EP2205976A2 - Test biochimique pour confirmer la presence de l. monocytogenes - Google Patents

Test biochimique pour confirmer la presence de l. monocytogenes

Info

Publication number
EP2205976A2
EP2205976A2 EP08844892A EP08844892A EP2205976A2 EP 2205976 A2 EP2205976 A2 EP 2205976A2 EP 08844892 A EP08844892 A EP 08844892A EP 08844892 A EP08844892 A EP 08844892A EP 2205976 A2 EP2205976 A2 EP 2205976A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
substrate
listeria
monocytogenes
biochemical
test
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP08844892A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Bernadette Blanc
Daniel Monget
Nadine Perrot
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP2205976A2 publication Critical patent/EP2205976A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/045—Culture media therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)

Definitions

  • the present invention relates to the identification of pathogenic bacteria of the genus Listeria, and more specifically of the species Listeria monocytogenes.
  • Listeria monocytogenes The isolation and identification of the bacterium Listeria monocytogenes is a major problem in the surveillance of agro-food hygiene and medical bacteriology. Of the Listeria bacteria, only Listeria monocytogenes is known to be pathogenic to humans. It can cause listeriosis, sometimes fatal (25 to 30% of cases) in immunocompromised people, young children or pregnant women. Other Listeria species are not pathogenic or are only for animals. This is particularly the case of Listeria ivanovii.
  • the genus Listeria sp now comprises six species, of which only Listeria monocytogenes is pathogenic for humans.
  • Germs are the cause of severe epidemics in humans, as a result of food contamination.
  • foods mainly milk and milk products
  • two species of Listeria are mainly isolated: nonpathogenic Listeria innocua and pathogenic Listeria monocytogenes. These two species have many common biochemical characters, so it is difficult to differentiate them.
  • the beta-hemolysis test is based on the determination of a beta-hemolytic activity related to the production by the bacterium of a substance that causes lysis of red blood cells (listeriolysin). This test is performed on sheep or horse blood agar, but the answer is often discreet. This test is therefore unreliable and if it makes it possible to differentiate the two species mainly encountered, ie L. mono cyto genes (positive response) of L. innocua (negative response), it is not specific for the pathogenic species.
  • the CAMP-test is another test, which is associated with the test of beta-hemolysis previously described.
  • the test is carried out on tryptic soy agar, containing 5% of washed red blood cells.
  • the beta-hemolytic strain of S. aureus CIP 5710 is inoculated into a streak perpendicular to the streaks formed by the culture of the Listeria strain to be tested.
  • the reinforcement of the hemolysis of staphylococcus in contact with the two zones indicates a positive reaction.
  • the CAMP-test is a heavy technique to implement, and, like hemolysis, is not always very reliable. It is also possible to use culture media or identification media.
  • patent EP496680 issued to the applicant, describes a bacteriological analysis method to differentiate the species Listeria monocytogenes from other bacteria of the genus Listeria sp.
  • a reaction medium comprising a chromogenic or fluoro -ogenic substrate capable of being hydrolyzed by an enzyme called Glycine aminopeptidase is used.
  • Glycine aminopeptidase is used.
  • This very interesting technique has the disadvantage that the species Listeria monocytogenes is the only one that does not have enzymatic Glycine aminopeptidase activity.
  • the detection of Listeria monocytogenes is carried out by a negative activity, which is not easy, the use of a negative test lacking specificity in case of mutant or if the other species are stressed and do not respond with normal activity .
  • Listeria monocytogenes and Listeria ivanovii species can be differentiated from other Listeria species by demonstrating phospholipase C activity specific for phosphatidylinositol (PI-PLC). Indeed, it has been demonstrated that PI-PLC is secreted into the culture medium by certain species of the genus Listeria such as Listeria monocytogenes and Listeria ivanovii (Leiffle-Wachter et al., Mol Microbiol. (1991) 5 (2)). ), pp. 361-366).
  • the Ottaviani Agosti Agar medium is a chromogenic medium that uses on the one hand a ⁇ -Glucosidase substrate that allows the detection of all species of the genus Listeria and on the other hand the highlighting of PI-PLC activity.
  • a confirmation test of Listeria monocytogenes generally implementing a second culture medium, for which a 24h incubation step is necessary.
  • AES ALOAConfirmation
  • BBL CHROMagar Identification listeria
  • a duration of 48 hours is therefore necessary to identify and confirm the presence of Listeria monocytogenes: use of a first culture medium, which requires 24 hours of incubation, then the second confirmation step which also requires a 24h incubation .
  • This duration of 48 hours is long, and it is desirable to shorten this duration to provide a reliable diagnosis as quickly as possible.
  • the present invention aims to provide a detection method that allows the differentiation of Listeria monocytogenes species compared to all other species of Listeria spp.
  • the invention proposes a new confirmatory test, which is a very rapid biochemical test since it can be implemented in less than 6 hours.
  • biochemical test we mean a test allowing the implementation of a biochemical reaction highlighting the presence of bacteria. Such a test may in particular be implemented directly from an inoculum, without implementing a growth step. It is then the preformed enzymes provided by the bacterial suspension that are detected.
  • Such tests are notably carried out in the API® range or the Vitek 2 system. These tests, packaged in dehydrated form, are brought into contact, under incubation, with the sample to be analyzed. The desired biochemical reaction is detected by a change in the state of the test (appearance disappearance of a coloration, a fluorescence).
  • the reading of the test is then done visually or with the aid of a reader, directly or after the addition of a developer reagent.
  • the API® range is based on a probabilistic numerical identification method, associating a biochemical test gallery, in cups and a database. It is the judicious combination of tests that ensures the characterization of a group of germs and the distinction of species between them.
  • the VITEK 2 system is a fully automated identification and antibiogram system that implements a 64 micro-well card. By eliminating manual steps, automation saves lab time and ensures consistent analysis procedures that improve the reliability of results.
  • the identification performed on this system uses a probabilistic method similar to that of API galleries. The automation of the reading allows a kinetic reading of the biochemical tests implemented and thus allows an identification in 4 to 8 hours for the current Gram positive germs as well as for Listeria monocytogenes.
  • the biochemical test according to the invention is a confirmation test for the presence of L monocytogenes, comprising a substrate of PI-PLC and a substrate of ⁇ -mannosidase, but may also comprise inorganic salts, peptones, carbohydrates, one or more compounds limiting pH variations, one or more enzyme inducers.
  • substrate any molecule capable of generating directly or indirectly a detectable signal due to an enzymatic or metabolic activity of the microorganism.
  • the substrate may in particular be an enzymatic substrate, that is to say a substrate that can be hydrolyzed by an enzyme into a product allowing the direct or indirect detection of a microorganism.
  • this substrate is in particular a phosphatidyl inositol phospholipase C substrate (PIPLC) or an ⁇ -mannosidase substrate.
  • PPLC phosphatidyl inositol phospholipase C substrate
  • ⁇ -mannosidase substrate an ⁇ -mannosidase substrate
  • This substrate may comprise in particular a first specific part of the enzymatic activity to be revealed and a second part serving as a marker, hereinafter referred to as a marker part.
  • This marker part may be chromogenic, fluorogenic, luminescent ... preferably, the substrates used in the present invention are chromogenic.
  • substrates based on indoxyl and its derivatives particularly suitable in the case of phosphatidyl inositol phospholipase C (PI-PLC) substrates, substrates based on nitrophenol and derivatives, particularly suitable in the case of substrates of ⁇ -mannosidase, but also the substrates based on hydroxyquinoline or esculetin or alizarin or catechol or aminophenol and naphthol and their derivatives
  • PI-PLC phosphatidyl inositol phospholipase C
  • substrates based on nitrophenol and derivatives particularly suitable in the case of substrates of ⁇ -mannosidase
  • substrates based on hydroxyquinoline or esculetin or alizarin or catechol or aminophenol and naphthol and their derivatives for the fluorogenic markers, mention may be made of coumarin derivatives and especially of umbelliferone, naphthol, resorufin, fluorescein
  • the substrate is preferably chosen
  • the PIPLC substrate is a chromogenic substrate.
  • the PIPLC substrate is an indolyl-phosphatidyl-myo-inositol, preferentially bromo 4-chloro-3-indoxyl myoinositol phosphate (X-indolyl-phosphatidyl-myo-inositol).
  • the ⁇ -mannosidase substrate is a chromogenic substrate or fluorogenic.
  • the ⁇ -mannosidase substrate is a chromogenic substrate.
  • the ⁇ -mannosidase substrate is a mannopyranosidase substrate.
  • the mannopyranosidase substrate is nitrophenyl-4- ⁇ D mannopyrano side.
  • the substrate concentration of PI-PLC is between 5 and 0.1 g / l, preferably between 1.5 and 0.5 g / l.
  • the concentration of ⁇ -mannosidase substrate is between 2 and 0.1 g / l, preferably between 1 and 0.5 g / l.
  • reaction medium is meant a medium comprising all the elements necessary for the expression of a metabolism and / or the growth of microorganisms.
  • the environment The reaction may be solid, semi-solid or liquid.
  • solid medium is meant for example a gelled medium.
  • Agar is the traditional gelling agent in microbiology for the cultivation of microorganisms, but it is possible to use gelatin or agarose.
  • a number of preparations are commercially available, for example Columbia agar, Trypcase-soy agar, Mac Conkey agar, Sabouraud agar or more generally those described in the Handbook of Microbiological Media (CRC Press).
  • the reaction medium may comprise one or more elements in combination, such as amino acids, peptones, carbohydrates, nucleotides, minerals, vitamins, active molecules such as antibiotics, enzymes, surfactants, buffers, phosphate, ammonium, sodium, metal salts, one or more substrates for the detection of enzymatic or metabolic activity ...
  • the medium may also comprise a dye.
  • dye of Evans blue, neutral red, sheep blood, horse blood, an opacifier such as titanium oxide, nitroaniline, malachite green, brilliant green ...
  • biological sample is meant a clinical sample, from a biological fluid sample or a food sample, from any type of food .
  • This sample may thus be liquid or solid and may be mentioned in a nonlimiting manner, a clinical sample of blood, cerebrospinal fluid, placenta, a food sample of water, drinks such as milk, a fruit juice.
  • the invention relates to a biochemical test for confirming the presence of L. monocytogenes, characterized in that it comprises at least one phosphatidyl inositol phospholipase C substrate (PIPLC) and at least one ⁇ -mannosidase substrate.
  • PPLC phosphatidyl inositol phospholipase C substrate
  • the PIPLC substrate is an indolylphosphatidyl-myo-inositol, preferentially bromo 4 chloro-3 indoxyl myoinositol phosphate.
  • the alpha mannosidase substrate is a mannopyranosidase substrate, preferentially nitrophenyl-4- ⁇ D mannopyrano side.
  • the test further comprises an activator of PIPLC, or several such as in particular alpha-glycerophosphate of
  • PLC is between 5 and 0.1 g / l, preferably between 1.5 and 0.5 g / l.
  • the concentration of ⁇ -mannosidase substrate is between 2 and 0.1 g / l, preferably between 1 and 0.5 g / l.
  • the invention also relates to the use of a biochemical test as described above, ie a biochemical confirmation test comprising a phosphatidyl inositol phospholipase C substrate (PIPLC) and at least one alpha mannosidase substrate, such as previously defined, to confirm the presence of L. monocytogenes.
  • a biochemical confirmation test comprising a phosphatidyl inositol phospholipase C substrate (PIPLC) and at least one alpha mannosidase substrate, such as previously defined, to confirm the presence of L. monocytogenes.
  • the test according to the invention is particularly suitable for unitary use or combined with a series of biochemical tests so as to give rise to an identification device API® range or Vitek® system.
  • identification of L monocytogenes on API or Vitek system uses a reaction profile established by the concatenation of positive or negative responses of several unit biochemical tests.
  • the test according to the invention may advantageously be integrated with such devices so as to reduce the number of tests.
  • the invention also relates to a method of identifying Listeria monocytogenes, characterized in that it comprises the following steps: a) having a reaction medium for detecting the genus Listeria, b) seeding the medium with a biological sample to be tested (c) incubating (d) revealing the presence of the Listeria genus; (e) confirming the presence of L monocytogenes by a biochemical test according to the invention, comprising a phosphatidyl inositol phospholipase C (PIPLC) substrate and at least one alpha mannosidase substrate, as defined above.
  • a biochemical test comprising a phosphatidyl inositol phospholipase C (PIPLC) substrate and at least one alpha mannosidase substrate, as defined above.
  • the seeding of the microorganisms can be carried out by all the seeding techniques known to those skilled in the art.
  • An incubation step can be carried out at a temperature for which the enzymatic activity that one wishes to detect is optimal, that the person skilled in the art can easily choose according to the enzymatic activity to be detected.
  • Step d) can be carried out by visual examination, colorimetry or fluorimetry.
  • OAA medium bioMerieux, ref 43641 which allows the detection of species of the genus Listeria by colony blue staining (beta-glucosidase activity).
  • the invention also relates to a method for identifying Listeria monocytogenes, characterized in that it comprises the following steps: a) having a biochemical test or a combination of biochemical tests to detect the genus Listeria, b) revealing the presence of the Listeria genus c) confirming the presence of L monocytogenes by a biochemical test according to the invention, comprising a phosphatidyl inositol phospholipase C substrate (PIPLC) and at least one alpha mannosidase substrate, as defined above.
  • a biochemical test comprising a phosphatidyl inositol phospholipase C substrate (PIPLC) and at least one alpha mannosidase substrate, as defined above.
  • PPLC phosphatidyl inositol phospholipase C substrate
  • a biochemical test according to the invention comprises the following elements in g / 1:
  • the test was evaluated to obtain a reaction in 4 to 6 hours at 37 ° C. +/- 20 ° C. after rehydration with 50 ⁇ l of demineralized water and addition of a colony or rehydration with 50 ⁇ l of a bacterial suspension. opacity equivalent to McF 0.5.
  • test staining is read and interpreted according to the following grid:
  • the test according to the invention was evaluated, initially using an inoculum of 0.5 McFarland, on 90 pure strains of the genus Listeria previously grown on OAA medium (Ref 43641).
  • the 6 species of the genus Listeria sp were distributed as follows: L. monocytogenes (30 strains), L. ivanovii (20) (including 10 strains of L. ivanovii spp londoniensis and L. ivanovii spp ivanovii subspecies), L. grayii (10), L. seeligeri (10), L. welshimeri (10), L. innocua (10). 4H, 80% of L.
  • the test according to the invention confirmed the belonging of the 6 presumed strains, to the species
  • L. monocytogenes in 4H The L. monocytogenes identification of the 6 strains was confirmed by other identification tools (API Listeria gallery, Vitek GP maps and 16S sequencing).
  • the other 5 matrices were contaminated with Listeria spp. Other than L. monocytogenes or other germs. In all these cases, the test according to the invention implemented on a colony of each of these matrices gave a negative response.
  • test according to the invention was also validated on 250 pure strains tested with the following distribution:
  • the 50 strains of Listeria sp developed on OAA medium The 50 strains of Listeria sp developed on OAA medium.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

L'invention concerne un test biochimique pour confirmer la présence de L. monocytogenes caractérisé en ce qu'il comprend au moins un substrat de phosphatidyl inositol phospholipase C (PIPLC) et au moins un substrat d'alpha mannosidase.

Description

Test biochimique pour confirmer la présence de L. monocytogenes
La présente invention concerne l'identification de bactéries pathogènes du genre Listeria, et plus précisément de l'espèce Listeria monocytogenes.
L'isolement et l'identification de la bactérie Listeria monocytogenes est un problème majeur de la surveillance de l'hygiène agro-alimentaire et de la bactériologie médicale. Parmi les bactéries du genre Listeria, seule l'espèce Listeria monocytogenes est connue pour être pathogène pour l'homme. Elle peut engendrer la listériose, parfois mortelle (25 à 30% des cas) chez les personnes immunodéprimées, les enfants en bas âge ou les femmes enceintes. Les autres espèces de Listeria ne sont pas pathogènes ou ne le sont que pour les animaux. C'est le cas notamment de Listeria ivanovii.
Même si les risques de listériose humaine ont régressé dans la plupart des pays développés lors des dernières décennies, la société moderne exige de plus en plus de sécurité qui, si elle s'accommode de cas sporadiques, ne peut tolérer les épidémies.
Dans le cadre de diagnostic d'affections bactériennes chez l'humain, il est donc important de distinguer nettement Listeria monocytogenes parmi les autres espèces du genre Listeria sp. qui ne sont pas pathogènes. Le genre Listeria sp comprend aujourd'hui six espèces, dont seule Listeria monocytogenes est pathogène pour l'homme.
Des germes sont à l'origine d'épidémies sévères chez l'homme, à la suite de contaminations à l'origine alimentaires. Dans les aliments (lait et produits laitiers essentiellement), deux espèces de Listeria sont principalement isolées : Listeria innocua non pathogène et Listeria monocytogenes pathogène. Ces deux espèces ont de nombreux caractères biochimiques communs, il est en conséquence difficile de les différencier. Le test de la beta-hémolyse, par exemple repose sur la détermination d'une activité beta-hémolytique liée à la production par la bactérie d'une substance qui provoque la lyse des hématies (listériolysine). Ce test est exercé sur gélose de sang de mouton ou de cheval, mais la réponse est souvent discrète. Ce test est donc peu fiable et s'il permet de différencier les deux espèces principalement rencontrées, à savoir L. mono cyto gènes (réponse positive) de L. innocua (réponse négative), il n'est pas spécifique de l'espèce pathogène.
Le CAMP-test est un autre test, qui est associé au test de la beta-hémolyse précédemment décrit. Le test est réalisé sur gélose trypticase soja, contenant 5 % d'hématies lavées de mouton. La souche beta-hémolytique de S. aureus CIP 5710 est ensemencée en une strie perpendiculaire aux stries formées par la culture de la souche de Listeria à tester. Le renforcement de l'hémolyse du staphylocoque au contact des deux zones indique une réaction positive. En pratique, le CAMP-test est une technique lourde à mettre en oeuvre, et, comme l'hémolyse, n'est pas toujours très fiable. II est également possible d'utiliser des milieux de culture ou des milieux d'identification. A ce titre, le brevet EP496680, délivré à la demanderesse, décrit un procédé d'analyse bactériologique pour différencier l'espèce Listeria monocytogenes des autres bactéries du genre Listeria sp. Selon ce procédé, on utilise un milieu réactionnel comprenant un substrat chromogène ou flu orogène susceptible d'être hydrolyse par une enzyme appelée Glycine aminopeptidase. Cette technique très intéressante présente un inconvénient résidant dans le fait que l'espèce Listeria monocytogenes est la seule à ne pas avoir d'activité enzymatique Glycine aminopeptidase. La détection de Listeria monocytogenes est réalisée par une activité négative, ce qui n'est pas aisée, l'utilisation d'un test négatif manquant de spécificité en cas de mutant ou si les autres espèces sont stressées et ne répondent pas avec une activité normale.
Il est possible de différencier les espèces Listeria monocytogenes et Listeria ivanovii, des autres Listeria par la mise en évidence de l'activité phospholipase C spécifique du phosphatidylinositol (PI-PLC). En effet, il a été démontré que la PI-PLC est sécrétée dans le milieu de culture par certaines espèces du genre Listeria telles que Listeria monocytogenes et Listeria ivanovii (Leimeister-Wàchter et al., Mol. Microbiol. (1991) 5(2), pp. 361-366). A ce titre, le milieu Ottaviani Agosti Agar est un milieu chromogène qui utilise d'une part un substrat β Glucosidase qui permet la détection de toutes les espèces du genre Listeria et d'autre part la mise en évidence de l'activité PI-PLC de Listeria monocytogenes et Listeria ivanovii par l'apparition d'un halo autour de la colonie. Quelque soit la technique utilisée, il est nécessaire de réaliser systématiquement un test de confirmation de Listeria monocytogenes, mettant généralement en œuvre un deuxième milieu de culture, pour lequel une étape d'incubation de 24h est nécessaire. On peut citer à ce titre les tests de confirmation ALOAConfirmation (AES), ou CHROMagar Identification listeria (BBL) . Au total, une durée de 48 H est donc nécessaire pour identifier et confirmer la présence de Listeria monocytogenes : utilisation d'un premier milieu de culture, qui nécessite 24H d'incubation, puis la seconde étape de confirmation qui nécessite également une incubation de 24h. Cette durée de 48h est longue, et il est souhaitable de raccourcir cette durée pour proposer un diagnostic fiable aussi rapidement que possible.
La présente invention a pour objectif de proposer une méthode de détection qui permet la différenciation de l'espèce Listeria monocytogenes par rapport à toutes les autres espèces de Listeria spp. En particulier, l'invention propose un nouveau test de confirmation, qui est un test biochimique très rapide puisqu'il peut être mis en œuvre en moins de 6h.
Avant d'aller plus avant dans la description de l'invention, les définitions ci dessous sont données afin de faciliter l'exposé de l'invention.
Par test biochimique, on entend un test permettant la mise en œuvre d'une réaction biochimique mettant en évidence la présence de bactéries. Un tel test peut être notamment mis en œuvre directement à partir d'un inoculum, sans mettre en oeuvre une étape de croissance. Ce sont alors les enzymes préformées apportées par la suspension bactérienne qui sont détectées.
De tels tests sont notamment mis en œuvre dans la gamme API® ou le système Vitek 2. Ces tests conditionnés sous forme déshydratée sont mis en contact, sous incubation, avec l'échantillon à analyser. La réaction biochimique recherchée est détectée par un changement d'état du test (apparition disparition d'une coloration, d'une fluorescence ).
La lecture du test se fait alors visuellement ou à l'aide d'un lecteur, de façon directe ou après l'ajout d'un réactif révélateur. La gamme API® repose sur une méthode probabiliste d'identification numérique, associant une galerie de tests biochimiques, dans des cupules et une base de données. C'est la combinaison judicieuse des tests qui assure la caractérisation d'un groupe de germe et la distinction des espèces entre elles. Le système VITEK 2 est un système d'identification et d'antibiogramme, entièrement automatisé, qui met en œuvre une carte de 64 micro-puits. En supprimant des étapes manuelles, l'automatisation permet de gagner du temps au laboratoire et garantit une uniformité des procédures d'analyse qui améliore la fiabilité des résultats. L'identification réalisée sur ce système utilise une méthode probabiliste similaire à celle des galeries API. L'automatisation de la lecture permet une lecture cinétique des tests biochimiques mis en œuvre et permet ainsi une identification en 4 à 8 heure pour les germes Gram positifs courants ainsi que pour Listeria monocytogenes.
Le test biochimique selon l'invention est un test de confirmation de la présence de L monocytogenes, comprenant un substrat de PI-PLC et un substrat d'α mannosidase, mais peut comprendre également des sels minéraux, des peptones, des hydrates de carbones, un ou plusieurs composés limitant les variations de pH, un ou plusieurs inducteurs d'enzymes.
Par substrat, on entend toute molécule susceptible d'engendrer directement ou indirectement un signal détectable dû à une activité enzymatique ou métabolique du microorganisme.
Le substrat peut être notamment un substrat enzymatique, c'est à dire un substrat pouvant être hydrolyse par une enzyme en un produit permettant la détection, directe ou indirecte d'un microorganisme.
Au sens de la présente invention, ce substrat est notamment un substrat de phosphatidyl inositol phospholipase C (PIPLC) ou un substrat d'α mannosidase.
Ce substrat peut comprendre notamment une première partie spécifique de l'activité enzymatique à révéler et une seconde partie faisant office de marqueur, ci-après appelée partie marqueur. Cette partie marqueur peut être chromogène, fluorogène, luminescente... préférentiellement, les substrats utilisés dans la présente invention sont chromogènes. On peut citer notamment les substrats à base d'indoxyl et ses dérivés, particulièrement adaptés dans le cas de substrats de phosphatidyl inositol phospholipase C (PI-PLC), les substrats à base de nitrophénol et dérivés, particulièrement adaptés dans le cas de substrats d' α-mannosidase, mais également les substrats à base d'hydroxyquinoline ou d'esculétine ou d'alizarine ou de catéchol ou d'aminophénol et de naphtol et leurs dérivés Pour les marqueurs fluorogène, on peut citer les dérivés de coumarines et notamment d'umbelliférone, de naphtol, de résorufine, de fluorescéïne Selon la présente invention, le substrat est préférentiellement choisi parmi les substrats à base : α d'indoxyl (3-Indoxyl,5-Bromo-3-indoxyl, 4-Chloro-3-indoxyl, 5-Iodo-3-indoxyl, 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl, 5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl, 6-Bromo-3-indoxyl, 6-Chloro-3-indoxyl, 6-Fluoro-3-indoxyl, 4,6-Dichloro-3-indoxyl, 6,7-Dichloro-3- indoxyl, 4,6,7-Trichloro-3-indoxyl, 5-Bromo-4-chloro-N-méthyl-3-indoxyl, N- Méthyl-3-indoxyl...) α de Nitrophénol (ortho-Nitrophénol, para- Nitrophénol, ...)
Préférentiellement, le substrat de PIPLC est un substrat chromogène. Préférentiellement, le substrat de PIPLC est un indolyl-phosphatidyl-myo-inositol, préférentiellement le 5 bromo 4 chloro 3 indoxyl myoinositol phosphate (X-indolyl-phosphatidyl-myo-inositol) Préférentiellement, le substrat d' α mannosidase est un substrat chromogène ou fluorogène. Préférentiellement, le substrat d' α mannosidase est un substrat chromogène. Préférentiellement, le substrat d' α mannosidase est un substrat de mannopyranosidase. Préférentiellement, le substrat de mannopyranosidase est le nitrophenyl-4-αD mannopyrano side . Préférentiellement, la concentration en substrat de PI-PLC est comprise entre 5 et 0,1 g/1, préférentiellement entre 1,5 et 0,5 g/1.
Préférentiellement, la concentration en substrat d' α mannosidase est comprise entre 2 et 0,1 g/1, préférentiellement entre 1 et 0,5 g/1. Par milieu réactionneL on entend un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à l'expression d'un métabolisme et/ou à la croissance de microorganismes. Le milieu réactionnel peut être solide, semi-solide ou liquide. Par milieu solide, on entend par exemple un milieu gélifié. L'agar est l'agent gélifiant traditionnel en microbiologie pour la culture des microorganismes, mais il est possible d'utiliser de la gélatine ou de l'agarose. Un certain nombre de préparation sont disponibles dans le commerce, comme par exemple l'agar Columbia, la gélose Trypcase-soja, la gélose Mac Conkey, la gélose Sabouraud ou plus généralement celles décrites dans le Handbook of Microbiological Media (CRC Press).
Le milieu réactionnel peut comprendre un ou plusieurs éléments en combinaison, tels que des acides aminés, des peptones, des hydrates de carbone, des nucléotides, des minéraux, des vitamines, des molécules actives telles que des antibiotiques, des enzymes, des tensioactifs, des tampons, des sels de phosphate, d'ammonium, de sodium, de métaux, un ou plusieurs substrats permettant la détection d'une activité enzymatique ou métabolique... Le milieu peut comprendre également un colorant. A titre indicatif, on peut citer comme colorant le bleu d' Evans, du rouge neutre, du sang de mouton, du sang de cheval, un opacifiant tel que l'oxyde de Titane, de la nitroaniline, du vert malachite, du vert brillant...
Pour détecter le genre Listeria, on peut citer notamment les milieux Palcam et Oxford, milieux sélectifs conventionnels fréquemment utilisés en industrie et cités dans les normes internationales ISO 11290-1 et 11290-2 pour la recherche et dénombrement de Listeria monocytogenes, ou des milieux chromogènes tel que le milieu OAA qui en plus de la détection permet l'identification présomptive de L.monocytogenes Par échantillon biologique, on entend un échantillon clinique, issu d'un prélèvement de liquide biologique ou un échantillon alimentaire, issu de tout type d'aliment. Cet échantillon peut être ainsi liquide ou solide et on peut citer d'une manière non limitative, un échantillon clinique de sang, de liquide cerebrospinal, de placenta, un échantillon alimentaire d'eau, de boissons tels que le lait, un jus de fruits; de yaourt, de viande, d'œufs, de légumes, de mayonnaise, de fromage , de poisson, un échantillon alimentaire issu d'une alimentation destinée aux animaux. A ce titre, l'invention concerne un test biochimique pour confirmer la présence de L. monocytogenes caractérisé en ce qu'il comprend au moins un substrat de phosphatidyl inositol phospholipase C (PIPLC) et au moins un substrat d' α mannosidase.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le substrat de PIPLC est un indolyl- phosphatidyl-myo-inositol, préférentiellement le 5 bromo 4 chloro 3 indoxyl myoinositol phosphate.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le substrat d'alpha mannosidase est un substrat de mannopyranosidase, préférentiellement le nitrophenyl-4-αD mannopyrano side . Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le test comprend en outre un activateur de la PIPLC, ou plusieurs tel que notamment l' alpha- glycerophosphate de
Magnésium, Sérum Albumine bovine.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la concentration en substrat de PI-
PLC est comprise entre 5 et 0,1 g/1, préférentiellement entre 1,5 et 0,5 g/1. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la concentration en substrat d' α mannosidase est comprise entre 2 et 0,1 g/1, préférentiellement entre 1 et 0,5 g/1.
L'invention concerne également l'utilisation d'un test biochimique tel que décrit précédemment, c'est à dire un test biochimique de confirmation comprenant un substrat de phosphatidyl inositol phospholipase C (PIPLC) et au moins un substrat de alpha mannosidase, tel que défini précédemment, pour confirmer la présence de L. monocytogenes.
Le test selon l'invention est particulièrement adapté pour une utilisation unitaire ou combinée à une série de tests biochimiques de façon à donner lieu à un dispositif d'identification en gamme API® ou système Vitek®. Actuellement l'identification de L monocytogenes sur galerie API ou système Vitek utilise un profil réactionnel établi par la concaténation des réponses positives ou négatives de plusieurs tests biochimiques unitaires. Le test selon l'invention peut avantageusement être intégré à de tels dispositifs de façon à réduire le nombre de tests. L'invention concerne également un procédé d'identification de Listeria monocytogenes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) disposer d'un milieu réactionnel pour détecter le genre Listeria, b) ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester, c) laisser incuber d) révéler la présence du genre Listeria e) confirmer la présence de L monocytogenes par un test biochimique selon l'invention, comprenant un substrat de phosphatidyl inositol phospholipase C (PIPLC) et au moins un substrat de alpha mannosidase, tel que défini précédemment.
L'ensemencement des microorganismes peut être réalisé par toutes les techniques d'ensemencement connues de l'homme du métier. Une étape d'incubation peut être réalisée à une température pour laquelle l'activité enzymatique que l'on souhaite détecter est optimale, que l'homme du métier peut choisir aisément selon l'activité enzymatique à détecter. L'étape d) peut s'effectuer par un examen visuel, par colorimétrie ou fluorimétrie.
Pour détecter le genre Listeria, on peut citer notamment le milieu OAA (bioMerieux, ref 43641) qui permet la détection des espèces du genre Listeria par coloration bleu des colonies (activité béta-glucosidase).
L'invention concerne également un procédé d'identification de Listeria monocytogenes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) disposer d'un test biochimique ou d'une combinaison de test biochimiques pour détecter le genre Listeria, b) révéler la présence du genre Listeria c) confirmer la présence de L monocytogenes par un test biochimique selon l'invention, comprenant un substrat de phosphatidyl inositol phospholipase C (PIPLC) et au moins un substrat de alpha mannosidase, tel que défini précédemment. Pour détecter le genre Listeria, on peut citer notamment la morphologie et la réaction de Gram auxquels on associe couramment le test à l'esculine, la catalase et des tests de fermentation de sucres tels Xylose, Rhamnose, mannitol, ribose, α Methyl D mannoside.
Les exemples ci dessous sont donnés à titre explicatif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention.
Exemple 1
A) Test biochimique selon l'invention Un test biochimique selon l'invention, comprend les éléments suivants en g/1 :
Tampon Tris 37,5
Extrait de peptone 2,5 extrait de levure 0,25 alpha- glycerophosphate de Mg 1,25 Sérum Albumine bovine 7,5
X- myo-inositol 1 phosphate 2
4-nitrophenyl-α D- mannopyranoside 2,25
pH = 7 en final . Après dépôt de 20μl de solution dans un support plastique, le test a été déshydraté à une température de 4O0C pendant 24H.
Le test a été évalué pour l'obtention d'une réaction en 4 à 6H à 370C +/-20C après réhydratation avec 50μl d'eau déminéralisée et addition d'une colonie ou réhydraté avec 50μl d'une suspension bactérienne d'opacité équivalente à McF 0,5.
B) Lecture et interprétation du test
Après 4 et 6 H d'incubation du test à 370C+/- I0C la coloration du test est lue et interprétée selon la grille suivante :
C) Validation du test selon l'invention
Le test selon l'invention a été évalué, dans un premier temps à l'aide d'un inoculum de 0,5 McFarland, sur 90 souches pures du genre Listeria préalablement cultivées sur milieu OAA (Ref 43641). Les 6 espèces du genre Listeria sp se répartissaient de la façon suivante : L. monocytogenes (30 souches), L. ivanovii (20) (comprenant 10 souches des sous espèces L. ivanovii spp londoniensis et L. ivanovii spp ivanovii) , L. grayii (10), L. seeligeri (10), L. welshimeri (10), L. innocua (10). Des 4H, 80% des souches de L. monocytogenes présentant un halo sur milieu OAA (25/25) ont révélées une coloration verte positive. Après 6H d'incubation toutes ces souches présentaient la couleur verte attendue. Après 24H la réaction est stable et le reste jusqu'à 72 heures d'incubation à 37±0,2°C.Aucune des 60 souches appartenant aux espèces autre que L monocytogenes n'ont données une coloration verte. Le test présente donc une sensibilité de 100% en 6H et une spécificité de 100% au sein du genre Listeria sp. Les performances du test selon l'invention ont également été évaluées pour un inoculum d'une colonie à partir de souches pures ou de souches issues de matrice alimentaires. Dans ce dernier cas les matrices ont été étudiées après pré enrichissement en bouillon Fraser Vi comme le recommande le protocole court AFNOR(BIO 12-14). Cette étape permet une revivifie ation des souches bactériennes qui peuvent avoir subit un stress lié au traitement de la matrice.
Etude sur souches pures
Cinquante souches de L. monocytogenes cultivées 24H à 350C ± 20C sur milieu OAA ont été inoculées à raison d'une colonie dans le test biochimique selon l'invention réhydraté par 50μl d'eau stérile. Le test incubé à 350C ±2 était positif en 4H pour 94% des souches qui présentaient une colonie caractéristique sur milieu OAA (colonie bleue avec halo). Après 6 heures toutes les souches de L. monocytogenes étaient détectées positives (verte) sur le test biochimique selon l'invention. Etude sur matrice
La recherche de L. monocytogenes sur 22 matrices alimentaires a été réalisée en suivant le protocole court AFNOR (BIO 12-14) soit : 25g de matrice/stomacher , enrichissement en Fraser 1/2 (24H-30°C) , Après cette phase d'enrichissement 0,1 ml de bouillon Fraser 1/2 sont ensemencés sur milieu OAA. Le milieu est alors incubé 24H à 35+ 20C. Chacun des milieux est vérifié et lorsque qu'une colonie caractéristique présumée L. monocytogenes (bleue avec halo) est observée, celle ci est prélevée pour inoculation du test selon l'invention. Celui ci est préalablement re -hydrater par 50μl de suspension médium (70 700) . Parmi les 22 matrices testées, 11 présentaient une croissance bactérienne sur milieu OAA après 24H. Six présentaient des colonies caractéristiques de l'espèce L. monocytogenes
(bleu avec halo).
Le test selon l'invention a confirmé l'appartenance des 6 souches présumées, à l'espèce
L. monocytogenes en 4H. L'identification à l'espèce L. monocytogenes des 6 souches a été confirmée par d'autres outils d'identification (galerie API Listeria, cartes Vitek GP et par séquençage 16S).
Les 5 autres matrices étaient contaminées par des Listeria spp autres que L. monocytogenes ou d'autres germes. Dans tous ces cas, le test selon l'invention mis en œuvre sur une colonie de chacune de ces matrices a donné une réponse négative.
Exemple 2
Le test selon l'invention a également été validé sur 250 souches pures testées avec la répartition suivante :
• L. monocytogenes 150 souches de sérotypes et d'origines variées. • Listeria sp 50 souches : L. grayi 1, L. innocua 11, L. ivanovii 26 (dont L. ivanovii spp ivanovii 6, LΛvanovii spp londoniensis 7), L. seeligeri 5, L. welshimeri 7.
• Autres genres 50 souches: Bacillus, Lactobacillus, Staphylocoques, Enterocoques. Les souches utilisées sont soit des souches de collections internationales soit des souches isolées de matrices alimentaires ou d'environnement. L'identification de ces souches à été établie par le laboratoire antérieurement à l'étude, et est considérée comme l'identification de référence. Les souches de Listeria ont été identifiées par galerie d'identification API Listeria.
Étude sur Souches pures
Les résultats obtenus sur souches pures sont présentés ci dessous.
A partir des géloses OAA incubées 24H à 370C, 149 souches de Listeria monocytogenes, sur 150 testées, sont confirmées par le test selon l'invention dès 6h. Le prolongement de l'incubation jusqu'à 24h ne modifie pas le résultat.
Les 50 souches de Listeria sp se sont développées sur milieu OAA.
Seules les 26 souches de L. ivanovii ont présenté des colonies caractéristiques sur gélose
OAA. La totalité de ces isolats testés par le test selon l'invention ont donné un résultat négatif en 6h et 24h.
Parmi les 50 souches autres genres testées, 12 se sont développées sur milieu OAA sans présenter de colonies caractéristiques. Le test selon l'invention réalisé sur ces isolats est négatif.
La lecture du test après 4h d'incubation permettait la détection de 148 isolats. Il est donc possible avec le test selon l'invention de rendre un résultat positif (vert) dès 4h. Un résultat négatif peut être rendu dès 6h. Les résultats étaient inchangés après 48h de culture en milieu OAA.
Des résultats comparables étaient obtenus sur milieux de culture autre que OAA (milieux TSA (trypcase soja agar et gélose au sang). Le test selon l'invention permettait la confirmation de la présence de L monocytogenes à 6h.

Claims

REVENDICATIONS
1) Test biochimique pour confirmer la présence de L. monocytogenes caractérisé en ce qu'il comprend au moins un substrat de phosphatidyl inositol phospholipase C (PIPLC) et au moins un substrat d'alpha mannosidase.
2) Test biochimique selon la revendication 1 selon lequel le substrat de PIPLC est un indolyl-phosphatidyl-myo-inositol.
3) Test biochimique selon la revendication 2 selon lequel l'indolyl-phosphatidyl-myo- inositol est le 5 bromo 4 chloro 3 indoxyl myoinositol phosphate.
4) Test biochimique selon la revendication 1 à 3 selon lequel la concentration en substrat de PI-PLC est comprise entre 5 et 0,1 g/1.
5) Test biochimique selon la revendication 1 à 4 selon lequel le substrat d'alpha mannosidase est un substrat de mannopyranosidase.
6) Test biochimique selon la revendication 5 selon lequel le substrat de mannopyranosidase est le p-nitrophenyl-mannopyranoside.
7) Test biochimique selon la revendication 1 à 6 selon lequel la concentration en substrat d' α mannosidase est comprise entre 2 et 0,1 g/1, préférentiellement entre 1 et 0,5 g/1.
8) Utilisation d'un test biochimique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour confirmer la présence de L. monocytogenes..
9) Procédé d'identification de Listeria monocytogenes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) disposer d'un milieu réactionnel pour détecter le genre Listeria, b) ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester, c) laisser incuber d) révéler la présence du genre Listeria e) confirmer la présence de Listeria monocytogenes par un test biochimique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
10) Procédé d'identification de Listeria monocytogenes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) disposer d'un test biochimique ou d'une combinaison de test biochimiques pour détecter le genre Listeria, b) révéler la présence du genre Listeria, c) confirmer la présence de Listeria monocytogenes par un test biochimique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
EP08844892A 2007-10-30 2008-10-29 Test biochimique pour confirmer la presence de l. monocytogenes Withdrawn EP2205976A2 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0758666A FR2922896B1 (fr) 2007-10-30 2007-10-30 Test biochimique pour confirmer la presence de l.monocytogenes
PCT/FR2008/051946 WO2009056762A2 (fr) 2007-10-30 2008-10-29 Test biochimique pour confirmer la presence de l. monocytogenes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP2205976A2 true EP2205976A2 (fr) 2010-07-14

Family

ID=39590766

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP08844892A Withdrawn EP2205976A2 (fr) 2007-10-30 2008-10-29 Test biochimique pour confirmer la presence de l. monocytogenes

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20100240091A1 (fr)
EP (1) EP2205976A2 (fr)
JP (1) JP2011500097A (fr)
CN (1) CN101842706A (fr)
FR (1) FR2922896B1 (fr)
WO (1) WO2009056762A2 (fr)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5911511B2 (ja) 2010-12-30 2016-04-27 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー 標的微生物を検出するための物品及び方法
CN102286608B (zh) * 2011-06-08 2014-06-25 郑州安图生物工程股份有限公司 衣原体诊断方法和试剂盒
WO2018225821A1 (fr) * 2017-06-09 2018-12-13 日水製薬株式会社 Milieu de culture pour détection de listeria

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0496680A1 (fr) * 1991-01-16 1992-07-29 BIO MERIEUX, Société anonyme Procédé et milieu d'identification de bactéries du genre Listeria

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5994066A (en) * 1995-09-11 1999-11-30 Infectio Diagnostic, Inc. Species-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories
FR2766204B1 (fr) * 1997-07-15 1999-09-03 Pasteur Sanofi Diagnostics Milieu de culture permettant la detection des bacteries pathogenes du genre listeria et procede d'identification de ces bacteries
FR2819266B1 (fr) * 2001-01-05 2004-01-16 Alain Rambach Milieu de culture pour la detection et/ou la discrimination des bacteries du genre listeria et procede de mise en oeuvre
CN100395346C (zh) * 2004-08-20 2008-06-18 深圳太太基因工程有限公司 一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌核苷酸片段的引物和探针序列
CN100463972C (zh) * 2006-03-07 2009-02-25 广东省微生物研究所 活体单核细胞增生李斯特氏菌rt-pcr检测试剂盒及检测方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0496680A1 (fr) * 1991-01-16 1992-07-29 BIO MERIEUX, Société anonyme Procédé et milieu d'identification de bactéries du genre Listeria

Also Published As

Publication number Publication date
WO2009056762A2 (fr) 2009-05-07
FR2922896A1 (fr) 2009-05-01
US20100240091A1 (en) 2010-09-23
WO2009056762A3 (fr) 2009-07-02
CN101842706A (zh) 2010-09-22
JP2011500097A (ja) 2011-01-06
FR2922896B1 (fr) 2011-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1546366B1 (fr) Procede de detection et de comptage de microorganismes dans un echantillon
WO2008104681A2 (fr) Milieu de détection et/ou d'identification de bactéries
Leclercq Atypical colonial morphology and low recoveries of Listeria monocytogenes strains on Oxford, PALCAM, Rapid'L. mono and ALOA solid media
EP2344663A2 (fr) Milieu reactionnel pour les bacteries staphylococcus aureus
EP2235202B1 (fr) Procédé de détection et/ou d'identification de clostridium difficile
WO2008104680A2 (fr) Milieu de détection et/ou d'identification de bactéries
EP2205976A2 (fr) Test biochimique pour confirmer la presence de l. monocytogenes
FR2875240A1 (fr) Procede de detection de streptococcus agalactiae en utilisant l'activite alpha-glucosidase
FR2924127A1 (fr) Milieu reactionnel pour la detection et/ou l'identification de staphyloccocus aureus
CA2878112A1 (fr) Procede de detection de bacteries productrices de carbapenemases de type oxa-48
JP5189722B2 (ja) サンプル中の標的微生物検出のための組成物および方法
EP2487235B1 (fr) Milieu de detection de Streptococcus agalatiae en utilisant l'activité esterase
Cox et al. Enhanced haemolysis agar (EHA)—an improved selective and differential medium for isolation ofListeria monocytogenes
EP2981619B1 (fr) Utilisation d'au moins un substrat de phosphatase chromogène et/ou fluorogène pour la détection et/ou le dénombrement d'entérobactéries dans un échantillon
EP2252700B1 (fr) Procede de detection en temps reel de microorganismes dans un milieu de culture liquide par lyse cellulaire
EP2611903B1 (fr) Utilisation d'un activateur de beta-glucosidase pour la détection et/ou l'identification de c.difficile
Omonigho et al. Microbiological quality assessment of garri with reference to thermonuclease activity
EP2670858B1 (fr) Milieu de culture de microorganismes comprenant l'acide para-aminobenzoique comme agent selectif
JP6124912B2 (ja) 病原性エルシニア・エンテロコリチカ細菌を検出するための培地および方法

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20100407

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: AL BA MK RS

RIN1 Information on inventor provided before grant (corrected)

Inventor name: PERROT, NADINE

Inventor name: MONGET, DANIEL

Inventor name: BLANC, BERNADETTE

17Q First examination report despatched

Effective date: 20110118

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20110729