WO2008104680A2 - Milieu de détection et/ou d'identification de bactéries - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/10—Enterobacteria
Definitions
- the field of the invention is that of microbiological biochemical analysis, and in particular the detection and identification of bacteria.
- Pathogenic bacteria including gram-negative bacilli, such as Enterobacteriaceae, are responsible for many diseases, epidemics, etc.
- the species E. coli ⁇ Escherichia coli) is the most represented aerobic species in the digestive tract. . However, their presence in water is a witness of faecal contamination, and some strains are pathogenic and responsible for peritoneal, biliary, appendicular or genital suppuration.
- E. coli Early and specific detection of E. coli makes it possible to propose a suitable solution, in terms of treatment, of decontamination ...
- This detection can be based notably on the use of detection media comprising particular substrates, specific for a metabolic activity, called target metabolic activity, such as that an enzymatic activity of the bacterium that one wishes to detect: by the choice of substrates, depending on whether there is reaction or not, it is possible to characterize the nature of a microorganism.
- the CPS ID 3 medium bioMerieux
- the invention proposes to solve the problems of the state of the art by presenting a new medium particularly suitable for identifying E. coli bacteria in a fast, inexpensive and easy to implement manner.
- an adapted complementary test allows a fast and easy detection of E. coli. More specifically, the inventors in particular, that an indole test carried out on E. coli which does not express the target metabolic activity makes it possible to increase the sensitivity of the test.
- Biological sample means a clinical sample, taken from a sample of biological fluid, or a food sample, derived from any type of food or an environmental sample such as a surface sample, water sample,
- This sample may thus be liquid or solid and may be mentioned in a nonlimiting manner, a clinical sample of blood, plasma, urine, faeces, nose samples, throats, skin, wounds, cerebrospinal fluid, a food sample of water, drinks such as milk, fruit juice; yogurt, meat, eggs, vegetables, mayonnaise, cheese; fish ..., a food sample from a feed intended for animals, such as in particular a sample from animal meal.
- detection medium is meant a medium comprising all the elements necessary for the survival and / or growth of microorganisms.
- This detection medium can either serve only as a detection medium, or a culture and detection medium.
- the culture of the microorganisms is carried out before seeding, and in the second case, the detection medium also constitutes the culture medium.
- the culture medium according to the invention may contain any other additives, for example: peptones or tissue extracts, one or more growth factors, carbohydrates, one or more selective agents, buffers, one or more gelling agents ...
- This culture medium can be in the form of a liquid, a ready-to-use gel, that is to say ready for seeding in a tube, a bottle, or on a petri dish.
- the detection may be carried out in a liquid medium, strip or other solid support
- substrate any molecule capable of generating directly or indirectly a detectable signal due to an enzymatic or metabolic activity of the microorganism.
- the substrate may in particular be a metabolic substrate, such as a source of carbon or nitrogen, coupled to an indicator producing a coloration in the presence of one of the products of the metabolism.
- the substrate can also be an enzymatic substrate, that is to say a substrate that can be hydrolyzed by an enzyme into a product allowing the direct or indirect detection of a microorganism.
- This substrate may in particular comprise a first specific part of the enzymatic activity to be revealed and a second part serving as a marker, hereinafter referred to as a marker part.
- This marker part can be chromogenic, fluorogenic, luminescent, etc.
- chromogenic substrate well suited to solid supports (filter, agar, electrophoresis gel), mention may be made in particular of substrates based on indoxyl and its derivatives, and substrates based on hydroxyquinoline or esculetin and their derivatives, which allow the detection of osidase and esterase activities. Mention may also be made of nitrophenol and nitroaniline substrates and derivatives, making it possible to detect osidase and esterase activities in the case of substrates based on nitrophenol, and peptidase activities in the case of substrates based on nitroaniline.
- substrates based on naphthol and naphthylamine and their derivatives which make it possible to detect the osidase and esterase activities via naphthol, and the peptidase activities via naphthylamine.
- This substrate may in particular, but in a nonlimiting manner, allow the detection of an enzymatic activity such as the activity of an osidase, peptidase, esterase, etc.
- the enzyme substrate may also be a natural substrate, the product of which hydrolysis is detected directly or indirectly.
- Tryptophan for detecting tryptophanase or desaminase activity
- a cyclic amino acid for detecting a desaminase activity
- Phosphatidyl Inositol for detecting phospholipase activity
- the substrate is preferably selected from indoxyl-based substrates (3-Indoxyl, 5-Bromo-3-indoxyl, 5-Iodo-3-indoxyl, 4-Chloro-3-indoxyl, 5-Bromo- 4-chloro-3-indoxyl, 6-bromo-3-indoxyl, 6-fluoro-3-indoxyl, 5-bromo-4-chloro-N-methyl-3-indoxyl, N-methyl-3-indoxyl, .); based on umbelliferone (4-Methylumbelliferone, Cyclohexenoesculetin, ...); Alizarin based; p-Naphtolbenzene; Nitrophenol-based (ortho-Nitrophenol, para-Nitrophenol, ...); at Aminophenol base (para-Aminophenol, Dichloro-aminophenol, ...); Hydroxyquinoline; Cathecol (Cathecol, Dihydroxyflavone, Hydramino
- the substrates used for the detection of a beta-glucuronidase activity may in particular be 4-methylumbelliferyl-beta-glucuronide, 5-Bromo-4-chloro
- the substrates used for the detection of a beta-galactosidase activity may in particular be 4-methylumbelliferyl-beta-galactoside, 5-Bromo-4-chloro
- the substrates used for the detection of a beta-glucosidase activity may especially be 4-methylumbelliferyl-beta-Glucoside, 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-glucoside, 5-Bromo-6-chloro 3-indolyl-beta-glucoside, 6-chloro-3-indolyl-beta-glucoside, Alizarin-beta-glucoside, Cyclohexenosculetin-beta-Glucoside,
- alpha-galactosidase substrate mention may be made of 4-methylumbelliferyl-alpha-galactoside, 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-alpha-galactoside and 5-Bromo-6-chloro-galactoside.
- 3-indolyl-alpha-galactoside 6-chloro-3-indolyl-alpha-galactoside, Alizarin-alpha-galactoside, Nitrophenyl-alpha-galactoside or their salts.
- enzyme A or C expressed by the majority of E. coli, is meant an enzyme which is expressed by more than 80% of E. coli under given conditions.
- Lactose tryptophanase
- enzyme B not expressed by the majority of E. coli, is meant an enzyme which is expressed by less than 20% of E. coli under given conditions.
- beta-glucosidase N-acetyl hexosaminidase
- esterase sulfatase
- beta-cellobiosidase alpha-glucosidase
- deaminase oxidase
- pigment synthesis beta-Alanine aminopeptidase, elastase.
- indole test is meant a test to detect the production of indole by microorganisms.
- the indole produced in a reaction medium is detected using a reagent, such as Kovacs reagent, dimethylamino cinnamaldehyde.
- inducer is meant a compound inducing an increase in the expression of the targeted metabolic activity, any experimental condition being equal, the metabolic activity is greater when the inducer is at an appropriate concentration than when it is absent or at an inappropriate concentration.
- a glucuronide preferably chosen from Glucuronate, methyl-beta-glucuronide.
- beta-galactosidase a beta-galactoside, preferentially chosen from Lactose, Isopropyl-beta-thio-galactoside
- beta-glucosidase a carbohydrate consisting of a carbohydrate bound in the ⁇ position to glucose or carbohydrate with a ⁇ -glucoside subunit, in particular cellobiose, cellulose, starch, cellotriosis, trehalose. Mention may also be made of Methyl- ⁇ -glucoside, Isopropyl- ⁇ -thio-glucoside, Indoxyl- ⁇ -glucoside or Methyl- ⁇ -thio-glucoside.
- alpha-galactosidase an alpha-galactoside, preferentially chosen from Melibiose, methyl-alpha-galactoside.
- the invention relates to a method for detecting and / or identifying Escherichia coli (E. coli) in a biological sample according to which a) the biological sample capable of containing E. coli is inoculated on a medium.
- detection method comprising tryptophan and a substrate of an enzyme A, expressed by the majority of E. coli to obtain colonies of bacteria b) colonies expressing the activity of the enzyme A are detected, and are identified as being E. coli c) colonies not expressing the activity of the enzyme A were detected, an indole test was performed, and colonies with a positive indole test were identified as E. coli.
- the seeding of the microorganisms can be carried out by all the seeding techniques known to those skilled in the art.
- An incubation step can be carried out at a temperature for which the enzymatic activity that one wishes to detect is optimal, that the person skilled in the art can easily choose according to the enzymatic activity to be detected.
- the detection / identification can be carried out by visual examination, colorimetry or fluorimetry.
- the enzyme A is selected from beta glucuronidase, alpha-galactosidase, beta-ribosidase, phosphatase, L-alanine aminopeptidase, L-Leucine aminopeptidase and beta-galactosidase.
- the enzyme A is beta-glucuronidase.
- the substrate of a beta-glucuronidase activity is chosen from 4-methylumbelliferyl-beta-glucuronide, 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-glucuronide and 5-Bromo-6-chloro-3.
- the enzyme A is beta-galactosidase.
- the substrate of a beta-galactosidase activity is chosen from 4-methylumbelliferyl-beta-galactoside, 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- beta-galactoside, 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, 6-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, Alizarin-beta-galactoside, Cyclohexenoesculetin-beta-galactoside or their salts, at a concentration preferably between 10 and 1000 mg / l, preferably between 20 and 500 mg / l.
- the substrate of said enzyme A is at a concentration of between
- the tryptophan concentration is equal to or greater than 0.02 g / l, preferably equal to or greater than 0.4 g / l.
- the detection medium further comprises a substrate of an enzyme B, not expressed by the majority of E. coli.
- the enzyme B is chosen from beta-glucosidase, N-acetyl hexosaminidase, esterase, sulfatase, beta-cellobiosidase, alpha-glucosidase, deaminase, oxidase, pigment synthesis, beta- Alanine aminopeptidase, elastase.
- the enzyme B is beta-glucosidase.
- the substrate of a beta-glucosidase activity is chosen from A-
- Methylumbelliferyl-beta-Glucoside 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-glucoside, 5-
- the substrate of said enzyme B is at a concentration of between
- the detection medium further comprises a substrate of an enzyme C, expressed by the majority of E. al.
- the enzyme C is identical to the enzyme A, in which case the substrate must be different.
- beta-galactosidase may be mentioned as enzyme A and C.
- the medium comprises, for example, as substrate for the enzyme A, 4-Methylumbelliferyl-beta-glucuronide and as substrate for the enzyme C, 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-glucuronide.
- enzyme C is different from the enzyme A, beta-galactosidase, for example, may be mentioned as enzyme A, in combination with, as enzyme C, alpha-galactosidase.
- Beta-galactosidase in combination with, as enzyme C, beta-glucuronidase, may also be mentioned as enzyme.
- the enzyme C is selected from beta-glucuronidase, alpha-galactosidase, beta-ribosidase, phosphatase, L-alanine aminopeptidase, L-Leucine aminopeptidase, beta-galactosidase.
- the enzyme C is beta-glucuronidase.
- the substrate of a beta-glucuronidase activity is chosen from 4-methylumbelliferyl-beta-glucuronide, 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, 5-Bromo-6-chloro-3 -indolyl-beta-glucuronide, 6-chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, Alizarin-beta-glucuronide, Cyclohexenoesculetin-beta-glucuronide or their salts, at concentrations preferably comprised between 10 and 1000 mg / l.
- the enzyme C is alpha-galactosidase.
- the substrate of an alpha-galactosidase activity is chosen from 4-methylumbelliferyl-alpha-galactoside, 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-alpha-galactoside and 5-Bromo-6-chloro-3.
- the substrate of said enzyme C is at a concentration of between 10 and 1000 mg / l, preferably between 20 and 500 mg / l.
- the enzyme A is beta-galactosidase
- enzyme B is beta-glucosidase
- enzyme C is alpha-galactosidase.
- the substrate of the enzyme A is preferably 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, 6-chloro-3 -indolyl-beta-galactoside, Alizarin-beta-galactoside, at a concentration of between 10 and 1000 mg / l
- the substrate of the enzyme B is preferably 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-glucoside, 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-glucoside, 6-Chloro-3 indolyl-beta-glucoside, Alizarin-beta-glucoside, at a concentration of between 10 and 1000 mg / l,
- the substrate of the enzyme C is preferably 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-alpha-galactoside, 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-alpha-galactoside, 6-chloro-3- indolyl-alpha-galactoside, Alizarin-alpha-galactoside at a concentration of between 10 and 1000 mg / l,
- the enzyme A is beta-galactosidase
- enzyme B is beta-glucosidase
- enzyme C is beta-glucuronidase
- the substrate of the enzyme A is preferably 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, 6-chloro-3 -indolyl-beta-galactoside, Alizarin-beta-galactoside, at a concentration of between 10 and 1000 mg / l,
- the substrate of the enzyme B is preferably 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-glucoside, 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-glucoside, 6-Chloro-3 indolyl-beta-glucoside, Alizarin-beta-glucoside, at a concentration of between 10 and 1000 mg / l,
- the substrate of the enzyme C is preferably 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, 6-chloro-3 -indolyl-beta-glucuronide, Alizarin-beta-glucuronide, at a concentration of between 10 and 1000 mg / l
- the detection medium further comprises an inducer of the enzyme A, an inducer of the enzyme B and / or an inducer of the enzyme C.
- the inducer of the enzyme A, B or C is at a concentration of between 100 ng / l and 10 g / l, preferably between 10 mg / l and 3 g / l.
- the inducer of said enzyme A or C is preferably a glucuronide, preferably chosen from Glucuronate,
- Methyl beta- glucuronide Methyl beta- glucuronide
- the inducer of said enzyme A or C is preferably a beta-galactoside, preferably selected from Lactose, Isopropyl-beta-thio-galactoside.
- the inducer of the enzyme B is preferably a beta-glucoside, preferentially chosen from methyl-beta-glucose, cellobiose, cellotriose, trehalose, cellulose, starch.
- the inducer of the enzyme B is Cellobiose, at a concentration preferably between 10 mg / l to 10 g / l
- the inducer of the enzyme C is preferably Melibiose, methyl-alpha-galactoside.
- the invention also relates to a detection medium comprising tryptophan, a substrate of a beta-galactosidase enzyme, a substrate of a beta-glucosidase enzyme, and cellobiose.
- the concentration of tryptophan is equal to or greater than 0.02 g / l, preferably equal to or greater than 0.4 g / l.
- the substrate of a beta-glucosidase activity is chosen from 4-methylumbelliferyl-beta-glucoside, 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-glucoside, and 5-bromo-6-chloro-3.
- the substrate of a beta-galactosidase activity is chosen from 4-methylumbelliferyl-beta-galactoside, 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, and 5-Bromo-6-chloro-3 -indolyl-beta-galactoside, 6-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, Alizarin-beta-galactoside, Cyclohexenoesculetin-beta-galactoside or their salts, a concentration preferably between 10 and 1000 mg / l, preferably between 20 and 500 mg / l.
- the cellobiose is at a concentration of between 10 mg / l and 10 g / l.
- the detection medium further comprises a substrate of an alpha-galactosidase enzyme.
- alpha-galactosidase substrates examples include 4-methylumbelliferyl-alpha-galactoside, 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-alpha-galactoside and 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl.
- the invention also relates to the use of a medium as defined above for detecting E. coli.
- Example 1 Contribution of the Indole test to colorless colonies for the detection of Escherichia coli
- Trypcase Soya Agar (bioMérieux) are added Tryptophan at 0,9g / l, 6-Chloro-3-indolyl- ⁇ -glucuronide at 0.15g / l of 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl- ⁇ -galactoside at 0.05 g / l and 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -glucoside at 0.1 g / l.
- This medium is or is not added with Cellobiose at 0.5 g / l. These two media are distributed at a rate of 20 ml per petri dish.
- Microorganisms frequently isolated from urinary samples and from the plaintiff's collection are inoculated on these media by semi-quantitative isolation of 10 ⁇ l of a 0.5 McFarland suspension diluted to 20 e .
- the dishes are incubated at 37 ° C. for 24 hours, then the colonies formed are examined visually. The coloration of these colonies is noted.
- An Indole test is performed on colorless colonies using James's reagent (bioMérieux). The results are shown in Table 2 below:
- Table 2 Contribution of the Indole test to a medium combining 6-chloro-3-indolyl- ⁇ -glucuronide, 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl- ⁇ -galactoside and 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl - ⁇ -glucoside supplemented or not with Cellobiose on the identification of E. coli
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Abstract
L'invention concerne un procédé de détection et/ou d'identification d'Escherichia coli (E. coli) dans un échantillon biologique selon lequel a) on ensemence l'échantillon biologique susceptible de contenir E. coli sur un milieu de détection comprenant du tryptophane et un substrat d'une enzyme A, exprimée par la majorité des E. coli pour obtenir des colonies de bactéries; b) on détecte les colonies exprimant l'activité de l'enzyme A, et on les identifie comme étant E. coli ; c) on détecte les colonies n'exprimant pas l'activité de l'enzyme A, on réalise un test indole, et on identifie les colonies ayant un test indole positif comme étant E. coli.
Description
Milieu de détection et/ou d'identification de bactéries
Le domaine de l'invention est celui de l'analyse microbiologique par voie biochimique, et en particulier de la détection et de l'identification de bactéries.
Les bactéries pathogènes, et notamment les bacilles à gram négatif, tels que les entérobactéries sont responsables chaque année de nombreuses maladies, épidémies... L'espèce E. coli {Escherichia colï) est l'espèce aérobie la plus représentée dans le tube digestif. Toutefois, leur présence dans l'eau est un témoin de contamination fécale, et certaines souches sont pathogènes et responsables de suppurations péritonéales, biliaires, appendiculaires ou génitales.
Une détection précoce et spécifique d'E. coli permet de proposer une solution adaptée, en terme de traitement, de décontamination... Cette détection peut être basée notamment sur l'utilisation de milieux de détection comprenant des substrats particuliers, spécifiques d'une activité métabolique, dite activité métabolique cible, telle qu'une activité enzymatique, de la bactérie que l'on souhaite détecter : par le choix des substrats, selon qu'il y a réaction ou non, il est possible de caractériser la nature d'un microorganisme. Le milieu CPS ID 3 (bioMerieux) utilise un substrat de β-glucuronidase associé à un substrat de β-glucosidase et éventuellement à la détection de la tryptophanase pour la détection des souches de l'espèce Escherichia coli. Toutefois, si ce milieu présente une excellente spécificité, l'utilisation d'un substrat de β-glucuronidase pour la détection des E. coli présentent une sensibilité imparfaite du fait de l'existence d'une faible proportion de souches d'E. coli (5-10%) n'exprimant pas cette activité. De plus, certaines souches de Citrobacter peuvent également produire des colonies β-glucuronidase positives, de la même couleur que celles d'E. coli
L'invention se propose de résoudre les problèmes de l'état de la technique en présentant un nouveau milieu particulièrement adapté pour identifier les bactéries E. coli d'une manière rapide, peu coûteuse et aisée à mettre en œuvre.
D'une manière surprenante, les inventeurs ont montré qu'un test complémentaire adapté permettait une détection rapide et aisée d'E. coli. Plus précisément, les inventeurs ont
notamment montré qu'un test indole réalisé sur les E. coli n'exprimant pas l'activité métabolique cible permettait d'augmenter la sensibilité du test.
Avant d'aller plus avant dans l'exposé de l'invention, les définitions suivantes sont données afin de faciliter la compréhension de l'invention.
Par échantillon biologique, on entend un échantillon clinique, issu d'un prélèvement de liquide biologique, ou un échantillon alimentaire, issu de tout type d'aliment ou un échantillon d'environnement tel qu'un prélèvement de surface, d'eau, d'air, .... Cet échantillon peut être ainsi liquide ou solide et on peut citer d'une manière non limitative, un échantillon clinique de sang, de plasma, d'urines, de fécès, de prélèvements de nez, de gorges, de peaux, de plaies, de liquide céphalo-rachidien, un échantillon alimentaire d'eau, de boissons tels que le lait, un jus de fruits; de yaourt, de viande, d'œufs, de légumes, de mayonnaise, de fromage ; de poisson..., un échantillon alimentaire issu d'une alimentation destinée aux animaux, tel que notamment un échantillon issu de farines animales.
Par milieu de détection, on entend un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à la survie et/ou à la croissance de microorganismes. Ce milieu de détection peut soit servir uniquement de milieu de détection, soit de milieu de culture et de détection. Dans le premier cas, la culture des microorganismes est effectuée avant ensemencement et, dans le deuxième cas, le milieu de détection constitue également le milieu de culture. Le milieu de culture selon l'invention peut contenir d'éventuels autres additifs comme par exemple : des peptones ou extraits de tissus, un ou plusieurs facteurs de croissance, des hydrates de carbone, un ou plusieurs agents sélectifs, des tampons, un ou plusieurs gélifiants... Ce milieu de culture peut se présenter sous forme de liquide, de gel prêt à l'emploi, c'est à dire prêt à l'ensemencement en tube, flacon, ou sur boite de Pétri. Au sens de la présente invention, la détection peut être réalisée en milieu liquide, bandelette ou autre support solide
Par substrat, on entend toute molécule susceptible d'engendrer directement ou indirectement un signal détectable dû à une activité enzymatique ou métabolique du microorganisme.
Le substrat peut être notamment un substrat métabolique, telle qu'une source de carbone ou d'azote, couplée à un indicateur produisant une coloration en présence de l'un des produits du métabolisme.
Le substrat peut être également un substrat enzymatique, c'est à dire un substrat pouvant être hydrolyse par une enzyme en un produit permettant la détection, directe ou indirecte d'un microorganisme. Ce substrat peut notamment comprendre une première partie spécifique de l'activité enzymatique à révéler et une seconde partie faisant office de marqueur, ci-après appelée partie marqueur. Cette partie marqueur peut être chromogène, fluorogène, luminescente... Comme substrat chromogène, bien adapté aux supports solides (filtre, gélose, gel d'électrophorèse), on peut citer notamment les substrats à base d'indoxyl et ses dérivés, et les substrats à base d'hydroxyquinoline ou d'esculétine et leurs dérivés, qui permettent la détection d'activités osidase et estérase. On peut citer également les substrats à base de nitrophénol et nitroaniline et dérivés, permettant de détecter les activités osidases et estérases dans le cas de substrats à base de nitrophénol, et des activités peptidases dans le cas de substrats à base de la nitroaniline. On peut citer enfin les substrats à base de naphtol et naphtylamine et leurs dérivés, qui permettent de détecter les activités osidases et estérases par l'intermédiaire du naphtol, et les activités peptidases par l'intermédiaire de la naphtylamine. Ce substrat peut permettre notamment, mais d'une façon non limitative, la détection d'une activité enzymatique telle que l'activité d'une osidase, peptidase, estérase... Le substrat enzymatique peut également être un substrat naturel dont le produit d'hydrolyse est détecté directement ou indirectement. Comme substrat naturel, on peut notamment citer le Tryptophane pour détecter une activité tryptophanase ou desaminase, un acide aminé cyclique (Tryptophane, Phénylalanine, Histidine, Tyrosine) pour détecter une activité desaminase, le Phosphatidyl Inositol pour détecter une activité phospholipase, ... Selon la présente invention, le substrat est préférentiellement choisi parmi les substrats à base d'indoxyl (3-Indoxyl, 5-Bromo-3-indoxyl, 5-Iodo-3-indoxyl, 4-Chloro-3-indoxyl, 5- Bromo-4-chloro-3-indoxyl, 6-Bromo-3-indoxyl, 6-Fluoro-3-indoxyl, 5-Bromo-4-chloro- N-méthyl-3-indoxyl, N-Méthyl-3-indoxyl, ...) ; à base d'umbelliférone (4- Méthylumbelliférone, Cyclohexenoesculétine, ...) ; à base d'Alizarine ; à base de p- Naphtolbenzéine ; à base de Nitrophénol (ortho-Nitrophénol, para-Nitrophénol, ...) ; à
base d'Aminophénol (para-Aminophénol, Dichloro-aminophénol, ...) ; d'Hydroxyquinoline ; de Cathécol (Cathécol, Dihydroxyflavone, Hydroxyflavone, ...) ; de Résorufine ; de Chlorophénol Red ; de Fluorescéine ; de Naphtol (alpha-Naphtol, 2-
Naphtol, Naphtol-ASBI, ...) ; d'Aminocoumarine (7-Amino-4-méthyl-coumarine, ...) ; de Naphtylamide ; d'Acridine (Amino-phényl-acridine...) ; d'Amino-phénoxazine
(Amino-benzophénoxazinone, Amino-pentyl-resorufine...).
A titre indicatif, les substrats utilisés pour la détection d'une activité beta-glucuronidase peuvent notamment être le 4-Méthylumbelliféryl-beta-glucuronide, le 5-Bromo-4-chloro-
3-indolyl-beta-glucuronide, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, le
6-Chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, l'Alizarine-beta-glucuronide, le
Cyclohexenoesculetine-beta-glucuronide ou leurs sels.
Les substrats utilisés pour la détection d'une activité beta-galactosidase peuvent notamment être le 4-Méthylumbelliféryl-beta-galactoside, le 5-Bromo-4-chloro-
3-indolyl-beta-galactoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, le 6-Chloro-
3-indolyl-beta-galactoside, l'Alizarine-beta-galactoside, le Cyclohexenoesculetine- beta-galactoside ou leurs sels.
Les substrats utilisés pour la détection d'une activité beta-glucosidase peuvent notamment être le 4-Méthylumbelliféryl-beta-Glucoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- beta-Glucoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-Glucoside, le 6-Chloro-3-indolyl- beta-Glucoside, l'Alizarine-beta-Glucoside, le Cyclohexenoesculetine-beta-Glucoside, le
Nitrophényl-beta-glucoside, le Dichloroaminophényl-glucoside ou leurs sels.
Comme substrat d'alpha-galactosidase, on peut citer le 4-Méthylumbelliféryl-alpha- galactoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-alpha-galactoside, le 5-Bromo-6-chloro-
3-indolyl-alpha-galactoside, le 6-Chloro-3-indolyl-alpha-galactoside, l'Alizarine- alpha-galactoside, le Nitrophényl-alpha-galactoside ou leur sels.
Par enzyme A ou C, exprimée par la majorité des E. coli, on entend une enzyme qui est exprimée par plus de 80% des E. coli dans des conditions données.
L'homme de l'art connaît un grand nombre d'activités exprimées par la majorité des souches d'E. coli. Certaines sont notamment décrites dans le Manual of Clinical
Microbiology 7e édition (P. R. Murray et al. 1999), ainsi que dans les bases de données des produits d'identification de bioMérieux (api 2OE, ID 32E, rapid ID 32, ...)
A titre d'enzyme exprimée par la majorité des E. coli, on peut citer notamment la beta-glucuronidase, alpha-galactosidase, beta-ribosidase, phosphatase, L-Alanine- aminopeptidase, L-Leucine-aminopeptidase, beta galactosidase, l'acidification du
Lactose, la tryptophanase.
Par enzyme B, non exprimée par la majorité des E. coli, on entend une enzyme qui est exprimée par moins de 20% des E. coli dans des conditions données.
Ces activités sont aussi connues de l'homme du métier et pour certaines décrites dans les documents cités ci-dessus. On peut citer notamment beta-glucosidase, N-Acétyl hexosaminidase, estérase, sulfatase, beta-cellobiosidase, alpha-glucosidase, désaminase, oxydase, synthèse de pigment, beta-Alanine-aminopeptidase, élastase.
Par test indole, on entend un test permettant de détecter la production d'indole par des microorganismes. En général, l'indole produit dans un milieu réactionnel est détecté à l'aide d'un réactif, tel que le réactif de Kovacs, le Diméthyl-amino-cinnamaldéhyde
(DMACA) ou le réactif de James. En présence d'indole, une coloration rouge est obtenue avec les réactif de Kovacs et de James et une coloration bleue est obtenue avec le
DMACA.
Par inducteur, on entend un composé induisant une augmentation de l'expression de l'activité métabolique ciblée, toute condition expérimentale étant égale par ailleurs, l'activité métabolique est plus forte lorsque l'inducteur est à une concentration appropriée que lorsqu'il est absent ou à une concentration inadaptée.
On peut citer notamment :
• pour la beta-glucuronidase, un glucuronide, préférentiellement choisi parmi le Glucuronate, le Méthyl-beta- glucuronide.
• pour la beta-galactosidase, un beta-galactoside, préférentiellement choisi parmi le Lactose, l'Isopropyl-beta-thio-galactoside
• pour la beta-glucosidase, un hydrate de carbone constitué d'un hydrate de carbone lié en position β au glucose ou hydrate de carbone avec une sous-unité β-glucoside, en particulier le cellobiose, la cellulose, l'amidon, le cellotriose, le trehalose. On peut citer également le Méthyl-β-glucoside, l'Isopropyl-β-thio- glucoside, l'Indoxyl-β-glucoside ou le Méthyl-β-thio-glucoside
• pour l'alpha galactosidase, , un alpha-galactoside, préférentiellement choisi parmi le Mélibiose, le Méthyl-alpha-galactoside.
A ce titre, l'invention concerne un procédé de détection et/ou d'identification d'Escherichia coli (E. coli) dans un échantillon biologique selon lequel a) on ensemence l'échantillon biologique susceptible de contenir E. coli sur un milieu de détection comprenant du tryptophane et un substrat d'une enzyme A, exprimée par la majorité des E. coli pour obtenir des colonies de bactéries b) on détecte les colonies exprimant l'activité de l'enzyme A, et on les identifie comme étant E. coli c) on détecte les colonies n'exprimant pas l'activité de l'enzyme A, on réalise un test indole, et on identifie les colonies ayant un test indole positif comme étant E. coli.
L'ensemencement des microorganismes peut être réalisé par toutes les techniques d'ensemencement connues de l'homme du métier. Une étape d'incubation peut être réalisée à une température pour laquelle l'activité enzymatique que l'on souhaite détecter est optimale, que l'homme du métier peut choisir aisément selon l'activité enzymatique à détecter. La détection/identification peut s'effectuer par un examen visuel, par colorimétrie ou fluorimétrie.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'enzyme A est choisi parmi la beta glucuronidase, alpha-galactosidase, beta-ribosidase, phosphatase, L-Alanine- aminopeptidase, L-Leucine-aminopeptidase, beta galactosidase.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'enzyme A est la beta-glucuronidase. Préférentiellement, le substrat d'une activité beta-glucuronidase est choisi parmi le 4-Méthylumbelliféryl-beta-glucuronide, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- beta-glucuronide, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, le 6-Chloro- 3-indolyl-beta-glucuronide, l'Alizarine-beta-glucuronide, le Cyclohexenoesculetine- beta-glucuronide ou leurs sels, à des concentrations comprises préférentiellement entre 20 et 1000mg/l.
Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, l'enzyme A est la beta-galactosidase. Préférentiellement, le substrat d'une activité beta-galactosidase est choisi parmi le 4-Méthylumbelliféryl-beta-galactoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-
beta-galactoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, le 6-Chloro-3-indolyl- beta-galactoside, l'Alizarine-beta-galactoside, le Cyclohexenoesculetine-beta-galactoside ou leurs sels, à une concentration comprise préférentiellement entre 10 et 1000mg/l, préférentiellement entre 20 et 500 mg/1.
Préférentiellement, le substrat de ladite enzyme A est à une concentration comprise entre
10 et 1000mg/l, préférentiellement entre 20 et 500 mg/1.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la concentration en tryptophane est égale ou supérieure à 0,02 g/1, préférentiellement égale ou supérieure à 0,4 g/1.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le milieu de détection comprend en outre, un substrat d'une enzyme B, non exprimé par la majorité des E. coll.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'enzyme B est choisi parmi la beta- glucosidase, N-Acétyl hexosaminidase, estérase, sulfatase, beta-cellobiosidase, alpha- glucosidase, désaminase, oxydase, synthèse de pigment, beta-Alanine-aminopeptidase, élastase.
Préférentiellement, l'enzyme B est la beta-glucosidase.
Préférentiellement, le substrat d'une activité beta-glucosidase est choisi parmi le A-
Méthylumbelliféryl-beta-Glucoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-Glucoside, le 5-
Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-Glucoside, le 6-Chloro-3-indolyl-beta-Glucoside, l'Alizarine-beta-Glucoside, le Cyclohexenoesculetine-beta-Glucoside, le Nitrophényl- beta-glucoside, le Dichloroaminophényl-glucoside ou leurs sels, à une concentration comprise préférentiellement entre 10 et 1000mg/l, préférentiellement entre 20 et 500 mg/1.
Préférentiellement, le substrat de ladite enzyme B est à une concentration comprise entre
10 et 1000mg/l, préférentiellement entre 20 et 500 mg/1.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le milieu de détection comprend en outre, un substrat d'une enzyme C, exprimé par la majorité d'E. coll.
Deux modes de réalisation sont alors possibles :
• soit l'enzyme C est identique à l'enzyme A, dans ce cas, le substrat doit être différent. On peut citer par exemple comme enzyme A et C, la beta-galactosidase, dans ce cas, le milieu comprend par exemple comme substrat de l'enzyme A, le
4-Méthylumbelliféryl-beta-glucuronide et comme substrat de l'enzyme C, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-glucuronide.
• soit l'enzyme C est différente de l'enzyme A, on peut citer par exemple comme enzyme A la beta-galactosidase, en combinaison avec, comme enzyme C, alpha- galactosidase. On peut citer également comme enzyme A la beta-galactosidase, en combinaison avec, comme enzyme C, la beta-glucuronidase.
Préférentiellement, l'enzyme C est choisi parmi beta-glucuronidase, alpha-galactosidase, beta-ribosidase, phosphatase, L-Alanine-aminopeptidase, L-Leucine-aminopeptidase, beta-galactosidase.
Préférentiellement, l'enzyme C est la beta-glucuronidase. Préférentiellement, le substrat d'une activité beta-glucuronidase est choisi parmi le 4-Méthylumbelliféryl- beta-glucuronide, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, le 5-Bromo-6-chloro- 3-indolyl-beta-glucuronide, le 6-Chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, l'Alizarine- beta-glucuronide, le Cyclohexenoesculetine-beta-glucuronide ou leurs sels, à des concentrations comprises préférentiellement entre 10 et 1000mg/l.
Préférentiellement, l'enzyme C est l' alpha-galactosidase. Préférentiellement, le substrat d'une activité alpha-galactosidase est choisi parmi le 4-Méthylumbelliféryl-alpha- galactoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-alpha-galactoside, le 5-Bromo-6-chloro- 3-indolyl-alpha-galactoside, le 6-Chloro-3-indolyl-alpha-galactoside, l'Alizarine- alpha-galactoside, le Nitrophényl-alpha-galactoside à des concentrations comprises entre 10 et 1000mg/l/, préférentiellement entre 20 et 500 mg/1.
Préférentiellement, le substrat de ladite enzyme C est à une concentration comprise entre 10 et 1000mg/l, préférentiellement entre 20 et 500 mg/1.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'enzyme A est la beta- galactosidase ; l'enzyme B est la beta-glucosidase, et l'enzyme C est l'alpha- galactosidase. Dans ce mode particulier de réalisation de l'invention,
• le substrat de l'enzyme A est préférentiellement le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- beta-galactoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, le 6-Chloro- 3-indolyl-beta-galactoside, l'Alizarine-beta-galactoside, à une concentration comprise entre 10 et 1000mg/l,
• le substrat de l'enzyme B est préférentiellement le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- beta-glucoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-glucoside, le 6-Chloro-3- indolyl-beta-glucoside, l'Alizarine-beta-glucoside, à une concentration comprise entre 10 et 1000mg/l,
• le substrat de l'enzyme C est préférentiellement 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- alpha-galactoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-alpha-galactoside, le 6-Chloro- 3-indolyl-alpha-galactoside, l'Alizarine-alpha-galactoside à une concentration comprise entre 10 et 1000mg/l,
Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, l'enzyme A est la beta- galactosidase ; l'enzyme B est la beta-glucosidase, et l'enzyme C est la beta- glucuronidase. Dans ce mode particulier de réalisation de l'invention,
• le substrat de l'enzyme A est préférentiellement le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- beta-galactoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, le 6-Chloro- 3-indolyl-beta-galactoside, l'Alizarine-beta-galactoside, à une concentration comprise entre 10 et 1000mg/l,
• le substrat de l'enzyme B est préférentiellement le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- beta-glucoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-glucoside, le 6-Chloro-3- indolyl-beta-glucoside, l'Alizarine-beta-glucoside, à une concentration comprise entre 10 et 1000mg/l,
• le substrat de l'enzyme C est préférentiellement le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- beta-glucuronide, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, le 6-Chloro- 3-indolyl-beta-glucuronide, l'Alizarine-beta-glucuronide, à une concentration comprise entre 10 et 1000mg/l
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le milieu de détection comprend en outre, un inducteur de l'enzyme A, un inducteur de l'enzyme B et/ou un inducteur de l'enzyme C.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'inducteur de l'enzyme A, B ou C est a une concentration comprise entre 100ng/l à 10g/l, préférentiellement comprise entre 10mg/l et 3g/l.
Lorsque l'enzyme A ou C est la beta-glucuronidase, l'inducteur de ladite enzyme A ou C est préférentiellement un glucuronide, préférentiellement choisi parmi le Glucuronate, le
Méthyl-beta- glucuronide .
Lorsque l'enzyme A ou C est la beta-galactosidase, l'inducteur de ladite enzyme A ou C est préférentiellement un beta-galactoside, préférentiellement choisi parmi le Lactose, l'Isopropyl-beta-thio-galactoside.
Lorsque l'enzyme B est la beta-glucosidase, l'inducteur de l'enzyme B est préférentiellement un beta-glucoside, préférentiellement choisi parmi la Méthyl- beta-glucose, le Cellobiose, cellotriose, trehalose, cellulose, amidon. Préférentiellement, l'inducteur de l'enzyme B est le Cellobiose, à une concentration préférentiellement comprise entre 10mg/l à 10g/l
Lorsque l'enzyme C est l'alpha-galactosidase, l'inducteur de l'enzyme C est préférentiellement le Mélibiose, le Méthyl-alpha-galactoside.
L'invention concerne également un milieu de détection comprenant du tryptophane, un substrat d'une enzyme beta-galactosidase, un substrat d'une enzyme beta-glucosidase, et du cellobiose.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la concentration en tryptophane est égale ou supérieure à 0,02g/l, préférentiellement égale ou supérieure à 0,4g/l. Préférentiellement, le substrat d'une activité beta-glucosidase est choisi parmi le 4- Méthylumbelliféryl-beta-Glucoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-Glucoside, le 5- Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-Glucoside, le 6-Chloro-3-indolyl-beta-Glucoside, l'Alizarine-beta-Glucoside, le Cyclohexenoesculetine-beta-Glucoside, le Nitrophényl- beta-glucoside, le Dichloroaminophényl-glucoside ou leurs sels, à une concentration comprise préférentiellement entre 10 et 1000mg/l, préférentiellement entre 20 et 500 mg/1.
Préférentiellement, le substrat d'une activité beta-galactosidase est choisi parmi le 4-Méthylumbelliféryl-beta-galactoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, le 6-Chloro-3-indolyl-beta-galactoside, l'Alizarine-beta-galactoside, le Cyclohexenoesculetine-beta-galactoside ou leurs sels, à
une concentration comprise préférentiellement entre 10 et 1000mg/l, préférentiellement entre 20 et 500 mg/1.
Préférentiellement, le cellobiose est à une concentration comprise entre 10mg/l à 10g/l.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention,, le milieu de détection comprend en outre un substrat d'une enzyme alpha-galactosidase.
Comme substrat d' alpha-galactosidase, on peut citer notamment le 4-Méthylumbelliféryl- alpha-galactoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-alpha-galactoside, le 5-Bromo- 6-chloro-3-indolyl-alpha-galactoside, le 6-Chloro-3-indolyl-alpha-galactoside, l'Alizarine-alpha-galactoside, le Nitrophényl-alpha-galactoside à des concentrations comprises entre 20 et 1000mg/l/.
L'invention concerne également l'utilisation d'un milieu tel que défini ci dessus pour détecter E. coli.
Les exemples ci dessous sont donnés à titre explicatif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention.
Exemple 1 : Apport du test Indole sur les colonies incolores pour la détection d'Escherichia coli
Trois mille (3 000) prélèvements urinaires ont été ensemencés sur le milieu CPS ID 3 commercialisé (bioMérieux). Les milieux ont été incubés et analysés conformément aux recommandations du fournisseur : pour la détection et l'identification des souches d' Esche richia coli, les colonies rosés à rouges ont été pré-identifiées comme appartenant à l'espèce E. coli. Un test Indole a été pratiqué pour confirmer cette identification. Parallèlement, les milieux ont été utilisés et analysés conformément à la présente invention : les colonies rosés à rouges ont été identifiées comme appartenant à l'espèce E. coli ; un test Indole a été effectué sur les colonies incolores, si la réaction était positive la souche était identifiée comme E. coli. L'ensemble des identifications a été confirmé par des tests biochimiques adaptés couramment utilisés par les laboratoires d'analyses médicales.
Tableau 1 : Apport du test Indole sur colonies incolores pour l'identification des souches d'E. coli sur le milieu CPS ID 3
Du tableau 1, il ressort très nettement que lorsque le test Indole est pratiqué uniquement sur les colonies rosés à rouges sur le milieu CPS ID 3, comme proposé par le fournisseur, cela conduit à une diminution de la sensibilité d'identification des souches d'E. coli. Au contraire, si ce test est pratiqué sur les colonies incolores, cela permet d'obtenir une très haute sensibilité d'identification.
Exemple 2 : Apport du test Indole sur un milieu associant Cellobiose, 6-Chloro- 3-indolyl-β-glucuronide, 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-galactoside et 5-Bromo-4-chloro- 3-indolyl-β-glucoside
Au milieu Trypcase Soja Agar (bioMérieux) sont ajoutés du Tryptophane à 0,9g/l, du 6-Chloro-3-indolyl-β-glucuronide à 0,15g/l du 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl- β-galactoside à 0,05g/l et du 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glucoside à 0,1 g/1. Ce milieu est additionné ou non de Cellobiose à 0,5g/l. Ces deux milieux sont répartis à raison de 20ml par boîte de Pétri. Des micro-organismes fréquemment isolés de prélèvements urinaires et issus de la collection de la demanderesse sont ensemencés sur ces milieux par isolement semi-quantitatif de lOμl d'une suspension à 0,5 McFarland diluée au 20e. Les boîtes sont incubées à 370C pendant 24 heures, puis les colonies formées sont examinées visuellement. La coloration de ces colonies est notée. Un test Indole est pratiqué sur les colonies incolores à l'aide du réactif de James (bioMérieux). Les résultats sont présentés dans le tableau 2 ci-après :
Tableau 2 : Apport du test Indole sur un milieu associant 6-Chloro-3-indolyl- β-glucuronide, 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-galactoside et 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- β-glucoside additionné ou non de Cellobiose sur l'identification des E. coli
Dans le tableau 2 ci-dessus, il ressort que dans un milieu combinant Tryptophane, 6-Chloro-3-indolyl-β-glucuronide, 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-galactoside et 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glucoside, le Cellobiose permet de mieux différencier la souche de Citrobacter 009 des souches d'E. coli. Par ailleurs, en présence de Tryptophane, la recherche de la production d' Indole par les colonies incolores permet d'accroître encore la sensibilité pour la détection d'E. coli sans être pénalisé par une dégradation de la spécificité.
Exemple 3 : Impact de la concentration en Tryptophane sur la détection des colonies incolores d'E. coli
Différentes concentrations de Tryptophane (0-0,3-0,6-0,9g/l) ainsi que du Cellobiose à 100mg/l sont ajoutés au milieu CPS ID 3 (bioMérieux). Ces milieux comprennent du 6-Chloro-3-indolyl-beta-glucuronide à 250mg/l et du 5-Bromo-4-chloro- 3-indolyl-beta-glucoside à 50mg/l. Ces milieux sont répartis à raison de 20ml par boîte de Pétri. Des micro-organismes issus de la collection de la demanderesse ont été ensemencés sur ces milieux par isolement semi-quantitatif de lOμl d'une suspension à 0,5 McFarland diluée au 20e. Les boîtes ont été incubées à 370C pendant 24 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 heures d'incubation. La coloration de ces
colonies est notée. Un test Indole est pratiqué sur les colonies incolores à l'aide du réactif de James (bioMérieux). Les résultats sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous :
Tableau 3 : Impact de la concentration en Tryptophane sur la détection des colonies incolores d'E. coli
Dans le tableau 3 ci-dessus, il ressort que même avec une concentration en Tryptophane de 0,3g/l, il est possible de détecter la production d'Indole par les souches d'E. coli, néanmoins la réaction est plus marquée à des concentrations supérieures.
Exemple 4 : Apport du test Indole sur un milieu associant Cellobiose, 5-Bromo-6-chloro- 3-indolyl-alpha-galactoside, 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-galactoside et 5-Bromo- 4-chloro-3-indolyl-β-glucoside
Au milieu CPS ID 3 (bioMérieux) duquel ont été enlevés les substrats enzymatiques synthétiques, sont ajoutés du 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl- alpha-galactoside à 75mg/l, du 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-galactoside à 50mg/l, du 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glucoside à 50mg/l et de l'Isopropyl-thio-β-galactoside à 10mg/l. Ce milieu est réparti à raison de 20ml par boîte de Pétri. Des micro-organismes issus de la collection de la demanderesse ont été ensemencés sur ce milieu par isolement semi-quantitatif de lOμl d'une suspension à 0,5 McFarland diluée au 20e. Les boîtes ont été incubées à 370C pendant 24 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 heures d'incubation La coloration de ces colonies est notée. Un test Indole est pratiqué sur les colonies incolores à l'aide du réactif de James (bioMérieux). Les résultats sont présentés dans le tableau 4 ci-dessous :
Tableau 4 : Impact de la concentration en Tryptophane sur la détection des colonies incolores à'E. coli
Dans le tableau 4 ci-dessus, il ressort que dans un milieu associant 5-Bromo-6-chloro- 3-indolyl-alpha-galactoside, 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-galactoside et 5-Bromo- 4-chloro-3-indolyl-β-glucoside la production d'Indole par les colonies incolores permet d'accroître la sensibilité pour la détection à'E. coli.
Claims
REVENDICATIONS
1) Procédé de détection et/ou d'identification d'Escherichia coli (E. coli) dans un échantillon biologique selon lequel a) on ensemence l'échantillon biologique susceptible de contenir E. coli sur un milieu de détection comprenant du tryptophane et un substrat d'une enzyme A, exprimée par la majorité des E. coli pour obtenir des colonies de bactéries b) on détecte les colonies exprimant l'activité de l'enzyme A, et on les identifie comme étant E. coli c) on détecte les colonies n'exprimant pas l'activité de l'enzyme A, on réalise un test indole, et on identifie les colonies ayant un test indole positif comme étant E. coli.
2) Procédé selon la revendication 1 selon lequel la concentration en tryptophane est égale ou supérieure à 0,02g/l, préférentiellement égale ou supérieure à 0,4 g/1.
3) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 2 selon lequel le milieu de détection comprend en outre, un substrat d'une enzyme B, non exprimé par la majorité des E. coli
4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 selon lequel le milieu de détection comprend en outre, un substrat d'une enzyme C, exprimé par la majorité des E. coli
5) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 selon lequel l'enzyme A est choisie parmi la beta-glucuronidase, alpha-galactosidase, beta-ribosidase, phosphatase, L- Alanine-aminopeptidase, L-Leucine-aminopeptidase, beta-galactosidase.
6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 selon lequel l'enzyme A est la beta-glucuronidase ou la beta-galactosidase.
7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6 selon lequel l'enzyme B est choisi parmi la beta-glucosidase, N-Acétyl hexosaminidase, estérase, sulfatase, beta- xylosidase, phospholipase, alpha-mannosidase, beta-mannosidase, beta-cellobiosidase, alpha-glucosidase, désaminase, oxydase, synthèse de pigment, beta-Alanine- aminopeptidase, élastase
8) Procédé selon la revendication 7 selon lequel l'enzyme B est la beta-glucosidase
9) Procédé selon l'une quelconque des revendication 4 à 8 selon lequel l'enzyme C est choisi parmi beta-glucuronidase, alpha-galactosidase, beta-ribosidase, phosphatase, L- Alanine-aminopeptidase, L-Leucine-aminopeptidase, beta-galactosidase.
10) Procédé selon la revendication 4 selon lequel l'enzyme A est la beta-galactosidase ; l'enzyme B est la beta-glucosidase, et l'enzyme C est l' alpha-galactosidase
11) Procédé selon la revendication 4 selon lequel l'enzyme A est la beta-galactosidase ; l'enzyme B est la beta-glucosidase, et l'enzyme C est la beta-glucuronidase
12) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 selon lequel le milieu de détection comprend en outre, un inducteur de l'enzyme A, un inducteur de l'enzyme B et/ou un inducteur de l'enzyme C
13) Procédé selon la revendication 12 selon lequel l'enzyme A est la beta-glucuronidase et l'inducteur de ladite enzyme A est un glucuronide, préférentiellement choisi parmi le Glucuronate, le Méthyl-beta- glucuronide.
14) Procédé selon la revendication 12 selon lequel l'enzyme A est la beta-galactosidase et l'inducteur de ladite enzyme A est un beta-galactoside, préférentiellement choisi parmi le Lactose, l'Isopropyl-beta-thio-galactoside.
15) Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 a 14 selon lequel l'enzyme B est la beta-glucosidase, et l'inducteur de l'enzyme B est un beta-glucoside, préférentiellement choisi parmi la Méthyl-beta-glucose, le Cellobiose, cellotriose, trehalose, cellulose, amidon
16) Procédé selon la revendication 15 selon lequel l'inducteur de l'enzyme B est le Cellobiose
17) Milieu de détection comprenant du tryptophane, un substrat d'une enzyme beta- galactosidase, un substrat d'une enzyme beta-glucosidase, et de le cellobiose.
18) Milieu de détection selon la revendication 16 comprenant en outre un substrat d'une enzyme alpha-galactosidase.
19) Utilisation d'un milieu tel que défini dans la revendication 17 ou 18 pour détecter E. coli
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