cy5.5-酸、BODIPY 500/510、prodan、Alexa Fluor 405-DBCO、瀑布蓝、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau488-NHS、Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647-酸和DAPI及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合，优选地选自DRAQ5、Cytrak橙、Alexa Fluor 350、太平洋蓝、Cy5(优选为Sulfo-Cy5)、Cy5.5(优选为Sulfo-Cy5.5)、BODIPY染料(优选为BODIPY 500/510)、prodan、Alexa Fluor405、瀑布蓝、Seta染料(优选为Seta 650或Seta 375)、SeTau染料(优选为SeTau 647或SeTau 488)、Alexa Fluor 488、MB660R和ATTO647及其衍生物和组合，更优选地选自DRAQ5、Cytrak橙、Alexa Fluor 350-NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、Sulfo-Cy5.5-酸、BODIPY 500/510、prodan、Alexa Fluor405-DBCO、瀑布蓝、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO和ATTO647-酸及其组合；和/或
-所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于酵母和霉菌的微生物，优选地选自属于假丝酵母属(Candida)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)、地霉属(Geotrichum)和青霉属(Penicillium)的真菌及其组合，更优选地选自白假丝酵母(Candida albicans)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白地霉(Geotrichum candidum)、宛氏青霉(Penicilliumvariotii)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自吖啶染料、基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和DAPI及其组合，优选地选自吖啶橙、Alexa Fluor 350、太平洋蓝、Cy5(优选为Sulfo-Cy5)、prodan、Alexa Fluor405、瀑布蓝、BODIPY 500/510、Seta染料(优选为Seta 650)、SeTau染料(优选为SeTau 647或SeTau488)、Alexa Fluor 488、MB660R和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自吖啶橙、Alexa Fluor 350-NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、prodan、Alexa Fluor 405-DBCO、瀑布蓝、BODIPY 500/510、Seta650-DBCO、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸、MB660R-DBCO和DAPI及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和DAPI及其组合，优选地选自AlexaFluorTM350、太平洋蓝TM、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、prodan、Alexa FluorTM405、瀑布蓝TM、Seta染料(优选为Seta 650)、SeTau染料(优选为SeTau 647和SeTau 488)、Alexa Fluor488、MB660R、ATTO647和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自Alexa FluorTM350-NHS酯、太平洋蓝TM-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、prodan、Alexa FluorTM405-DBCO、瀑布蓝TM、Seta 650-DBCO、SeTau 488-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647-酸和DAPI及其组合。更优选地，所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料，优选地选自MB660R及其衍生物和组合，优选为MB660R-DBCO；和/或
-所述感兴趣的微生物或成组微生物包含优选地选自嗜热嗜酸细菌(TAB)、醋酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、厌氧细菌、好氧中温细菌、革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌及其组合的一种或几种细菌，以及优选地选自酵母和霉菌的一种或几种微观真菌，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合，优选地选自Alexa FluorTM350、太平洋蓝TM、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、Alexa FluorTM405、瀑布蓝TM、Seta染料(优选为Seta 650)、SeTau染料(优选为SeTau 647和SeTau 488)、Alexa Fluor 488和MB660R及其衍生物和组合，更优选地选自Alexa FluorTM350-NHS酯、太平洋蓝TM-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、Alexa FluorTM405-DBCO、瀑布蓝TM、Seta 650-DBCO、SeTau 488-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸和MB660R-DBCO及其组合，甚至更优选地选自Sulfo-Cy5-酸和MB660R-DBCO及其组合。
在某些实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物包含优选地选自嗜热嗜酸细菌(TAB)、醋酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、厌氧细菌、好氧中温细菌、革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌、异养细菌及其组合的一种或几种细菌，以及优选地选自酵母和霉菌的一种或几种微观真菌，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合，优选地选自Alexa Fluor 350、太平洋蓝、Cy5(优选为Sulfo-Cy5)、Alexa Fluor 405、瀑布蓝TM、Seta染料(优选为Seta 650或Seta 375)、SeTau染料(优选为SeTau 647和SeTau488)、Alexa Fluor 488和MB660R及其衍生物和组合，更优选地选自Alexa Fluor 350-NHS酯、太平洋蓝TM-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、Alexa Fluor405-DBCO、瀑布蓝、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 488-NHS、SeTau647-马来酰亚胺、Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸和MB660R-DBCO及其组合，甚至更优选地选自Sulfo-Cy5-酸和MB660R-DBCO及其组合。
具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以属于或包含属于好氧中温细菌(AMB)的微生物，优选地选自属于甲基杆菌属(Methylobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、克罗诺杆菌属(Cronobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、肠球菌属(Enterococcus)、李斯特菌属(Listeria)、志贺氏菌属(Shigella)、考克氏菌属(Kocuria)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的细菌及其组合，更优选地选自扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)及其组合，并且所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和DAPI及其组合，优选地选自DRAQ5TM、Alexa FluorTM350、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、BODIPYTM染料(优选为BODIPY 500/510)、prodan、Alexa FluorTM405、Seta染料(优选为Seta650)、SeTau染料(优选为SeTau647)、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自DRAQ5TM、Alexa FluorTM350-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、BODIPY 500/510、prodan、Alexa FluorTM405-DBCO、Seta 650-DBCO、SeTau 647-马来酰亚胺、Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647-酸和DAPI及其组合。
具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以属于或可以包含属于酵母和霉菌的微生物，优选地选自属于假丝酵母属(Candida)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)、地霉属(Geotrichum)和青霉属(Penicillium)的真菌及其组合，更优选地选自白假丝酵母(Candida albicans)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白地霉(Geotrichum candidum)、宛氏青霉(Penicilliumvariotii)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)及其组合，并且所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和DAPI及其组合，优选地选自AlexaFluorTM350、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、prodan、Alexa FluorTM405、Seta染料、SeTau染料、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自AlexaFluorTM350-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、prodan、Alexa FluorTM405-DBCO、Seta650-DBCO、SeTau647-马来酰亚胺、Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647-酸和DAPI及其组合。
具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以属于或可以包含属于革兰氏阴性细菌的微生物，优选地选自属于埃希氏杆菌属(Escherichia)和假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌及其组合，更优选地选自大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)及其组合，并且所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料和基于花青的染料及其组合，优选地选自Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、MB660R及其衍生物和组合，更优选地选自Sulfo-Cy5-酸和MB660R-DBCO及其组合。
具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以包含优选地选自嗜热嗜酸细菌(TAB)、醋酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、厌氧细菌、好氧中温细菌、革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌及其组合的一种或几种细菌，以及优选地选自酵母和霉菌的一种或几种微观真菌，并且所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合，优选地选自Alexa FluorTM350、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、Alexa FluorTM405、Seta染料(优选为Seta 650)、SeTau染料(优选为SeTau647)、Alexa Fluor 488和MB660R及其衍生物和组合，更优选地选自Alexa FluorTM350-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、Alexa FluorTM405-DBCO、Seta 650-DBCO、SeTau 647-马来酰亚胺、AlexaFluor 488-酸、MB660R-酸和MB660R-DBCO及其组合，甚至更优选地选自Sulfo-Cy5-酸和MB660R-DBCO及其组合。
具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以属于嗜热嗜酸细菌，并且所述至少一种荧光染料可以包含选自基于呫吨的染料，优选地选自MBTM660R及其衍生物的染料，更优选为MBTM660R DBCO。
具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以属于或包含选自巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、白假丝酵母(Candida albicans)和大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)及其组合的微生物，并且所述至少一种荧光染料选自Bodipy 500/510；Alexa Fluor 350或其衍生物，优选为Alexa Fluor 350-NHS酯；太平洋蓝或其衍生物，优选为太平洋蓝-NHS酯；prodan；Alexa Fluor 405或其衍生物，优选为Alexa Fluor405-DBCO；瀑布蓝；Seta 650或其衍生物，优选为Seta 650-DBCO；Setau 488或其衍生物，优选为Setau 488-NHS；Setau 647或其衍生物，优选为Setau 647-马来酰亚胺，及其任何组合。
在其中在步骤a)或步骤a2)之前将所述样品的微生物浓缩在膜滤器上的实施方式中，可以在步骤b)之后并且在步骤c)之前将所述膜滤器从所述固体生长培养基上取下，并且可以在步骤c)中检测和/或计数其上的微菌落。可选地，可以将所述膜滤器保持在所述固体生长培养基上来进行步骤c)。
优选地，在步骤c)中，使用荧光显微镜或固相细胞仪检测和/或计数发射对应于所述至少一种荧光染料的荧光信号的微菌落。
另一方面，本发明还涉及本发明的方法用于确定样品是否含有至少一种感兴趣的微生物，用于确定样品是否无菌，或用于确定样品的生物负载的用途。
另一方面，本发明还涉及一种试剂盒用于根据本发明的方法检测和/或计数感兴趣的微生物或成组微生物的用途，所述试剂盒包含：
(i)-至少一种荧光染料，其优选地如上所定义，
和任选的
-至少一个膜滤器，其优选地如上所定义，和/或
-至少一个容器，其包含含有支持所述感兴趣的微生物或成组微生物生长的营养物的固体生长培养基，或获得所述至少一个容器所需的材料，和/或
-提供所述试剂盒的使用说明的小册子，或
(ii)-至少一个容器，其包含含有优选地如上所定义的至少一种荧光染料和支持所述感兴趣的微生物或成组微生物生长的营养物的固体生长培养基，或获得所述至少一个容器所需的材料，
和任选的
-至少一个膜滤器，其优选地如上所定义，和/或
-提供所述试剂盒的使用说明的小册子。
附图说明
图1：酸土脂环酸芽孢杆菌(A.acidoterrestris)24h，PVDF膜，MB660R-DBCO 100μM，光功率100％，增益1，曝光时间100ms
图2：大肠埃希氏杆菌(E.coli)17h，MCE黑色膜，Alexa FluorTM350-NHS酯500μM，光功率50％，增益1，曝光时间200ms
图3：大肠埃希氏杆菌(E.coli)17h，PVDF膜，Alexa FluorTM350-NHS酯150μM，光功率20％，增益1，曝光时间200ms
图4：大肠埃希氏杆菌(E.coli)17h，MCE黑色膜，Alexa FluorTM405-DBCO 500μM，光功率50％，增益1，曝光时间200ms
图5：大肠埃希氏杆菌(E.coli)15h，PVDF膜，MB660R-DBCO 250μM，光功率100％，增益1，曝光时间100ms
图6：大肠埃希氏杆菌(E.coli)18h，MCE黑色膜，Sulfo-Cy5-酸150μM，光功率100％，增益1，曝光时间400ms
图7：大肠埃希氏杆菌(E.coli)18h，PVDF膜，Sulfo-Cy5-酸50μM，光功率100％，增益1，曝光时间400ms
图8：白假丝酵母(C.albicans)21h，PVDF膜，MB660R-DBCO 250μM，光功率100％，增益1，曝光时间100ms
图9：巴西曲霉(A.brasiliensis)21h，PVDF膜，MB660R-DBCO 250μM，光功率100％，增益1，曝光时间200ms
图10：混合白假丝酵母(C.albicans)+巴西曲霉(A.brasiliensis)20h，PVDF膜，Sulfo-Cy5-酸50μM，光功率100％，增益1，曝光时间400ms
图11：混合白假丝酵母(C.albicans)+巴西曲霉(A.brasiliensis)21h，MCE黑色膜，Alexa FluorTM405-DBCO 500μM，光功率50％，增益1，曝光时间200ms
图12：混合白假丝酵母(C.albicans)+巴西曲霉(A.brasiliensis)21h，MCE黑色膜，Alexa FluorTM350-NHS酯500μM，光功率50％，增益1，曝光时间200ms
图13：混合白假丝酵母(C.albicans)+巴西曲霉(A.brasiliensis)21h，PVDF膜，Alexa FluorTM350-NHS酯500μM，光功率20％，增益1，曝光时间300ms
图14：粪肠球菌(E.faecalis)+白假丝酵母(C.albicans)+巴西曲霉(A.brasiliensis)24h，TSA琼脂板25℃，PVDF膜，MB660R100μM+Sulfo-Cy5-酸100μM，光功率100％，增益1，曝光时间200ms
图15：荧光染料的结构。
图16：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，黑色或白色膜，MB660R-DBCO(50μM)和Sulfo-Cy5-酸(50μM)，使用不同方法将荧光染料与细菌接触。
图17：酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)和Alicyclobacillus herbarius，MB660R-DBCO，在置于琼脂培养基上的膜上或直接在琼脂培养基(无膜)上检测。
具体实施方式
本发明人在本文中证实，可以在荧光染料存在下在固体培养基上培养微生物，以便允许微菌落的早期检测。事实上，他们令人吃惊地发现，荧光染料没有表现出显著毒性，因此不影响待检测的微生物的生长。在微生物生长阶段中这些染料的存在允许在微菌落阶段对所述微生物进行非常早的检测和计数。具体而言，本发明人显示，这种方法可用于快速检测和计数嗜热嗜酸细菌(TAB)、醋酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、厌氧细菌、好氧中温细菌、酵母、霉菌和在UTI诊断中具有相关重要性的细菌，还可用于评估样品的无菌性或生物负载。由本发明人开发的方法提供了比其他方法更快、更精确的结果，同时是一种成本效益高的方法，其使用标准设备和试剂，具有简单的工作流程，不需要高技能的专家投入实践，并且能够区分活的和死的微生物。因此，这种方法满足了对用于检测和计数感兴趣的样品中的微生物的快速、灵敏、用户友好且成本效益高的方法的需求。
因此，第一方面，本发明涉及一种用于检测或计数感兴趣的微生物或成组微生物的方法，所述方法包括：
a)将怀疑含有所述微生物或成组微生物的样品与含有支持所述微生物或成组微生物生长的营养物的固体生长培养基并与至少一种荧光染料在容器中接触；
b)将所述容器在足以形成所述微生物或成组微生物的微菌落的条件下温育足够的时间；和
c)检测或计数发射所述至少一种荧光染料的荧光信号的微菌落，
从而检测或计数所述样品中包含的所述微生物或成组微生物。
本发明的方法可用于检测样品中的微生物或成组微生物，即通过在所述方法的步骤c)中检测微菌落来揭示所述样品中存在的微生物的存在。它也可用于计数样品中的微生物或成组微生物。在这种情况下，假设步骤c)中检测到的每个微菌落来自已经历细胞分裂的单个细胞。因此，通过对微菌落的数量进行计数并任选地考虑稀释或浓缩系数，可以确定所述样品中所述微生物的数量。本发明的方法也可用于鉴定微生物或成组微生物。本文所使用的术语“鉴定”不一定需要确定给定微菌落的属和种。该术语可以是指微生物在分类组(任何级别)或特定组(例如嗜热嗜酸细菌、醋酸菌、乳酸菌、酵母或霉菌、好氧中温细菌、厌氧细菌)中的分类。
本发明的方法的步骤a)包括将怀疑含有微生物或成组微生物的样品与含有支持所述微生物或成组微生物生长的营养物的固体生长培养基并与至少一种荧光染料在容器中接触。
步骤a)可以包括
a1)将怀疑含有所述微生物或成组微生物的样品与至少一种荧光染料接触，和
a2)将所述样品与含有支持所述微生物或成组微生物生长的营养物的固体生长培养基在容器中接触，
步骤a1)和a2)同时或以任何次序顺序进行。
在某些实施方式中，步骤a1)在步骤a2)之前进行。任选地，在步骤a2)之前，将所述样品的微生物浓缩在膜滤器上。具体而言，可以在步骤a1)之前或之后，优选地在步骤a1)之后，将所述样品浓缩在膜滤器上。具体而言，在过滤所述样品之前或之后，可以将所述至少一种荧光染料在与所述样品相同的膜上过滤。
在某些特定实施方式中，步骤a1)和a2)同时进行。
所述方法还可以包括在步骤a)之前提供怀疑含有所述感兴趣的微生物或成组微生物的样品。
样品
样品可以从液体(例如水、果汁、啤酒、葡萄酒、生物流体如尿液)、固体(例如食品、药品或化妆品、医疗器械或任何固体表面)或气体(例如空气)获得。取决于待测试的产品/环境的形式，样品可以直接用于本发明的方法，或者可以提交到预备步骤。
具体而言，所述样品可以是液体样品或液化样品。本文所使用的术语“液化样品”是指从固体样品获得的液体样品。在某些情况下，固体样品可以通过物理和/或化学处理溶解或悬浮在液体介质中。微生物也可以使用本领域技术人员已知的任何方法从不同表面或装置提取，例如拭子法、摩擦法(例如使用湿巾)、印刷法(例如通过琼脂接触法)、漂洗或浸渍法或超声处理法，特别是去除生物膜(参见例如等，Int J Environ Res PublicHealth.2013Nov 14；10(11):6169-83，通过引用并入本文)。
液体样品可以含有悬浮的固体。然而，如果需要，可以使用适合的方法，优选地使用使微生物损失最小化的方法，例如通过低速离心或使用适合孔径的过滤，从液体介质中去除残留的悬浮固体。用于悬浮固体样品的液体介质可以是任何适合的溶剂，例如无菌水、缓冲溶液或液体培养基。
任选地，所述液体或液化样品可以在步骤a)之前使用任何适合的方法例如离心或过滤进行稀释(例如连续稀释)或浓缩。
在本发明的方法中使用/分析的样品可以是试图确定其是否被微生物污染的任何样品。
样品的实例包括但不限于生物样品(例如唾液、鼻咽、尿液、粪便、血液、血浆、脑脊液或黏液样品)、环境样品(例如住宅、商业或工业用水、废水、冷却水、锅炉水、地下水、娱乐用水、工艺用水、水处理装置的出水、土壤或其他环境材料)、医疗器械或其任何部分、供人类或动物食用的食品或饮料(例如乳制品、原材料、饮用水、果汁、啤酒、葡萄酒、产品组合物中使用的水)、药品或化妆品，以及此类食品、饮料、药品或化妆品的成分。
膜滤器
在某些优选实施方式中，所述方法还可以包括在步骤a)之前将所述样品的微生物浓缩在膜滤器上。
随后在步骤a)中，将该膜与如下所述的固体生长培养基和至少一种荧光染料接触。可选地，可以将所述样品在过滤之前，或在过滤之后但在与固体生长培养基接触之前，与所述至少一种荧光染料接触。具体而言，可以将所述样品与所述至少一种荧光染料混合，然后可以在所述膜上过滤，或者可以在过滤所述样品之前或之后，将所述至少一种荧光染料在与所述样品相同的膜上过滤。具体而言，可以将所述荧光染料添加到所述样品中，然后在所述膜上过滤/浓缩，或者可以在过滤所述样品之前或之后，优选地在过滤所述样品之后，将所述荧光染料在同一个膜上过滤。然后可以将所述膜滤器放置在所述生长培养基的表面上。
在温育期间营养物穿过所述滤器，允许生物体以微菌落的形式在所述膜的上表面上生长。
可以使用适合于保留所述样品中包含的微生物的无菌膜滤器，通常为孔径小于目标微生物的微滤膜滤器来过滤/浓缩所述液体、液化或气体样品。可以使用过滤漏斗和真空系统使所述样品通过所述膜。优选地，所述膜滤器具有不大于0.45μm的标称孔径，0.22μm至0.45μm的孔径。所述滤器的直径可以取决于用于过滤样品的装置和含有生长培养基的容器的尺寸。例如，所述容器可以是直径为90mm或55mm的皮氏培养皿，并且所述膜可以具有47mm的直径。
所述膜滤器可以由任何适合的材料例如混合纤维素酯(MCE)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚酯砜(PES)、硝酸纤维素、聚四氟乙烯、聚碳酸酯或尼龙制成。优选地，所述膜滤器由混合纤维素酯(MCE)、聚偏氟乙烯(PVDF)、硝酸纤维素、聚四氟乙烯、聚碳酸酯或尼龙制成。更优选地，所述膜滤器由混合纤维素酯(MCE)或聚偏氟乙烯(PVDF)制成。所述膜滤器可以是白色或有色的例如黑色，和/或可以是网格膜。
待过滤的样品的体积可以取决于所述样品的本质和预期的微生物含量。该体积通常在1mL至1L之间，并且可以由专业技术人员容易地调整。
微生物
本发明的方法允许检测或计数可以在培养装置中、特别是适合的固体生长培养基上生长的各种微生物或成组微生物，即可培养微生物。
本文所使用的术语“微生物”是指细菌、古菌或微观真菌。优选地，该术语是指细菌、酵母(即单细胞微观真菌)或霉菌(即多细胞和丝状微观真菌)。具体而言，本发明的方法允许检测或计数活微生物。本文所使用的术语“活微生物”是指当在适合的液体培养基中或适合的固体培养基上温育时能够繁殖的微生物。事实上，与现有技术的某些其他方法相反，本发明的方法不检测死微生物或其碎片例如DNA或细胞碎片，并且可以清楚地辨别活微生物。
本文所使用的术语“成组微生物”是指包含至少两种不同微生物的组。所述微生物可以选自细菌、古菌和微观真菌及其组合，优选地选自细菌、酵母和霉菌及其组合。具体而言，所述成组微生物可以包含两种或更多种细菌、两种或更多种真菌或一种或多种细菌与一种或多种真菌的混合物。
所述感兴趣的微生物可以是病原性或非病原性微生物。优选地，所述微生物是可以使产品(例如食品、饮料、医疗器械、药品或化妆品)或环境(例如游泳池、地下水)变质或腐败的病原性微生物或非病原性微生物。
在某些实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物是细菌。细菌可以是好氧、厌氧或兼性厌氧细菌以及革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。
具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以属于嗜热嗜酸细菌(TAB)组、醋酸菌(AAB)组、乳酸菌(LAB)组、厌氧细菌组、好氧中温细菌组、革兰氏阴性细菌组、革兰氏阳性细菌组、异养细菌组或其组合。更具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以属于嗜热嗜酸细菌(TAB)组、醋酸菌(AAB)组、乳酸菌(LAB)组、厌氧细菌组、好氧中温细菌组、革兰氏阴性细菌组或革兰氏阳性细菌组或其组合。
在实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于脂环酸芽孢杆菌属菌种(Alicyclobacillus spp.)，也被称为嗜热嗜酸细菌(TAB)。
脂环酸芽孢杆菌属菌种(Alicyclobacillus spp.)是可以在升高的温度(高达70℃)下在酸性环境中生长的形成芽孢的细菌。所述芽孢能够在典型的巴氏灭菌程序中存活下来，因此这些细菌是果汁、果汁相关产品(浓缩物调配果汁、浓缩果汁、水提取果汁、脱水/粉状果汁、果肉果汁和含水果制品的非酒精或酒精饮料如调味水)或糖浆的潜在腐败生物体。通常TAB是无害的，但如果菌株产生愈创木酚这种污染果汁的具有烟熏口味和气味的天然酚类化学物质或其他异味物质，则发生腐败。最常见的产生愈创木酚的TAB是酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)。
优选地，所述属于脂环酸芽孢杆菌属菌种(Alicyclobacillus spp.)的感兴趣的微生物或成组微生物选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacilluscycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius和Alicyclobacillus contaminans及其组合。
在另一个实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于醋酸菌(AAB)组。
AAB是严格好氧微生物，过氧化氢酶阳性和氧化酶阴性，椭圆形至杆状细胞，可以单独、成对或成串出现。它们也是中温微生物，并且它们的最适生长温度在25至30℃之间。它们生长的最适pH为5.0-6.5，但它们也可以在更低的pH值下生长。
这些细菌在自然界中广泛存在，并在食品和饮料例如醋的生产中发挥重要作用。然而，AAB在其他发酵饮料例如葡萄酒、苹果酒、啤酒和其他软饮料中的不希望的生长会导致不想要的酸味。作为说明，属于这一组的葡糖杆菌属(Gluconobacter)菌株被认为是软饮料的典型腐败者。事实上，在这些物质上，糖和醇被不完全氧化，导致有机酸的积累，例如由乙醇产生乙酸或由葡萄糖产生葡萄糖酸。
优选地，所述属于醋酸菌(AAB)组的感兴趣的微生物或成组微生物选自属于醋杆菌属(Acetobacter)、酸单胞菌属(Acidomonas)、亚细亚菌属(Asaia)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、雨山杆菌属(Ameyamaea)、熊蜂属(Bombella)、Commensalibacter、Endobacter、颗粒杆菌属(Granulibacter)、驹形杆菌属(Komagataeibacter)、公崎杆菌属(Kozakia)、新亚细亚菌属(Neoasaia)、新驹形杆菌属(Neokomagataea)、阮杆菌属(Nguyenibacter)、糖杆菌属(Saccharibacter)、斯瓦米纳坦杆菌属(Swaminathania)、斯温斯杆菌属(Swingsia)和塔堤查仁杆菌属(Tanticharoenia)的细菌及其组合。
更优选地，所述属于醋酸菌(AAB)组的感兴趣的微生物或成组微生物选自属于醋杆菌属(Acetobacter)的细菌例如巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)、苹果醋杆菌(Acetobacter malorum)、酿酒醋杆菌(Acetobacter cerevisiae)、葡萄酒醋杆菌(Acetobacter oeni)、果实醋杆菌(Acetobacter pomorum)和醋酸醋杆菌(Acetobacteraceti)，属于亚细亚菌属(Asaia)的细菌例如Asaia bogorensis、暹罗亚细亚菌(Asaiasiamensis)、Asaia krungthepensis和Asaia lannaensis，属于葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)的细菌例如液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens)、Gluconacetobacter entanii和Gluconacetobacter intermedius，属于葡糖杆菌属(Gluconobacter)的细菌例如氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)，及其组合。
甚至更优选地，所述属于醋酸菌(AAB)组的感兴趣的微生物或成组微生物选自醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和暹罗亚细亚菌(Asaia siamensis)及其组合。
在另一个实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于乳酸菌(LAB)组。
这组细菌通常在食品工业中发挥积极作用，但它们也会导致严重的腐败，尤其是在葡萄酒和具有低pH或真空包装的食品中。此外，这些细菌可以被视为指标，因为有利于它们生长的条件也有利于肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)这种高致病性细菌。这些细菌形成一个异质组，但它们的共同之处在于过氧化氢酶阴性(有些菌株能够产生血红素依赖性过氧化氢酶)，不形成芽孢，严格发酵，兼性好氧，并产生乳酸作为葡萄糖发酵的主要产物。
所述属于乳酸菌(LAB)组的感兴趣的微生物或成组微生物优选地选自属于乳杆菌属(Lactobacillus)(例如干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、Lactobacillus lindneri、食果糖乳杆菌(Lactobacillusfructivorans)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus))、明串珠菌属(Leuconostoc)(例如Leuconostoc gelidum、Leuconostoc gasicomitatum和肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides))、片球菌属(Pediococcus)(例如有害片球菌(Pediococcusdamnosus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、小片球菌(Pediococcus parvulus)、意外片球菌(Pediococcusinopinatus)、嗜盐片球菌(Pediococcus halophilus)、糊精片球菌(Pediococcusdextrinicus)和马尿片球菌(Pediococcus urinaeequi))、乳球菌属(Lactococcus)(例如Lactococcus piscium)、肠球菌属(Enterococcus)(例如粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)和屎肠球菌(Enterococcus faecium))、肉杆菌属(Carnobacterium)(例如广布肉杆菌(Carnobacterium divergens)、麦芽香肉杆菌(Carnobacteriummaltaromaticum))、链球菌属(Streptococcus)(例如乳酸链球菌(Streptococcuslactis))和魏斯氏菌属(Weissellas)(例如融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)、绿色魏斯氏菌(Weissellas viridescens))的细菌及其组合。
更优选地，所述属于乳酸菌(LAB)组的感兴趣的微生物或成组微生物选自属于乳杆菌属(Lactobacillus)和魏斯氏菌属(Weissellas)的细菌及其组合。
甚至更优选地，所述属于乳酸菌(LAB)组的感兴趣的微生物或成组微生物选自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)及其组合。
在另一个特定实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于厌氧细菌组。
厌氧细菌可分为三类：专性厌氧菌，其受到氧气存在的伤害；耐氧生物，其不能利用氧气生长，但耐受氧气的存在；兼性厌氧菌，其可以在没有氧气的情况下生长，但如果存在氧气则利用氧气。大多数致病性食源性微生物是兼性厌氧菌。厌氧细菌，特别是梭状芽孢杆菌属(Clostridium)细菌，可能使真空包装食品或罐头食品腐败。厌氧细菌，特别是痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)，也可能参与术后感染，因为它们能够在身体植入物和手术器械上持续存在。
所述属于厌氧细菌组的感兴趣的微生物或成组微生物优选地选自属于梭状芽孢杆菌属(Clostridium)的细菌例如生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes)、Clostridium algidicarnis、Clostridium frigoris、Clostridium bowmanii、Clostridium frigidicarmis、Clostridium ruminantium、酯化梭状芽孢杆菌(Clostridium estertheticum)、产气梭状芽孢杆菌(Clostridium gasigenes)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)或肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridiumbotulinum)，属于丙酸杆菌属(Cutibacterium)的细菌例如痤疮丙酸杆菌(Cutibacteriumacnes)和属于环丝菌属(Brochothrix)的细菌例如热死环丝菌(Brochothrixthermosphacta)，及其组合。
更优选地，所述属于厌氧细菌组的感兴趣的微生物或成组微生物选自属于梭状芽孢杆菌属(Clostridium)或丙酸杆菌属(Cutibacterium)的细菌及其组合，甚至更优选地选自生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes)和痤疮丙酸杆菌(Cutibacteriumacnes)及其组合。
在另一个实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于好氧中温细菌(AMB)组。好氧中温细菌是在中温下、即25℃至40℃之间好氧生长的细菌。好氧中温细菌的检测和计数是食品、化妆品、医疗器械和非无菌药品的质量控制的关键指标。
所述属于好氧中温细菌组的感兴趣的微生物或成组微生物优选地选自属于甲基杆菌属(Methylobacterium)(例如扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens))、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus))、埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli))、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、不动杆菌属(Acinetobacter)(例如鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii))、克罗诺杆菌属(Cronobacter)(例如阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii))、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、肠球菌属(Enterococcus)(例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis))、李斯特菌属(Listeria)(例如格氏李斯特菌(Listeria grayi)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes))、志贺氏菌属(Shigella)(例如宋内志贺氏菌(Shigella sonnei))、弧菌属(Vibrio)(例如副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、创伤弧菌(Vibriovulnificus))、弯曲杆菌属(Campylobacter)(例如空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)、大肠弯曲杆菌属(Campylobacter coli))、耶尔森氏菌属(Yersinia)(例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica))、考克氏菌属(Kocuria)(例如嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila))和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)(例如洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia))的细菌及其组合。
更优选地，所述属于好氧中温细菌组的感兴趣的微生物或成组微生物选自属于甲基杆菌属(Methylobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、克罗诺杆菌属(Cronobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、肠球菌属(Enterococcus)、李斯特菌属(Listeria)、志贺氏菌属(Shigella)、考克氏菌属(Kocuria)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的细菌及其组合。所述属于好氧中温细菌组的感兴趣的微生物或成组微生物更优选地可以选自属于甲基杆菌属(Methylobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、克罗诺杆菌属(Cronobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、肠球菌属(Enterococcus)、志贺氏菌属(Shigella)、考克氏菌属(Kocuria)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的细菌及其组合。
甚至更优选地，所述属于好氧中温细菌组的感兴趣的微生物或成组微生物选自扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuriarhizophila)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)及其组合。甚至更优选地，所述属于好氧中温细菌组的感兴趣的微生物或成组微生物选自扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)及其组合。
在另一个实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。
革兰氏阴性细菌的特征在于它们的细胞包膜，其由夹在细胞质内膜和细菌外膜之间的薄肽聚糖细胞壁组成。它们是重要的医学挑战，因为它们的外膜保护它们免受许多抗生素(包括青霉素)、通常会破坏(内部)细胞膜的肽聚糖的去污剂和溶菌酶(一种由动物产生的构成先天免疫系统的一部分的抗微生物酶)的影响。此外，该膜的外叶包含复合脂多糖(LPS)，其脂质A组分在这些细菌被免疫细胞裂解时可引起毒性反应。例如，它们与大多数尿路感染病例有关。大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)是最常见的革兰氏阴性病原体，但其他革兰氏阴性细菌也具有显著重要性，例如克雷伯氏菌属(Klebsiella)、衣原体属(Chlamydia)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、耶尔森氏菌属(Yersinia)和沙门氏菌属(Salmonella)。
所述属于革兰氏阴性细菌组的感兴趣的微生物或成组微生物优选地选自属于埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli))、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))、变形杆菌属(Proteus)(例如奇异变形杆菌(Proteus mirabilis))、衣原体属(Chlamydia)(例如沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis))、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、肠杆菌属(Enterobacter)(例如粪肠杆菌(Enterobacter faecalis)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes))、不动杆菌属(Acinetobacter)(例如鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii))、克罗诺杆菌属(Cronobacter)(例如阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii))、志贺氏菌属(Shigella)(例如宋内志贺氏菌(Shigellasonnei))、考克氏菌属(Kocuria)(例如嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila))、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)(例如洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens))、嗜血杆菌属(Haemophilus)(例如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)和沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))的细菌及其组合。更优选地，所述属于革兰氏阴性细菌组的感兴趣的微生物或成组微生物选自属于埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli))、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))、变形杆菌属(Proteus)(例如奇异变形杆菌(Proteusmirabilis))、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、肠杆菌属(Enterobacter)(例如粪肠杆菌(Enterobacter faecalis)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes))、不动杆菌属(Acinetobacter)(例如鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii))、克罗诺杆菌属(Cronobacter)(例如阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii))、志贺氏菌属(Shigella)(例如宋内志贺氏菌(Shigellasonnei))、考克氏菌属(Kocuria)(例如嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila))、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)(例如洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens))和沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))的细菌及其组合，特别是选自大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuriarhizophila)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、黏质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。
更具体而言，所述属于革兰氏阴性细菌组的感兴趣的微生物或成组微生物可以选自埃希氏杆菌属(Escherichia)、变形杆菌属(Proteus)和假单胞菌属(Pseudomonas)细菌及其组合，更优选地选自大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)及其组合。甚至更具体而言，所述属于革兰氏阴性细菌组的感兴趣的微生物或成组微生物可以选自埃希氏杆菌属(Escherichia)和假单胞菌属(Pseudomonas)细菌及其组合，更优选地选自大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)及其组合，甚至更优选地选自大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)细菌。
具体而言，所述属于革兰氏阴性细菌组的感兴趣的微生物或成组微生物可以属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，包括例如埃希氏杆菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)和沙门氏菌属(Salmonella)及其组合，更具体来说是大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)及其组合。
革兰氏阳性细菌也是临床相关的。具体而言，在细菌性UTI中分离到的革兰氏阳性细菌中，腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是最常见的革兰氏阳性病原体。
所述属于革兰氏阳性细菌组的感兴趣的微生物或成组微生物优选地选自属于葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)的细菌及其组合。更具体而言，所述属于革兰氏阳性细菌组的感兴趣的微生物或成组微生物可以选自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)及其组合。
在另一个实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于异养细菌组，特别是通常可以从制药用水系统即自来水(或饮用水)、纯化水和WFI(注射用水)中回收的异养细菌(参见例如Tim Sandle,September 2015.SOJ Microbiology&Infectious Diseases 3(2):1-8，通过引用并入本文)。事实上，水是制药行业的关键部分。水被用于清洁；作为水性无菌和非无菌产品的成分；用于洗手；以及作为高压灭菌器的蒸汽供应等用途。由于水在制药生产中的关键性，水的微生物控制至关重要。由于水总是存在的，每种级别的制药用水都是微生物污染的潜在来源，尤其是在控制不当的情况下。在制药中，存在三种类型的水：a)自来水(或饮用水)；b)纯化水；c)WFI(注射用水)。它们中的每种都有不同的等级，并且名单随着对微生物控制的期望增加排列(即应用于注射用水的限制比自来水的限制更严格)。自来水由公用事业公司供应，并具有“饮用水”(饮用水)的质量。水系统监测的结果根据预先定义的警报和行动水平，从异养微生物计数来评估。
所述属于异养细菌组的感兴趣的微生物或成组微生物优选地选自属于不动杆菌属(Acinetobacter)(例如鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii))、气单胞菌属(Aeromonas)(例如嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila))、短波单胞菌属(Brevundimonas)(例如缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta))、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)(例如洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia))、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)(例如弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii))、爱德华氏菌属(Edwardsiella)(例如迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda))、肠杆菌属(Enterobacter)(例如产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes))、埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli))、苍白杆菌属(Ochrobactrum)(例如人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropic))、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))、甲基杆菌属(Methylobacterium)(例如扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens))、莫拉氏菌属(Moraxella)(例如奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis))、泛菌属(Pantoea)(例如成团泛菌(Pantoea agglomerans))、变形杆菌属(Proteus)(例如奇异变形杆菌(Proteus mirabilis))、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens))、罗尔斯通菌属(Ralstonia)(例如皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii))、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens))、志贺氏菌属(Shigella)(例如宋内志贺氏菌(Shigella sonnei))、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)(例如少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis))、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)(例如嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia))、弧菌属(Vibrio)(例如副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus))、耶尔森氏菌属(Yersinia)(例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica))、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、肠球菌属(Enterococcus)(例如粪肠球菌(Enterococcusfaecalis))、微球菌属(Micrococcus)(例如滕黄微球菌(Micrococcus luteus)(嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)))、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))的细菌及其组合。更优选地，所述属于异养细菌组的感兴趣的微生物或成组微生物选自属于不动杆菌属(Acinetobacter)(例如鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii))、气单胞菌属(Aeromonas)(例如嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila))、短波单胞菌属(Brevundimonas)(例如缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta))、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)(例如洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia))、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)(例如弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii))、爱德华氏菌属(Edwardsiella)(例如迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda))、肠杆菌属(Enterobacter)(例如产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes))、埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli))、苍白杆菌属(Ochrobactrum)(例如人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropic))、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))、甲基杆菌属(Methylobacterium)(例如扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens))、莫拉氏菌属(Moraxella)(例如奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis))、泛菌属(Pantoea)(例如成团泛菌(Pantoea agglomerans))、变形杆菌属(Proteus)(例如奇异变形杆菌(Proteusmirabilis))、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens))、罗尔斯通菌属(Ralstonia)(例如皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii))、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如黏质沙雷氏菌(Serratiamarcescens))、志贺氏菌属(Shigella)(例如宋内志贺氏菌(Shigella sonnei))、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)(例如少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis))、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)(例如嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia))、耶尔森氏菌属(Yersinia)(例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica))、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、肠球菌属(Enterococcus)(例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis))、微球菌属(Micrococcus)(例如滕黄微球菌(Micrococcus luteus)(嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)))、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))的细菌及其组合。
更具体而言，所述属于异养细菌组的感兴趣的微生物或成组微生物优选地选自鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropic)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、滕黄微球菌(Micrococcus luteus)(嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及其组合。甚至更具体而言，所述属于异养细菌组的感兴趣的微生物或成组微生物可以选自鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropic)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、滕黄微球菌(Micrococcusluteus)(嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)及其组合。
具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以选自属于脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)(例如酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacilluscycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacillus contaminans)、醋杆菌属(Acetobacter)(例如醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti))、葡糖醋杆菌属(Gluconoacetobacter)(例如液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens))、葡糖杆菌属(Gluconobacter)(例如氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans))、亚细亚菌属(Asaia)(例如暹罗亚细亚菌(Asaiasiamensis))、乳杆菌属(Lactobacillus)(例如干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum))、魏斯氏菌属(Weissellas)(例如融合魏斯氏菌(Weissellas confusa))、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)(例如生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes))、丙酸杆菌属(Cutibacterium)(例如痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes))、甲基杆菌属(Methylobacterium)(例如扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens))、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))、埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli))、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、不动杆菌属(Acinetobacter)(例如鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii))、克罗诺杆菌属(Cronobacter)(例如阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii))、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、肠球菌属(Enterococcus)(例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis))、李斯特菌属(Listeria)(例如格氏李斯特菌(Listeria grayi))、志贺氏菌属(Shigella)(例如宋内志贺氏菌(Shigellasonnei))、微球菌属(Micrococcus)(也被命名为考克氏菌属(Kocuria))(例如滕黄微球菌(Micrococcus luteus)(嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)))、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)(例如洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia))、气单胞菌属(Aeromonas)(例如嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila))、短波单胞菌属(Brevundimonas)(例如缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta))、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)(例如弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii))、爱德华氏菌属(Edwardsiella)(例如迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda))、肠杆菌属(Enterobacter)(例如产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes))、苍白杆菌属(Ochrobactrum)(例如人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropic))、莫拉氏菌属(Moraxella)(例如奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis))、泛菌属(Pantoea)(例如成团泛菌(Pantoea agglomerans))、变形杆菌属(Proteus)(例如奇异变形杆菌(Proteus mirabilis))、罗尔斯通菌属(Ralstonia)(例如皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens))、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)(例如少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis))、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)(例如嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia))、弧菌属(Vibrio)(例如副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus))、耶尔森氏菌属(Yersinia)(例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica))的细菌及其组合。更具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以选自属于脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)(例如酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacillus contaminans)、醋杆菌属(Acetobacter)(例如醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti))、葡糖醋杆菌属(Gluconoacetobacter)(例如液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens))、葡糖杆菌属(Gluconobacter)(例如氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans))、亚细亚菌属(Asaia)(例如暹罗亚细亚菌(Asaia siamensis))、乳杆菌属(Lactobacillus)(例如干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum))、魏斯氏菌属(Weissellas)(例如融合魏斯氏菌(Weissellas confusa))、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)(例如生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes))、丙酸杆菌属(Cutibacterium)(例如痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes))、甲基杆菌属(Methylobacterium)(例如扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens))、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli))、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、不动杆菌属(Acinetobacter)(例如鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii))、克罗诺杆菌属(Cronobacter)(例如阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii))、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium))、肠球菌属(Enterococcus)(例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis))、志贺氏菌属(Shigella)(例如宋内志贺氏菌(Shigella sonnei))、微球菌属(Micrococcus)(也被命名为考克氏菌属(Kocuria))(例如滕黄微球菌(Micrococcus luteus)(嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)))、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)(例如洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia))、气单胞菌属(Aeromonas)(例如嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila))、短波单胞菌属(Brevundimonas)(例如缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta))、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)(例如弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii))、爱德华氏菌属(Edwardsiella)(例如迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda))、肠杆菌属(Enterobacter)(例如产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes))、苍白杆菌属(Ochrobactrum)(例如人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropic))、莫拉氏菌属(Moraxella)(例如奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis))、泛菌属(Pantoea)(例如成团泛菌(Pantoea agglomerans))、变形杆菌属(Proteus)(例如奇异变形杆菌(Proteusmirabilis))、罗尔斯通菌属(Ralstonia)(例如皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens))、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)(例如少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis))、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)(例如嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia))、耶尔森氏菌属(Yersinia)(例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica))的细菌及其组合。
更具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacillus contaminans、醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、暹罗亚细亚菌(Asaia siamensis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)、生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes)、痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、宋内志贺氏菌(Shigellasonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropic)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)及其组合。甚至更具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacillus contaminans、醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、暹罗亚细亚菌(Asaia siamensis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)、生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes)、痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuriarhizophila)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropic)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxellaosloensis)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)及其组合。
可选地，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以选自属于脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)(例如酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacilluscycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacillus contaminans)、醋杆菌属(Acetobacter)(例如醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti))、葡糖醋杆菌属(Gluconoacetobacter)(例如液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens))、葡糖杆菌属(Gluconobacter)(例如氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans))、亚细亚菌属(Asaia)(例如暹罗亚细亚菌(Asaiasiamensis))、乳杆菌属(Lactobacillus)(例如干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum))、魏斯氏菌属(Weissellas)(例如融合魏斯氏菌(Weissellas confusa))、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)(例如生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes))、丙酸杆菌属(Cutibacterium)(例如痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes))、甲基杆菌属(Methylobacterium)(例如扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens))、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))、埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli))、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、不动杆菌属(Acinetobacter)(例如鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii))、克罗诺杆菌属(Cronobacter)(例如阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii))、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、肠球菌属(Enterococcus)(例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis))、李斯特菌属(Listeria)(例如格氏李斯特菌(Listeria grayi))、志贺氏菌属(Shigella)(例如宋内志贺氏菌(Shigellasonnei))、考克氏菌属(Kocuria)(例如嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila))、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)(例如洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia))的细菌及其组合。所述感兴趣的微生物或成组微生物也可以选自属于脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)(例如酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacilluscycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacillus contaminans)、醋杆菌属(Acetobacter)(例如醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti))、葡糖醋杆菌属(Gluconoacetobacter)(例如液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens))、葡糖杆菌属(Gluconobacter)(例如氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans))、亚细亚菌属(Asaia)(例如暹罗亚细亚菌(Asaiasiamensis))、乳杆菌属(Lactobacillus)(例如干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum))、魏斯氏菌属(Weissellas)(例如融合魏斯氏菌(Weissellas confusa))、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)(例如生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes))、丙酸杆菌属(Cutibacterium)(例如痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes))、甲基杆菌属(Methylobacterium)(例如扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens))、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))、埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli))、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、不动杆菌属(Acinetobacter)(例如鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii))、克罗诺杆菌属(Cronobacter)(例如阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii))、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、肠球菌属(Enterococcus)(例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis))、志贺氏菌属(Shigella)(例如宋内志贺氏菌(Shigella sonnei))、考克氏菌属(Kocuria)(例如嗜根考克氏菌(Kocuriarhizophila))、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)(例如洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia))的细菌及其组合。更具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacilluscontaminans、醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacterliquefaciens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、暹罗亚细亚菌(Asaiasiamensis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)、生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridiumsporogenes)、痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)、扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)及其组合。所述感兴趣的微生物或成组微生物也可以选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacilluscontaminans、醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacterliquefaciens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、暹罗亚细亚菌(Asaiasiamensis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)、生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridiumsporogenes)、痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)、扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)及其组合。
在某些其他实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物是微观真菌，特别是酵母或霉菌。酵母和霉菌可以导致各种产品例如食品、葡萄酒、饮料、化妆品或药品的变质。具体而言，它们可以在任何时候入侵并生长在几乎任何类型的食品上；它们在收获之前和储存期间侵入田地中作物例如谷物、坚果、豆类和水果。它们也生长在加工食品、食品混合物中，并且是乳制品中、特别是发酵乳制品和低水分产品例如奶酪中的重要腐败生物体。据估计，由于真菌污染，5-10％的食物被浪费并且必须扔掉。优选地，通过本发明的方法检测或计数的真菌属于子囊菌门(Ascomycota)，并且更优选地属于酵母纲(Saccharomycetes)或半知菌纲(Deuteromycetes)。
在实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物选自属于假丝酵母属(Candida)(例如白假丝酵母(Candida albicans))、接合酵母属(Zygosaccharomyces)(例如拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii))、曲霉属(Aspergillus)(例如巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis))、地霉属(Geotrichum)(白地霉(Geotrichum candidum))、酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))和青霉属(Penicillium)(例如宛氏青霉(Penicillium variotii)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum))的真菌及其组合。优选地，所述感兴趣的微生物或成组微生物选自白假丝酵母(Candida albicans)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白地霉(Geotrichum candidum)、宛氏青霉(Penicillium variotii)和产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)及其组合。
具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以选自属于脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)(例如酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacilluscycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacillus contaminans)、醋杆菌属(Acetobacter)(例如醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti))、葡糖醋杆菌属(Gluconoacetobacter)(例如液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens))、葡糖杆菌属(Gluconobacter)(例如氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans))、亚细亚菌属(Asaia)(例如暹罗亚细亚菌(Asaiasiamensis))、乳杆菌属(Lactobacillus)(例如干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum))、魏斯氏菌属(Weissellas)(例如融合魏斯氏菌(Weissellas confusa))、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)(例如生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes))、丙酸杆菌属(Cutibacterium)(例如痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes))、甲基杆菌属(Methylobacterium)(例如扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens))、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))、埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli))、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、不动杆菌属(Acinetobacter)(例如鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii))、克罗诺杆菌属(Cronobacter)(例如阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii))、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、肠球菌属(Enterococcus)(例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis))、李斯特菌属(Listeria)(例如格氏李斯特菌(Listeria grayi))、志贺氏菌属(Shigella)(例如宋内志贺氏菌(Shigellasonnei))、考克氏菌属(Kocuria)(例如嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila))、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)(例如洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia))、气单胞菌属(Aeromonas)(例如嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila))、短波单胞菌属(Brevundimonas)(例如缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta))、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)(例如弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii))、爱德华氏菌属(Edwardsiella)(例如迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda))、肠杆菌属(Enterobacter)(例如产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes))、苍白杆菌属(Ochrobactrum)(例如人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropic))、莫拉氏菌属(Moraxella)(例如奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis))、泛菌属(Pantoea)(例如成团泛菌(Pantoea agglomerans))、变形杆菌属(Proteus)(例如奇异变形杆菌(Proteus mirabilis))、罗尔斯通菌属(Ralstonia)(例如皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens))、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)(例如少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis))、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)(例如嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia))、弧菌属(Vibrio)(例如副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus))、耶尔森氏菌属(Yersinia)(例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica))的细菌，以及属于假丝酵母属(Candida)(例如白假丝酵母(Candida albicans))、接合酵母属(Zygosaccharomyces)(例如拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii))、曲霉属(Aspergillus)(例如巴西曲霉(Aspergillusbrasiliensis))、地霉属(Geotrichum)(白地霉(Geotrichum candidum))、酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))和青霉属(Penicillium)(例如宛氏青霉(Penicillium variotii)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum))的真菌及其组合。所述感兴趣的微生物或成组微生物也可以选自属于脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)(例如酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacilluscycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacillus contaminans)、醋杆菌属(Acetobacter)(例如醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti))、葡糖醋杆菌属(Gluconoacetobacter)(例如液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens))、葡糖杆菌属(Gluconobacter)(例如氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans))、亚细亚菌属(Asaia)(例如暹罗亚细亚菌(Asaiasiamensis))、乳杆菌属(Lactobacillus)(例如干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum))、魏斯氏菌属(Weissellas)(例如融合魏斯氏菌(Weissellas confusa))、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)(例如生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes))、丙酸杆菌属(Cutibacterium)(例如痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes))、甲基杆菌属(Methylobacterium)(例如扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens))、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))、埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli))、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、不动杆菌属(Acinetobacter)(例如鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii))、克罗诺杆菌属(Cronobacter)(例如阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii))、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、肠球菌属(Enterococcus)(例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis))、志贺氏菌属(Shigella)(例如宋内志贺氏菌(Shigella sonnei))、考克氏菌属(Kocuria)(例如嗜根考克氏菌(Kocuriarhizophila))、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)(例如洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia))、气单胞菌属(Aeromonas)(例如嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila))、短波单胞菌属(Brevundimonas)(例如缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta))、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)(例如弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii))、爱德华氏菌属(Edwardsiella)(例如迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda))、肠杆菌属(Enterobacter)(例如产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes))、苍白杆菌属(Ochrobactrum)(例如人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropic))、莫拉氏菌属(Moraxella)(例如奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis))、泛菌属(Pantoea)(例如成团泛菌(Pantoea agglomerans))、变形杆菌属(Proteus)(例如奇异变形杆菌(Proteusmirabilis))、罗尔斯通菌属(Ralstonia)(例如皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens))、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)(例如少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis))、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)(例如嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia))、耶尔森氏菌属(Yersinia)(例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica))的细菌，以及属于假丝酵母属(Candida)(例如白假丝酵母(Candida albicans))、接合酵母属(Zygosaccharomyces)(例如拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii))、曲霉属(Aspergillus)(例如巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis))、地霉属(Geotrichum)(白地霉(Geotrichum candidum))、酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))和青霉属(Penicillium)(例如宛氏青霉(Penicillium variotii)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum))的真菌及其组合。
更具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacillus contaminans、醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、暹罗亚细亚菌(Asaia siamensis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)、生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes)、痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、宋内志贺氏菌(Shigellasonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropic)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、白假丝酵母(Candida albicans)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白地霉(Geotrichum candidum)、宛氏青霉(Penicilliumvariotii)和产黄青霉(Penicillium chrysogenum)及其组合。所述感兴趣的微生物或成组微生物也可以选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacilluscycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacillus contaminans、醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、暹罗亚细亚菌(Asaia siamensis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)、生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes)、痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropic)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、成团泛菌(Pantoeaagglomerans)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstoniapickettii)、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、白假丝酵母(Candida albicans)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白地霉(Geotrichum candidum)、宛氏青霉(Penicilliumvariotii)和产黄青霉(Penicillium chrysogenum)及其组合。
可选地，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以选自属于脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)(例如酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacilluscycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacillus contaminans)、醋杆菌属(Acetobacter)(例如醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti))、葡糖醋杆菌属(Gluconoacetobacter)(例如液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens))、葡糖杆菌属(Gluconobacter)(例如氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans))、亚细亚菌属(Asaia)(例如暹罗亚细亚菌(Asaiasiamensis))、乳杆菌属(Lactobacillus)(例如干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum))、魏斯氏菌属(Weissellas)(例如融合魏斯氏菌(Weissellas confusa))、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)(例如生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes))、丙酸杆菌属(Cutibacterium)(例如痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes))、甲基杆菌属(Methylobacterium)(例如扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens))、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))、埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli))、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、不动杆菌属(Acinetobacter)(例如鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii))、克罗诺杆菌属(Cronobacter)(例如阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii))、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、肠球菌属(Enterococcus)(例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis))、李斯特菌属(Listeria)(例如格氏李斯特菌(Listeria grayi))、志贺氏菌属(Shigella)(例如宋内志贺氏菌(Shigellasonnei))、考克氏菌属(Kocuria)(例如嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila))、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)(例如洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia))的细菌，以及属于假丝酵母属(Candida)(例如白假丝酵母(Candida albicans))、接合酵母属(Zygosaccharomyces)(例如拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii))、曲霉属(Aspergillus)(例如巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis))、地霉属(Geotrichum)(白地霉(Geotrichum candidum))、酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))和青霉属(Penicillium)(例如宛氏青霉(Penicillium variotii)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum))的真菌及其组合。所述感兴趣的微生物或成组微生物也可以选自属于脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)(例如酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacillus contaminans)、醋杆菌属(Acetobacter)(例如醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti))、葡糖醋杆菌属(Gluconoacetobacter)(例如液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens))、葡糖杆菌属(Gluconobacter)(例如氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans))、亚细亚菌属(Asaia)(例如暹罗亚细亚菌(Asaia siamensis))、乳杆菌属(Lactobacillus)(例如干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum))、魏斯氏菌属(Weissellas)(例如融合魏斯氏菌(Weissellas confusa))、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)(例如生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes))、丙酸杆菌属(Cutibacterium)(例如痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes))、甲基杆菌属(Methylobacterium)(例如扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens))、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli))、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、不动杆菌属(Acinetobacter)(例如鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii))、克罗诺杆菌属(Cronobacter)(例如阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii))、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium))、肠球菌属(Enterococcus)(例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis))、志贺氏菌属(Shigella)(例如宋内志贺氏菌(Shigella sonnei))、考克氏菌属(Kocuria)(例如嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila))、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)(例如洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia))的细菌，以及属于假丝酵母属(Candida)(例如白假丝酵母(Candida albicans))、接合酵母属(Zygosaccharomyces)(例如拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii))、曲霉属(Aspergillus)(例如巴西曲霉(Aspergillusbrasiliensis))、地霉属(Geotrichum)(白地霉(Geotrichum candidum))、酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))和青霉属(Penicillium)(例如宛氏青霉(Penicillium variotii)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum))的真菌及其组合。更具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacillus contaminans、醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、暹罗亚细亚菌(Asaia siamensis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)、生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes)、痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、宋内志贺氏菌(Shigellasonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)、白假丝酵母(Candida albicans)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白地霉(Geotrichum candidum)、宛氏青霉(Penicillium variotii)和产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)及其组合。所述感兴趣的微生物或成组微生物也可以选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacillus contaminans、醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、暹罗亚细亚菌(Asaia siamensis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)、生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes)、痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuriarhizophila)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、白假丝酵母(Candidaalbicans)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、巴西曲霉(Aspergillusbrasiliensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白地霉(Geotrichum candidum)、宛氏青霉(Penicillium variotii)和产黄青霉(Penicillium chrysogenum)及其组合。
在优选实施方式中，本发明的方法被用于检测或计数感兴趣的成组微生物。
具体而言，所述成组微生物可以包含
-两种或更多种选自如上所定义的嗜热嗜酸细菌(TAB)组、即属于脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)的微生物，优选为选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius和Alicyclobacillus contaminans及其组合的两种或更多种微生物；或
-两种或更多种选自如上所定义的醋酸菌(AAB)组的微生物，优选地选自属于醋杆菌属(Acetobacter)、酸单胞菌属(Acidomonas)、亚细亚菌属(Asaia)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、雨山杆菌属(Ameyamaea)、熊蜂属(Bombella)、Commensalibacter、Endobacter、颗粒杆菌属(Granulibacter)、驹形杆菌属(Komagataeibacter)、公崎杆菌属(Kozakia)、新亚细亚菌属(Neoasaia)、新驹形杆菌属(Neokomagataea)、阮杆菌属(Nguyenibacter)、糖杆菌属(Saccharibacter)、斯瓦米纳坦杆菌属(Swaminathania)、斯温斯杆菌属(Swingsia)和塔堤查仁杆菌属(Tanticharoenia)的细菌及其组合，更优选地选自属于醋杆菌属(Acetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)和亚细亚菌属(Asaia)的细菌及其组合，甚至更优选地选自醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacterliquefaciens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和暹罗亚细亚菌(Asaiasiamensis)及其组合；或
-两种或更多种选自如上所定义的乳酸菌(LAB)组的微生物，优选地选自属于乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、肉杆菌属(Carnobacterium)、链球菌属(Streptococcus)和魏斯氏菌属(Weissellas)的细菌及其组合，更优选地选自属于乳杆菌属(Lactobacillus)和魏斯氏菌属(Weissellas)的细菌及其组合，甚至更优选地选自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)及其组合；或
-两种或更多种选自厌氧细菌组的微生物，优选地选自梭状芽孢杆菌属(Clostridium)和丙酸杆菌属(Cutibacterium)细菌及其组合，更优选地选自生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes)和痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)及其组合；或
-两种或更多种选自如上所定义的好氧中温细菌(AMB)组的微生物，优选地选自属于甲基杆菌属(Methylobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、克罗诺杆菌属(Cronobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、肠球菌属(Enterococcus)、李斯特菌属(Listeria)、志贺氏菌属(Shigella)、考克氏菌属(Kocuria)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的细菌及其组合，更优选地选自扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、宋内志贺氏菌(Shigellasonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)及其组合，甚至更优选地选自扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuriarhizophila)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)及其组合；或
-两种或更多种选自如上所定义的革兰氏阴性细菌组的微生物，优选地选自属于埃希氏杆菌属(Escherichia)、变形杆菌属(Proteus)和假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌及其组合，更优选地选自大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)及其组合，甚至更优选地选自属于埃希氏杆菌属(Escherichia)和假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌及其组合，特别是选自大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)及其组合；或
-两种或更多种选自如上所定义的革兰氏阳性细菌组的微生物，优选地选自属于葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)的细菌及其组合，更优选地选自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)及其组合；或
-两种或更多种选自如上所定义的异养细菌组的微生物，优选地选自属于不动杆菌属(Acinetobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、莫拉氏菌属(Moraxella)、泛菌属(Pantoea)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、罗尔斯通菌属(Ralstonia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)的细菌及其组合，更优选地选自鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropic)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、滕黄微球菌(Micrococcus luteus)(嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及其组合，甚至更优选地选自鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropic)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、滕黄微球菌(Micrococcus luteus)(嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及其组合；或
-两种或更多种选自如上所定义的嗜热嗜酸细菌(TAB)、醋酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、厌氧细菌、好氧中温细菌、革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌、异养细菌组及其组合的微生物，优选地选自如上所定义的嗜热嗜酸细菌(TAB)、醋酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、厌氧细菌、好氧中温细菌、革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌组及其组合；或
-两种或更多种选自如上所定义的酵母和霉菌的微生物，优选地选自属于假丝酵母属(Candida)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)、地霉属(Geotrichum)和青霉属(Penicillium)的真菌及其组合，更优选地选自白假丝酵母(Candida albicans)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白地霉(Geotrichum candidum)、宛氏青霉(Penicillium variotii)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)及其组合；或
-两种或更多种选自如上所定义的嗜热嗜酸细菌(TAB)、醋酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、厌氧细菌、好氧中温细菌、革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌、异养细菌、酵母和霉菌组及其组合的微生物，优选地选自如上所定义的嗜热嗜酸细菌(TAB)、醋酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、厌氧细菌、好氧中温细菌、革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌、酵母和霉菌组及其组合。
具体而言，所述通过本发明的方法检测或计数的成组微生物可以包含
-一种或几种细菌，优选地选自如上所定义的嗜热嗜酸细菌(TAB)、醋酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、厌氧细菌、好氧中温细菌、革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌、异养细菌组及其组合，和
-一种或几种微观真菌，优选地选自如上所定义的酵母和霉菌。
优选地，所述通过本发明的方法检测或计数的成组微生物可以包含
-一种或几种细菌，优选地选自如上所定义的嗜热嗜酸细菌(TAB)、醋酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、厌氧细菌、好氧中温细菌、革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌组及其组合，和
-一种或几种微观真菌，优选地选自如上所定义的酵母和霉菌。
所述通过本发明的方法检测或计数的微生物或成组微生物可以取决于所述样品的本质。
例如：
-从果汁、果汁相关产品或糖浆获得的样品可能被怀疑含有嗜热嗜酸细菌；
-从真空包装食品或罐头食品获得的样品可能被怀疑含有厌氧细菌；
-从药物原材料获得的样品可能被怀疑含有特别是来自芽孢杆菌属(Bacillus)的中温好氧细菌、特别是来自梭状芽孢杆菌属(Clostridium)的厌氧细菌或真菌例如青霉属(Penicillium)和曲霉属(Aspergillus)真菌；
-从化妆品获得的样品可能被怀疑含有好氧中温细菌，特别是铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠埃希氏杆菌(E.coli)和芽孢杆菌属(Bacillus)菌种；并且
-从医疗器械或尿液(即用于UTI诊断)获得的样品可能被怀疑含有革兰氏阴性细菌，特别是大肠埃希氏杆菌(E.coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)或肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，或革兰氏阳性细菌，特别是金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)或粪肠球菌(Enterococcus faecalis)；并且
-从制药用水系统获得的样品可能被怀疑含有如上所定义的异养细菌，特别是选自属于不动杆菌属(Acinetobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、莫拉氏菌属(Moraxella)、泛菌属(Pantoea)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、罗尔斯通菌属(Ralstonia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)的细菌及其组合，优选地选自属于不动杆菌属(Acinetobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、莫拉氏菌属(Moraxella)、泛菌属(Pantoea)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、罗尔斯通菌属(Ralstonia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)的细菌及其组合，更优选地选自鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumanii)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropic)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、滕黄微球菌(Micrococcus luteus)(嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及其组合，甚至更优选地选自鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropic)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、滕黄微球菌(Micrococcus luteus)(嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及其组合。
对于可以使用本发明方法的每个领域(例如药品、化妆品、食品和饮料、环境分析、诊断等)来说，专业技术人员知道可以怀疑样品中含有哪些微生物，并因此可以改编本发明的方法以适应这些微生物。
生长培养基
在本发明的方法的步骤a)中，将样品与含有支持所述感兴趣的微生物或成组微生物生长的营养物的固体生长培养基在容器中接触。
本文所使用的术语“生长培养基”或“培养基”是指在本发明的上下文中用于微生物或成组微生物生长的营养培养基。所述生长培养基可以是从各个化学物质合成的限定培养基，因此确切的分子组成是已知的，也可以是包含一些复杂成分例如酵母提取物或酪蛋白水解物的非限定培养基，所述复杂成分由比例未知的许多化学物质的混合物组成。
在本发明的方法中使用的生长培养基可以是非选择性生长培养基或选择性生长培养基。非选择性生长培养基是用于细菌生长的通用培养基例如胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)，用于真菌生长的通用培养基例如沙氏葡萄糖琼脂(SDA)，或用于细菌和真菌两者的生长的通用培养基例如Reasoner's 2A琼脂(R2A)。非选择性培养基通常含有支持广泛种类的微生物生长所需的营养物。选择性生长培养基是仅用于生长选定微生物的培养基。事实上，选择性培养基的组成确保了具有某些特性例如抗生素抗性或合成某种代谢物例如氨基酸的能力的细胞的增殖。因此，该培养基提供了与样品中可能存在的非目标微生物相比更加有利于目标微生物生长的环境。
本文所使用的表述“固体生长培养基”或“固体培养基”是指允许微生物在其表面上形成微菌落的生长培养基，例如具有凝胶样外观或采取凝胶形式的培养基，凝胶是一种胶体系统，其中互连粒子的多孔网络跨越液体介质的体积，并允许营养物通过介质扩散，从而变得可以为微生物所用。优选地，本文所使用的固体生长培养基通过向液体生长培养基添加足量的胶凝剂例如琼脂、琼脂糖、藻酸盐、卡拉胶、纤维素、明胶、果胶及其组合来制备。通常，固体生长培养基含有浓度为0.5％至3％、优选为1％至2.5％的胶凝剂，优选为琼脂。优选地，在本发明的方法中使用的固体生长培养基是琼脂生长培养基。
所述固体生长培养基被倾倒在容器中。这种容器可以是适应于微生物培养的任何无菌容器，特别是常规皮氏培养皿。
生长培养基的选择基本上取决于所述感兴趣的微生物或成组微生物。然而，这种选择也可以取决于应用领域(例如药品、化妆品、食品和饮料、环境分析、诊断等)和该领域中使用的标准方法。作为说明，为了从非酒精饮料获得的样品中同时检测酵母、霉菌、乳酸菌和醋酸菌，IFU微生物学方法2推荐使用橙色血清琼脂(OSA)培养基。另一方面，对于制药工业中的生物负载测试来说，建议使用R2A或TSA培养基。类似地，某些应用需要选择性培养基，以仅仅检测特定微生物或特定成组微生物(例如用于分析尿液样品以诊断由革兰氏阴性细菌引起的UTI的MacConkey琼脂培养基)，而其他应用例如无菌性测试或生物负载测试通常需要非选择性培养基，以便检测或计数尽可能多的微生物。当然，正如后文中解释的，温育的条件和时间也对所述方法的选择性或非选择性发挥作用。专业技术人员可以容易地考虑这些参数来选择适合的生长培养基。
适合支持嗜热嗜酸细菌生长的生长培养基的实例包括但不限于YSG(酵母-淀粉-葡萄糖)琼脂(Matsubara等，2002,Int J Syst Evol Microbiol 52,1681–1685)、PDA(马铃薯葡萄糖琼脂；Pettipher等，1997,Lett Appl Microbiol 24,185–189)、OSA(橙色血清琼脂；Pettipher等，2000,Food Austr 57,293–295)、K琼脂(Walls等，1998,Dairy FoodEnviron Sanit 18,499–503)、BAT(Bacillus AcidoTerrestris)琼脂。优选地，用于支持嗜热嗜酸细菌生长的生长培养基是根据IFU标准方法No.12的推荐用于检测嗜热嗜酸细菌的生长培养基。
适合支持乳酸菌生长的生长培养基的实例包括但不限于Rogosa琼脂(Rogosa等，1951,J Bacteriol 62,132–133)、MRS(De Man、Rogosa和Sharpe)琼脂培养基(De Man等，1960,J Appl Bacteriol 23,30–35)、乳杆菌选择性琼脂(Mitsuoka,1978,IntestinalBacteria and Health.Tokyo,Harcourt Brace Jovanovich Japan)、LAMVAB(Hartemink等，1997,J Microbiol Methods 29,77–84)、TSA-BCP和PCA-BCP(胰蛋白酶大豆琼脂和含有溴甲酚紫的平板计数琼脂；Lin等，2006,Food Microbiol 23,74–81)或Raka Ray琼脂。优选地，用于支持乳酸菌生长的生长培养基是根据IFU标准方法No.5的推荐用于检测乳酸菌的生长培养基。
适合支持酵母或霉菌生长的生长培养基的实例包括但不限于YM(酵母提取物麦芽提取物)和YMG(酵母提取物-麦芽提取物-葡萄糖)琼脂培养基(Wickerham,1939J.TropicalMed.Hyg.,42,176)、OSA(橙色血清琼脂)、PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)、番茄汁琼脂(MacFaddinJ.F.,1985，《用于医学细菌的分离-培养-鉴定-维持的培养基》(Media for Isolation-Cultivation-Identification-Maintenance of Medical Bacteria)，Vol.1,Williams&Wilkins,Baltimore,Md)、MEA(麦芽提取物琼脂)培养基、葡萄糖蛋白胨琼脂(Glathe等，Zentralbl Bakteriol Parasitenkd Infektionskr Hyg.1968；122(1):3-21)、Wallerstein营养琼脂(Green和Gray.1950.Wallerstein Lab.Commun.12:43)、Wort琼脂(Parfitt E.H.(1933)J.Dairy Sci.16.141-147)和沙氏葡萄糖琼脂(Sabouraud,R.(1892)Ann.Dermatol.Syphilol.3:1061)。具体来说，YM和YMG琼脂培养基是具有低pH的选择性生长培养基，可用于培养酵母、霉菌或其他耐酸或嗜酸生物体(即能够在pH范围为3至4的酸性自然环境中生长)，同时阻止大多数细菌和其他不耐酸生物体的生长。优选地，用于支持酵母或霉菌生长的生长培养基是根据USP61标准、BS EN ISO 16212-2017标准或IFU标准方法No.3和4的推荐用于检测酵母或霉菌的生长培养基。
适合支持醋酸菌生长的生长培养基的实例包括但不限于YM(酵母提取物麦芽提取物)琼脂培养基、YMG(酵母提取物麦芽提取物葡萄糖)琼脂培养基、GYC(葡萄糖酵母提取物碳酸钙；10％葡萄糖、1.0％酵母提取物、2.0％碳酸钙、1.5％琼脂，pH 6.8)琼脂培养基、YPE(酵母提取物-蛋白胨-乙醇)琼脂培养基、YPG(酵母提取物聚蛋白胨甘油)、YPM/YPS(酵母提取物聚蛋白胨甘露糖醇或山梨糖醇)琼脂培养基、YPGD(酵母提取物聚蛋白胨葡萄糖)琼脂培养基。
适合支持好氧中温细菌生长的生长培养基的实例包括但不限于TSA(胰蛋白酶大豆琼脂)培养基、PCA(平板计数琼脂)培养基、R2A(Reasoner's 2A琼脂)培养基、SCDA(大豆酪蛋白消化物琼脂)、FTM(液体巯基乙酸盐培养基)琼脂培养基。具体来说，TSA和PCA培养基是通常用于评估样品的活细菌生长的非选择性生长培养基，R2A培养基是适应于通常栖居在饮用水中的细菌生长的培养基。优选地，用于支持好氧中温细菌生长的生长培养基是根据USP61标准或BS EN ISO 21149-2017标准的推荐用于检测好氧中温细菌的生长培养基。
适合支持厌氧细菌生长的生长培养基的实例包括但不限于TSA(胰蛋白胨大豆琼脂)培养基、强化梭菌琼脂(Barnes等，(1963)J.Appl.Bact.26.415-427)、厌氧琼脂(BrewerJ.H.,1942,Science,95:587)、任选地增补有去纤维蛋白绵羊血的Columbia琼脂(Ellner等，Amer.J.Clin.Path.,29；181-183(1958))。在某些实施方式中，用于支持厌氧细菌生长的生长培养基可以是根据ISO 7937:2004或ISO 14189:2013标准的推荐用于检测厌氧细菌，特别是用于检测产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)的生长培养基。
适合支持革兰氏阳性菌生长的生长培养基的实例包括但不限于MSA(甘露糖醇盐琼脂)培养基或苯乙醇琼脂(Brewer和Lilley.1949.December meeting of the MarylandAssociation of Medical and Public Health Laboratories)。
适合支持革兰氏阴性细菌生长的生长培养基的实例包括但不限于MacConkey琼脂培养基、Hektoen肠琼脂(King和Metzger.1968.Appl.Microbiol.16:577-578)或XLD(木糖-赖氨酸-脱氧胆酸盐)琼脂(Taylor,1965.Am.J.Clin.Pathol.,44:471-475)。具体而言，MacConkey琼脂培养基含有胆汁盐和结晶紫，它们会干扰许多革兰氏阳性细菌的生长，并有利于革兰氏阴性细菌、特别是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的生长。在某些实施方式中，用于支持革兰氏阴性细菌生长的生长培养基可以是根据ISO 21528:2017标准的推荐用于检测属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的革兰氏阴性细菌的生长培养基。
适合支持细菌和真菌生长的生长培养基的实例包括但不限于Reasoner's 2A琼脂(R2A)、胰蛋白胨酵母提取物琼脂或橙色血清琼脂。优选地，用于支持所有微生物(细菌、酵母和霉菌)生长的生长培养基是根据IFU标准方法No.2或ISO 6222:1999标准的推荐用于计数可培养微生物(总计数)的生长培养基。
任选地，为了提高培养基的选择性，可以向培养基添加一种或几种额外的选择性成分，例如抗生素、pH指示剂、选择性生长抑制剂。
所有这些生长培养基都是专业技术人员公知的，并且是可商购或容易制备的。
荧光染料
在本发明的方法的步骤a)中，将所述样品不仅与如上所述的固体生长培养基接触，而且与至少一种荧光染料接触。
本文所使用的术语“荧光染料”、“荧光团”或“荧光色素”可互换使用，并且是指在光激发后可以重新发光的化合物。通常，荧光团吸收特定波长范围(激发光谱)的光，并以更长的波长范围(发射光谱)重新发射它，具有相应的激发和发射最大值。这个术语是指不需任何化学修饰就能表现出荧光性质的化合物。具体而言，所述至少一种荧光染料不是产荧光底物，即在与微生物的酶或一组酶反应后产生荧光物质的底物。此外，所述至少一种荧光染料不与能够特异性识别微生物或成组微生物的功能性部分例如抗体连接。优选地，在本发明的方法中使用的荧光染料不限制感兴趣的微生物的生长，即感兴趣的微生物的生长不受荧光染料存在的显著影响。优选地，所述至少一种荧光染料不被包封在例如脂质体或脂质囊泡中。优选地，所述至少一种荧光染料不是DNA和/或RNA嵌入剂。优选地，所述至少一种荧光染料不是磺基罗丹明B、Hoechst染料、罗丹明B、中性红、溴百里酚蓝、曙红、亚甲基蓝、两性霉素B或尼罗红。
在本发明的方法中，可以将所述样品与一种或几种荧光染料接触。优选地，在该方法中使用的每种荧光染料能够染色至少一种感兴趣的微生物。在某些实施方式中，使用几种荧光染料，每种荧光染料能够染色一种或几种感兴趣的微生物，并且所有感兴趣的微生物均被这些荧光染料中的至少一者染色。在本发明的方法中使用的荧光染料可以是可透过膜的荧光染料并对微生物的内侧进行染色，或者可以仅吸附在微生物的外表面上。
专业技术人员可以根据待检测的微生物或成组微生物选择一种或几种荧光染料。
具体而言，专业技术人员可以如实验部分中所述评估荧光染料对感兴趣的微生物进行染色的能力。简单来说，将所述微生物的培养物在0,45μm膜滤器例如MCE或PVDF膜上过滤，并将所述过滤膜沉积在荧光染料液滴上方，以在适合于支持所述微生物生长的固体生长培养基上进行测试。将所述培养基在足以形成所述微生物的微菌落的条件下温育足够的时间。对发射荧光信号的微菌落的检测指示了所述荧光染料可以在本发明的方法中用于检测所述微生物。如果必须检测成组微生物，则专业技术人员可以使用相同或不同的荧光染料为该组中的每种微生物重复这种测定，直至确定允许检测所有感兴趣的微生物的适合的组合。
在实施方式中，将所述样品与至少一种荧光染料接触，所述荧光染料选自吖啶染料例如吖啶橙、基于蒽的染料例如蒽醌染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料例如花青、吲哚羰花青、氧杂羰花青、硫代羰花青和部花青染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于呫吨的染料例如荧光素染料、曙红染料、罗丹明染料和carbopyronine染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)及其组合。优选地，将所述样品与至少一种荧光染料接触，所述荧光染料选自基于蒽的染料例如蒽醌染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料例如花青、吲哚羰花青、氧杂羰花青、硫代羰花青和部花青染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于呫吨的染料例如荧光素染料、曙红染料、罗丹明染料和carbopyronine染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)及其组合。
具体而言，所述至少一种荧光染料可以选自
-吖啶染料，特别是吖啶橙，
-基于蒽的染料，特别是DRAQ5TM(例如1,5-双(2-(二甲基氨基)乙基氨基)-4,8-二羟基蒽-9,10-二酮)、Cytrak橙TM(Edward,R.(2009)Mol.Cells 27(4):391-396；CAS登记号1195771-25-5)及其衍生物，
-基于香豆素的染料，特别是Alexa FluorTM350(例如7-氨基-3-[2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基-2-氧代乙基]-4-甲基-2-氧代色烯-6-磺酸)、太平洋蓝TM(例如6,8-二氟-7-羟基-2-氧代色烯-3-甲酸)及其衍生物，
-基于花青的染料，特别是Cy5TM或Cy5.5TM，包括磺化和非磺化的形式，优选为磺化的形式，例如磺化的Cy5TM(例如sulfo-Cy5酸，图15)或磺化的Cy5.5TM(例如Sulfo-Cy5.5酸，图15)、吲哚花青绿(例如4-[(2Z)-2-[(2E,4E,6E)-7-[1,1-二甲基-3-(4-磺酸基丁基)苯并[e]吲哚-3-鎓-2-基]亚庚-2,4,6-三烯基]-1,1-二甲基苯并[e]吲哚-3-基]丁-1-磺酸钠)及其衍生物，
-基于二吡咯甲川的染料，特别是BODIPYTM染料(基于核心结构4,4-二氟-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省)例如BODIPYTM500/510(例如12-(2,2-二氟-12-甲基-1-氮杂-3-氮阳离子-2-硼负离子三环[7.3.0.03,7]十二碳-3,5,7,9,11-五烯-4-基)十二烷酸)及其衍生物，
-基于萘的染料，特别是prodan(6-丙酰基-2-二甲基氨基萘)及其衍生物，
-基于芘的染料，特别是Alexa FluorTM405(例如8-[2-[4-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基哌啶-1-基]-2-氧代乙氧基]芘-1,3,6-三磺酸三乙基铵)、瀑布蓝TM(例如[4-[[4-(二乙基氨基)苯基]-[4-(乙基氨基)萘-2-基]亚甲基]亚环己-2,5-二烯-1-基]-二乙基铵)及其衍生物，
-基于方酸的染料，特别是Seta染料例如Seta 650(CAS登记号2043938-22-1)、Seta 375(CAS登记号2043938-18-5)及其衍生物，
-基于方酸轮烷的染料，特别是SeTau染料例如SeTau 647(例如SeTau 647Di-NHS，CAS登记号1442086-02-3)、SeTau 488(例如SeTau-488-NHS，Seta Biomedicals，产品编号K9-3152，分子量：1642.73，λAb max.[nm]：486；ε[M–1cm–1]：59000；λEm max.[nm]：532；QY[％]：27)及其衍生物，
-基于呫吨的染料，特别是罗丹明染料例如MBTM660R(例如MBTM660R酸，参见图15)、ROX(羧基-X-罗丹明)、TAMRA(羧基四甲基罗丹明)、TEXTM615(CAS登记号1209486-62-3)及其衍生物，荧光素染料例如Alexa FluorTM488(例如Alexa FluorTM488酸，参见图15)、6-FAM(6-羧基荧光素)、HEX(六氯荧光素)、JOE(6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素)、MAX(CAS登记号1610888-25-9)、TET(四氯荧光素)和SUN(例如参见图15)及其衍生物，和基于carbopyronine的染料例如ATTOTM647(例如ATTOTM647酸，参见图15)及其衍生物，
和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，
及其组合。
更具体而言，所述至少一种荧光染料可以选自
-基于蒽的染料，特别是DRAQ5TM、Cytrak橙TM及其衍生物，
-基于香豆素的染料，特别是Alexa FluorTM350、太平洋蓝TM及其衍生物，
-基于花青的染料，特别是Cy5TM或Cy5.5TM，包括磺化和非磺化的形式，优选为磺化的形式，例如磺化的Cy5TM或磺化的Cy5.5TM、吲哚花青绿及其衍生物，
-基于二吡咯甲川的染料，特别是BODIPYTM染料例如BODIPYTM500/510及其衍生物，
-基于萘的染料，特别是prodan及其衍生物，
-基于芘的染料，特别是Alexa FluorTM405、瀑布蓝TM及其衍生物，
-基于方酸的染料，特别是Seta染料例如Seta 650、Seta 375及其衍生物，
-基于方酸轮烷的染料，特别是SeTau染料例如SeTau 647、SeTau488及其衍生物，
-基于呫吨的染料，特别是罗丹明染料例如MBTM660R、ROX、TAMRA、TEXTM615及其衍生物，荧光素染料例如Alexa FluorTM488、6-FAM、HEX、JOE、MAX、TET和SUN及其衍生物，和基于carbopyronine的染料例如ATTOTM647及其衍生物，
和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，
及其组合。
更具体而言，所述至少一种荧光染料可以选自基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料、基于呫吨的染料和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)及其组合。甚至更具体而言，所述至少一种荧光染料可以选自基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和基于呫吨的染料及其组合。
在特定实施方式中，所述至少一种荧光染料可以选自吖啶橙、DRAQ5TM、Cytrak橙、Alexa FluorTM350、太平洋蓝、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5TM)、CY5.5(优选为Sulfo-Cy5.5)、BODIPYTM500/510、prodan、Alexa FluorTM405、瀑布蓝、SetaTM650、SetaTM375、SetauTM647、SeTau 488、MBTM660R、Alexa FluorTM488、ATTOTM647和DAPI、其衍生物及其组合。
在另一个特定实施方式中，所述至少一种荧光染料可以选自DRAQ5TM、AlexaFluorTM350、太平洋蓝、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5TM)、BODIPYTM500/510、prodan、AlexaFluorTM405、瀑布蓝、SetaTM650、SetauTM647、SeTau 488、MBTM660R、Alexa FluorTM488、ATTOTM647和DAPI、其衍生物及其组合。
在另一个特定实施方式中，所述至少一种荧光染料可以选自DRAQ5TM、AlexaFluorTM350、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5TM)、BODIPYTM500/510、prodan、Alexa FluorTM405、SetaTM650、SetauTM647、MBTM660R、Alexa FluorTM488、ATTOTM647和DAPI、其衍生物及其组合。
在另一个特定实施方式中，所述至少一种荧光染料可以选自DRAQ5TM、Cytrak橙、Alexa FluorTM350、太平洋蓝、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5TM)、CY5.5(优选为Sulfo-Cy5.5)、BODIPYTM500/510、prodan、Alexa FluorTM405、瀑布蓝、SetaTM650、SetaTM375、SetauTM647、SeTau 488、MBTM660R、Alexa FluorTM488、ATTOTM647和DAPI、其衍生物及其组合。
在另一个特定实施方式中，所述至少一种荧光染料可以选自吖啶橙、DRAQ5TM、Cytrak橙、Alexa FluorTM350、太平洋蓝、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5TM)、CY5.5(优选为Sulfo-Cy5.5)、BODIPYTM500/510、prodan、Alexa FluorTM405、瀑布蓝、SetaTM650、SetaTM375、SetauTM647、SeTau 488、MBTM660R、Alexa FluorTM488和ATTOTM647、其衍生物及其组合。
在另一个特定实施方式中，所述至少一种荧光染料可以选自DRAQ5TM、Cytrak橙、Alexa FluorTM350、太平洋蓝、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5TM)、CY5.5(优选为Sulfo-Cy5.5)、BODIPYTM500/510、prodan、Alexa FluorTM405、瀑布蓝、SetaTM650、SetaTM375、SetauTM647、SeTau 488、MBTM660R、Alexa FluorTM488和ATTOTM647、其衍生物及其组合。
本文所使用的术语“衍生物”是指包含所述母体化合物的核心结构(即，定义染料的颜色或吸收/发射波长的芳香环骨架，例如蒽、香豆素、花青、二吡咯甲川、萘、芘、方酸、方酸轮烷、呫吨、罗丹明、荧光素或carbopyronine染料的核心结构)的荧光化合物，并且其与所述母体化合物的不同之处在于一个或几个化学修饰，例如取代基的修饰。例如，衍生物可以通过将至少一个取代基用另一个取代基代替、通过缺失至少一个取代基、通过添加至少一个取代基及其组合而不同于母体化合物。例如，可以将氢用卤素如氟或氯代替，可以将羟基(-OH)用羧酸部分(-COOH)代替，或者可以将羧酸部分用氢代替。可以考虑任何种类的取代基修饰，前提是得到的衍生物是荧光团并且适合于执行本发明的方法。
优选地，荧光染料的衍生物选自酯衍生物，特别是NHS酯(琥珀酰亚胺酯)衍生物、TFP酯(四氟苯基酯)衍生物、STP(4-磺基-2,3,5,6-四氟苯酚钠盐)酯衍生物或sulfo-NHS酯衍生物、羧酸衍生物、二苯并环辛炔(DBCO)衍生物、四嗪衍生物、酰肼衍生物、叠氮化物衍生物、反式-环辛烯(TCO)衍生物、炔烃衍生物、马来酰亚胺衍生物。更优选地，荧光染料的衍生物选自羧酸衍生物、二苯并环辛炔(DBCO)衍生物、NHS酯衍生物和马来酰亚胺衍生物。
在更特定实施方式中，所述至少一种荧光染料选自DRAQ5TM、Alexa FluorTM350NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5酸、BODIPYTM500/510、prodan、Alexa FluorTM405-DBCO、瀑布蓝、SetaTM650-DBCO、SeTau 488-NHS、SeTauTM647-马来酰亚胺、MBTM660R-酸、MBTM660R-DBCO、Alexa FluorTM488-酸、Alexa FluorTM488-DBCO、ATTOTM647-酸和DAPI及其组合。
在另一个更特定实施方式中，所述至少一种荧光染料选自DRAQ5TM、AlexaFluorTM350NHS酯、Sulfo-Cy5酸、BODIPYTM500/510、prodan、Alexa FluorTM405-DBCO、SetaTM650-DBCO、SeTauTM647-马来酰亚胺、MBTM660R-酸、MBTM660R-DBCO、Alexa FluorTM488-酸、Alexa FluorTM488-DBCO、ATTOTM647-酸和DAPI及其组合。
在另一个更特定实施方式中，所述至少一种荧光染料可以选自吖啶橙、DRAQ5TM、Cytrak橙、Alexa FluorTM350NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5酸、Sulfo-Cy5.5酸(优选为Sulfo-Cy5.5)、BODIPYTM500/510、prodan、Alexa FluorTM405-DBCO、瀑布蓝、SetaTM650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTauTM647-马来酰亚胺、SeTau 488-NHS、MBTM660R-酸、MBTM660R-DBCO、Alexa FluorTM488-酸、Alexa FluorTM488-DBCO、ATTOTM647-酸和DAPI、其衍生物及其组合。
在另一个更特定实施方式中，所述至少一种荧光染料可以选自DRAQ5TM、Cytrak橙、Alexa FluorTM350NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5酸、Sulfo-Cy5.5酸(优选为Sulfo-Cy5.5)、BODIPYTM500/510、prodan、Alexa FluorTM405-DBCO、瀑布蓝、SetaTM650-DBCO、Seta375-NHS、SeTauTM647-马来酰亚胺、SeTau 488-NHS、MBTM660R-酸、MBTM660R-DBCO、AlexaFluorTM488-酸、Alexa FluorTM488-DBCO、ATTOTM647-酸和DAPI、其衍生物及其组合。
在另一个更特定实施方式中，所述至少一种荧光染料可以选自吖啶橙、DRAQ5TM、Cytrak橙、Alexa FluorTM350NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5酸、Sulfo-Cy5.5酸(优选为Sulfo-Cy5.5)、BODIPYTM500/510、prodan、Alexa FluorTM405-DBCO、瀑布蓝、SetaTM650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTauTM647-马来酰亚胺、SeTau 488-NHS、MBTM660R-酸、MBTM660R-DBCO、Alexa FluorTM488-酸、Alexa FluorTM488-DBCO和ATTOTM647-酸、其衍生物及其组合。
在另一个更特定实施方式中，所述至少一种荧光染料可以选自DRAQ5TM、Cytrak橙、Alexa FluorTM350NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5酸、Sulfo-Cy5.5酸(优选为Sulfo-Cy5.5)、BODIPYTM500/510、prodan、Alexa FluorTM405-DBCO、瀑布蓝、SetaTM650-DBCO、Seta375-NHS、SeTauTM647-马来酰亚胺、SeTau 488-NHS、MBTM660R-酸、MBTM660R-DBCO、AlexaFluorTM488-酸、Alexa FluorTM488-DBCO和ATTOTM647-酸、其衍生物及其组合。
优选地，在本发明的方法中，将所述样品与1、2、3或4种荧光染料、更优选地与1或2种荧光染料接触。
在某些实施方式中，所述至少一种荧光染料是选自下述的组合：吖啶橙–DAPI、吖啶橙-Seta 375-NHS、吖啶橙-MB660R酸、吖啶橙–Alexa Fluor 350-NHS酯、吖啶橙-太平洋蓝-NHS酯、吖啶橙-Sulfo Cy5-酸、吖啶橙–BODIPY、吖啶橙–Prodan、吖啶橙-Alexa Fluor405-DBCO、吖啶橙-瀑布蓝、吖啶橙-Alexa Fluor 488-酸、DRAQ5-Alexa Fluor 350-NHS酯、DRAQ5-太平洋蓝-NHS酯、DRAQ5-Sulfo Cy5-酸、DRAQ5–BODIPY 500/510、DRAQ5–Prodan、DRAQ5-Alexa Fluor 405-DBCO、DRAQ5-瀑布蓝、DRAQ5-Seta 650-DBCO、DRAQ5-SeTau 647-马来酰亚胺、DRAQ5-MB660R-酸、DRAQ5-MB660R-DBCO、DRAQ5-ATTO647-酸、Cytrak橙-AlexaFluor 350-NHS酯、Cytrak橙-太平洋蓝-NHS酯、Cytrak橙-Sulfo Cy5-酸、Cytrak橙–BODIPY500/510、Cytrak橙–Prodan、Cytrak橙-Alexa Fluor 405-DBCO、Cytrak橙-瀑布蓝、Seta375-NHS-Alexa Fluor 350-NHS酯、Seta 375-NHS-太平洋蓝-NHS酯、Seta 375-NHS-SulfoCy5-酸、Seta 375-NHS-BODIPY 500/510、Seta 375-NHS–Prodan、Seta 375-NHS-AlexaFluor 405-DBCO、Seta 375-NHS-瀑布蓝、Alexa Fluor 488-酸-Alexa Fluor 350-NHS酯、Alexa Fluor 488-酸-太平洋蓝-NHS酯、Alexa Fluor 488-酸-Sulfo Cy5-酸、Alexa Fluor488-酸-BODIPY 500/510、Alexa Fluor 488-酸–Prodan、Alexa Fluor 488-酸-AlexaFluor 405-DBCO、Alexa Fluor 488-酸-瀑布蓝、MB660R-酸-Alexa Fluor 350-NHS酯、MB660R-酸-太平洋蓝-NHS酯、MB660R-酸-Sulfo Cy5-酸、MB660R-酸-BODIPY 500/510、MB660R-酸–Prodan、MB660R-酸-Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-酸-瀑布蓝、MB660R-酸-Seta 650-DBCO、MB660R-酸-SeTau 647-马来酰亚胺、MB660R-DBCO-Alexa Fluor 350-NHS酯、MB660R-DBCO-太平洋蓝-NHS酯、MB660R-DBCO-Sulfo Cy5-酸、MB660R-DBCO-BODIPY500/510、MB660R-DBCO–Prodan、MB660R-DBCO-Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-DBCO-瀑布蓝、MB660R-DBCO-Seta 650-DBCO、MB660R-DBCO-SeTau 647-马来酰亚胺、ATTO647-酸-Sulfo Cy5-酸、ATTO647-酸-Seta 650-DBCO、ATTO647-酸-SeTau 647-马来酰亚胺、ATTO647-酸-MB660R-酸、ATTO647-酸-MB660R-DBCO、Sulfo Cy5.5-酸-Sulfo Cy5-酸、SulfoCy5-酸-Seta 650-DBCO、Sulfo Cy5-酸-SeTau 647-马来酰亚胺和Seta 650-DBCO-SeTau647-马来酰亚胺，优选地选自吖啶橙-Seta 375-NHS、吖啶橙-MB660R酸、吖啶橙–AlexaFluor 350-NHS酯、吖啶橙-太平洋蓝-NHS酯、吖啶橙-Sulfo Cy5-酸、吖啶橙–BODIPY、吖啶橙–Prodan、吖啶橙-Alexa Fluor 405-DBCO、吖啶橙-瀑布蓝、吖啶橙-Alexa Fluor 488-酸、DRAQ5-Alexa Fluor 350-NHS酯、DRAQ5-太平洋蓝-NHS酯、DRAQ5-Sulfo Cy5-酸、DRAQ5–BODIPY 500/510、DRAQ5–Prodan、DRAQ5-Alexa Fluor 405-DBCO、DRAQ5-瀑布蓝、DRAQ5-Seta 650-DBCO、DRAQ5-SeTau 647-马来酰亚胺、DRAQ5-MB660R-酸、DRAQ5-MB660R-DBCO、DRAQ5-ATTO647-酸、Cytrak橙-Alexa Fluor350-NHS酯、Cytrak橙-太平洋蓝-NHS酯、Cytrak橙-Sulfo Cy5-酸、Cytrak橙–BODIPY 500/510、Cytrak橙–Prodan、Cytrak橙-Alexa Fluor405-DBCO、Cytrak橙-瀑布蓝、Seta 375-NHS-Alexa Fluor350-NHS酯、Seta 375-NHS-太平洋蓝-NHS酯、Seta 375-NHS-Sulfo Cy5-酸、Seta 375-NHS-BODIPY 500/510、Seta 375-NHS–Prodan、Seta 375-NHS-Alexa Fluor 405-DBCO、Seta 375-NHS-瀑布蓝、Alexa Fluor488-酸-Alexa Fluor 350-NHS酯、Alexa Fluor 488-酸-太平洋蓝-NHS酯、Alexa Fluor488-酸-Sulfo Cy5-酸、Alexa Fluor 488-酸-BODIPY 500/510、Alexa Fluor 488-酸–Prodan、Alexa Fluor 488-酸-Alexa Fluor 405-DBCO、Alexa Fluor 488-酸-瀑布蓝、MB660R-酸-Alexa Fluor 350-NHS酯、MB660R-酸-太平洋蓝-NHS酯、MB660R-酸-Sulfo Cy5-酸、MB660R-酸-BODIPY 500/510、MB660R-酸–Prodan、MB660R-酸-Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-酸-瀑布蓝、MB660R-酸-Seta 650-DBCO、MB660R-酸-SeTau 647-马来酰亚胺、MB660R-DBCO-Alexa Fluor 350-NHS酯、MB660R-DBCO-太平洋蓝-NHS酯、MB660R-DBCO-Sulfo Cy5-酸、MB660R-DBCO-BODIPY 500/510、MB660R-DBCO–Prodan、MB660R-DBCO-AlexaFluor 405-DBCO、MB660R-DBCO-瀑布蓝、MB660R-DBCO-Seta 650-DBCO、MB660R-DBCO-SeTau647-马来酰亚胺、ATTO647-酸-Sulfo Cy5-酸、ATTO647-酸-Seta 650-DBCO、ATTO647-酸-SeTau 647-马来酰亚胺、ATTO647-酸-MB660R-酸、ATTO647-酸-MB660R-DBCO、Sulfo Cy5.5-酸-Sulfo Cy5-酸、Sulfo Cy5-酸-Seta 650-DBCO、Sulfo Cy5-酸-SeTau 647-马来酰亚胺和Seta 650-DBCO-SeTau 647-马来酰亚胺。
在特定实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于如上所定义的嗜热嗜酸细菌(TAB)组、即属于脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)的微生物，优选地选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius和Alicyclobacilluscontaminans及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料及其组合，更优选地选自Alexa Fluor488、MB660R和ATTO647及其衍生物和组合，甚至更优选地选自Alexa Fluor 488-酸、AlexaFluor488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO和ATTO647-酸及其组合。在特别优选实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于如上所定义的嗜热嗜酸细菌(TAB)组、即属于脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)的微生物，优选地选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius和Alicyclobacillus contaminans及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自MB660R及其衍生物，优选地选自MB660R-酸和MB660R-DBCO及其组合，更优选为MB660R-DBCO。
在另一个特定实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于如上所定义的醋酸菌(AAB)组的微生物，优选地选自属于醋杆菌属(Acetobacter)、酸单胞菌属(Acidomonas)、亚细亚菌属(Asaia)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、雨山杆菌属(Ameyamaea)、熊蜂属(Bombella)、Commensalibacter、Endobacter、颗粒杆菌属(Granulibacter)、驹形杆菌属(Komagataeibacter)、公崎杆菌属(Kozakia)、新亚细亚菌属(Neoasaia)、新驹形杆菌属(Neokomagataea)、阮杆菌属(Nguyenibacter)、糖杆菌属(Saccharibacter)、斯瓦米纳坦杆菌属(Swaminathania)、斯温斯杆菌属(Swingsia)和塔堤查仁杆菌属(Tanticharoenia)的细菌及其组合，更优选地选自属于醋杆菌属(Acetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)和亚细亚菌属(Asaia)的细菌及其组合，甚至更优选地选自醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和暹罗亚细亚菌(Asaia siamensis)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料、基于carbopyronine的染料和DAPI及其组合，更优选地选自Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647和DAPI及其衍生物和组合，甚至更优选地选自Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647-酸和DAPI及其组合。优选地，所述至少一种荧光染料选自Alexa Fluor 488、MB660R和ATTO647及其衍生物和组合，更优选地选自Alexa Fluor488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO和ATTO647-酸及其组合。
在特别优选实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于如上所定义的醋酸菌(AAB)组的微生物，优选地选自属于醋杆菌属(Acetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)和亚细亚菌属(Asaia)的细菌及其组合，甚至更优选地选自醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和暹罗亚细亚菌(Asaia siamensis)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自Alexa Fluor 488、MB660R和ATTO647及其衍生物和组合，优选地选自Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸和ATTO647-酸及其组合，更优选地选自MB660R和ATTO647及其衍生物和组合，特别是选自MB660R-酸和ATTO647-酸及其组合。
在另一个特定实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于如上所定义的乳酸菌(LAB)组的微生物，优选地选自属于乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、肉杆菌属(Carnobacterium)、链球菌属(Streptococcus)和魏斯氏菌属(Weissellas)的细菌及其组合，更优选地选自属于乳杆菌属(Lactobacillus)和魏斯氏菌属(Weissellas)的细菌及其组合，甚至更优选地选自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料，优选地选自罗丹明染料、荧光素染料、基于carbopyronine的染料和DAPI及其组合，更优选地选自Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647和DAPI及其衍生物和组合，甚至更优选地选自Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO和ATTO647-酸及其组合。在特别优选实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于如上所定义的乳酸菌(LAB)组的微生物，优选地选自属于乳杆菌属(Lactobacillus)和魏斯氏菌属(Weissellas)的细菌及其组合，甚至更优选地选自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647和DAPI及其衍生物和组合，优选地选自AlexaFluor 488-酸、Alexa Fluor488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647-酸和DAPI及其组合。在优选实施方式中，所述至少一种荧光染料选自Alexa Fluor 488、MB660R和DAPI及其衍生物和组合，优选地选自Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸和DAPI及其组合，更优选地选自Alexa Fluor 488-酸和MB660R-酸及其组合，甚至更优选为MB660R-酸。在另一个优选实施方式中，所述至少一种荧光染料选自Alexa Fluor 488和MB660R及其衍生物和组合，优选地选自Alexa Fluor 488-酸和MB660R-酸及其组合。
在另一个特定实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于厌氧细菌组的微生物，优选地选自梭状芽孢杆菌属(Clostridium)和丙酸杆菌属(Cutibacterium)细菌及其组合，更优选地选自生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridiumsporogenes)和痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料(优选为罗丹明染料)、基于花青的染料和DAPI及其组合，优选地选自MB660R、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自MB660R-DBCO、Sulfo-Cy5酸和DAPI及其组合。具体而言，在这个实施方式中，所述至少一种荧光染料可以是MB660R与Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)的组合，特别是MB660R-DBCO与Sulfo-Cy5酸的组合。
在另一个特定实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于如上所定义的好氧中温细菌(AMB)组的微生物，优选地选自属于甲基杆菌属(Methylobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、克罗诺杆菌属(Cronobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、肠球菌属(Enterococcus)、李斯特菌属(Listeria)、志贺氏菌属(Shigella)、考克氏菌属(Kocuria)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的细菌及其组合，更优选地选自扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuriarhizophila)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和DAPI及其组合，优选地选自DRAQ5TM、Alexa FluorTM350、太平洋蓝、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、BODIPYTM染料(优选为BODIPY 500/510)、prodan、Alexa FluorTM405、瀑布蓝、Seta染料(优选为Seta 650)、SeTau染料(优选为SeTau 647或SeTau 488)、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自DRAQ5TM、Alexa FluorTM350-NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、BODIPY 500/510、prodan、Alexa FluorTM405-DBCO、瀑布蓝、Seta 650-DBCO、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488-酸、AlexaFluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647-酸和DAPI及其组合。具体而言，所述至少一种荧光染料可以选自DRAQ5TM、Alexa FluorTM350、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、BODIPYTM染料(优选为BODIPY 500/510)、prodan、Alexa FluorTM405、Seta染料(优选为Seta 650)、SeTau染料(优选为SeTau 647)、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自DRAQ5TM、Alexa FluorTM350-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、BODIPY 500/510、prodan、Alexa FluorTM405-DBCO、Seta 650-DBCO、SeTau 647-马来酰亚胺、Alexa Fluor488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647-酸和DAPI及其组合。
更具体而言，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以属于或包含属于如上所定义的好氧中温细菌(AMB)组的微生物，优选地选自属于甲基杆菌属(Methylobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、克罗诺杆菌属(Cronobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、肠球菌属(Enterococcus)、志贺氏菌属(Shigella)、考克氏菌属(Kocuria)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的细菌及其组合，更优选地选自扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuriarhizophila)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自吖啶染料、基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和DAPI及其组合，优选地选自吖啶橙、DRAQ5TM、Cytrak橙、Alexa FluorTM350、太平洋蓝、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、Cy5.5TM(优选为Sulfo-Cy5.5)、BODIPYTM染料(优选为BODIPY 500/510)、prodan、Alexa FluorTM405、瀑布蓝、Seta染料(优选为Seta 650或Seta 375)、SeTau染料(优选为SeTau 647或SeTau 488)、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自吖啶橙、DRAQ5TM、Cytrak橙、Alexa FluorTM350-NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、Sulfo-Cy5.5-酸、BODIPY 500/510、prodan、Alexa FluorTM405-DBCO、瀑布蓝、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647-酸和DAPI及其组合。具体而言，所述至少一种荧光染料可以选自DRAQ5TM、Cytrak橙、Alexa FluorTM350、太平洋蓝、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、Cy5.5TM(优选为Sulfo-Cy5.5)、BODIPYTM染料(优选为BODIPY500/510)、prodan、Alexa FluorTM405、瀑布蓝、Seta染料(优选为Seta 650或Seta 375)、SeTau染料(优选为SeTau 647或SeTau 488)、Alexa Fluor 488、MB660R和ATTO647及其衍生物和组合，更优选地选自DRAQ5TM、Cytrak橙、Alexa FluorTM350-NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、Sulfo-Cy5.5-酸、BODIPY 500/510、prodan、Alexa FluorTM405-DBCO、瀑布蓝、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau 488-NHS、AlexaFluor488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO和ATTO647-酸及其组合。
在优选实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物可以属于或包含属于如上所定义的好氧中温细菌(AMB)组的微生物，优选地选自属于甲基杆菌属(Methylobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、克罗诺杆菌属(Cronobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、肠球菌属(Enterococcus)、志贺氏菌属(Shigella)、考克氏菌属(Kocuria)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的细菌及其组合，更优选地选自扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自MB660R及其衍生物和组合，任选地与选自Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)的荧光染料组合。优选地，所述至少一种荧光染料是MB660R-DBCO，任选地与Sulfo-Cy5-酸组合。
在另一个特定实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于如上所定义的革兰氏阴性细菌组的微生物，优选地选自属于埃希氏杆菌属(Escherichia)和假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌及其组合，更优选地选自大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料(优选为罗丹明染料)、基于芘的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料和DAPI及其组合，优选地选自Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、Alexa FluorTM350、AlexaFluorTM405、MB660R和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自Sulfo-Cy5-酸、AlexaFluorTM350-NHS酯、Alexa FluorTM405-DBCO、MB660R-DBCO和DAPI及其组合。甚至更优选地，所述至少一种荧光染料选自Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、Alexa FluorTM350、AlexaFluorTM405和MB660R及其衍生物和组合，更优选地选自Sulfo-Cy5-酸、Alexa FluorTM350-NHS酯、Alexa FluorTM405-DBCO和MB660R-DBCO及其组合。
更具体而言，所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料(优选为罗丹明染料)和基于花青的染料及其组合，优选地选自Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、MB660R及其衍生物和组合，更优选地选自Sulfo-Cy5-酸和MB660R-DBCO及其组合。可选地，所述至少一种荧光染料可以选自基于芘的染料、基于香豆素的染料及其组合，优选地选自Alexa FluorTM350和Alexa FluorTM405及其衍生物和组合，更优选地选自Alexa FluorTM350-NHS酯、AlexaFluorTM405-DBCO及其组合。具体而言，所述至少一种荧光染料可以是Alexa FluorTM350-NHS酯、Alexa FluorTM405-DBCO的组合。
在另一个特定实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于如上所定义的革兰氏阴性细菌组的微生物，优选地选自属于埃希氏杆菌属(Escherichia)、变形杆菌属(Proteus)和假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌及其组合，更优选地选自大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)及其组合，并且所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料(优选为罗丹明染料)、基于花青的染料和DAPI及其组合，优选地选自Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、MB660R和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自Sulfo-Cy5-酸、MB660R-DBCO和DAPI及其组合。更具体而言，所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料(优选为罗丹明染料)和基于花青的染料及其组合，优选地选自Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、MB660R及其衍生物和组合，更优选地选自Sulfo-Cy5-酸和MB660R-DBCO及其组合。
在另一个特定实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于如上所定义的革兰氏阳性细菌组的微生物，优选地选自属于葡萄球菌属(Staphylococcus)和肠球菌属(Enterococcus)的细菌及其组合，更优选地选自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)及其组合，并且所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料(优选为罗丹明染料)、基于花青的染料和DAPI及其组合，优选地选自Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、MB660R和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自Sulfo-Cy5-酸、MB660R-DBCO和DAPI及其组合。更具体而言，所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料(优选为罗丹明染料)和基于花青的染料及其组合，优选地选自Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、MB660R及其衍生物和组合，更优选地选自Sulfo-Cy5-酸和MB660R-DBCO及其组合。
在另一个特定实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于如上所定义的革兰氏阳性或阴性细菌组的微生物，优选地选自属于埃希氏杆菌属(Escherichia)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和肠球菌属(Enterococcus)的细菌及其组合，更优选地选自大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)及其组合，并且所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料(优选为罗丹明染料)、基于花青的染料和DAPI及其组合，优选地选自Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、MB660R和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自Sulfo-Cy5-酸、MB660R-DBCO和DAPI及其组合。更具体而言，所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料(优选为罗丹明染料)和基于花青的染料及其组合，优选地选自Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、MB660R及其衍生物和组合，更优选地选自Sulfo-Cy5-酸和MB660R-DBCO及其组合。
在另一个特定实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于如上所定义的异养细菌组的微生物，优选地选自属于不动杆菌属(Acinetobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、莫拉氏菌属(Moraxella)、泛菌属(Pantoea)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、罗尔斯通菌属(Ralstonia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、微球菌属(Micrococcus)和葡萄球菌属(Staphylococcus)的细菌及其组合，更优选地选自鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumanii)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropic)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、滕黄微球菌(Micrococcus luteus)(嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自吖啶染料、基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和DAPI及其组合，优选地选自吖啶橙、DRAQ5TM、Cytrak橙、Alexa FluorTM350、太平洋蓝、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、Cy5.5TM(优选为Sulfo-Cy5.5)、BODIPYTM染料(优选为BODIPY 500/510)、prodan、Alexa FluorTM405、瀑布蓝、Seta染料(优选为Seta 650或Seta 375)、SeTau染料(优选为SeTau 647或SeTau 488)、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自吖啶橙、DRAQ5TM、Cytrak橙、Alexa FluorTM350-NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、Sulfo-Cy5.5-酸、BODIPY 500/510、prodan、Alexa FluorTM405-DBCO、瀑布蓝、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau 488-NHS、AlexaFluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647-酸和DAPI及其组合。
具体而言，所述至少一种荧光染料可以选自DRAQ5TM、Cytrak橙、AlexaFluorTM350、太平洋蓝、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、Cy5.5TM(优选为Sulfo-Cy5.5)、BODIPYTM染料(优选为BODIPY 500/510)、prodan、Alexa FluorTM405、瀑布蓝、Seta染料(优选为Seta650或Seta 375)、SeTau染料(优选为SeTau 647或SeTau 488)、Alexa Fluor 488、MB660R和ATTO647及其衍生物和组合，更优选地选自DRAQ5TM、Cytrak橙、Alexa FluorTM350-NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、Sulfo-Cy5.5-酸、BODIPY 500/510、prodan、AlexaFluorTM405-DBCO、瀑布蓝、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau488-NHS、Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO和ATTO647-酸及其组合。
在优选实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于如上所定义的异养细菌组的微生物，优选地选自属于不动杆菌属(Acinetobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、莫拉氏菌属(Moraxella)、泛菌属(Pantoea)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、罗尔斯通菌属(Ralstonia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、微球菌属(Micrococcus)和葡萄球菌属(Staphylococcus)的细菌及其组合，更优选地选自鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumanii)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropic)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、滕黄微球菌(Micrococcus luteus)(嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自i)Alexa Fluor 350或其衍生物与Alexa Fluor 405或其衍生物的组合，和(ii)MB660R或其衍生物与Sulfo-Cy5或其衍生物的组合，优选地选自AF350-NHS酯与AF405-DBCO的组合和MB660R-DBCO与Sulfo-Cy5-酸的组合。
在另一个特定实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于如上所定义的酵母和霉菌组的微生物，优选地选自属于假丝酵母属(Candida)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)、地霉属(Geotrichum)和青霉属(Penicillium)的真菌及其组合，更优选地选自白假丝酵母(Candida albicans)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白地霉(Geotrichum candidum)、宛氏青霉(Penicillium variotii)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自吖啶染料、基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和DAPI及其组合，优选地选自吖啶橙、Alexa FluorTM350、太平洋蓝、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、prodan、Alexa FluorTM405、瀑布蓝、BODIPY 500/510、Seta染料(优选为Seta 650)、SeTau染料(优选为SeTau 647或SeTau 488)、Alexa Fluor 488、MB660R和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自吖啶橙、Alexa FluorTM350-NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、prodan、Alexa FluorTM405-DBCO、瀑布蓝、BODIPY 500/510、Seta 650-DBCO、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸、MB660R-DBCO和DAPI及其组合。更具体而言，所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和DAPI及其组合，优选地选自Alexa FluorTM350、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、prodan、Alexa FluorTM405、Seta染料(优选为Seta 650)、SeTau染料(优选为SeTau 647)、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自Alexa FluorTM350-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、prodan、Alexa FluorTM405-DBCO、Seta 650-DBCO、SeTau 647-马来酰亚胺、Alexa Fluor488-酸、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647-酸和DAPI及其组合。甚至更具体而言，所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和DAPI及其组合，优选地选自Alexa FluorTM350、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、prodan、Alexa FluorTM405、Seta染料(优选为Seta 650)、SeTau染料(优选为SeTau 647)、Alexa Fluor 488、MB660R和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自Alexa FluorTM350-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、prodan、Alexa FluorTM405-DBCO、Seta 650-DBCO、SeTau 647-马来酰亚胺、Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸、MB660R-DBCO和DAPI及其组合。
在另一个特定实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于如上所定义的酵母和霉菌组的微生物，优选地选自属于假丝酵母属(Candida)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)、地霉属(Geotrichum)和青霉属(Penicillium)的真菌及其组合，更优选地选自白假丝酵母(Candida albicans)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白地霉(Geotrichum candidum)、宛氏青霉(Penicillium variotii)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合，优选地选自Alexa FluorTM350、太平洋蓝、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、prodan、Alexa FluorTM405、瀑布蓝、BODIPY 500/510、Seta染料(优选为Seta 650)、SeTau染料(优选为SeTau 647或SeTau 488)、Alexa Fluor 488和MB660R及其衍生物和组合，更优选地选自Alexa FluorTM350-NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、prodan、AlexaFluorTM405-DBCO、瀑布蓝、BODIPY 500/510、Seta 650-DBCO、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau488-NHS、Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸和MB660R-DBCO及其组合。
在优选实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于如上所定义的酵母和霉菌组的微生物，优选地选自属于假丝酵母属(Candida)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)、地霉属(Geotrichum)和青霉属(Penicillium)的真菌及其组合，更优选地选自白假丝酵母(Candida albicans)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白地霉(Geotrichum candidum)、宛氏青霉(Penicillium variotii)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自MB660R及其衍生物和组合，更优选为MB660R-DBCO。
在另一个特定实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物包含
-一种或几种细菌，优选地选自如上所定义的嗜热嗜酸细菌(TAB)、醋酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、厌氧细菌、好氧中温细菌、革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌组及其组合，以及
-一种或几种微观真菌，优选地选自如上所定义的酵母和霉菌，并且
所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合，优选地选自Alexa FluorTM350、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、Alexa FluorTM405、Seta染料(优选为Seta 650)、SeTau染料(优选为SeTau647)、Alexa Fluor 488和MB660R及其衍生物和组合，更优选地选自Alexa FluorTM350-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、Alexa FluorTM405-DBCO、Seta 650-DBCO、SeTau 647-马来酰亚胺、AlexaFluor 488-酸、MB660R-酸和MB660R-DBCO及其组合，甚至更优选地选自Sulfo-Cy5-酸和MB660R-DBCO及其组合。具体而言，所述至少一种荧光染料可以是Sulfo-Cy5-酸与MB660R-DBCO的组合。
优选地，在这个实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物选自属于脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)(例如酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacillus contaminans)、醋杆菌属(Acetobacter)(例如醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti))、葡糖醋杆菌属(Gluconoacetobacter)(例如液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens))、葡糖杆菌属(Gluconobacter)(例如氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans))、亚细亚菌属(Asaia)(例如暹罗亚细亚菌(Asaia siamensis))、乳杆菌属(Lactobacillus)(例如干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum))、魏斯氏菌属(Weissellas)(例如融合魏斯氏菌(Weissellas confusa))、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)(例如生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes))、丙酸杆菌属(Cutibacterium)(例如痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes))、甲基杆菌属(Methylobacterium)(例如扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens))、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli))、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、不动杆菌属(Acinetobacter)(例如鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii))、克罗诺杆菌属(Cronobacter)(例如阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii))、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium))、肠球菌属(Enterococcus)(例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis))、李斯特菌属(Listeria)(例如格氏李斯特菌(Listeria grayi))、志贺氏菌属(Shigella)(例如宋内志贺氏菌(Shigella sonnei))、考克氏菌属(Kocuria)(例如嗜根考克氏菌(Kocuriarhizophila))、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)(例如洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia))的细菌，以及属于假丝酵母属(Candida)(例如白假丝酵母(Candida albicans))、接合酵母属(Zygosaccharomyces)(例如拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii))、曲霉属(Aspergillus)(例如巴西曲霉(Aspergillusbrasiliensis))、地霉属(Geotrichum)(白地霉(Geotrichum candidum))、酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))和青霉属(Penicillium)(例如宛氏青霉(Penicillium variotii)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum))的真菌及其组合。
更优选地，在这个实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacilluscontaminans、醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacterliquefaciens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、暹罗亚细亚菌(Asaiasiamensis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)、生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridiumsporogenes)、痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)、扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、白假丝酵母(Candida albicans)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白地霉(Geotrichum candidum)、宛氏青霉(Penicilliumvariotii)和产黄青霉(Penicillium chrysogenum)及其组合。
更优选地，在这个实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物选自属于魏斯氏菌属(Weissellas)(例如融合魏斯氏菌(Weissellas confusa))、丙酸杆菌属(Cutibacterium)(例如痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes))、甲基杆菌属(Methylobacterium)(例如扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens))、肠球菌属(Enterococcus)(例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis))的细菌，以及属于假丝酵母属(Candida)(例如白假丝酵母(Candida albicans))和曲霉属(Aspergillus)(例如巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis))的真菌及其组合，特别是选自融合魏斯氏菌(Weissellasconfusa)、痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)、扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、白假丝酵母(Candida albicans)和巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)及其组合。
在另一个特定实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物包含
-一种或几种细菌，优选地选自如上所定义的嗜热嗜酸细菌(TAB)、醋酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、厌氧细菌、好氧中温细菌、革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌、异养细菌组及其组合，以及
-一种或几种微观真菌，优选地选自如上所定义的酵母和霉菌，并且
所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合，优选地选自Alexa FluorTM350、太平洋蓝TM、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、Alexa FluorTM405、瀑布蓝TM、Seta染料(优选为Seta 650)、SeTau染料(优选为SeTau 647或SeTau 488)、Alexa Fluor 488和MB660R及其衍生物和组合，更优选地选自Alexa FluorTM350-NHS酯、太平洋蓝TM-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、Alexa FluorTM405-DBCO、瀑布蓝TM、Seta 650-DBCO、SeTau 488-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、Alexa Fluor488-酸、MB660R-酸和MB660R-DBCO及其组合，甚至更优选地选自Sulfo-Cy5-酸和MB660R-DBCO及其组合。具体而言，所述至少一种荧光染料可以是Sulfo-Cy5-酸与MB660R-DBCO的组合。
优选地，在这个实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物选自属于脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)(例如酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacillus contaminans)、醋杆菌属(Acetobacter)(例如醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti))、葡糖醋杆菌属(Gluconoacetobacter)(例如液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens))、葡糖杆菌属(Gluconobacter)(例如氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans))、亚细亚菌属(Asaia)(例如暹罗亚细亚菌(Asaia siamensis))、乳杆菌属(Lactobacillus)(例如干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum))、魏斯氏菌属(Weissellas)(例如融合魏斯氏菌(Weissellas confusa))、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)(例如生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes))、丙酸杆菌属(Cutibacterium)(例如痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes))、甲基杆菌属(Methylobacterium)(例如扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens))、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli))、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、不动杆菌属(Acinetobacter)(例如鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii))、克罗诺杆菌属(Cronobacter)(例如阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii))、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium))、肠球菌属(Enterococcus)(例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis))、李斯特菌属(Listeria)(例如格氏李斯特菌(Listeria grayi))、志贺氏菌属(Shigella)(例如宋内志贺氏菌(Shigella sonnei))、考克氏菌属(Kocuria)(例如嗜根考克氏菌(Kocuriarhizophila))、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)(例如洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia))、气单胞菌属(Aeromonas)(例如嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila))、短波单胞菌属(Brevundimonas)(例如缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta))、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)(例如弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii))、爱德华氏菌属(Edwardsiella)(例如迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda))、肠杆菌属(Enterobacter)(例如产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes))、苍白杆菌属(Ochrobactrum)(例如人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropic))、莫拉氏菌属(Moraxella)(例如奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis))、泛菌属(Pantoea)(例如成团泛菌(Pantoea agglomerans))、变形杆菌属(Proteus)(例如奇异变形杆菌(Proteusmirabilis))、罗尔斯通菌属(Ralstonia)(例如皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens))、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)(例如少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis))、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)(例如嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia))、弧菌属(Vibrio)(例如副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus))、耶尔森氏菌属(Yersinia)(例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica))的细菌及其组合。
更优选地，在这个实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacilluscontaminans、醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacterliquefaciens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、暹罗亚细亚菌(Asaiasiamensis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)、生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridiumsporogenes)、痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)、扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropic)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、成团泛菌(Pantoeaagglomerans)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstoniapickettii)、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、白假丝酵母(Candida albicans)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白地霉(Geotrichum candidum)、宛氏青霉(Penicillium variotii)和产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)及其组合。
甚至更优选地，在这个实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacilluscontaminans、醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacterliquefaciens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、暹罗亚细亚菌(Asaiasiamensis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)、生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridiumsporogenes)、痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)、扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropic)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)、黏质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、白假丝酵母(Candida albicans)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白地霉(Geotrichum candidum)、宛氏青霉(Penicillium variotii)和产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)及其组合。
本文公开了本发明的方法的任何实施方式，
-其中所述微生物是表1中所定义的微生物A，或者其中所述感兴趣的成组微生物包含表1中所定义的微生物A，并且
-其中所述至少一种荧光染料是表1中所定义的荧光染料B。
在其中将样品在过滤膜上过滤的实施方式中，所述过滤膜优选为表1中所定义的膜C。
具体公开了表1的微生物、荧光染料和任选的膜的每种组合。因此，作为说明，本文具体公开了任选地在PVDF膜上过滤后使用Alexa Fluor 488-酸来检测或计数样品中的酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)，或任选地在MCE膜上过滤后使用DAPI来检测或计数样品中的醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)。
表1：可用于检测微生物的荧光染料的实例
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在某些实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、暹罗亚细亚菌(Asaia siamensis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的微生物及其组合，并且所述至少一种荧光染料是Alexa Fluor488或其衍生物，优选为Alexa Fluor 488-酸。
在某些实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens)、暹罗亚细亚菌(Asaia siamensis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)的微生物及其组合，并且所述至少一种荧光染料是Alexa Fluor 488或其衍生物，优选为Alexa Fluor 488-DBCO。
在某些实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacilluscontaminans、醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacterliquefaciens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、暹罗亚细亚菌(Asaiasiamensis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomycesbailii)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、白假丝酵母(Candida albicans)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、宛氏青霉(Penicillium variotii)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、白地霉(Geotrichum candidum)、痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)、生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的微生物及其组合，并且所述至少一种荧光染料是MB660R或其衍生物，优选为MB660R-酸和/或MB660R-DBCO。
在某些实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacilluscycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacillus contaminans、醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、暹罗亚细亚菌(Asaia siamensis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的微生物及其组合，并且所述至少一种荧光染料是MB660R或其衍生物，优选为MB660R-酸。
在某些实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacilluscontaminans、醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacterliquefaciens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomycesbailii)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、白假丝酵母(Candida albicans)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、宛氏青霉(Penicillium variotii)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、白地霉(Geotrichum candidum)、痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)、生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的微生物及其组合，并且所述至少一种荧光染料是MB660R或其衍生物，优选为MB660R-DBCO。任选地，所述至少一种荧光染料还包含Cy5，优选为SulfoCy-5或其衍生物，优选为Sulfo Cy5-酸。
在某些实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius、Alicyclobacilluscontaminans、醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacterliquefaciens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomycesbailii)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、白假丝酵母(Candida albicans)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、宛氏青霉(Penicillium variotii)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、白地霉(Geotrichum candidum)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)的微生物及其组合，并且所述至少一种荧光染料是MB660R或其衍生物，优选为MB660R-DBCO。
在某些实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含选自痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)、生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、成团泛菌(Pantoeaagglomerans)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的微生物及其组合，并且所述至少一种荧光染料是MB660R或其衍生物与Cy5、优选为Sulfo Cy-5或其衍生物的组合，优选为MB660R-DBCO与Sulfo Cy5-酸的组合。
在某些实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、暹罗亚细亚菌(Asaia siamensis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的微生物及其组合，并且所述至少一种荧光染料是ATTO647或其衍生物，优选为ATTO647-酸。
在某些实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含选自醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)和奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)的微生物及其组合，并且所述至少一种荧光染料是DAPI。
在某些实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含选自巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、白假丝酵母(Candida albicans)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的微生物及其组合，并且所述至少一种荧光染料是Alexa Fluor 350或其衍生物，优选为Alexa Fluor 350-NHS酯。任选地，所述至少一种荧光染料还包含Alexa Fluor 405或其衍生物，优选为AlexaFluor 405-DBCO。
在某些实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含选自巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、白假丝酵母(Candida albicans)、痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)、生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、宋内志贺氏菌(Shigellasonnei)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstoniapickettii)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、黏质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的微生物及其组合，并且所述至少一种荧光染料是Cy5(优选为Sulfo-Cy5)或其衍生物，优选为SulfoCy5-酸。任选地，所述至少一种荧光染料还包含MB660R或其衍生物，优选为MB660R-DBCO。
在某些实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含选自巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、白假丝酵母(Candida albicans)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的微生物及其组合，并且所述至少一种荧光染料是Cy5(优选为Sulfo-Cy5)或其衍生物，优选为Sulfo Cy5-酸。
在某些实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)，并且所述至少一种荧光染料是Cy5.5(优选为Sulfo-Cy5.5)或其衍生物，优选为Sulfo Cy5.5-酸。
在某些实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含选自巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、白假丝酵母(Candida albicans)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的微生物及其组合，并且所述至少一种荧光染料是Alexa Fluor 405或其衍生物，优选为Alexa Fluor 405-DBCO。任选地，所述至少一种荧光染料还包含Alexa Fluor 350或其衍生物，优选为AlexaFluor 350-NHS酯。
在某些实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含选自巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)和大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)的微生物及其组合，并且所述至少一种荧光染料是吖啶橙。
在某些实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含选自巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、白假丝酵母(Candida albicans)和大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)的微生物及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自Bodipy 500/510；Alexa Fluor 350或其衍生物，优选为Alexa Fluor 350-NHS酯；太平洋蓝或其衍生物，优选为太平洋蓝-NHS酯；prodan；Alexa Fluor 405或其衍生物，优选为Alexa Fluor 405-DBCO；瀑布蓝；Seta 650或其衍生物，优选为Seta 650-DBCO；Setau 488或其衍生物，优选为Setau 488-NHS；Setau 647或其衍生物，优选为Setau 647-马来酰亚胺，及其任何组合。
在某些实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含选自白假丝酵母(Candida albicans)和大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)的微生物及其组合，并且所述至少一种荧光染料是Seta 375或其衍生物，优选为Seta 375-NHS。
在某些实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含选自大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的微生物及其组合，并且所述至少一种荧光染料是DRAQ5。
在某些实施方式中，所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)，并且所述至少一种荧光染料是Cytrak橙。
包含荧光染料的溶液可以在将生长培养基倾倒在容器中之前掺入到所述培养基中，或者可以倾倒在所述固体生长培养基的表面上或在其上划线。优选地，在将固体生长培养基与样品接触之前或之后，将所述荧光染料倾倒在所述生长培养基的表面上或在其上划线。在其中在步骤a)之前已将样品浓缩在膜滤器上的实施方式中，可以将所述荧光染料倾倒(均匀地或作为液滴)在所述固体生长培养基的表面上，然后将所述膜滤器置于所述生长培养基的表面上，从而接触生长培养基和荧光染料两者。或者，可以在膜上过滤/浓缩之前将所述荧光染料添加到样品中，或者可以在过滤样品之前或之后，优选地在过滤样品之后，将所述荧光染料在同一个膜上过滤。然后可以将所述膜滤器放置在所述生长培养基的表面上。
每种荧光染料的浓度和体积可以由专业技术人员容易地调节。通常，所述荧光染料以1μM至1mM范围内，优选地1μM至500μM范围内，优选地5μM至250μM范围内的浓度使用。在其中将所述荧光染料倾倒在固体生长培养基的表面上，然后将膜滤器(47mm)放置在所述生长培养基的表面上的实施方式中，含有荧光染料的液滴的体积通常在100μL至300μL之间，优选地在150μL至200μL之间。
温育条件和时间
在本发明的方法的步骤b)中，将包含如上所定义的样品、生长培养基和至少一种荧光染料的容器在足以形成所述感兴趣的微生物或成组微生物的微菌落的条件下温育足够的时间。因此，微生物的生长在存在所述荧光染料的情况下进行。
本文所使用的术语“微菌落”是指已生长几小时或几天(取决于微生物)并且肉眼不可见或几乎不可见的菌落。通常，微菌落的尺寸小于500μm，优选地在10μm至200μm之间。
获得微菌落所需的温育时间取决于所述微生物，特别是取决于微生物的传代时间。这种温育时间可以由专业技术人员根据感兴趣的微生物或成组微生物以及影响传代时间的参数例如温度和生长培养基的类型，容易地调整。通常，温育时间在3h至96h的范围内。所述生长培养基或膜滤器的表面可以使用荧光显微镜或另一种适合的系统，在一个或多个特定波长下定期显微镜监测生长，以便调整温育时间。
类似地，温育条件、特别是气氛和温度条件，也取决于所述微生物。这些条件可以被改变以便有利于所述感兴趣的微生物或成组微生物和/或限制其他微生物的污染。
具体而言，所述温育可以在好氧、半好氧(通常在2至10％的氧气之间)或厌氧条件下进行。在半好氧或厌氧条件下，可以升高二氧化碳的浓度以便有利于嗜二氧化碳微生物，通常达到1至20％的二氧化碳之间的值。
温度通常在15℃至50℃之间，优选地20℃至45℃之间的范围内。然而，极端微生物可以在低于15℃或高于50℃的温度下培养。温育温度可以由专业技术人员根据感兴趣的微生物或成组微生物容易地调整。嗜热微生物例如TAB通常在37℃至48℃之间，优选地约45℃下培养。中温微生物通常在30℃至40℃之间，优选地约35℃下培养。醋酸菌和微观真菌通常在20℃至30℃之间，优选地约25℃下培养。乳酸菌通常在20℃至40℃之间，优选地约30℃下培养。
在其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于嗜热嗜酸细菌的实施方式中，温育时间优选为至少20h，更优选地在20h至30h之间，甚至更优选为约24h，并且温度优选为至少40℃，更优选地在40℃至50℃之间，甚至更优选为约45℃。
在其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于醋酸菌的实施方式中，温育时间优选为至少35h，更优选地在35h至72h之间，甚至更优选为约48h，并且温度优选为至少20℃，更优选地在20℃至30℃之间，甚至更优选为约25℃。
在其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于乳酸菌的实施方式中，温育时间优选为至少20h，更优选地在20h至48h之间，甚至更优选为约24h，并且温度优选为至少20℃，更优选地在20℃至40℃之间，甚至更优选为约30℃。
在其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于好氧中温细菌的实施方式中，温育时间优选为至少8h，更优选地在10h至36h之间，甚至更优选地在10h至24h之间，并且温度优选为至少25℃，更优选地在25℃至40℃之间，甚至更优选为约35℃。然而，某些中温细菌例如扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)可能需要更长的温育时间，例如长达96h。
在其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于厌氧细菌的实施方式中，温育时间优选为至少10h，更优选地在20h至72h之间，甚至更优选地在20h至24h之间，并且温度优选为至少20℃，更优选地在20℃至45℃之间，甚至更优选为约37℃。然而，某些厌氧细菌例如痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)可能需要更长的温育时间，例如长达96h。
在其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于如上所定义的异养细菌的实施方式中，温育时间优选为至少8h，更优选地在14h至48h之间，甚至更优选地在24h至42h之间，并且温度优选地在20℃至37℃之间，更优选地在32℃至37℃之间，甚至更优选为约32.5℃。然而，某些异养细菌例如扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)可能需要更长的温育时间，例如在22.5℃下长达96h。
在其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于微观真菌的实施方式中，温育时间优选为至少20h，更优选地在30h至50h之间，甚至更优选地在30h至40h之间，并且温度优选为至少20℃，更优选地在20℃至35℃之间，甚至更优选为约25℃。
当然，当所述感兴趣的成组微生物包含属于不同组的微生物时，温育时间以及温度必须进行调整，以便允许每种微生物的生长。
在某些实施方式中，特别是当所述方法被用于评估样品的无菌性时，温育时间可以延长，以便检测样品中存在的任何微生物的生长。通常，在这种情况下，可以将所述容器温育至少48h或甚至至少72h。
检测
在本发明的方法的步骤c)中，检测和/或计数在所述生长培养基的表面上或所述膜滤器的表面上形成并发射如上所定义的至少一种荧光染料的荧光信号的微菌落。
发射荧光信号的微菌落使用专业技术人员已知的任何方法来检测和/或计数。具体而言，微菌落可以使用荧光固相细胞仪或显微镜，优选地使用自动固相细胞仪或显微镜，或适合于检测荧光发射的任何其他成像系统来检测和/或计数。用于计数培养装置中发射荧光信号的微生物微菌落的自动系统在本领域中是已知的。此类自动系统通常包含成像系统，用于确定菌落计数的图像分析算法，以及用于显示并任选地储存和操作菌落计数数据和图像的数据管理系统。作为实例，由DIAMIDEX销售的微菌落半自动计数器MICA能够以荧光测量方式检测和计数处于微菌落早期阶段的微生物。
在其中步骤b)在膜滤器上进行并因此其中微菌落生长在所述膜滤器的表面上的某些实施方式中，可以在步骤b)之后并在步骤c)之前将所述滤器从所述固体生长培养基上取下，并在步骤c)中检测和/或计数其上的微菌落。这个步骤仍然是任选的，并且可以直接在温育容器中检测和/或计数所述膜滤器表面上的微菌落。
检测到至少一个微菌落表明在所述样品中存在感兴趣的微生物。
此外，假设在步骤c)中检测到的每个微菌落来自已经历细胞分裂的单个细胞。因此，通过对微菌落的数量进行计数并任选地考虑稀释或浓缩系数，可以确定所述样品中感兴趣的微生物的数量。
取决于选择性特点例如选择性生长培养基、选择性温育参数等的使用，本发明的方法也可以允许鉴定所述样品中的微生物。具体而言，微菌落的检测可以揭示属于特定分类组或功能组的微生物(例如嗜热嗜酸细菌、醋酸菌、乳酸菌、革兰氏阴性细菌、酵母或霉菌、好氧中温细菌、厌氧细菌等)的存在。
本发明的方法在步骤c)之后可以包括额外的步骤，以便进一步表征所述检测到的微菌落的微生物，例如包括酶活性或代谢物的检测在内的生物化学测定，使用免疫化学标志物、特异性染色剂、测试或特异性鉴定和/或检测特定微生物的试剂(包括抗生素)的测定。
本发明的方法的用途
本发明还涉及本发明的方法的用途，其用于检测或计数样品中任何感兴趣的微生物或成组微生物，特别是用于检测或计数样品中的嗜热嗜酸细菌(TAB)、醋酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、厌氧细菌、好氧中温细菌(AMB)、酵母和霉菌、革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌、异养细菌或其任何组合，优选地用于检测或计数样品中的嗜热嗜酸细菌(TAB)、醋酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、厌氧细菌、好氧中温细菌(AMB)、酵母和霉菌、革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌或其任何组合。
本发明还涉及本发明的方法的用途，其用于确定样品是否含有至少一种感兴趣的微生物，特别是属于嗜热嗜酸细菌(TAB)、醋酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、厌氧细菌、好氧中温细菌、酵母和霉菌、革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌、异养细菌或其任何组合至少一种微生物，优选为属于嗜热嗜酸细菌(TAB)、醋酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、厌氧细菌、好氧中温细菌、酵母和霉菌、革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌或其任何组合的至少一种微生物。
在这一方面中也设想了与本发明的方法有关的所有实施方式。
本发明还涉及本发明的方法的用途，其用于确定样品是否无菌。
本文所使用的术语“无菌的”是指样品中不存在任何感兴趣的微生物。取决于应用领域(如药品、化妆品、食品和饮料、环境分析、诊断等)和标准方法，在无菌性测试中考虑的微生物可能有所不同。然而，通常，设计本发明的方法是为了有利于检测可能包含在所述样品中的最大量的微生物。
在这一方面，本发明的方法被用于检测感兴趣的微生物或成组微生物，所述感兴趣的微生物或成组微生物的不存在表明所述样品是无菌的，并且检测到所述感兴趣的微生物或成组微生物表明所述样品不是无菌的。
对于这种应用来说，生长培养基通常是非选择性培养基例如R2A或TSA。通常，将培养物在20℃至40℃之间、优选地约35℃的温度下温育至少72h。生长培养基和培养条件可能随着应用领域(例如药物领域、水分析等)和该领域中推荐的标准方法而有很大差异。专业技术人员可以容易地调整本发明的方法以将这些参数考虑在内。
如果需要，可以例如使用不同的生长培养基、温育条件、荧光染料等重复本发明的方法，以检测不同微生物或成组微生物。
优选地，对于这种应用来说，将所述样品与至少一种荧光染料接触，所述荧光染料选自基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合，优选地选自Alexa FluorTM350、太平洋蓝TM、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、AlexaFluorTM405、瀑布蓝TM、Seta染料(优选为Seta 650或Seta 375)、SeTau染料(优选为SeTau647或SeTau 488)、Alexa Fluor 488和MB660R及其衍生物和组合，甚至更优选地选自AlexaFluorTM350-NHS酯、太平洋蓝TM-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、Alexa FluorTM405-DBCO、瀑布蓝TM、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor488-酸、MB660R-酸和MB660R-DBCO及其组合。具体而言，所述至少一种荧光染料可以选自Alexa FluorTM350、太平洋蓝TM、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、Alexa FluorTM405、瀑布蓝TM、Seta染料(优选为Seta 650)、SeTau染料(优选为SeTau 647或SeTau 488)、Alexa Fluor488和MB660R及其衍生物和组合，优选地选自Alexa FluorTM350-NHS酯、太平洋蓝TM-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、Alexa FluorTM405-DBCO、瀑布蓝TM、Seta 650-DBCO、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸和MB660R-DBCO及其组合。
具体而言，所述至少一种荧光染料可以选自Alexa FluorTM350、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、Alexa FluorTM405、Seta染料(优选为Seta 650)、SeTau染料(优选为SeTau647)、Alexa Fluor 488和MB660R及其衍生物和组合，并且优选地选自Alexa FluorTM350-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、Alexa FluorTM405-DBCO、Seta 650-DBCO、SeTau 647-马来酰亚胺、Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸和MB660R-DBCO及其组合。
更具体而言，所述至少一种荧光染料可以是基于呫吨的染料与基于花青的染料的组合，优选为Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)或其衍生物与MBTM660R或其衍生物的组合，更优选为MBTM660R DBCO与Sulfo-Cy5-酸的组合。
在某些实施方式中，所述至少一种荧光染料是选自下述的组合：吖啶橙–DAPI、吖啶橙-Seta 375-NHS、吖啶橙-MB660R酸、吖啶橙–Alexa Fluor 350-NHS酯、吖啶橙-太平洋蓝-NHS酯、吖啶橙-Sulfo Cy5-酸、吖啶橙–BODIPY、吖啶橙–Prodan、吖啶橙-Alexa Fluor405-DBCO、吖啶橙-瀑布蓝、吖啶橙-Alexa Fluor 488-酸、DRAQ5-Alexa Fluor 350-NHS酯、DRAQ5-太平洋蓝-NHS酯、DRAQ5-Sulfo Cy5-酸、DRAQ5–BODIPY 500/510、DRAQ5–Prodan、DRAQ5-Alexa Fluor 405-DBCO、DRAQ5-瀑布蓝、DRAQ5-Seta 650-DBCO、DRAQ5-SeTau 647-马来酰亚胺、DRAQ5-MB660R-酸、DRAQ5-MB660R-DBCO、DRAQ5-ATTO647-酸、Cytrak橙-AlexaFluor 350-NHS酯、Cytrak橙-太平洋蓝-NHS酯、Cytrak橙-Sulfo Cy5-酸、Cytrak橙–BODIPY500/510、Cytrak橙–Prodan、Cytrak橙-Alexa Fluor 405-DBCO、Cytrak橙-瀑布蓝、Seta375-NHS-Alexa Fluor 350-NHS酯、Seta 375-NHS-太平洋蓝-NHS酯、Seta 375-NHS-SulfoCy5-酸、Seta 375-NHS-BODIPY 500/510、Seta 375-NHS–Prodan、Seta 375-NHS-AlexaFluor 405-DBCO、Seta 375-NHS-瀑布蓝、Alexa Fluor 488-酸-Alexa Fluor 350-NHS酯、Alexa Fluor 488-酸-太平洋蓝-NHS酯、Alexa Fluor 488-酸-Sulfo Cy5-酸、Alexa Fluor488-酸-BODIPY 500/510、Alexa Fluor 488-酸–Prodan、Alexa Fluor 488-酸-AlexaFluor 405-DBCO、Alexa Fluor 488-酸-瀑布蓝、MB660R-酸-Alexa Fluor 350-NHS酯、MB660R-酸-太平洋蓝-NHS酯、MB660R-酸-Sulfo Cy5-酸、MB660R-酸-BODIPY 500/510、MB660R-酸–Prodan、MB660R-酸-Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-酸-瀑布蓝、MB660R-酸-Seta 650-DBCO、MB660R-酸-SeTau 647-马来酰亚胺、MB660R-DBCO-Alexa Fluor 350-NHS酯、MB660R-DBCO-太平洋蓝-NHS酯、MB660R-DBCO-Sulfo Cy5-酸、MB660R-DBCO-BODIPY500/510、MB660R-DBCO–Prodan、MB660R-DBCO-Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-DBCO-瀑布蓝、MB660R-DBCO-Seta 650-DBCO、MB660R-DBCO-SeTau 647-马来酰亚胺、ATTO647-酸-Sulfo Cy5-酸、ATTO647-酸-Seta 650-DBCO、ATTO647-酸-SeTau 647-马来酰亚胺、ATTO647-酸-MB660R-酸、ATTO647-酸-MB660R-DBCO、Sulfo Cy5.5-酸-Sulfo Cy5-酸、SulfoCy5-酸-Seta 650-DBCO、Sulfo Cy5-酸-SeTau 647-马来酰亚胺和Seta 650-DBCO-SeTau647-马来酰亚胺，优选地选自吖啶橙-Seta 375-NHS、吖啶橙-MB660R酸、吖啶橙–AlexaFluor 350-NHS酯、吖啶橙-太平洋蓝-NHS酯、吖啶橙-Sulfo Cy5-酸、吖啶橙–BODIPY、吖啶橙–Prodan、吖啶橙-Alexa Fluor405-DBCO、吖啶橙-瀑布蓝、吖啶橙-Alexa Fluor 488-酸、DRAQ5-Alexa Fluor 350-NHS酯、DRAQ5-太平洋蓝-NHS酯、DRAQ5-Sulfo Cy5-酸、DRAQ5–BODIPY 500/510、DRAQ5–Prodan、DRAQ5-Alexa Fluor 405-DBCO、DRAQ5-瀑布蓝、DRAQ5-Seta 650-DBCO、DRAQ5-SeTau 647-马来酰亚胺、DRAQ5-MB660R-酸、DRAQ5-MB660R-DBCO、DRAQ5-ATTO647-酸、Cytrak橙-Alexa Fluor350-NHS酯、Cytrak橙-太平洋蓝-NHS酯、Cytrak橙-Sulfo Cy5-酸、Cytrak橙–BODIPY 500/510、Cytrak橙–Prodan、Cytrak橙-Alexa Fluor405-DBCO、Cytrak橙-瀑布蓝、Seta 375-NHS-Alexa Fluor350-NHS酯、Seta 375-NHS-太平洋蓝-NHS酯、Seta 375-NHS-Sulfo Cy5-酸、Seta 375-NHS-BODIPY 500/510、Seta 375-NHS–Prodan、Seta375-NHS-Alexa Fluor 405-DBCO、Seta 375-NHS-瀑布蓝、AlexaFluor488-酸-Alexa Fluor 350-NHS酯、Alexa Fluor 488-酸-太平洋蓝-NHS酯、AlexaFluor 488-酸-Sulfo Cy5-酸、Alexa Fluor 488-酸-BODIPY 500/510、Alexa Fluor 488-酸–Prodan、Alexa Fluor 488-酸-Alexa Fluor405-DBCO、Alexa Fluor 488-酸-瀑布蓝、MB660R-酸-Alexa Fluor350-NHS酯、MB660R-酸-太平洋蓝-NHS酯、MB660R-酸-Sulfo Cy5-酸、MB660R-酸-BODIPY 500/510、MB660R-酸–Prodan、MB660R-酸-Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-酸-瀑布蓝、MB660R-酸-Seta650-DBCO、MB660R-酸-SeTau 647-马来酰亚胺、MB660R-DBCO-Alexa Fluor 350-NHS酯、MB660R-DBCO-太平洋蓝-NHS酯、MB660R-DBCO-Sulfo Cy5-酸、MB660R-DBCO-BODIPY 500/510、MB660R-DBCO–Prodan、MB660R-DBCO-AlexaFluor 405-DBCO、MB660R-DBCO-瀑布蓝、MB660R-DBCO-Seta 650-DBCO、MB660R-DBCO-SeTau647-马来酰亚胺、ATTO647-酸-Sulfo Cy5-酸、ATTO647-酸-Seta 650-DBCO、ATTO647-酸-SeTau 647-马来酰亚胺、ATTO647-酸-MB660R-酸、ATTO647-酸-MB660R-DBCO、Sulfo Cy5.5-酸-Sulfo Cy5-酸、Sulfo Cy5-酸-Seta 650-DBCO、Sulfo Cy5-酸-SeTau 647-马来酰亚胺和Seta 650-DBCO-SeTau 647-马来酰亚胺。
在这一方面中也设想了与本发明的方法有关的所有实施方式。
本发明还涉及本发明的方法的用途，其用于确定样品的生物负载。
本文所使用的术语“生物负载”是指样品中存在的感兴趣的活微生物的数量。取决于应用领域(如药品、化妆品、食品和饮料、环境分析、诊断等)和标准方法，在生物负载测试中考虑的微生物可能有所不同。然而，通常，设计本发明的方法是为了有利于检测可能包含在所述样品中的最大量的微生物。
在这一方面，本发明的方法被用于检测和计数感兴趣的微生物或成组微生物，所述感兴趣的微生物或成组微生物的计数被用于评估所述样品的生物负载。
对于这种应用来说，生长培养基通常是非选择性培养基例如R2A、TSA或SDA琼脂。通常，将培养物在20℃至40℃之间、优选地约35℃的温度下温育至少30h。生长培养基和培养条件可能随着应用领域(例如药物领域、水分析等)和该领域中推荐的标准方法而有很大差异。专业技术人员可以容易地调整本发明的方法以将这些参数考虑在内。
如果需要，可以例如使用不同的生长培养基、温育条件、荧光染料等重复本发明的方法，以检测和计数不同微生物或成组微生物。
优选地，对于这种应用来说，将所述样品与至少一种荧光染料接触，所述荧光染料选自基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合，更优选地选自Alexa FluorTM350、太平洋蓝TM、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、AlexaFluorTM405、瀑布蓝TM、Seta染料(优选为Seta 650或Seta 375)、SeTau染料(优选为SeTau647或SeTau 488)、Alexa Fluor 488和MB660R及其衍生物和组合，甚至更优选地选自AlexaFluorTM350-NHS酯、太平洋蓝TM-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、Alexa FluorTM405-DBCO、瀑布蓝TM、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor488-酸、MB660R-酸和MB660R-DBCO及其组合。更具体而言，所述至少一种荧光染料可以选自Alexa FluorTM350、太平洋蓝TM、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、Alexa FluorTM405、瀑布蓝TM、Seta染料(优选为Seta 650)、SeTau染料(优选为SeTau 647或SeTau 488)、Alexa Fluor488和MB660R及其衍生物和组合，甚至更优选地至少一种荧光染料选自Alexa FluorTM350-NHS酯、太平洋蓝TM-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、Alexa FluorTM405-DBCO、瀑布蓝TM、Seta 650-DBCO、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸和MB660R-DBCO及其组合。
具体而言，所述至少一种荧光染料可以选自Alexa FluorTM350、Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)、Alexa FluorTM405、Seta染料(优选为Seta 650)、SeTau染料(优选为SeTau647)、Alexa Fluor 488和MB660R及其衍生物和组合，优选地选自Alexa FluorTM350-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、Alexa FluorTM405-DBCO、Seta 650-DBCO、SeTau 647-马来酰亚胺、AlexaFluor 488-酸、MB660R-酸和MB660R-DBCO及其组合。更具体而言，所述至少一种荧光染料可以是基于呫吨的染料与基于花青的染料的组合，优选为Cy5TM(优选为Sulfo-Cy5)或其衍生物与MBTM660R或其衍生物的组合，更优选为MBTM660R DBCO与Sulfo-Cy5-酸的组合。任选地，可以向如上所定义的所述至少一种荧光染料添加一种或几种额外的荧光染料，特别地所述一种或几种额外的荧光染料选自基于蒽的染料、基于二吡咯甲川的染料和基于萘的染料及其组合，优选地选自DRAQ5TM、BODIPYTM染料，优选为BODIPY 500/510和prodan及其衍生物和组合，更优选地选自DRAQ5TM、BODIPY 500/510和prodan及其组合。
在某些实施方式中，所述至少一种荧光染料是选自下述的组合：吖啶橙–DAPI、吖啶橙-Seta 375-NHS、吖啶橙-MB660R酸、吖啶橙–Alexa Fluor 350-NHS酯、吖啶橙-太平洋蓝-NHS酯、吖啶橙-Sulfo Cy5-酸、吖啶橙–BODIPY、吖啶橙–Prodan、吖啶橙-Alexa Fluor405-DBCO、吖啶橙-瀑布蓝、吖啶橙-Alexa Fluor 488-酸、DRAQ5-Alexa Fluor 350-NHS酯、DRAQ5-太平洋蓝-NHS酯、DRAQ5-Sulfo Cy5-酸、DRAQ5–BODIPY 500/510、DRAQ5–Prodan、DRAQ5-Alexa Fluor 405-DBCO、DRAQ5-瀑布蓝、DRAQ5-Seta 650-DBCO、DRAQ5-SeTau 647-马来酰亚胺、DRAQ5-MB660R-酸、DRAQ5-MB660R-DBCO、DRAQ5-ATTO647-酸、Cytrak橙-AlexaFluor 350-NHS酯、Cytrak橙-太平洋蓝-NHS酯、Cytrak橙-Sulfo Cy5-酸、Cytrak橙–BODIPY500/510、Cytrak橙–Prodan、Cytrak橙-Alexa Fluor 405-DBCO、Cytrak橙-瀑布蓝、Seta375-NHS-Alexa Fluor 350-NHS酯、Seta 375-NHS-太平洋蓝-NHS酯、Seta 375-NHS-SulfoCy5-酸、Seta 375-NHS-BODIPY 500/510、Seta 375-NHS–Prodan、Seta 375-NHS-AlexaFluor 405-DBCO、Seta 375-NHS-瀑布蓝、Alexa Fluor 488-酸-Alexa Fluor 350-NHS酯、Alexa Fluor 488-酸-太平洋蓝-NHS酯、Alexa Fluor 488-酸-Sulfo Cy5-酸、Alexa Fluor488-酸-BODIPY 500/510、Alexa Fluor 488-酸–Prodan、Alexa Fluor 488-酸-AlexaFluor 405-DBCO、Alexa Fluor 488-酸-瀑布蓝、MB660R-酸-Alexa Fluor 350-NHS酯、MB660R-酸-太平洋蓝-NHS酯、MB660R-酸-Sulfo Cy5-酸、MB660R-酸-BODIPY 500/510、MB660R-酸–Prodan、MB660R-酸-Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-酸-瀑布蓝、MB660R-酸-Seta 650-DBCO、MB660R-酸-SeTau 647-马来酰亚胺、MB660R-DBCO-Alexa Fluor 350-NHS酯、MB660R-DBCO-太平洋蓝-NHS酯、MB660R-DBCO-Sulfo Cy5-酸、MB660R-DBCO-BODIPY500/510、MB660R-DBCO–Prodan、MB660R-DBCO-Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-DBCO-瀑布蓝、MB660R-DBCO-Seta 650-DBCO、MB660R-DBCO-SeTau 647-马来酰亚胺、ATTO647-酸-Sulfo Cy5-酸、ATTO647-酸-Seta 650-DBCO、ATTO647-酸-SeTau 647-马来酰亚胺、ATTO647-酸-MB660R-酸、ATTO647-酸-MB660R-DBCO、Sulfo Cy5.5-酸-Sulfo Cy5-酸、SulfoCy5-酸-Seta 650-DBCO、Sulfo Cy5-酸-SeTau 647-马来酰亚胺和Seta 650-DBCO-SeTau647-马来酰亚胺，优选地选自吖啶橙-Seta 375-NHS、吖啶橙-MB660R酸、吖啶橙–AlexaFluor 350-NHS酯、吖啶橙-太平洋蓝-NHS酯、吖啶橙-Sulfo Cy5-酸、吖啶橙–BODIPY、吖啶橙–Prodan、吖啶橙-Alexa Fluor 405-DBCO、吖啶橙-瀑布蓝、吖啶橙-Alexa Fluor 488-酸、DRAQ5-Alexa Fluor 350-NHS酯、DRAQ5-太平洋蓝-NHS酯、DRAQ5-Sulfo Cy5-酸、DRAQ5–BODIPY 500/510、DRAQ5–Prodan、DRAQ5-Alexa Fluor 405-DBCO、DRAQ5-瀑布蓝、DRAQ5-Seta 650-DBCO、DRAQ5-SeTau 647-马来酰亚胺、DRAQ5-MB660R-酸、DRAQ5-MB660R-DBCO、DRAQ5-ATTO647-酸、Cytrak橙-Alexa Fluor350-NHS酯、Cytrak橙-太平洋蓝-NHS酯、Cytrak橙-Sulfo Cy5-酸、Cytrak橙–BODIPY 500/510、Cytrak橙–Prodan、Cytrak橙-Alexa Fluor405-DBCO、Cytrak橙-瀑布蓝、Seta 375-NHS-Alexa Fluor350-NHS酯、Seta 375-NHS-太平洋蓝-NHS酯、Seta 375-NHS-Sulfo Cy5-酸、Seta 375-NHS-BODIPY 500/510、Seta 375-NHS–Prodan、Seta 375-NHS-Alexa Fluor 405-DBCO、Seta 375-NHS-瀑布蓝、Alexa Fluor488-酸-Alexa Fluor 350-NHS酯、Alexa Fluor 488-酸-太平洋蓝-NHS酯、Alexa Fluor488-酸-Sulfo Cy5-酸、Alexa Fluor 488-酸-BODIPY 500/510、Alexa Fluor 488-酸–Prodan、Alexa Fluor 488-酸-Alexa Fluor 405-DBCO、Alexa Fluor 488-酸-瀑布蓝、MB660R-酸-Alexa Fluor 350-NHS酯、MB660R-酸-太平洋蓝-NHS酯、MB660R-酸-Sulfo Cy5-酸、MB660R-酸-BODIPY 500/510、MB660R-酸–Prodan、MB660R-酸-Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-酸-瀑布蓝、MB660R-酸-Seta 650-DBCO、MB660R-酸-SeTau 647-马来酰亚胺、MB660R-DBCO-Alexa Fluor 350-NHS酯、MB660R-DBCO-太平洋蓝-NHS酯、MB660R-DBCO-Sulfo Cy5-酸、MB660R-DBCO-BODIPY 500/510、MB660R-DBCO–Prodan、MB660R-DBCO-AlexaFluor 405-DBCO、MB660R-DBCO-瀑布蓝、MB660R-DBCO-Seta 650-DBCO、MB660R-DBCO-SeTau647-马来酰亚胺、ATTO647-酸-Sulfo Cy5-酸、ATTO647-酸-Seta 650-DBCO、ATTO647-酸-SeTau 647-马来酰亚胺、ATTO647-酸-MB660R-酸、ATTO647-酸-MB660R-DBCO、Sulfo Cy5.5-酸-Sulfo Cy5-酸、Sulfo Cy5-酸-Seta 650-DBCO、Sulfo Cy5-酸-SeTau 647-马来酰亚胺和Seta 650-DBCO-SeTau 647-马来酰亚胺。
在这个方面中，也设想了与本发明的方法有关的所有实施方式。
试剂盒及其用途
本发明还涉及一种试剂盒，其包含
-至少一种如上所定义的荧光染料；
和任选的-至少一个如上所定义的膜滤器。
所述试剂盒还可以包含
-至少一个容器，其包含含有支持感兴趣的微生物或成组微生物生长的营养物的固体生长培养基，或获得所述至少一个容器所需的材料，和/或
-提供所述试剂盒的使用说明的小册子。
在特定实施方式中，本发明的试剂盒包含
-至少一种如上所定义的荧光染料；和
-至少一个如上所定义的膜滤器；
和任选的至少一个容器，其包含含有支持感兴趣的微生物或成组微生物生长的营养物的固体生长培养基，或获得所述至少一个容器所需的材料，和/或提供所述试剂盒的使用说明的小册子。
在另一个特定实施方式中，本发明的试剂盒包含
-至少一个容器，其包含含有优选地如上所定义的至少一种荧光染料和支持所述感兴趣的微生物或成组微生物生长的营养物的固体生长培养基，或获得所述至少一个容器所需的材料，
和任选的
-至少一个膜滤器，其优选地如上所定义，和/或
-提供所述试剂盒的使用说明的小册子。
在这个方面中，还设想了与本发明的方法有关的所有实施方式。
本发明还涉及根据本发明的试剂盒的用途，其用于根据如上所述的本发明的方法检测或计数感兴趣的微生物或成组微生物。在这个方面中，还设想了与本发明的方法有关的所有实施方式。
本说明书中引用的所有参考文献通过引用并入本申请。本发明的其他特点和优点将在下面的实施例中变得更加清楚，提供所述实施例的目的是为了说明而非限制。
实施例
除了巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)和痤疮丙酸杆菌(Cutibacteriumacnes)之外，所有菌株都从以前定量的冷冻储用物在0.9％ NaCl中稀释，以便为每种实验条件获得确定量的微生物，并将每个细菌制剂在0.45μm PVDF或MCE膜(47mm)上过滤。
对于巴西曲霉(A.brasiliensis)和痤疮丙酸杆菌(C.acnes)来说，将来自Biomérieux的含有精确数量的微生物的(/>Multishot 550，巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)，SKU编号：56001；/>Multishot，痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)(以前的名称为痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)，菌株DSM 1897)，SKU编号：416600)在0.9％ NaCl中稀释，以便为每种实验条件获得确定量的微生物，并将每个细菌制剂在0.45μm PVDF或MCE膜(47mm)上过滤。
实施例1：嗜热嗜酸细菌(TAB)的检测
在本实施例中使用了脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)细菌的几个菌株，包括酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)49025TM、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)/>27009TM、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)DSM 14558、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacilluscycloheptanicus)/>49028TM、Alicyclobacillus hesperidum DSM 12766、Alicyclobacillus herbarius DSM 13609和Alicyclobacillus contaminans DSM 17975。
将150μL选自Alexa Fluor 488-酸(50μM)、Alexa Fluor 488-DBCO(50μM)、MB660R-酸(250μM)、MB660R-DBCO(250μM)和ATTO647-酸(5μM)的荧光染料放置在BAT琼脂板(酵母提取物2g/l，D(+)葡萄糖5g/l，氯化钙0.25066g/l，硫酸镁0.5g/l，硫酸铵0.2g/l，磷酸二氢钾3g/l，硫酸锌0.00018g/l，硫酸铜0.00016g/l，硫酸锰0.00015g/l，二水钼酸钠0.0003g/l，琼脂18g/l，pH值3.8-4.2)上。每个琼脂板包含一滴荧光染料。
然后将过滤膜放置在每个琼脂板上的荧光染料液滴上方。然后将板在45℃下温育24h，例外的是酸热脂环酸芽孢杆菌(A.acidocaldarius)和A.contaminans，它们在45℃下温育48h。
在温育后，使用微菌落半自动计数器(MICA，DIAMIDEX，光功率100％，增益1，曝光时间100和400ms)检测微菌落。
所测试的条件和结果呈现在表2中。
表2：TAB菌株的标记和检测
实施例2：醋酸菌(AAB)的检测
在本实施例中使用的醋酸菌菌株是醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)15973TM、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens)/>14835TM、暹罗亚细亚菌(Asaia siamensis)DSM 15972和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)/>19357TM。
将150μL选自DAPI(50μM)、Alexa Fluor 488-酸(50μM)、Alexa Fluor 488-DBCO(50μM)、MB660R-酸(250μM)、MB660R-DBCO(250μM)和ATTO647-酸(5μM)的荧光染料放置在YM琼脂板(葡萄糖10g/L，麦芽提取物3g/L，蛋白胨5g/L，酵母提取物3g/L，琼脂15g/L，pH值6.2±0,2)上。每个琼脂板包含一滴荧光染料。
然后将过滤膜放置在每个琼脂板上的荧光染料液滴上方。然后将板在25℃下温育72h。
在温育后，使用微菌落半自动计数器(MICA，DIAMIDEX，Cy5光功率100％，增益1，曝光时间对于MB660R-DBCO和ATTO647-酸来说为200ms，对于AF488-酸来说为300ms，对于MB660R-酸来说为400ms，对于AF488-DBCO来说为600ms，UV光功率12％，增益1，曝光时间对于DAPI来说为400ms)检测微菌落。
所测试的条件和结果呈现在表3中。
表3：AAB菌株的标记和检测
/>
实施例3：乳酸菌(LAB)的检测
在本实施例中使用的乳酸菌菌株是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)8014TM、融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)/>10881TM和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)/>393TM。
将150μL选自DAPI(50μM)、Alexa Fluor 488-酸(50μM)、Alexa Fluor 488-DBCO(50μM)、MB660R-酸(250μM)、MB660R-DBCO(250μM)和ATTO647-酸(5μM)的荧光染料放置在MRS琼脂板(柠檬酸氢二铵2g/L，磷酸氢二钾2g/L，D(+)-葡萄糖20g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锰0.05g/L，肉提取物5g/L，乙酸钠5g/L，通用蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，琼脂12g/L，pH值5.7)上。每个琼脂板包含一滴荧光染料。
然后将过滤膜放置在每个琼脂板上的荧光染料液滴上方。然后将板在30℃下温育48h。
在温育后，使用微菌落半自动计数器(MICA，DIAMIDEX，Cy5光功率100％，增益1，曝光时间对于MB660R-DBCO和ATTO647-酸来说为200ms，对于AF488-酸来说为300ms，对于MB660R-酸来说为400ms，对于AF488-DBCO来说为600ms，UV光功率12％，增益1，曝光时间对于DAPI来说为100ms，例外的是干酪乳杆菌(L.casei)，其使用35％的UV光功率)检测微菌落。
所测试的条件和结果呈现在表4中。
表4：LAB菌株的标记和检测
实施例4：厌氧细菌的检测
在本实施例中使用的厌氧细菌菌株是生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridiumsporogenes)ATCC 19404和痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)ATCC 6919。
将200μL of DAPI(50μM)放置在TSA琼脂板(胰蛋白胨15g/L，大豆木瓜蛋白酶解蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L，pH值7.3±0.2)上，将150μl Sulfo-Cy5-酸(100μM)和MB660R-DBCO(100μM)的混合物放置在TSA琼脂板(对于生芽孢梭状芽孢杆菌(C.sporogenes)来说)上和增补有5％绵羊血的Columbia琼脂板(酪蛋白胰酶消化物12g/L，动物组织的胃蛋白酶消化物5g/L，酵母提取物3g/L，牛肉提取物3g/L，玉米淀粉1g/L，氯化钠5g/L，琼脂13.5g/L，去纤维蛋白绵羊血5％，pH值7.3±0.2)(对于痤疮丙酸杆菌(C.acnes)来说)上。每个琼脂板包含一滴荧光染料。
然后将过滤膜放置在每个琼脂板上的荧光染料液滴上方。然后将包含生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes)的板在厌氧条件下在35℃温育15h(对于DAPI染色来说)至24h(对于MB660R-DBCO和Sulfo-Cy5-酸染色来说)。将包含痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)的板在厌氧条件下在35℃温育96h。
在温育后，使用微菌落半自动计数器(MICA，DIAMIDEX，Cy5光功率100％，增益1，曝光时间对于Sulfo-Cy5-酸和MB660R-DBCO的混合物来说为200ms，UV光功率12％，增益1，曝光时间对于DAPI来说为400ms)检测微菌落。
所测试的条件和结果呈现在表5中。
表5：厌氧细菌菌株的标记和检测
实施例5：好氧中温细菌的检测
在本实施例中使用的中温细菌菌株是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)9027、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)/>6633TM、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)/>8739TM、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)/>6538TM、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)ATCC 19606、阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)/>29544TM、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)13883TM、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)/>13311TM、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)ATCCTM29212TM、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)/>25931TM、嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)/>9341TM、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)ATCC 43645和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)/>25608TM。
将150μL选自吖啶橙(40μM)、Cytrak橙(50μM)、DRAQ5(125μM)、AF350-NHS酯(50μM)、太平洋蓝-NHS酯(10μM)、Sulfo-Cy5-酸(150μM)、Sulfo-Cy5.5酸(50μM)、BODIPY 500/510(在PVDF膜上10μM并且在MCE膜上150μM)、Seta 375-NHS(5μM)、Prodan(在PVDF膜上15μM并且在MCE膜上50μM)、AF405-DBCO(50μM)、瀑布蓝(1μM)、Seta 650-DBCO(100μM)、SeTau488-NHS(50μM)、SeTau 647-马来酰亚胺(100μM)、DAPI(50μM)、Alexa Fluor 488-酸(50μM)、Alexa Fluor 488-DBCO(50μM)、MB660R-酸(250μM)、MB660R-DBCO(250μM)和ATTO647-酸(5μM)的荧光染料放置在TSA琼脂板和PCA琼脂板(胰蛋白胨5g/L，酵母提取物2.5g/L，葡萄糖1g/L，琼脂15g/L，pH值7.0±0.2)上(对于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)和嗜根考克氏菌(Kocuriarhizophila)来说)或TSA琼脂板上(对于扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)来说)。每个琼脂板包含一滴荧光染料。
然后将过滤膜放置在每个琼脂板上的荧光染料液滴上方。然后将板在35℃下温育11h(对于PCA和TSA板上的阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)和TSA板上的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)来说)、18h(对于PCA板上的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、PCA和TSA板上的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuriarhizophila)和TSA板上的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)来说)、24h(对于TSA板上的洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)来说)和96h(对于TSA板上的扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)来说)。
在温育后，使用微菌落半自动计数器检测微菌落(MICA，DIAMIDEX，DAPI：UV光功率12％，增益1，曝光时间200ms；MB660R-DBCO、MB660R-酸、ATTO647-酸：CY5光功率100％，增益1，曝光时间200和500ms；AF488-酸和AF488-DBCO：FITC光功率100％，增益1，曝光时间200和400ms；Sulfo-CY5-酸、Seta-650 DBCO：CY5光功率100％，增益1，曝光时间50ms和400ms；AF350-NHS酯、AF405-DBCO：UV光功率：20％或50％，增益1，曝光时间100ms和400ms；SeTau647-马来酰亚胺：CY5光功率100％，增益1，曝光时间50ms和200ms；Prodan：UV光功率100％或50％，增益1，曝光时间100ms和400ms；BODIPY 500/510和SeTau 488-NHS(50μM)：FITC光功率100％，增益1，曝光时间50ms和200ms；DRAQ5：CY5光功率100％，增益1，曝光时间200ms和400ms；瀑布蓝和太平洋蓝-NHS酯：UV光功率100％或50％，增益1，曝光时间50ms和200ms；Seta375-NHS：UV光功率100％，增益1，曝光时间200ms；Sulfo-Cy5.5酸：CY5.5光功率20％，增益1，曝光时间50ms；吖啶橙：CY5光功率100％，增益1，曝光时间400ms；Cytrak橙：FITC光功率7％，增益1，曝光时间400ms)。
所测试的条件和结果呈现在表6中。
表6：好氧中温细菌菌株的标记和检测
/>
/>
实施例6：酵母和霉菌的检测
在本实施例中使用的酵母和霉菌是巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)16404TM、宛氏青霉(Penicillium variotii)ATCC 18502、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)/>10106TM、白假丝酵母(Candida albicans)/>10231TM、白地霉(Geotrichum candidum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)/>9763TM和拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)DSM 70492。
将200μl MB660R-DBCO(250μM)、Alexa Fluor 488-酸(50μM)、MB660R-酸(250μM)或ATTO647-酸(5μM)、Seta 375-NHS(5μM)、150μL of吖啶橙(40μM)、BODIPY 500/510(在PVDF膜上10μM并且在MCE膜上150μM)或250μl DAPI(50μM)放置在YM琼脂板(葡萄糖10g/L，麦芽提取物3g/L，蛋白胨5g/L，酵母提取物3g/L，琼脂15g/L，pH值6.2±0,2)或SDA琼脂板(酪蛋白胰酶消化物5g/L，动物组织的胃蛋白酶消化物5g/L，葡萄糖40g/L，琼脂15g/L，pH值5.6±0.2)上(对于拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)来说)和SDA琼脂板上(对于白假丝酵母(Candida albicans)、宛氏青霉(Penicillium variotii)和产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)来说)。每个琼脂板包含一滴荧光染料。然后将过滤膜放置在每个琼脂板上的荧光染料液滴上方。然后将板在25℃下温育39h。
将150μL选自AF350-NHS酯(50μM)、太平洋蓝-NHS酯(10μM)、Sulfo-Cy5-酸(150μM)、Prodan(在PVDF膜上15μM并且在MCE膜上50μM)、AF405-DBCO(50μM)、瀑布蓝(1μM)、Seta650-DBCO(100μM)、SeTau 488-NHS(50μM)、SeTau 647-马来酰亚胺(100μM)的荧光染料放置在SDA琼脂板上。每个琼脂板包含一滴荧光染料。然后将过滤膜放置在每个琼脂板上的荧光染料液滴上方。然后将板在35℃下温育21h。
在温育后，使用微菌落半自动计数器检测微菌落(MICA，DIAMIDEX，DAPI：光功率12％，增益1，曝光时间200ms；MB660R-DBCO、MB660R-酸、ATTO647-酸：CY5光功率100％，增益1，曝光时间200和500ms；AF488-酸：FITC光功率100％，增益1，曝光时间200和400ms；Sulfo-CY5-酸、Seta-650 DBCO：CY5光功率100％，增益1，曝光时间50ms和400ms；AF350-NHS酯、AF405-DBCO：UV光功率：50％或20％，增益1，曝光时间100ms和400ms；SeTau488-NHS：FITC光功率100％，增益1，曝光时间50ms和200ms；SeTau647-马来酰亚胺：CY5光功率100％，增益1，曝光时间50ms和200ms；Prodan：UV光功率100％或50％，增益1，曝光时间100ms和400ms；瀑布蓝和太平洋蓝-NHS酯：UV光功率100％或50％，增益1，曝光时间50ms和200ms；Seta 375-NHS：UV光功率100％，增益1，曝光时间200ms；吖啶橙：CY5光功率100％，增益1，曝光时间400ms；BODIPY 500/510：FITC光功率100％，增益1，曝光时间50ms和200ms)。
所测试的条件和结果呈现在表7中。
表7：酵母和霉菌菌株的标记和检测
/>
将包含白假丝酵母(C.albicans)和巴西曲霉(A.brasiliensis)的混合培养物在0.45μm PVDF或MCE膜(47mm)上过滤。将150μL选自AF350-NHS酯(50μM)、Sulfo-Cy5-酸(150μM)、AF405-DBCO(50μM)、Seta 650-DBCO(100μM)或SeTau 647-马来酰亚胺(100μM)的荧光染料放置在SDA琼脂板上。每个琼脂板包含一滴荧光染料。然后将过滤膜放置在每个琼脂板上的荧光染料液滴上方。然后将板在35℃下温育21h。在温育后，使用微菌落半自动计数器检测微菌落(MICA，DIAMIDEX，Sulfo-CY5-酸、Seta-650 DBCO：CY5光功率100％，增益1，曝光时间50ms和400ms；AF350-NHS酯、AF405-DBCO：UV光功率：50％或20％，增益1，曝光时间100ms和400ms；SeTau 647-马来酰亚胺：CY5光功率100％，增益1，曝光时间50ms和200ms)。
结果呈现在下面的的表8和图10至13中。
表8：白假丝酵母(C.albicans)和巴西曲霉(A.brasiliensis)的混合物的标记和
检测
实施例7：UTI诊断中革兰氏阴性细菌的检测
在本实施例中使用的革兰氏阴性细菌是大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)8739TM。
将200μL MB660R-DBCO(100μM)和Sulfo-Cy5-酸(100μM)的混合物放置在MacConkey琼脂板(蛋白胨20g/L，乳糖10g/L，胆盐1.5g/L，结晶紫0.001g/L，中性红0.05g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L，pH值7.1+/-0.2)上。每个琼脂板包含一滴染料混合物。
然后将过滤膜放置在每个琼脂板上的荧光染料液滴上方。然后将板在35℃下温育8h。
在温育后，使用微菌落半自动计数器检测微菌落(MICA，DIAMIDEX，光功率100％，增益1，曝光时间200ms)。
在每种条件下标记并检测大肠埃希氏杆菌(E.coli)菌落。
实施例8：微生物(细菌、酵母和霉菌)的总计数
在本实施例中使用的菌株是痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)6919TM、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)/>43645TM、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)/>29212TM、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)16404TM、白假丝酵母(Candida albicans)/>10231TM和融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)/>10881TM。
将包含粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、巴西曲霉(Aspergillusbrasiliensis)和白假丝酵母(Candida albicans)的混合培养物在0,45μm PVDF膜(47mm)上过滤。对于所述混合物来说，将150μL MB660R-DBCO(100μM)和Sulfo-Cy5-酸(100μM)的混合物放置在TSA或SDA琼脂板上。每个琼脂板包含一滴染料混合物。然后将过滤膜放置在每个琼脂板上的荧光染料液滴上方。然后将板在35℃下(对于TSA板来说)和25℃下(对于SDA板来说)温育24h。在温育后，使用微菌落半自动计数器检测微菌落(MICA，DIAMIDEX，Cy5光功率100％，增益1，曝光时间50和200ms)。
将包含巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)和白假丝酵母(Candidaalbicans)的混合培养物和融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)的培养物在0.45μm PVDF膜(47mm)上过滤。对于这些培养物来说，将150μL MB660R-DBCO(100μM)和Sulfo-Cy5-酸(100μM)的混合物放置在OSA板(酪蛋白蛋白胨10g/L，磷酸氢二钾3g/L，D(+)-葡萄糖4g/L，柑橘提取物5g/L，酵母提取物3g/L，琼脂17g/L，pH值5.5±0.2)上。每个琼脂板包含一滴染料混合物。然后将过滤膜放置在每个琼脂板上的荧光染料液滴上方。然后将板在30℃下温育24h。在温育后，使用微菌落半自动计数器检测微菌落(MICA，DIAMIDEX，Cy5光功率100％，增益1，曝光时间200ms)。
将扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)的培养物在0.45μm PVDF膜(47mm)上过滤。对于这种培养物来说，将150μL MB660R-DBCO(100μM)和Sulfo-Cy5-酸(100μM)的混合物放置在TSA或R2A琼脂板(酪蛋白酸水解物0.5g/L，葡萄糖0.5g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硫酸镁0.024g/L，蛋白胨0.5g/L，丙酮酸钠0.3g/L，可溶性淀粉0.5g/L，酵母提取物0.5g/L，琼脂15g/L,pH值7.2±0.2)上。每个琼脂板包含一滴染料混合物。然后将过滤膜放置在每个琼脂板上的荧光染料液滴上方。然后将板在25℃下温育96h。
将痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)的培养物在0.45μm PVDF膜(47mm)上过滤。对于这种培养物来说，将150μL MB660R-DBCO(100μM)和Sulfo-Cy5-酸(100μM)的混合物放置在TSA上。每个琼脂板包含一滴染料混合物。然后将过滤膜放置在每个琼脂板上的荧光染料液滴上方。然后将板在35℃、5％ CO2下温育96h。
在温育后，使用微菌落半自动计数器检测微菌落(MICA，DIAMIDEX，CY5光功率100％，增益1，曝光时间50ms和200ms)。
结果呈现在表9中。
表9：使用MB660R-DBCO和Sulfo-Cy5-酸的混合物标记和检测多种目标菌株
实施例9：本发明的方法与不使用荧光染料的方法的比较
在本实施例中使用的菌株是大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)8739TM、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)/>16404TM和白假丝酵母(Candidaalbicans)/>10231TM。
将150μL选自DRAQ5(125μM)、AF350-NHS酯(50μM)、Sulfo-Cy5-酸(150μM)、BODIPY500/510(10μM)、Prodan(在PVDF膜上15μM，并且在MCE膜上50μM)、AF405-DBCO(50μM)、Seta650-DBCO(100μM)或SeTau 647-马来酰亚胺(100μM)的荧光染料放置在TSA琼脂板(对于大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)来说)和SDA琼脂板(对于巴西曲霉(Aspergillusbrasiliensis)和白假丝酵母(Candida albicans)来说)上。然后将过滤膜放置在每个琼脂板上的荧光染料液滴上方。然后将板在35℃下温育18h(对于大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)来说)和在35℃下温育21h(对于巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)和白假丝酵母(Candida albicans)来说)。在温育后，使用微菌落半自动计数器检测微菌落(MICA，DIAMIDEX，Sulfo-CY5-酸、Seta-650 DBCO：CY5光功率100％，增益1，曝光时间50ms和400ms；AF350-NHS酯、AF405-DBCO：UV光功率：50％或20％，增益1，曝光时间100ms和400ms；SeTau647-马来酰亚胺：CY5光功率100％，增益1，曝光时间50ms和200ms；Prodan：UV光功率100％或50％，增益1，曝光时间100ms和400ms；BODIPY 500/510：FITC光功率100％，增益1，曝光时间50ms和200ms；DRAQ5：CY5光功率100％，增益1，曝光时间200ms和400ms)。
为了比较使用本发明的方法获得的结果和使用标准方法获得的结果，将在本实施例中使用的菌株(大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)8739TM、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)/>16404TM和白假丝酵母(Candida albicans)10231TM)在0.45μm MCE膜(47mm)上过滤。然后将过滤膜放置在TSA(对于大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)来说)或SDA琼脂板(对于巴西曲霉(Aspergillusbrasiliensis)和白假丝酵母(Candida albicans)来说)上。然后将板在35℃下温育3至4天。在温育后，用肉眼计数菌落。
结果呈现在表10中。
表10：使用本发明的方法和标准方法的菌落计数
(/)：表示所述条件未测试。
正如该表中所示，与标准方法相比，本发明的方法允许更早地检测微生物以及更准确的计数。
实施例10：纯化水和制药用水系统中涉及的微生物的计数
水是制药工业的关键部分。水被用于清洁，作为水性无菌和非无菌产品的成分，用于洗手，以及作为高压灭菌器的蒸汽供应等用途。由于水在制药生产中的关键性，水的微生物控制极为重要。由于水是一直存在的，因此每种级别的制药用水都是微生物污染的潜在来源，尤其是在控制不当的情况下。
在制药中存在三种类型的水：
a)自来水(或饮用水)；
b)纯化水；
c)WFI(注射用水)。
它们中的每种都有不同的等级，并且名单随着对微生物控制的期望增加排列(即应用于注射用水的限制比自来水的限制更严格)。自来水由公用事业公司供应，并具有“饮用水”(饮用水)的质量。水系统监测的结果根据预先定义的警报和行动水平，从异养微生物计数来评估。
对于水的微生物检查来说，测试方法是使用0.45μm滤器进行膜过滤。将滤器放置在R2A琼脂上，并对自来水来说在20-25℃的温度条件下14天，对纯化水和WFI来说在30-35℃的温度条件下5天。这些不同条件的原因是对于GMP设施来说，欧洲药典要求使用规定的温度和时间。对于自来水来说，制药厂可以选择培养条件。选择最佳培养条件涉及微生物学中关于使用最适合的温度、时间和培养基的经典难题。R2A用低水平的营养物配制，因此它会检测到更高比例的异养细菌。理论认为，由于水中的细菌受到营养耗尽的条件影响，因此它们更有可能在与这些普遍条件更密切匹配的生长培养基上生长。
进行了一项元数据研究，其涵盖了15年的回顾期(2000年至2014年)，共收集和测试了54140个样品，并呈现了可以从制药用水系统中回收的典型可培养微生物的回顾(TimSandle,September 2015.SOJ Microbiology&Infectious Diseases 3(2):1-8)。
根据该元数据分析和药典建议，测试了一系列微生物。在本实施例中使用的革兰氏阴性细菌是鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)ATCC 19606、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)ATCC 35654、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)ATCC19146、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)ATCC 25608、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)ATCC 8090、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)ATCC 15947、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)ATCC 8739、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)ATCC 35028、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)CIP 82.115、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC 13883、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)CIP 106787、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)ATCC 19976、成团泛菌(Pantoeaagglomerans)ATCC 27155、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)ATCC 29906、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 10145、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ATCC13525、皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)ATCC 27511、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)ATCC 13311、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)ATCC13880、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)ATCC 25931、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)ATCC29837、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)ATCC 13637、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)ATCC 9610。革兰氏阳性细菌是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 6633、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)ATCC 19433、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 6538。测试的酵母和霉菌是巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)16404TM和白假丝酵母(Candida albicans)10231TM。该选择覆盖了至少84％的自来水系统微生物染污物、77％的纯化水系统污染物和制药用WFI系统的最常见污染物。
将150μL MB660R-DBCO(100μM)和Sulfo-Cy5-酸(100μM)的混合物放置在Reasoner's 2A琼脂(R2A)板(酵母提取物0.5g/L，蛋白胨0.5g/L，酪蛋白水解物0.5g/L，葡萄糖0.5g/L，淀粉0.5g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，无水硫酸镁0.024g/L，丙酮酸钠0.3g/L，琼脂15.0g/L，最终pH 7.2±0.2)、TSA琼脂板(胰蛋白胨15g/L，大豆木瓜蛋白酶解蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L，pH值7.3±0.2)或SDA琼脂板(酪蛋白胰酶消化物5g/L，动物组织的胃蛋白酶消化物5g/L，葡萄糖40g/L，琼脂15g/L，pH值5.6±0.2)上。或者，将150μlAF350-NHS酯(150μM)和AF405-DBCO(150μM)的混合物在相同条件下放置在同一组微生物上。每个琼脂板包含一滴染料混合物。
将每种微生物培养物在0.45μm PVDF或MCE膜(47mm)上过滤。然后将每个膜放置在每个琼脂板上荧光染料液滴的上方。然后将板在32.5℃下温育必需的最少时间，以使用微菌落半自动计数器计数掺入在膜上的所有微菌落(MICA，DIAMIDEX，当使用MB660R-DBCO和Sulfo-Cy5-酸时：Cy5光功率100％，增益1，曝光时间100和200ms；当使用AF350-NHS酯和AF405-DBCO时：UV光功率100％，增益1，曝光时间50和100ms)。结果被呈现在下面的表11和12上。
表11：用AF350-NHS酯和AF405-DBCO染料的混合物标记并检测纯化水和制药用水
系统中涉及的微生物
表12：用MB660R-DBCO和Sulfo-Cy5-酸染料的混合物标记并检测纯化水和制药用
水系统中涉及的微生物
/>
实施例11：用荧光色素的混合物染色的方法
在过滤前向细菌培养物添加荧光染料
从以前定量的冷冻保存的储用物中将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC6633在0,9％ NaCl中稀释，为每个实验条件获得确定数目的微生物。向悬液添加MB660R-DBCO(50μM)和Sulfo-Cy5-酸(50μM)的混合物，最终体积为10ml的0,9％ NaCl。将得到的悬液在白色或黑色MCE膜上过滤，并允许微生物在TSA板(胰蛋白胨15g/L，大豆木瓜蛋白酶解蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L，pH值7.3±0.2)上，在32.5℃下生长16h。
将荧光染料掺入到琼脂培养基中
将150μl由MB660R-DBCO(50μM)和Sulfo-Cy5-酸(50μM)组成的混合物在TSA板(胰蛋白胨15g/L，大豆木瓜蛋白酶解蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L，pH值7.3±0.2)的表面上划线，或添加到熔化的TSA琼脂培养基中并混合，然后将所述培养基倾倒在板上。将琼脂板在4℃下保持12天。在实验的当天，从以前定量的冷冻保存的储用物中将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 6633在0,9％ NaCl中稀释，为每个实验条件获得确定数目的微生物。将得到的悬液在白色MCE膜上过滤，并允许微生物在掺入有荧光色素混合物的TSA板上，在32.5℃下生长16h。
将荧光染料放置在膜与琼脂培养基之间
从以前定量的冷冻保存的储用物中将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC6633在0,9％ NaCl中稀释，为每个实验条件获得确定数目的微生物。将得到的悬液在白色或黑色MCE膜上过滤。将150μl由MB660R-DBCO(50μM)和Sulfo-Cy5-酸(50μM)组成的混合物放置在TSA琼脂板上。然后将过滤膜放置在每个琼脂板上荧光染料液滴的上方，并允许微生物在TSA板上在32.5℃下生长16h。
对于每种方案来说，在温育后，使用微菌落半自动计数器检测微菌落(MICA，DIAMIDEX，Sulfo-CY5-酸和MB660R-DBCO：CY5光功率10％-20％，增益1，曝光时间50ms和100ms)。
这些方法中的每一种都允许微生物的高效染色和检测。这些实验的结果示出在图16中。
实施例12：避免与琼脂培养基分开的检测方法
在本实施例中使用了脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)细菌的几个菌株，包括酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)49025TM、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)/>49028TM和Alicyclobacillus herbarius DSM 13609。从以前定量的冷冻保存的储用物中将菌株在0,9％ NaCl中稀释，为每个实验条件获得确定数目的微生物。
方案1：在置于琼脂培养基上的膜上进行检测
将150μL荧光染料MB660R-DBCO(100μM)放置在BAT琼脂板(酵母提取物2g/l，D(+)葡萄糖5g/l，氯化钙0.25066g/l，硫酸镁0.5g/l，硫酸铵0.2g/l，磷酸二氢钾3g/l，硫酸锌0.00018g/l，硫酸铜0.00016g/l，硫酸锰0.00015g/l，二水钼酸钠0,00030g/l，琼脂18g/l，pH值3.8-4.2)上。每个琼脂板包含一滴荧光染料。将环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)和Alicyclobacillus herbarius在PVDF过滤膜上过滤。然后将膜放置在每个琼脂板上荧光染料液滴的上方。
方案2：直接在琼脂培养基上进行检测
将250μl含有在纯化水中稀释的酸土脂环酸芽孢杆菌(A.acidoterrestris)的液滴和12.5μL荧光染料MB660R-DBCO(250μM)在琼脂培养基的表面上划线。然后将板在45℃下温育24h。
对于每种方案来说，在温育后，使用微菌落半自动计数器检测微菌落(MICA，DIAMIDEX，对于在琼脂培养基上的膜上进行的检测来说光功率100％，增益1，曝光时间100；对于直接在琼脂培养基上的检测来说光功率100％，增益1，曝光时间50)。
这两种方案都允许微生物的高效染色和检测。这些实验的结果示出在图17中。
实施例13：无并发症和有并发症UTI中涉及的细菌的计数
无并发症和有并发症UTI两者的最常见致病因子都是大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)。对于无并发症UTI中涉及的因子来说，流行率紧随大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)之后的是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、B组链球菌(Streptococcus)(GBS)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和假丝酵母属菌种(Candidaspp.)。对于有并发症UTI来说，致病因子的流行率顺序紧随最常见的大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)之后的是肠球菌属菌种(Enterococcus spp.)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、假丝酵母属菌种(Candida spp.)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa和GBS。
在本实施例中使用的革兰氏阴性细菌是大肠埃希氏杆菌(E.coli)8739TM、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)/>13883TM和奇异变形杆菌(P.mirabilis)29906TM。革兰氏阳性细菌是粪肠球菌(E.faecalis)/>19433TM和金黄色葡萄球菌(S.aureus)/>6538TM。这种选择覆盖了89％的无并发症和有并发症UTI。/>
将150μL MB660R-DBCO(100μM)和Sulfo-Cy5-酸(100μM)的混合物放置在TSA琼脂板(胰蛋白胨15g/L，大豆木瓜蛋白酶解蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L，pH值7.3±0.2)或哥伦比亚血琼脂板(蛋白胨23g/l，淀粉1g/l，氯化钠5g/l，绵羊血50ml/l，琼脂14g/l，pH值7.3±0.2)(对于革兰氏阳性细菌和奇异变形杆菌(P.mirabilis)来说)和TSA琼脂板、哥伦比亚血琼脂板或Mac Conkey琼脂板(蛋白胨20g/L，乳糖10g/L，胆盐1.5g/L，结晶紫0.001g/L，中性红0.05g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂15.0g/L，pH值7.1+/-0.2)(对于大肠菌群(大肠埃希氏杆菌(E.coli)和肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae))来说)上。或者，将150μlDAPI(50μM)在相同条件下放置在同一组微生物上。每个琼脂板包含一滴染料的混合物。
将每种细菌从以前定量的冷冻保存的储用物稀释，为每种实验条件获得确定数目的微生物。将得到的悬液在PVDF或MCE膜上过滤。
然后将过滤膜放置在每个琼脂板上的荧光染料液滴上方。然后将板在37℃下温育必需的最少时间，使用微菌落半自动计数器计数掺入到膜上的所有微菌落(MICA，DIAMIDEX，MB660R-DBCO和Sulfo-Cy5-酸：Cy5光功率100％，增益1，曝光时间100和200ms；DAPI：UV光功率100％，增益1，曝光时间50和100ms)。
表13：计数微菌落必需的最少时间和与标准程序时间(在37℃下24h)相比检测到
的对象的百分率
如表13中所示，造成75％的无并发症UTI和65％的有并发症UTI的大肠埃希氏杆菌(E.coli)，可以使用本发明的方法在TSA琼脂板上在不到6h内、在哥伦比亚琼脂板上在不到7h30内并且在Mac conkey琼脂板上在不到10h内计数。此外，在TSA琼脂板、哥伦比亚血琼脂板和Mac conkey琼脂板上，无并发症和有并发症UTI中涉及的最普遍的微生物可以在不到11h内计数。
Claims (55)
1.一种用于检测或计数感兴趣的微生物或成组微生物的方法，所述方法包括：
a)将怀疑含有所述微生物或成组微生物的样品与含有支持所述微生物或成组微生物生长的营养物的固体生长培养基并与至少一种荧光染料在容器中接触；
b)将所述容器在足以形成所述微生物或成组微生物的微菌落的条件下温育足够的时间；和
c)检测或计数发射所述至少一种荧光染料的荧光信号的微菌落，
从而检测或计数所述样品中包含的所述微生物或成组微生物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤a)之前，将所述样品的微生物浓缩在膜滤器上，并且其中在步骤a)中，将所述膜和微生物与所述固体生长培养基和所述至少一种荧光染料接触。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)可以包括
a1)将怀疑含有所述微生物或成组微生物的样品与至少一种荧光染料接触，和
a2)将所述样品与含有支持所述微生物或成组微生物生长的营养物的固体生长培养基在容器中接触，
步骤a1)和a2)同时或以任何次序顺序进行。
4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤a1)在步骤a2)之前进行。
5.根据权利要求4所述的方法，其中在步骤a2)之前，将所述样品的微生物浓缩在膜滤器上。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述膜滤器由混合纤维素酯(MCE)、聚偏氟乙烯(PVDF)、硝酸纤维素、聚四氟乙烯、聚碳酸酯或尼龙制成。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述膜滤器由MCE或PVDF制成。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述膜滤器由MCE制成。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述膜滤器由PVDF制成。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述固体生长培养基对所述微生物或成组微生物具有选择性。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、吖啶染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)及其组合。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)及其组合。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合.
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述至少一种荧光染料选自MB660R、吖啶橙、DRAQ5、Cytrak橙、Alexa Fluor 350、太平洋蓝、Cy5、优选为Sulfo-Cy5、Cy5.5、优选为Sulfo-Cy5.5、BODIPY 500/510、prodan、Alexa Fluor 405、瀑布蓝、Seta650、Seta 375、Setau647、SeTau 488、Alexa Fluor 488、ATTO 647和DAPI、其衍生物及其组合。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述至少一种荧光染料选自MB660R、DRAQ5、Cytrak橙、Alexa Fluor 350、太平洋蓝、Cy5、优选为Sulfo-Cy5、Cy5.5、优选为Sulfo-Cy5.5、BODIPY 500/510、prodan、Alexa Fluor 405、瀑布蓝、Seta 650、Seta 375、Setau647、SeTau 488、Alexa Fluor 488和ATTO 647、其衍生物及其组合。
16.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述至少一种荧光染料选自MB660R-DBCO、MB660R-酸、吖啶橙、DRAQ5、Cytrak橙、Alexa Fluor 350NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5酸、Sulfo-Cy5.5酸、BODIPY 500/510、prodan、Alexa Fluor 405-DBCO、瀑布蓝、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau488-NHS、Alexa Fluor488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、ATTO 647-酸和DAPI、其衍生物及其组合。
17.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述至少一种荧光染料选自MB660R-DBCO、MB660R-酸、DRAQ5、Cytrak橙、Alexa Fluor 350NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5酸、Sulfo-Cy5.5酸、BODIPY 500/510、prodan、Alexa Fluor 405-DBCO、瀑布蓝、Seta650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO和ATTO 647-酸、其衍生物及其组合。
18.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述至少一种荧光染料选自DRAQ5、Alexa Fluor 350、太平洋蓝、Cy5、优选为Sulfo-Cy5、BODIPY 500/510、prodan、AlexaFluor 405、瀑布蓝、Seta650、Setau 647、SeTau 488、MB 660R、Alexa Fluor 488、ATTO 647和DAPI、其衍生物及其组合，优选地选自DRAQ5、Alexa Fluor 350-NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5酸、BODIPY 500/510、prodan、Alexa Fluor 405-DBCO、瀑布蓝、Seta 650-DBCO、SeTau 488-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、MB 660R-酸、MB 660R-DBCO、Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、ATTO 647-酸和DAPI及其组合。
19.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述至少一种荧光染料选自DRAQ5、Alexa Fluor 350、Cy5、优选为Sulfo-Cy5、BODIPY 500/510、prodan、Alexa Fluor 405、Seta 650、Setau 647、MB 660R、Alexa Fluor 488、ATTO 647和DAPI、其衍生物及其组合，优选地选自DRAQ5、Alexa Fluor 350-NHS酯、Sulfo-Cy5酸、BODIPY 500/510、prodan、AlexaFluor 405-DBCO、Seta 650-DBCO、SeTau 647-马来酰亚胺、MB 660R-酸、MB 660R-DBCO、Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、ATTO 647-酸和DAPI及其组合。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的微生物或成组微生物
-属于嗜热嗜酸细菌，并且优选地选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、环庚烷脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius和Alicyclobacillus contaminans及其组合；和/或
-属于醋酸菌，并且优选地选自属于醋杆菌属(Acetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)和亚细亚菌属(Asaia)的细菌及其组合；和/或
-属于乳酸菌，并且优选地选自属于乳杆菌属(Lactobacillus)和魏斯氏菌属(Weissellas)的细菌及其组合；和/或
-属于厌氧细菌，并且优选地选自梭状芽孢杆菌属(Clostridium)和丙酸杆菌属(Cutibacterium)的细菌及其组合，和/或
-属于好氧中温细菌，并且优选地选自甲基杆菌属(Methylobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、克罗诺杆菌属(Cronobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、肠球菌属(Enterococcus)、志贺氏菌属(Shigella)、考克氏菌属(Kocuria)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)及其组合，和/或
-属于革兰氏阴性细菌，并且优选地选自埃希氏杆菌属(Escherichia)和假单胞菌属(Pseudomonas)及其组合，和/或
-属于异养细菌，优选地选自属于不动杆菌属(Acinetobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、莫拉氏菌属(Moraxella)、泛菌属(Pantoea)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、罗尔斯通菌属(Ralstonia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)的细菌及其组合，和/或
-属于酵母和霉菌，并且优选地选自假丝酵母属(Candida)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)、地霉属(Geotrichum)和青霉属(Penicillium)及其组合。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的微生物或成组微生物
-属于嗜热嗜酸细菌，并且优选地选自酸土脂环酸芽孢杆菌、酸热脂环酸芽孢杆菌、嗜酸脂环酸芽孢杆菌、环庚烷脂环酸芽孢杆菌、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius和Alicyclobacillus contaminans及其组合；和/或
-属于醋酸菌，并且优选地选自属于醋杆菌属、葡糖杆菌属、葡糖醋杆菌属和亚细亚菌属的细菌及其组合；和/或
-属于乳酸菌，并且优选地选自属于乳杆菌属和魏斯氏菌属的细菌及其组合；和/或
-属于厌氧细菌，并且优选地选自梭状芽孢杆菌属和丙酸杆菌属细菌及其组合，和/或
-属于好氧中温细菌，并且优选地选自甲基杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、埃希氏杆菌属、葡萄球菌属、不动杆菌属、克罗诺杆菌属、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、肠球菌属、志贺氏菌属、考克氏菌属和伯克霍尔德氏菌属及其组合，和/或
-属于革兰氏阴性细菌，并且优选地选自埃希氏杆菌属和假单胞菌属及其组合，和/或
-属于酵母和霉菌，并且优选地选自假丝酵母属、接合酵母属、曲霉属、酵母属、地霉属和青霉属及其组合。
22.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于嗜热嗜酸细菌的微生物，优选地选自酸土脂环酸芽孢杆菌、酸热脂环酸芽孢杆菌、嗜酸脂环酸芽孢杆菌、环庚烷脂环酸芽孢杆菌、Alicyclobacillus hesperidum、Alicyclobacillus herbarius和Alicyclobacillus contaminans及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料，优选地选自MB660R、Alexa Fluor 488和ATTO647及其衍生物和组合，更优选地选自MB660R-酸、MB660R-DBCO、Alexa Fluor 488-酸、AlexaFluor488-DBCO和ATTO647-酸及其组合。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料，优选地选自MB660R和衍生物，更优选地选自MB660R-酸和MB660R-DBCO，甚至更优选为MB660R-DBCO。
24.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于醋酸菌(AAB)的微生物，优选地选自属于醋杆菌属、葡糖杆菌属、葡糖醋杆菌属和亚细亚菌属的细菌及其组合，更优选地选自醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(Gluconoacetobacter liquefaciens)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)和暹罗亚细亚菌(Asaia siamensis)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料和DAPI及其组合，优选地选自Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647-酸和DAPI及其组合。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料，优选地选自Alexa Fluor 488、MB660R和ATTO647及其衍生物和组合，更优选地选自AlexaFluor 488-酸、Alexa Fluor488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO和ATTO647-酸及其组合。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述至少一种荧光染料选自MB660R和ATTO647及其衍生物和组合，优选地选自MB660R-酸、MB660R-DBCO和ATTO647-酸及其组合，更优选地选自MB660R-酸和ATTO647-酸及其组合。
27.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于乳酸菌(LAB)的微生物，优选地选自属于乳杆菌属和魏斯氏菌属的细菌及其组合，更优选地选自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和融合魏斯氏菌(Weissellas confusa)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料和DAPI及其组合，优选地选自Alexa Fluor488、MB660R、ATTO647和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO和ATTO647-酸及其组合。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述至少一种荧光染料选自Alexa Fluor 488、MB660R和DAPI及其衍生物和组合，特别是选自Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸和DAPI及其组合，优选地选自基于呫吨的染料，更优选地选自Alexa Fluor 488-酸和MB660R-酸及其组合，甚至更优选为MB660R-酸。
29.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于厌氧细菌的微生物，优选地选自梭状芽孢杆菌属和丙酸杆菌属细菌及其组合，更优选地选自生芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes)和痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于花青的染料和DAPI及其组合，优选地选自MB660R、Cy5、优选为Sulfo-Cy5、和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自MB660R-DBCO、sulfo-Cy5酸和DAPI及其组合。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料和基于花青的染料，优选地选自MB660R和Cy5、优选为Sulfo-Cy5、及其衍生物和组合，更优选地选自MB660R-DBCO和sulfo-Cy5酸及其组合。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述至少一种荧光染料包括MB660R-DBCO和sulfo-Cy5酸。
32.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于好氧中温细菌(AMB)的微生物，优选地选自属于甲基杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、埃希氏杆菌属、葡萄球菌属、不动杆菌属、克罗诺杆菌属、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、肠球菌属、志贺氏菌属、考克氏菌属和伯克霍尔德氏菌属的细菌及其组合，更优选地选自扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、吖啶染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和DAPI及其组合，优选地选自吖啶橙、DRAQ5、Cytrak橙、Alexa Fluor 350、太平洋蓝、Cy5、优选为Sulfo-Cy5、BODIPY染料、优选为BODIPY 500/510、prodan、Alexa Fluor 405、瀑布蓝、Seta染料、优选为Seta650或Seta 375、SeTau染料、优选为SeTau 647或SeTau 488、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自吖啶橙、DRAQ5、Cytrak橙、Alexa Fluor350-NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、BODIPY 500/510、prodan、Alexa Fluor 405-DBCO、瀑布蓝、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647-酸和DAPI及其组合。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合，优选地选自DRAQ5、Cytrak橙、Alexa Fluor 350、太平洋蓝、Cy5、优选为Sulfo-Cy5、BODIPY染料、优选为BODIPY500/510、prodan、Alexa Fluor 405、瀑布蓝、Seta染料、优选为Seta 650或Seta 375、SeTau染料、优选为SeTau 647或SeTau 488、Alexa Fluor 488、MB660R和ATTO647及其衍生物和组合，更优选地选自DRAQ5、Cytrak橙、Alexa Fluor 350-NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、BODIPY 500/510、prodan、Alexa Fluor405-DBCO、瀑布蓝、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO和ATTO647-酸及其组合。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料，优选地选自MB660R及其衍生物和组合，任选地与选自基于花青的染料的荧光染料、优选为Cy5、特别是Sulfo-Cy5组合，更优选为MB660R-DBCO，任选地与Sulfo-Cy5-酸组合。
35.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于革兰氏阴性细菌的微生物，优选地选自属于埃希氏杆菌属、变形杆菌属和假单胞菌属的细菌及其组合，更优选地选自大肠埃希氏杆菌、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)和铜绿假单胞菌及其组合，并且所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料、优选为罗丹明染料、基于花青的染料和DAPI及其组合，优选地选自Cy5、优选为Sulfo-Cy5、MB660R和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自Sulfo-Cy5-酸、MB660R-DBCO和DAPI及其组合。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料和基于花青的染料及其组合，优选地选自Cy5、优选为Sulfo-Cy5、MB660R及其衍生物和组合，更优选地选自Sulfo-Cy5-酸和MB660R-DBCO及其组合。
37.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于革兰氏阴性细菌的微生物，优选地选自属于埃希氏杆菌属和假单胞菌属的细菌及其组合，更优选地选自大肠埃希氏杆菌和铜绿假单胞菌及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、优选为罗丹明染料、基于芘的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料和DAPI及其组合，优选地选自Cy5、优选为Sulfo-Cy5、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、MB660R和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自Sulfo-Cy5-酸、AlexaFluor 350-NHS酯、Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-DBCO和DAPI及其组合。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、优选为罗丹明染料、基于芘的染料、基于香豆素的染料和基于花青的染料及其组合，优选地选自Cy5、优选为Sulfo-Cy5、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405和MB660R及其衍生物和组合，更优选地选自Sulfo-Cy5-酸、Alexa Fluor 350-NHS酯、Alexa Fluor 405-DBCO和MB660R-DBCO及其组合。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述至少一种荧光染料选自基于芘的染料、基于香豆素的染料及其组合，优选地选自Alexa Fluor350和Alexa Fluor 405及其衍生物和组合，更优选地选自Alexa Fluor350-NHS酯、Alexa Fluor 405-DBCO及其组合。
40.根据权利要求37所述的方法，其中所述至少一种荧光染料是Alexa Fluor 350-NHS酯与Alexa Fluor 405-DBCO的组合。
41.根据权利要求37所述的方法，其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料和基于花青的染料及其组合，优选地选自Cy5、优选为Sulfo-Cy5、MB660R及其衍生物和组合，更优选地选自Sulfo-Cy5-酸和MB660R-DBCO及其组合。
42.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于革兰氏阳性细菌的微生物，优选地选自属于葡萄球菌属和肠球菌属的细菌及其组合，更优选地选自金黄色葡萄球菌和粪肠球菌及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于花青的染料和DAPI及其组合，优选地选自Cy5、优选为Sulfo-Cy5、MB660R、DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自Sulfo-Cy5-酸、MB660R-DBCO和DAPI及其组合。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料和基于花青的染料及其组合，优选地选自Cy5、优选为Sulfo-Cy5和MB660R及其衍生物和组合，更优选地选自Sulfo-Cy5-酸和MB660R-DBCO及其组合。
44.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于异养细菌的微生物，优选地选自属于不动杆菌属、气单胞菌属、短波单胞菌属、伯克霍尔德氏菌属、柠檬酸杆菌属、爱德华氏菌属、肠杆菌属、埃希氏杆菌属、苍白杆菌属、克雷伯氏菌属、甲基杆菌属、莫拉氏菌属、泛菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、罗尔斯通菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、鞘氨醇单胞菌属、寡养单胞菌属、耶尔森氏菌属、芽孢杆菌属、肠球菌属、微球菌属、葡萄球菌属的细菌及其组合，更优选地选自鲍曼不动杆菌、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、洋葱伯克霍尔德氏菌、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、大肠埃希氏杆菌、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropic)、肺炎克雷伯氏菌、扭脱甲基杆菌、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)、鼠伤寒沙门氏菌、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、宋内志贺氏菌、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、滕黄微球菌(Micrococcus luteus)(嗜根考克氏菌)、金黄色葡萄球菌及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自吖啶染料、基于呫吨的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和DAPI及其组合，优选地选自吖啶橙、DRAQ5、Cytrak橙、Alexa Fluor 350、太平洋蓝、Cy5、优选为Sulfo-Cy5、Cy5.5、优选为Sulfo-Cy5.5、BODIPY染料、优选为BODIPY 500/510、prodan、Alexa Fluor 405、瀑布蓝、Seta染料、优选为Seta 650或Seta 375、SeTau染料、优选为SeTau 647或SeTau 488、Alexa Fluor488、MB660R、ATTO647和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自吖啶橙、DRAQ5、Cytrak橙、Alexa Fluor 350-NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、Sulfo-Cy5.5-酸、BODIPY 500/510、prodan、Alexa Fluor405-DBCO、瀑布蓝、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647-酸和DAPI及其组合。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合，优选地选自DRAQ5、Cytrak橙、Alexa Fluor 350、太平洋蓝、Cy5、优选为Sulfo-Cy5、Cy5.5、优选为Sulfo-Cy5.5、BODIPY染料、优选为BODIPY 500/510、prodan、Alexa Fluor 405、瀑布蓝、Seta染料、优选为Seta 650或Seta 375、SeTau染料、优选为SeTau 647或SeTau 488、Alexa Fluor488、MB660R和ATTO647及其衍生物和组合，更优选地选自DRAQ5、Cytrak橙、Alexa Fluor350-NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、Sulfo-Cy5.5-酸、BODIPY 500/510、prodan、Alexa Fluor 405-DBCO、瀑布蓝、Seta650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO和ATTO647-酸及其组合。
46.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于酵母和霉菌的微生物，优选地选自属于假丝酵母属、接合酵母属、曲霉属、酵母属、地霉属和青霉属的真菌及其组合，更优选地选自白假丝酵母(Candida albicans)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白地霉(Geotrichumcandidum)、宛氏青霉(Penicillium variotii)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)及其组合，并且所述至少一种荧光染料选自吖啶染料、基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和DAPI及其组合，优选地选自吖啶橙、Alexa Fluor350、太平洋蓝、Cy5、优选为Sulfo-Cy5、prodan、Alexa Fluor405、瀑布蓝、BODIPY 500/510、Seta染料、优选为Seta 650、SeTau染料、优选为SeTau 647或SeTau 488、Alexa Fluor 488、MB660R和DAPI及其衍生物和组合，更优选地选自吖啶橙、Alexa Fluor 350-NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、prodan、Alexa Fluor 405-DBCO、瀑布蓝、BODIPY 500/510、Seta 650-DBCO、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau488-NHS、Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸、MB660R-DBCO和DAPI及其组合。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合，优选地选自Alexa Fluor 350、太平洋蓝、Cy5、优选为Sulfo-Cy5、prodan、Alexa Fluor 405、瀑布蓝、BODIPY 500/510、Seta染料、优选为Seta 650、SeTau染料、优选为SeTau 647或SeTau 488、Alexa Fluor 488和MB660R及其衍生物和组合，更优选地选自Alexa Fluor 350-NHS酯、太平洋蓝-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、prodan、AlexaFluor 405-DBCO、瀑布蓝、BODIPY 500/510、Seta 650-DBCO、SeTau 647-马来酰亚胺、SeTau488-NHS、Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸和MB660R-DBCO及其组合。
48.根据权利要求46所述的方法，其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料，优选地选自MB660R及其衍生物和组合，优选为MB660R-DBCO。
49.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的微生物或成组微生物包含优选地选自嗜热嗜酸细菌(TAB)、醋酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、厌氧细菌、好氧中温细菌、革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌、异养细菌及其组合的一种或几种细菌，以及优选地选自酵母和霉菌的一种或几种微观真菌，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合，优选地选自Alexa Fluor 350、太平洋蓝、Cy5、优选为Sulfo-Cy5、Alexa Fluor 405、瀑布蓝TM、Seta染料、优选为Seta 650或Seta 375、SeTau染料、优选为SeTau 647和SeTau 488、AlexaFluor 488和MB660R及其衍生物和组合，更优选地选自Alexa Fluor 350-NHS酯、太平洋蓝TM-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、Alexa Fluor 405-DBCO、瀑布蓝、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 488-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸和MB660R-DBCO及其组合，甚至更优选地选自Sulfo-Cy5-酸和MB660R-DBCO及其组合。
50.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的微生物或成组微生物包含优选地选自嗜热嗜酸细菌(TAB)、醋酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、厌氧细菌、好氧中温细菌、革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌及其组合的一种或几种细菌，以及优选地选自酵母和霉菌的一种或几种微观真菌，并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合，优选地选自Alexa Fluor 350、Cy5TM、优选为Sulfo-Cy5、Alexa Fluor 405、Seta染料、优选为Seta 650或Seta 375、SeTau染料、优选为SeTau 647、Alexa Fluor 488和MB660R及其衍生物和组合，更优选地选自Alexa Fluor 350-NHS酯、Sulfo-Cy5-酸、Alexa Fluor 405-DBCO、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-马来酰亚胺、Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸和MB660R-DBCO及其组合，甚至更优选地选自Sulfo-Cy5-酸和MB660R-DBCO及其组合。
51.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含选自巴西曲霉、白假丝酵母和大肠埃希氏杆菌及其组合的微生物，并且所述至少一种荧光染料选自Bodipy 500/510；Alexa Fluor 350或其衍生物，优选为Alexa Fluor350-NHS酯；太平洋蓝或其衍生物，优选为太平洋蓝-NHS酯；prodan；Alexa Fluor 405或其衍生物，优选为Alexa Fluor 405-DBCO；瀑布蓝；Seta 650或其衍生物，优选为Seta 650-DBCO；Setau 488或其衍生物，优选为Setau 488-NHS；Setau 647或其衍生物，优选为Setau647-马来酰亚胺，及其任何组合。
52.根据权利要求2至51中任一项所述的方法，其中在步骤b)之后并且在步骤c)之前，将所述膜滤器从所述固体生长培养基上取下，并在步骤c)中检测和/或计数其上的微菌落。
53.根据权利要求1至52中任一项所述的方法，其中在步骤c)中，使用荧光显微镜或固相细胞仪检测和/或计数发射荧光信号的微菌落。
54.如权利要求1至53中任一项所定义的方法用于确定样品是否含有至少一种感兴趣的微生物，用于确定样品是否无菌，或用于确定样品的生物负载的用途。
55.一种试剂盒用于根据权利要求1至54中任一项的方法检测和/或计数感兴趣的微生物或成组微生物的用途，所述试剂盒包含：
(i)-至少一种荧光染料，其优选地如权利要求11至19中任一项所定义，
和任选的
-至少一个膜滤器，其优选地如权利要求6至9中任一项所定义，和/或
-至少一个容器，其包含含有支持所述感兴趣的微生物或成组微生物生长的营养物的固体生长培养基，或获得所述至少一个容器所需的材料，和/或
-提供所述试剂盒的使用说明的小册子，或
(ii)-至少一个容器，其包含含有优选地如权利要求11至19中任一项所定义的至少一种荧光染料和支持所述感兴趣的微生物或成组微生物生长的营养物的固体生长培养基，或获得所述至少一个容器所需的材料，
和任选的
-至少一个膜滤器，其优选地如权利要求6至9中任一项所定义，和/或
-提供所述试剂盒的使用说明的小册子。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP21305813.4 | 2021-06-14 | ||
| EP21306443 | 2021-10-15 | ||
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|---|---|
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202280053194.4A Pending CN117769603A (zh) | 2021-06-14 | 2022-06-14 | 通过向固体生长培养基直接添加荧光染料来检测微生物的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117769603A (zh) |
-
2022
- 2022-06-14 CN CN202280053194.4A patent/CN117769603A/zh active Pending
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| PB01 | Publication | ||
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