EP2804954A1 - Detection in vitro de microorganismes presentant une activite azoreductase - Google Patents

Detection in vitro de microorganismes presentant une activite azoreductase

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EP2804954A1
EP2804954A1 EP13704178.6A EP13704178A EP2804954A1 EP 2804954 A1 EP2804954 A1 EP 2804954A1 EP 13704178 A EP13704178 A EP 13704178A EP 2804954 A1 EP2804954 A1 EP 2804954A1
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EP
European Patent Office
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sample
fluorescence
reduction
azo compound
microorganisms
Prior art date
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Ceased
Application number
EP13704178.6A
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German (de)
English (en)
Inventor
Arthur James
Céline ROGER-DALBERT
Claire Mercier
Sylvain Orenga
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Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
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Filing date
Publication date
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    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
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    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/906—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7)
    • G01N2333/90688—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)

Definitions

  • the present invention relates to the field of microbiology. More specifically, it relates to a method for detecting microorganisms in a sample, comprising a step of detecting the reduction by said microorganisms of an azo compound.
  • the detection of microorganisms in a sample involves a step of bringing said sample into contact with a reaction medium and the detection of modifications in this reaction medium, markers of the presence of microorganisms.
  • the method of detection of microorganisms thus implemented should preferably be substantially independent of the nature of the sample in which the microorganisms are sought, and have a high sensitivity.
  • the method consists of direct observation of cells or observation of the formation of colonies.
  • a first method consists of an observation of the reaction medium by nephelometry or turbidimetry, that is to say by revealing the opacity of the reaction medium.
  • the present invention relates to a novel method for detecting at least one microorganism having an azoreductase activity, which may be present in a sample, comprising the steps of:
  • azo compounds comprising an azo bond have also been described as "quenchers", that is to say that they will modify the fluorescence properties of a medium or a fluorophore, as in the application WO 2005/049849. They can then be conjugated to biological molecules such as lipids, nucleic acids, peptides, proteins, etc.
  • the azo derivatives are used for the labeling of oligonucleotides, for the specific detection of sequences: the non-hybridized oligonucleotide is non-fluorescent; there is emission of fluorescence when it is hybridized on its complementary target sequence.
  • the Applicant describes here a new use of azo compounds, implemented in in vitro diagnostic methods, and microbiological control, for example in the food industry, pharmaceutical, cosmetological or environmental control.
  • Biological sample means a small or small amount isolated from an entity for analysis. It can be a clinical sample, human or animal, from a collection of biological fluid, or a food sample, from any type of food, a pharmaceutical or cosmetological product, or a sample of the production environment or processing food, pharmaceutical or cosmetological products. This sample can be liquid or solid.
  • Non-limiting examples include a clinical sample of whole blood, serum, plasma, urine, feces, nasal specimens, throats, skin, wounds, cerebrospinal fluid, a sample of food, water, drinks such as milk, fruit juice, yogurt, meat, eggs, vegetables, mayonnaise, cheese, fish ..., a sample from a feed intended for animals, such as in particular a sample derived from animal or vegetable meal, a sample for surface control or water.
  • a sample from a feed intended for animals such as in particular a sample derived from animal or vegetable meal, a sample for surface control or water.
  • the food-based sample it is also referred to as the food matrix.
  • This sample may be used as it is or, prior to the analysis, undergo an enrichment-type preparation, dilution, extraction, concentration, purification, according to methods known to those skilled in the art.
  • microorganism covers bacteria, yeasts, molds and more generally, generally unicellular organisms, invisible to the naked eye, which can be multiplied and manipulated in the laboratory.
  • gram-negative bacteria As gram-negative bacteria, mention may be made of the following genera: Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Campylobacter, Haemophilus, Morganella, Vibrio, Yersinia, Acinetobacter, Branhamella, Neisseria, Burkholderia , Citrobacter, Hafnia, Edwardsiella, Aeromonas, Moraxella, Pasteurella, Providencia, Actinobacillus, Alcaligenes, Bordetella, Cedecea, Erwinia, Pantoea, Ralstonia, Stenotrophomonas, Xanthomonas and Legionella.
  • Gram-positive bacteria mention may be made of the following genera: Aerococcus, Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Lactobacillus, Listeria, Clostridium, Gardnerella, Kocuria, Lactococcus, Leuconostoc, Micrococcus, Falkamia, Gemella, Pediococcus, Mycobacterium and Corynebacterium.
  • yeasts that may be mentioned include yeasts of the following genera: Candida, Cryptococcus, Saccharomyces and Trichosporon.
  • molds there may be mentioned molds of the following genera: Aspergillus, Fusarium, Geotrichum and Penicillium.
  • reaction medium a medium comprising all the elements necessary for the expression of a metabolism and / or the growth of microorganisms.
  • the reaction medium may be solid, semi-solid or liquid.
  • solid medium is meant for example a gelled medium.
  • Agar is the traditional gelling agent in microbiology for the cultivation of microorganisms, but it is possible to use gelatin, agarose or other natural or artificial gelling agents.
  • a number of preparations are commercially available, such as Columbia agar, Trypcase-soy agar, Mac Conkey agar, Mueller Hinton agar or more generally those described in the Handbook of Microbiological Media (CRC Press).
  • the reaction medium may comprise one or more elements in combination, such as amino acids, peptones, carbohydrates, nucleotides, minerals, vitamins, etc.
  • the medium may also comprise a dye.
  • dye of Evans blue, neutral red, sheep blood, horse blood, an opacifier such as titanium oxide, nitroaniline, malachite green, brilliant green , one or more metabolic indicators, one or more metabolic regulators ...
  • the reaction medium may be a revelation medium or a culture and revelation medium.
  • the culture of the microorganisms is not necessary or is performed before seeding, and in the second case, the detection and / or characterization medium also constitutes the culture medium.
  • the reaction medium may comprise one or more selective agents.
  • selective agent is meant any compound capable of preventing or slowing the growth of a microorganism other than the target microorganism. Without being limiting, a concentration between 0.01 mg / l and 5 g / l is particularly suitable for the present invention.
  • Antibiotics we mean any compound that can prevent or slow down the growth of a bacteria. They belong especially to the beta-lactam groups, glycopeptides, aminoglycosides, polypeptides, sulfonamides, quinolones.
  • antifungal is meant any compound that can prevent or slow the growth of yeast or mold. As an indication, mention may be made in particular amphotericin B, fluconazole, itraconazole, voriconazole, cycloheximide.
  • azoreductase any enzyme, whatever its structure and classification, which is capable of reducing an azo function.
  • substrate or chromogenic substrate is meant a compound allowing the detection of an enzymatic or metabolic activity by means of a detectable signal directly or indirectly.
  • said enzymatic or metabolic activity is that of a microorganism.
  • chromogenic substrate is meant a compound allowing the detection of an enzymatic or metabolic activity by virtue of the variation of an optical signal such as a variation in absorbance and / or fluorescence.
  • this substrate may be bound to a fluorescent or colored marker moiety (Orenga et al., 2009, J. Microbiol Methods, 79 (2): 139-55).
  • the reaction medium according to the invention may additionally comprise a pH indicator, sensitive to the pH variation induced by the consumption of the substrate and revealing the metabolism of the target microorganisms.
  • the said pH indicator may be a chromophore or a fluorophore.
  • chromophores include bromocresol purple, bromothymol blue, neutral red, aniline blue, bromocresol blue.
  • the fluorophores include, for example, 4-methylumbelliferone, hydroxycoumarin derivatives, fluorescein derivatives or resorufin derivatives.
  • the enzymatic activities targeted by the chromogenic substrates may belong to the group of hydrolases, preferentially to the groups of osidases, esterases or peptidases.
  • the enzymatic activities targeted by the chromogenic substrates are chosen from: glucuronidase, glucosidase, galactosidase, esterase, sulphatase and deaminase.
  • the azo compounds used in the process according to the invention correspond to substrates detecting an azoreductase activity.
  • Incubate is meant to carry and maintain between 5 minutes and 48 hours, preferably between 4 and 24 hours, more preferably between 16 and 24 hours, at an appropriate temperature, generally between 20 and 50 ° C, preferably between 30 and 40 ° vs.
  • detection it is meant to detect with the naked eye or with the aid of an optical device the existence of growth and / or activity of the target bacteria.
  • the detection may also allow a characterization of the target microorganisms.
  • Quencher means an element that makes it possible to reduce the fluorescence intensity of a given substance.
  • a quencher can be defined as an extinguisher by absorption of excitation or emission energy.
  • the quenching can then be defined as an extinction or a quenching of the excitation or emission wavelength, or by the substitution of a group on a molecule, said substitution inducing a modification of the excitation capacity of the electrons.
  • group means groups or residues containing nitrogen, hydroxyl, thiols, carbon, methyl, propyl, butyl or phenyl.
  • the present invention relates to a method for detecting, in a biological sample, at least one microorganism having an azoreductase activity, comprising the steps of:
  • step c) detecting the reduction of the azo compound by said microorganism, indicating the presence of said at least one microorganism.
  • step c) also allows a count of the microorganisms.
  • the method according to the invention allows the characterization (or identification) of at least one group of microorganisms. In other words, it allows both to detect and to determine which group of microorganisms is detected.
  • Most azo compounds are colored in the oxidized state and colorless in the reduced state.
  • the reduction of azo compounds can lead to the formation of a fluorescent compound.
  • the reduction of the azo compound is detected by measuring a change in absorbance or fluorescence.
  • the reduction of the azo compound is detected by the disappearance of a coloration and / or by the appearance of a fluorescence.
  • the incubation step may be carried out aerobically or anaerobically, that is, in the presence or absence of oxygen.
  • the activity of microorganisms, detected according to the present invention is related to the respiratory, aerobic and / or anaerobic metabolism of microorganisms. The majority of microorganisms thus have this type of activity.
  • the azo compounds used in the process according to the invention can be coupled to a fluorophore whose emission wavelength or excitation wavelength is quenched by the coloration of the azo compound.
  • the azo compounds used in the process according to the invention can quench the fluorescence of another molecule.
  • fluorophores include but are not limited to coumarins including AMC (7-Amino-4-methyl-coumarin), 4-MU (4-Methyl umbelliferone), fluorescein derivatives, and the like.
  • Coupling between the fluorophore and the azo compound may be intramolecular coupling, or intermolecular coupling.
  • intramolecular coupling is meant that the fluorophore is covalently bound to the azo compound.
  • the azo compound may be coupled with a fluorophore, capable of being excited or emitting at the absorbance wavelength of the oxidized azo compound. The oxidized, colored compound then masks the fluorescence. After reduction, the compound is decolourized and reveals the fluorescence by disappearance of the intramolecular quenching phenomenon.
  • Intermolecular coupling means that the fluorophore and the azo compound are two different chemical molecules.
  • the reduction of the azo compound then leads to the possible appearance of fluorescence by disappearance of the intermolecular quenching phenomenon.
  • the reaction medium used in the process according to the invention further comprises at least one second substrate capable of detecting an enzymatic activity.
  • said substrate is a chromogenic substrate, that is to say that the metabolism of said substrate produces a coloration or a fluorescence.
  • said enzymatic activity is different from the azoreductase activity.
  • the method according to the invention is of particular interest for food type samples.
  • the detection of total flora according to a commercially available kit uses three fluorescent substrates and allows a reading of the result in 48 hours.
  • the disadvantage is that some food matrices cross-react with this kit. In other words, an unspecific enzymatic reaction linked to the food itself leads to false results. positive. Tests conducted with azo compounds show that the food matrices with the most false positives in this total flora detection test do not show background with the azo compound.
  • the process according to the invention can be implemented in a solid container of the microplate, microtube, microcupule, capillary, multi-well card type such as VITEK® card or TEMPO® card.
  • the reaction card is a VITEK® card or a TEMPO® card
  • the invention also relates to the use of at least one azo compound for the detection of at least one microorganism included in a sample.
  • the reaction medium consists of:
  • Inoculum 0.5 MacFarland
  • the reduction of the substrate and the growth of microorganisms are monitored using a Infinity® M200 TECAN microplate reader at 35 ° C over 24 hours.
  • the substrate is considered to be reduced by microorganisms when the substrate is decolorized (followed by decreased absorbance) (Decol) and / or when the fluorescence of the substrate is multiplied by 2 compared to the baseline fluorescence of a control without substrate (Fluo). Growth is indicated by Co.
  • the "+” signifies good growth / discoloration / significant fluorescence increase.
  • the acronym “+/-” means difficult growth.
  • the symbol “-” means that there is no significant growth / discoloration / increase of fluorescence. RED indicates whether the substrate is reduced (O) or not (N).
  • microorganisms can reduce "azo" molecules if there is growth. Some molecules can be reduced by all the microorganisms tested (examples: Methyl red) and others are reduced specifically by a single species (example: Methyl orange reduced only by E. faecalis). Accordingly, the azoreductase activity can be used as a means of detecting microorganisms, either of a targeted group, or universally, depending on the choice of the azo compound. In the case of Orange I, Ponceau 2G, and BF 38, the discoloration of the substrate makes it possible to visualize an increase in fluorescence. This fluorescence is that of microorganisms.
  • the reaction medium consists of:
  • the reduction of the substrate and the growth of microorganisms are monitored using a Infinity® M200 TECAN microplate reader at 35 ° C over 24 hours.
  • the substrate is considered to be reduced by the microorganisms when the fluorescence is multiplied by 2 relative to the basic fluorescence of the reaction medium. Strains that reduce the substrate and "-" strains that do not reduce the substrate are marked with a "+".
  • Table VII show that the 3- (4-hydroxyphenylazo) benzoic acid sodium salt can be reduced by all the bacterial species tested and by some yeasts, whereas Tartrazine and Orange II are reduced mainly by E. faecalis.
  • the "azo" molecules can be used either to detect the presence of any microbial genus, or to detect the presence of specific microorganisms, or to differentiate or characterize specific microorganisms.
  • the matrices are tested at different concentrations: 1/400, 1/4000 and 4/40000.
  • the reduction of the substrate and the growth of microorganisms are monitored using a Infinity® M200 TECAN microplate reader at 35 ° C over 24 hours.
  • Methyl red Reduction of Methyl red is followed by reading the fluorescence with the pair of wavelengths 250nm / 395nm. The potential growth of microorganisms is monitored by reading the absorbance at 660nm. The symbol "-" means that there is no growth or increase in fluorescence of the medium indicating a reduction of the substrate over 24 hours.
  • TEMPO ® TVC bioMérieux, France
  • Columbia agar medium without antibiotic The TEMPO ® TVC medium is taken up in 3.9 ml of water + antimicrobial cocktail to which 100 ⁇ l of the 1/10 food matrix sample solution is added. This suspension is transferred to the TEMPO ® chart using TEMPO ® Lead 1, incubated 40-48 hours at 30 ⁇ 1 ° C, and fluorescence is observed with the TEMPO ® Reader.
  • agar medium On the agar medium is spread 100 ⁇ of 1/10 food matrix sample solution, corresponding to the amount of sample contained in the 1/400 concentration.
  • the starting food matrix sample solution is diluted 1/10 twice successively, and then 100 ⁇ of each solution corresponding to the sample amounts contained in the 1/4000 and 1/40000 concentrations previously tested are spread out.
  • Table VIII shows the growth (or absence of growth) of microorganisms in the different samples detected by TEMPO ® TVC (TEMPO), by culture on columbia agar (Culture) and by reading the optical density at 660 nm. Colonies were observed for calf liver and brie liver samples from WCA, while no growth was observed for these samples at 660 nm reading. This difference may be due to the fact that the sample is maintained in an environment containing an antimicrobial cocktail while the culture medium on which the sample is seeded is devoid of antimicrobial cocktail.
  • Table IX shows the growth (or absence of growth) of microorganisms in the different samples detected by TEMPO ® TVC (TEMPO), by culture on columbia agar (Culture) and by reading the optical density at 660 nm. Colonies were observed for calf liver and brie liver samples from WCA, while no growth was observed for these samples at 660 nm reading. This difference may be due to the fact that the sample
  • Table IX indicates the absence of increased fluorescence (-) of the medium containing the food matrix in the absence of growth of microorganisms thus showing that there is no reduction of Methyl red by the food matrix.
  • the results reported in Table IX indicate that the matrices tested do not express azoreductase activity capable of degrading Methyl red. All these results indicate that the matrices: mussels, calf liver, avocado and brie Meaux AOC emit fluorescence in the presence of the sample and medium TVC, in the absence of growth of microorganisms while it is not the case with the Methyl red substrate. It can therefore be concluded that no non-microbial activity of Methyl red azoreduction by food matrices interferes with the detection of microbial azoreductase activity in foods.
  • 3- (4-hydroxyphenyl) azobenzoic acid becomes colorless and reveals the fluorescence of 7-amino-4-methyl-coumarin.
  • Both media are made with and without an antimicrobial cocktail combining 500mg / l of chloramphenicol and 10mg / l of gentamycin to inhibit the growth of bacteria and fungi.
  • the matrices are tested at different concentrations: 1/400, 1/4000 and 4/40000. For this, 10 g of matrices are weighed and dispersed by stomachage in 90 ml of Tryptone-Sel solution which corresponds to a 1/10 dilution from which the dilutions tested are made.
  • the product TEMPO ® TVC is taken up in 3,9mL of water and the medium is distributed by AZO aliquot 3,9mL. 100 L of template sample is added to each medium.
  • the TEMPO® cards are filled and incubated at 30 ° C and read after 48 hours by the TEMPO ® Reader.
  • CFU Colony Forming Units, a counting unit known to those skilled in the art.
  • Table X indicates whether there is growth on the PCA medium thus indicating the amount of microorganism contained in one gram of matrix.
  • the sign "-" means ⁇ 100UFC / gram, "+” 100 ⁇ x ⁇ 1,500,000 CFU / gram and "++"> 1,500,000 CFU / gram.
  • Growth of microorganisms was observed for all the matrices incubated in a medium without antimicrobial cocktail, whereas growth of microorganisms was observed only for the pizza dough, Saint Marcellin and soy bean dies in the presence of the antimicrobial cocktail. This phenomenon is similar to that observed in Example 3.
  • Table XI indicates the fluorescence detection by the TEMPO ® Reader. Fluorescence is detected for all matrices tested except for scotch, pizza, Saint Marcellin, soybean and pecan nuts in the presence of the antimicrobial cocktail, whereas no fluorescence is detected under these conditions.
  • AZO medium Referring to the results in Table X, we can conclude that a matrix-medium interference TVC for dolphinfish ravioles, veal liver, beef kidneys, almonds, mussels, Paris mushrooms and the mixture of baking flours. This interference is not observed with AZO medium.

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Abstract

La présente invention porte sur l'utilisation d'au moins un composé azo pour la détection d'au moins un microorganisme dans un échantillon. Plus précisément, la présente invention porte sur un procédé de détection, dans un échantillon biologique, d'au moins un microorganisme présentant une activité azoréductase, comprenant les étapes consistant à: mettre en contact l'échantillon avec un milieu réactionnel comprenant au moins un composé azo, incuber ledit milieu réactionnel, et détecter la réduction du composé azo par ledit microorganisme, indiquant la présence dudit au moins un microorganisme.

Description

Détection in vitro de microorganismes présentant une activité azoréductase
La présente invention se rapporte au domaine de la microbiologie. Plus spécifiquement, elle porte sur un procédé de détection de microorganismes, dans un échantillon, comprenant une étape consistant à détecter la réduction, par lesdits microorganismes, d'un composé azo.
D'une manière générale, la détection de microorganismes dans un échantillon met en œuvre une étape de mise en contact dudit échantillon avec un milieu réactionnel et la détection de modifications dans ce milieu réactionnel, marqueurs de la présence de microorganismes. La méthode de détection de microorganismes ainsi mise en œuvre doit, de préférence, être substantiellement indépendante de la nature de l'échantillon dans lequel les microorganismes sont recherchés, et présenter une grande sensibilité.
Lorsque le milieu réactionnel est solide, la méthode consiste en l'observation directe de cellules ou en l'observation de la formation de colonies.
Un degré supplémentaire de complexité apparaît lorsqu'on souhaite automatiser la détection.
Une première méthode consiste en une observation du milieu réactionnel par néphélométrie ou turbidimétrie, c'est-à-dire par révélation de l'opacité du milieu réactionnel.
D'autres méthodes, par voie biochimique, automatisées ou non, font appel à la détection par colorimétrie ou fluorimétrie.
Il est possible de détecter la réaction entre l'échantillon et un réactif comprenant un hydrate de carbone comme le glucose, au moyen d'un indicateur de pH.
Il est possible de détecter la réaction entre l'échantillon et un indicateur chromogène ou fluorogène de réduction ou d'oxydoréduction, tel que rapporté dans le brevet EP 0424293 B1 .
Il est possible d'utiliser des substrats enzymatiques de synthèse chromogènes ou fluorescents (pour une revue, voir Orenga et al., 2009 ; J. Microbiol. Methods ; 79(2):139-55). De tels substrats sont le plus souvent adaptés à des activités enzymatiques spécifiques et permettent une détection ciblée de microrganismes dans des échantillons cliniques, alimentaires ou environnementaux. Il est possible, en particulier lorsque le contenant du milieu réactionnel est un récipient scellé, de mettre en évidence un changement du pH ou de la concentration en CO2, comme le rapporte le brevet EP 0790299 B1 . Au vu de cet art antérieur, il reste à ce jour des voies de recherche de substrats universels, et/ou permettant une réponse rapide, et/ou utilisables avec un échantillon complexe tel une matrice alimentaire, et/ou permettant la détection de germes difficiles à détecter. A cet égard, la présente invention porte sur une nouvelle méthode de détection d'au moins un microorganisme présentant une activité azoréductase, susceptible d'être présent dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à :
• mettre en contact l'échantillon avec un milieu réactionnel comprenant au moins un composé azo. ;
• incuber ledit milieu réactionnel ; et
· détecter la réduction du composé azo par ledit au moins un microorganisme, indiquant la présence dudit microorganisme.
Les composés azo sont des molécules comprenant une ou plusieurs liaisons « azo », de type R1 -N=N-R2. Ils sont essentiellement connus comme des colorants, utilisés dans l'industrie textile, plastique, cosmétique et agroalimentaire. Il a été rapporté que des systèmes enzymatiques microbiens et de mammifères dégradent les composés azo (Xu et al., 2010 ; Anaerobe, 16 : 1 14-1 19). La présence d'une activité azoréductase chez des espèces bactériennes du colon humain a même mené à la synthèse de pro-drogues comprenant des polymères présentant des liaisons croisées azo (Chourasia & Kain, 2003 ; J. Pharm. Pharmacet. Sci., 6 (1 ) : 33- 66).
Des composés comprenant une liaison azo ont également été décrits comme « quenchers », c'est à dire qu'ils vont modifier les propriétés de fluorescence d'un milieu ou d'un fluorophore, comme dans la demande WO 2005/049849. Ils peuvent alors être conjugués à des molécules biologiques telles les lipides, les acides nucléiques, les peptides, les protéines, etc. A ce titre, les dérivés azo sont utilisés pour le marquage d'oligonucléotides, pour la détection spécifique de séquences : l'oligonucléotide non hybridé est non fluorescent ; il y a émission de fluorescence lorsque celui-ci est hybridé sur sa séquence cible complémentaire. La Demanderesse décrit ici une nouvelle utilisation de composés azo, mise en œuvre dans des méthodes de diagnostic in vitro, et de contrôle microbiologique, par exemple dans l'industrie agroalimentaire, pharmaceutique, cosmétologique ou dans le contrôle environnemental.
Les définitions qui suivent sont données dans le but de faciliter la compréhension de la présente invention.
Par échantillon biologique, on entend une petite partie ou petite quantité isolée d'une entité pour l'analyse. Ce peut être un échantillon clinique, humain ou animal, issu d'un prélèvement de liquide biologique, ou un échantillon alimentaire, issu de tout type d'aliment, d'un produit pharmaceutique ou cosmétologique, ou un échantillon de l'environnement de production ou de transformation d'aliments, de produits pharmaceutiques ou cosmétologiques. Cet échantillon peut être ainsi liquide ou solide. On peut citer d'une manière non limitative, un échantillon clinique de sang total, de sérum, de plasma, d'urines, de fèces, de prélèvements de nez, de gorges, de peau, de plaies, de liquide céphalo-rachidien, un échantillon alimentaire, d'eau, de boissons tels que le lait, un jus de fruits, de yaourt, de viande, d'œufs, de légumes, de mayonnaise, de fromage, de poisson..., un échantillon issu d'une alimentation destinée aux animaux, tel que notamment un échantillon issu de farines animales ou végétales, un échantillon pour contrôle de surface ou d'eau. Dans le cas de l'échantillon d'origine alimentaire, on parle également de matrice alimentaire.
Cet échantillon peut être utilisé tel quel ou, préalablement à l'analyse, subir une préparation de type enrichissement, dilution, extraction, concentration, purification, selon des méthodes connues de l'homme du métier.
Au sens de la présente invention, le terme microorganisme recouvre les bactéries, les levures, les moisissures et plus généralement, les organismes généralement unicellulaires, invisibles à l'œil nu, qui peuvent être multipliés et manipulés en laboratoire.
A titre de bactéries à Gram négatif, on peut citer les bactéries des genres suivants : Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Campylobacter, Haemophilus, Morganella, Vibrio, Yersinia, Acinetobacter, Branhamella, Neisseria, Burkholderia, Citrobacter, Hafnia, Edwardsiella, Aeromonas, Moraxella, Pasteurella, Providencia, Actinobacillus, Alcaligenes, Bordetella, Cedecea, Erwinia, Pantoea, Ralstonia, Stenotrophomonas, Xanthomonas et Legionella.
A titre de bactéries à Gram positif, on peut citer les bactéries des genres suivants : Aerococcus, Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Lactobacillus, Listeria, Clostridium, Gardnerella, Kocuria, Lactococcus, Leuconostoc, Micrococcus, Falkamia, Gemella, Pediococcus, Mycobacterium et Corynebacterium.
A titre de levures, on peut citer les levures des genres suivants : Candida, Cryptococcus, Saccharomyces et Trichosporon.
A titre de moisissures, on peut citer les moisissures des genres suivants : Aspergillus, Fusarium, Geotrichum et Pénicillium.
Par milieu réactionnel, on entend un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à l'expression d'un métabolisme et/ou à la croissance de microorganismes. Le milieu réactionnel peut être solide, semi-solide ou liquide. Par milieu solide, on entend par exemple un milieu gélifié. L'agar est l'agent gélifiant traditionnel en microbiologie pour la culture des microorganismes, mais il est possible d'utiliser de la gélatine, de l'agarose ou d'autres gélifiants naturels ou artificiels. Un certain nombre de préparations sont disponibles dans le commerce, comme par exemple l'agar Columbia, la gélose Trypcase-soja, la gélose Mac Conkey, la gélose Mueller Hinton ou plus généralement celles décrites dans le Handbook of Microbiological Media (CRC Press).
Le milieu réactionnel peut comprendre un ou plusieurs éléments en combinaison, tels que des acides aminés, des peptones, des hydrates de carbone, des nucléotides, des minéraux, des vitamines ... Le milieu peut comprendre également un colorant. A titre indicatif, on peut citer comme colorant le bleu d'Evans, du rouge neutre, du sang de mouton, du sang de cheval, un opacifiant tel que l'oxyde de Titane, de la nitroaniline, du vert malachite, du vert brillant, un ou plusieurs indicateurs métaboliques, un ou plusieurs régulateurs métaboliques...
Le milieu réactionnel peut être un milieu de révélation ou un milieu de culture et de révélation. Dans le premier cas, la culture des microorganismes n'est pas nécessaire ou est effectuée avant ensemencement et, dans le deuxième cas, le milieu de détection et/ou de caractérisation constitue également le milieu de culture.
Le milieu réactionnel peut comprendre un ou plusieurs agents sélectifs. Par agent sélectif, on entend tout composé susceptible d'empêcher ou de ralentir la croissance d'un microorganisme autre que le microorganisme cible. Sans être limitatif, une concentration comprise entre 0,01 mg/l et 5 g/l est particulièrement adaptée à la présente invention.
On peut citer comme agent sélectif, les antibiotiques, les antifongiques, les sels biliaires, le crystal violet, la fushine basique, le vert brillant, ... Par antibiotique, on entend tout composé susceptible d'empêcher ou de ralentir la croissance d'une bactérie. Ils appartiennent notamment aux groupes des beta-lactamines, des glycopeptides, des aminosides, des polypeptides, des sulfamides, des quinolones. Par antifongique, on entend tout composé susceptible d'empêcher ou de ralentir la croissance d'une levure ou d'une moisissure. A titre indicatif, on peut citer notamment l'amphotéricine B, le fluconazole, l'itraconazole, le voriconazole, la cycloheximide.
Par composé azo, on entend toute molécule comprenant au moins un groupement azo, c'est-à-dire au moins une liaison de type Ri-N=N-R2.
Par azoréductase, on entend toute enzyme, quelle que soit sa structure et sa classification, qui est capable de réduire une fonction azo.
Par réduction, en pratique, on entend réduction de la double liaison azo (-N=N-). Cette réduction peut être totale et conduire à la formation de deux résidus aminés (- NH2), mais elle peut être partielle et conduire à une liaison partiellement-réduite par exemple -NH-NH-.
Par substrat ou substrat chromogène, on entend un composé permettant la détection d'une activité enzymatique ou métabolique grâce à un signal détectable directement ou indirectement. Préférentiellement, ladite activité enzymatique ou métabolique est celle d'un microorganisme. Par substrat chromogène, on entend un composé permettant la détection d'une activité enzymatique ou métabolique grâce à la variation d'un signal optique telle qu'une variation d'absorbance et/ou de fluorescence. Pour une détection directe, ce substrat peut être lié à une partie faisant office de marqueur, fluorescent ou coloré (Orenga et al., 2009 ; J. Microbiol. Methods ; 79(2):139-55). Pour une détection indirecte, le milieu réactionnel selon l'invention peut comporter en sus un indicateur de pH, sensible à la variation de pH induite par la consommation du substrat et révélant le métabolisme des microorganismes cibles. Ledit indicateur de pH peut être un chromophore ou un fluorophore. On citera comme exemples de chromophores le bromocresol pourpre, le bleu de bromothymol, le rouge neutre, le bleu d'aniline, le bleu de bromocresol. Les fluorophores comprennent par exemple la 4-méthylumbelliferone, les dérivés de l'hydroxycoumarine, les dérivés de fluorescéine ou les dérivés de la résorufine.
A titre indicatif, les activités enzymatiques ciblées pas les substrats chromogènes peuvent appartenir au groupe des hydrolases, préférentiellement aux groupes des osidases, des estérases ou des peptidases. Préférentiellement, les activités enzymatiques ciblées par les substrats chromogènes sont choisies parmi : la glucuronidase, la glucosidase, la galactosidase, l'estérase, la sulfatase et la désaminase. Bien entendu, les composés azo mis en œuvre dans le procédé selon l'invention correspondent à des substrats détectant une activité azoréductase.
Par incuber, on entend porter et maintenir entre 5 minutes et 48 heures, préférentiellement entre 4 et 24 heures, plus préférentiellement entre 16 et 24 heures, à une température appropriée, généralement comprise entre 20 et 50°C, préférentiellement entre 30 et 40°C.
Par détecter, on entend déceler à l'œil nu ou à l'aide d'un appareil optique l'existence d'une croissance et/ou d'une activité des bactéries cibles. Avantageusement, lorsque le milieu mis en œuvre comprend un substrat chromogène, la détection peut également permettre une caractérisation des microorganismes cibles.
Par quencher, on entend un élément qui permet de diminuer l'intensité de fluorescence d'une substance donnée. Un quencher peut être défini comme un extincteur, par absorption de l'énergie d'excitation ou d'émission. Le quenching peut alors être défini comme une extinction ou un étouffement de la longueur d'onde d'excitation ou d'émission, ou par la substitution d'un groupement sur une molécule, ladite substitution induisant une modification de la capacité d'excitation des électrons. Par groupement, on entend des groupes ou des restes azotés, hydroxylés, thiols, carbonés, méthyle, propyle, butyle, phényle etc.
La présente invention porte sur un procédé de détection, dans un échantillon biologique, d'au moins un microorganisme présentant une activité azoréductase, comprenant les étapes consistant à :
a) mettre en contact l'échantillon avec un milieu réactionnel comprenant au moins un composé azo,
b) incuber ledit milieu réactionnel, et
c) détecter la réduction du composé azo par ledit microorganisme, indiquant la présence dudit au moins un microorganisme. Avantageusement, l'étape c) permet également un dénombrement des microorganismes. Avantageusement, le procédé selon l'invention permet la caractérisation (ou identification) d'au moins un groupe de microorganismes. En d'autres termes, il permet à la fois de détecter et de déterminer quel groupe de microorganismes est détecté. La plupart des composés azo sont colorés à l'état oxydé et incolores à l'état réduit. La réduction des composés azo peut conduire à la formation d'un composé fluorescent. Ainsi, de façon préférentielle, la réduction du composé azo est détectée en mesurant une variation d'absorbance ou de fluorescence . Préférentiellement, la réduction du composé azo est détectée par la disparition d'une coloration et/ou par l'apparition d'une fluorescence.
Selon la présente invention, l'étape d'incubation peut être effectuée en aérobiose ou en anaérobiose, autrement dit en présence ou en absence d'oxygène. En effet, l'activité des microorganismes, détectée selon la présente invention, est liée au métabolisme respiratoire, aérobie et/ou anaérobie, des microorganismes. La majorité des microorganismes possède donc ce type d'activité.
Selon un mode de réalisation particulier, les composés azo mis en œuvre dans le procédé selon l'invention peuvent être couplés à un fluorophore dont la longueur d'onde d'émission ou la longueur d'onde d'excitation est quenchée par la coloration du composé azo.
Selon un autre mode de réalisation particulier, les composés azo mis en œuvre dans le procédé selon l'invention peuvent quencher la fluorescence d'une autre molécule.
Pour résumer, il est possible :
• de détecter la disparition de la coloration du composé azo ;
• de détecter la fluorescence naturelle d'un produit de la réduction ; ou • de détecter un fluorophore couplé avec le composé azo ou un fluorophore correspondant à une molécule différente, la fluorescence apparaissant par disparition du phénomène de quenching. Parmi les fluorophores préférés, on citera de façon non restrictive les coumarines parmi lesquelles l'AMC (7-Amino-4-méthyl-coumarine), la 4-MU (4-Méthyl umbelliferone), les dérivés de la fluorescéine, etc.
Le couplage entre le fluorophore et le composé azo peut être un couplage intramoléculaire, ou un couplage intermoléculaire. Par couplage intramoléculaire, on entend que le fluorophore est lié de façon covalente au composé azo. Par exemple, le composé azo peut être couplé avec un fluorophore, susceptible d'être excité ou d'émettre à la longueur d'onde d'absorbance du composé azo oxydé. Le composé oxydé, coloré, masque alors la fluorescence. Après réduction, le composé est décoloré et laisse apparaître la fluorescence par disparition du phénomène de quenching intramoléculaire.
Par couplage intermoléculaire, on entend que le fluorophore et le composé azo sont deux molécules chimiques différentes. La réduction du composé azo entraine alors l'apparition possible d'une fluorescence par disparition du phénomène de quenching intermoléculaire.
Avantageusement, le milieu réactionnel mis en œuvre dans le procédé selon l'invention comprend en outre au moins un second substrat susceptible de détecter une activité enzymatique. Préférentiellement, ledit substrat est un substrat chromogène, c'est-à-dire que le métabolisme dudit substrat produit une coloration ou une fluorescence. Préférentiellement, ladite activité enzymatique est différente de l'activité azoréductase.
Le procédé selon l'invention présente un intérêt particulier pour les échantillons de type alimentaire. Actuellement, la détection de la flore totale selon un kit disponible commercialement utilise trois substrats fluorescents et autorise une lecture du résultat en 48 heures. L'inconvénient est que certaines matrices alimentaires présentent des réactions croisées avec ce kit. En d'autres termes, une réaction enzymatique aspécifique liée à l'aliment lui-même mène à des résultats faussement positifs. Les essais réalisés avec des composés azo montrent que les matrices alimentaires qui présentent le plus de faux positifs dans ce test de détection de la flore totale ne présentent pas de bruit de fond avec le composé azo.
Ainsi, de façon avantageuse, le procédé selon l'invention peut être mis en œuvre dans un conteneur solide de type microplaque, microtube, microcupule, capillaire, carte multipuit telle que carte VITEK® ou carte TEMPO®. De façon préférentielle, la carte réactionnelle est une carte VITEK® ou une carte TEMPO®
Enfin, l'invention concerne également l'utilisation d'au moins un composé azo pour la détection d'au moins un microorganisme compris dans un échantillon.
Les exemples développés ci-dessous ont pour but de faciliter la compréhension de l'invention. Ils sont donnés à titre explicatif et ne sauraient limiter la portée de l'invention.
Exemple 1
Tests de Réduction sur 24h à 35°C de composés possédant une fonction « azo » par 10 souches représentant 10 espèces de microorganismes. On teste, en plaque de microtitration, la réduction de la fonction « azo » des substrats listés dans le tableau I par les espèces listées dans le tableau II, chaque espèce étant représentée par une souche.
Tableau II
Le milieu réactionnel est constitué de :
Bouillon trypcase soja
Substrat 35mg/l
Inoculum 0,5 MacFarland La réduction du substrat et la croissance des nnicroorganisnnes sont suivies à l'aide d'un lecteur de microplaque Infinité® M200 TECAN à 35°C sur 24h.
La croissance est suivie par l'absorbance à 660nm et la réduction des substrats par absorbance et fluorescence aux longueurs d'onde spécifiques indiquées dans le tableau III.
Tableau III
Le substrat est considéré comme réduit par les microorganismes quand le substrat est décoloré (suivi par la diminution de l'absorbance) (Decol) et/ou quand la fluorescence du substrat est multipliée par 2 par rapport à la fluorescence de base d'un témoin sans substrat (Fluo). La croissance est indiquée par Co. Le sigle « + » signifie bonne croissance/décoloration/augmentation de fluorescence significative. Le sigle « +/- » signifie une croissance difficile. Le sigle « - » signifie qu'il n'y a pas de croissance/décoloration/augmentation de fluorescence significative. RED indique si le substrat est réduit (O) ou non (N).
5 Les résultats rapportés dans le tableau IV montrent que les microorganismes peuvent réduire des molécules « azo » s'il y a croissance. Certaines molécules peuvent être réduites par tous les microorganismes testés (exemples : Methyl red) et d'autres sont réduites spécifiquement par une seule espèce (exemple : Methyl orange réduit uniquement par E. faecalis). En conséquence, l'activité azoréductase peut être utilisée comme moyen de détection de microorganismes, soit d'un groupe ciblé, soit de façon universelle, selon le choix du composé azo. Dans les cas de l'Orange I, du Ponceau 2G, et de BF 38, la décoloration du substrat permet de visualiser une augmentation de fluorescence. Cette fluorescence est celle des microorganismes. Autrement dit, il s'agit de fluorescence intrinsèque qui existe pour les témoins sans substrat. Elle est quenchée par la coloration du substrat au départ et dévoilée au fur et à mesure de la décoloration du substrat par réduction. Dans ce cas, dans le tableau IV, la fluorescence est notée « - » car ce n'est pas celle du substrat. C'est pour cette raison que l'on observe des cas de décoloration sans augmentation de la fluorescence (tableau IV).
En conclusion, il est possible de détecter la présence de microorganismes par l'utilisation d'un substrat « azo ».
Exemple 2
Tests de réduction sur 24h à 35°C de 3 composés possédant une fonction « azo » par 45 souches représentant 25 espèces de microorganismes.
On teste, en plaque de microtitration, la réduction de la fonction « azo » des substrats listés dans le tableau V par les 25 espèces listées dans le tableau VI, chacune étant représentée par une ou deux souches.
Tableau V
Tableaux VI
Le milieu réactionnel est constitué de :
Bouillon trypcase soja
Substrat 35mg/l
Inoculum 0,5 MacFarland
La réduction du substrat et la croissance des microorganismes sont suivies à l'aide d'un lecteur de microplaque Infinité® M200 TECAN à 35°C sur 24h.
La croissance est suivie par l'absorbance à 660nm, et la réduction des substrats par absorbance et fluorescence aux longueurs d'onde indiquées dans le tableau III, supra.
Le substrat est considéré comme réduit par les microorganismes quand la fluorescence est multipliée par 2 par rapport à la fluorescence de base du milieu réactionnel. On marque d'un « + » les souches réduisant le substrat et d'un « - » les souches ne réduisant pas le substrat. Les résultats rapportés dans le tableau VII montrent que le 3-(4-hydroxyphenylazo) benzoic acid sel de sodium peut être réduit par toutes les espèces bactériennes testées ainsi que par quelques levures, alors que la Tartrazine et l'Orange II sont réduits principalement par E. faecalis. En conclusion, les molécules « azo » peuvent être utilisées soit pour détecter la présence de tout genre microbien, soit pour détecter la présence de microorganismes spécifiques, soit pour différencier ou caractériser des microorganismes spécifiques. Exemple 3
Test de réduction du Methyl red par des matrices alimentaires.
On teste, en plaque de microtitration, 9 matrices alimentaires, dont certaines à forte activité enzymatique (pour lesquels l'usage de TEMPO®TVC n'est pas recommandé), listées dans le tableau VIII, en présence de 35mg/l de Methyl red dans du milieu TSB auquel on ajoute un cocktail antimicrobien associant 200mg/l de chloramphenicol et
6mg/l de gentamycine pour inhiber la croissance des bactéries et des champignons.
Les matrices sont testées à différentes concentrations : 1/400, 1/4000 et 4/40000.
Pour cela 10g de matrices sont pesés et dispersés par stomachage dans 90ml de solution Tryptone-Sel ce qui correspond à une dilution de 1/10 à partir de laquelle sont faites les dilutions testées.
La réduction du substrat et la croissance des microorganismes sont suivies à l'aide d'un lecteur de microplaque Infinité® M200 TECAN à 35°C sur 24h.
La réduction du Methyl red est suivie par lecture de la fluorescence avec le couple de longueurs d'onde 250nm/395nm. La croissance potentielle de microorganismes est suivie par lecture de l'absorbance à 660nm. Le sigle « - » signifie qu'il n'y a pas de croissance ou d'augmentation de fluorescence du milieu indiquant une réduction du substrat sur 24h. En parallèle, les mêmes échantillons avec cocktail antimicrobien sont testés avec le produit TEMPO®TVC (bioMérieux, France), et sur milieu gélosé Columbia dépourvu d'antibiotique. Le milieu TEMPO®TVC est repris dans 3,9ml d'eau + cocktail antimicrobien auquel on ajoute 100μΙ de la solution d'échantillon de matrice alimentaire au 1/10. Cette suspension est transférée dans la carte TEMPO® à l'aide du TEMPO® Fil 1er, elle est incubée 40-48 heures à 30 ± 1 °C, et la fluorescence est observée avec le TEMPO® Reader.
Sur le milieu gélosé on étale 100μΙ de la solution d'échantillon de matrice alimentaire au 1/10, correspondant à la quantité d'échantillon contenue dans la concentration 1/400. On dilue la solution d'échantillon de matrice alimentaire de départ au 1/10 deux fois successivement, puis on étale 100μΙ de chaque solution correspondant aux quantités d'échantillon contenues dans les concentrations 1/4000 et 1/40000 précédemment testées.
Le tableau VIII indique la croissance (ou l'absence de croissance) de microorganismes dans les différents échantillons détectée par TEMPO® TVC (TEMPO), par culture sur gélose columbia (Culture) et par lecture de la densité optique à 660nm. Des colonies sont observées pour les échantillons de foie de veau et de brie de Meaux AOC, alors que aucune croissance n'est observée pour ces échantillons en lecture à 660nm. Cette différence peut être due au fait que l'échantillon soit maintenu dans un environnement contenant un cocktail antimicrobien alors que le milieu de culture sur lequel est ensemencé l'échantillon est dépourvu de cocktail antimicrobien. Tableau IX
Le tableau IX indique l'absence d'augmentation de fluorescence (-) du milieu contenant la matrice alimentaire en absence de croissance de microorganismes montrant ainsi qu'il n'y a pas de réduction du Methyl red par la matrice alimentaire. Les résultats rapportés dans le tableau IX indiquent que les matrices testées n'expriment pas d'activité azoréductase capable de dégrader le Methyl red. L'ensemble de ces résultats indique que les matrices : moules, foie de veau, avocat et brie de Meaux AOC émettent une fluorescence en présence de l'échantillon et du milieu TVC, en l'absence de croissance de microorganismes alors que ce n'est pas le cas avec le substrat Methyl red. On peut donc conclure qu'aucune activité non microbienne d'azoréduction du Methyl red par les matrices alimentaires n'interfère avec la détection de l'activité azoréductase microbienne dans les aliments.
Exemple 4
Test de réduction de l'acide 3-(4-hydroxyphenyl)-azobenzoique par des microorganismes contenus dans des matrices alimentaires.
On teste 12 matrices alimentaires par 2 milieux : le milieu commercial TEMPO® TVC et le milieu AZO fabriqué au laboratoire qui contient le substrat « azo » acide 3— (4— hydroxyphenyl)-azobenzoique (143,6mg/L) couplé à la 7— amino-4-methyl- coumarine (30,8mg/L) dans du bouillon trypcase soja. Cet exemple utilise un couplage inter-moléculaire entre un substrat azo et une molécule fluorescente. Le substrat oxydé acide 3— (4— hydroxyphenyl)-azobenzoique coloré en rouge quenche la fluorescence de la 7-amino-4-methylcoumarine. Une fois réduit, l'acide 3-(4-hydroxyphenyl) azobenzoique devient incolore et laisse apparaître la fluorescence de la 7-amino-4-methyl-coumarine. Les 2 milieux sont faits avec et sans cocktail antimicrobien associant 500mg/l de chloramphenicol et 10mg/l de gentamycine pour inhiber la croissance des bactéries et des champignons.
Les matrices sont testées à différentes concentrations : 1/400, 1/4000 et 4/40000. Pour cela 10g de matrices sont pesées et dispersés par stomachage dans 90ml de solution Tryptone-Sel ce qui correspond à une dilution de 1/10 à partir de laquelle sont faites les dilutions testées.
Le produit TEMPO®TVC est repris dans 3,9mL d'eau et le milieu AZO est réparti par aliquot de 3,9mL. On ajoute à chaque milieu 100 L d'échantillon de matrice.
Les cartes TEMPO® sont remplies et mises à incuber à 30°C et lues au bout de 48h par le TEMPO® Reader.
En parallèle une numération sur milieu PCA, qui est la méthode de référence, est faite en UFC/g (UFC signifie Unités Formant Colonies, unité de dénombrement connue de l'homme du métier).
Tableau X
Tableau XI
Détection de fluorescence par TEMPO® Reader
Le tableau X indique s'il y a croissance sur le milieu PCA indiquant ainsi la quantité de microorganisme contenu dans un gramme de matrice. Le signe « - » signifie <100UFC/gramme, « + » 100<x<1 500 000 UFC/gramme et « ++ » >1 500 000 UFC/gramme. On observe une croissance de microorganismes pour toutes les matrices incubées dans un milieu sans cocktail antimicrobien alors qu'on observe une croissance de microorganismes uniquement pour les matrices pâte à pizza, Saint Marcellin et pousses de soja en présence du cocktail antimicrobien. Ce phénomène est similaire à celui observé à l'exemple 3.
Le tableau XI indique la détection de fluorescence par le lecteur TEMPO® Reader. Une fluorescence est détectée pour toutes les matrices testées excepté la viande bovine macreuse, la pâte à pizza, le Saint Marcellin, les pousses de soja et les noix de Pécan en présence du cocktail antimicrobien alors que aucune fluorescence n'est détectée dans ces conditions pour le milieu AZO. En rapportant aux résultats contenus dans le tableau X, on peut conclure à une interférence matrice-milieu TVC pour les ravioles du dauphiné, le foie de veau, les rognons de bœuf, les amandes, les moules, les champignons de Paris et le mélange de farines boulangères. Cette interférence ne s'observe pas avec le milieu AZO.
Pour les milieux sans cocktail microbien, on observe une croissance et une fluorescence pour toutes les matrices dans tous les milieux. La fluorescence détectée dans le milieu AZO est due à la croissance microbienne.
Ces résultats permettent de conclure que le composé « azo » acide 3— (4— hydroxyphenyl)-azobenzoique n'est pas dégradé par les matrices alimentaires et permet la détection des microorganismes présent dans ces matrices.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Procédé de détection, dans un échantillon biologique, d'au moins un microorganisme présentant une activité azoréductase, comprenant les étapes consistant à :
a) mettre en contact l'échantillon avec un milieu réactionnel comprenant au moins un composé azo ;
b) incuber ledit milieu réactionnel ; et
c) détecter la réduction du composé azo par ledit microorganisme, indiquant la présence dudit au moins un microorganisme.
2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel l'étape c) permet également un dénombrement.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel l'étape c) permet la caractérisation d'au moins un groupe de microorganismes.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel la réduction du composé azo est détectée en mesurant une variation d'absorbance ou de fluorescence.
5. Procédé selon la revendication 4 dans lequel l'étape c) correspond à la détection de la disparition d'une coloration.
6. Procédé selon la revendication 4 dans lequel l'étape c) correspond à la détection de l'apparition d'une fluorescence.
7. Procédé selon la revendication 6 dans lequel la réduction du composé azo entraine la suppression d'un phénomène de quenching intramoléculaire.
8. Procédé selon la revendication 6 dans lequel la réduction du composé azo entraine la suppression d'un phénomène de quenching intermoléculaire.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8 dans lequel le milieu comprend au moins un second substrat susceptible de détecter une réaction enzymatique.
10. Procédé selon la revendication 9 dans lequel ledit second substrat est un substrat chromogénique, dont le métabolisme produit une coloration ou une fluorescence.
1 1 . Procédé selon l'une des revendications 1 à 10 dans lequel le milieu réactionnel est un milieu de culture solide ou liquide.
12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 1 1 caractérisé en ce qu'il est mis en œuvre dans un contenant sous forme de carte.
13. Procédé selon la revendication 12 dans lequel la carte réactionnelle est une carte VITEK® ou TEMPO®.
14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13 dans lequel l'échantillon est une matrice alimentaire.
15. Utilisation d'au moins un composé azo pour la détection d'au moins un microorganisme dans un échantillon.
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