EP2459738B1 - Nouveaux substrats enzymatiques de nitroreductase - Google Patents

Nouveaux substrats enzymatiques de nitroreductase Download PDF

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EP2459738B1
EP2459738B1 EP10762956.0A EP10762956A EP2459738B1 EP 2459738 B1 EP2459738 B1 EP 2459738B1 EP 10762956 A EP10762956 A EP 10762956A EP 2459738 B1 EP2459738 B1 EP 2459738B1
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EP
European Patent Office
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alkyl
carboxyl
aryl
compound
medium
Prior art date
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Active
Application number
EP10762956.0A
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German (de)
English (en)
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EP2459738A2 (fr
Inventor
Olivier Fabrega
Arthur James
Sylvain Orenga
John Perry
Vindhya Lakshika Salwatura
Stephen Stanforth
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Biomerieux SA filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP2459738A2 publication Critical patent/EP2459738A2/fr
Application granted granted Critical
Publication of EP2459738B1 publication Critical patent/EP2459738B1/fr
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Definitions

  • the present invention relates to novel enzyme substrates for the detection of nitroreductase activity. These substrates can be used in applications comprising an enzymatic reduction step producing a physico-chemical signal, particularly in microbiology, biochemistry, immunology, molecular biology, histology, etc.
  • the synthetic enzyme substrates are constituted in such a way that the substrate and the product of its metabolism by the target enzyme have different physicochemical properties, making it possible to distinguish them and to evaluate whether all or part of the substrate was converted into product by the enzyme.
  • the product of enzymatic metabolism may be chromogenic or fluorescent.
  • a nitroreductase activity can be used to reveal a group, a genus or a species of bacteria. It can also be used to monitor the reducing metabolism of microorganisms, for example related to their growth or inhibition of this growth.
  • nitroaromatic compounds The ability of some bacteria to reduce nitroaromatic compounds has been known for many years. Asnis (1957) reported the isolation of a flavoprotein from E. coli which was able to reduce p-nitrobenzoic acid. Since this report, nitroaryl-reductase activity has been identified in various varieties of organisms. This includes strict aerobes such as Pseudomonas spp. (Won et al., 1974) and Nocardia spp. (Villanueva 1964), strict anaerobes such as Clostridium spp. (Ancermaier & Simon 1983) and Veillonella spp.
  • strict aerobes such as Pseudomonas spp. (Won et al., 1974) and Nocardia spp. (Villanueva 1964
  • strict anaerobes such as Clostridium spp. (Ancermaier & Simon 1983) and Veillonella spp.
  • the detection of enzymatic nitroreductase activity is carried out by indirect methods such as monitoring the disappearance of the substrate or a cofactor.
  • Kitamura et al. (1983) studied the reduction of methyl p-nitrobenzoate and a range of other nitro aromatic compounds with E. coli.
  • this method is insensitive and is not suitable for detection in a heterogeneous medium.
  • WO 00/28073 describes a fluorogenic substrate based on nitrocoumarin for the direct detection of nitroaryl-reductase activities.
  • This type of nitroaromatic compound is capable of producing, after reduction, a highly fluorescent compound which is therefore easily detectable.
  • this substrate is not well suited to detection in a heterogeneous medium.
  • Other enzymatic nitroreductase substrates are described in the patent application FR2916762 .
  • the present invention therefore proposes to improve nitroreductase substrates for the detection of microorganisms. Compared to existing substrates, these new substrates are easy to synthesize, and can be used especially in gelled media for the detection of microorganisms because they produce a color that does not diffuse into the reaction medium.
  • the present invention contributes to improving the state of the art in that the compounds according to the invention allow the detection of microorganisms jointly having a nitroreductase activity and a metabolism causing a variation in the pH of the medium.
  • enzymatic substrate a substrate that can be modified by an enzyme into a product allowing the direct or indirect detection of a microorganism, a cell or an organelle.
  • this substrate notably comprises a nitrate function which is partially or totally reduced by the enzymatic activity to be revealed, the reduction of this nitrate function modifying certain physicochemical properties of the molecule, making it possible to monitor this reduction.
  • the substrates according to the invention are suitable for use in flow cytometry, because the product of the reduction remaining mainly located in the cell expressing the enzymatic activity, it is possible to specifically count the cells expressing this activity, or even to separate them. from the rest of the sample.
  • the substrates according to the invention are also well suited for use in histoenzymology, since the product of the reduction remains mainly located at the site of the reduction, it is possible to specifically identify the cells or organelles expressing this activity within tissue.
  • the substrates according to the invention are well suited to the monitoring of cell culture nitroreductase activity.
  • the substrates according to the invention are particularly well suited for use in detection and / or identification medium because they produce a staining or fluorescence that does not diffuse into the reaction medium.
  • coloring is used to cover a coloration in the visible spectrum, light absorption, or fluorescence, absorption at a wavelength ( ⁇ ex ) and emission at a higher wavelength ( ⁇ em , ⁇ em > ⁇ ex ).
  • the substrates of the invention may be salified, that is to say in salt form such as chloride, bromide, iodide, potassium or trifluoroacetate.
  • pH indicator is meant a chemical substance whose color and / or fluorescence varies as a function of the pH changes of the medium, said changes being related or not to the metabolism of the growing microorganism (s) on said medium.
  • nitroreductase an enzyme that can totally or partially reduce an NO 2 group.
  • Alkyl group means a chain of saturated hydrocarbon groups, such as in particular a C 1 -C 6 alkyl, that is to say a straight or branched alkyl having 1 to 6 carbon atoms.
  • a C 1 -C 6 alkyl that is to say a straight or branched alkyl having 1 to 6 carbon atoms.
  • Aryl group means a functional group (or substituent) derived from an aromatic ring such as in particular a C 6 -C 10 aromatic ring, especially phenyl, benzyl, 1-naphthyl or 2-naphthyl.
  • carboxyl group is meant in particular a functional group consisting of a carbon atom, linked by a double bond to a first oxygen atom, and by a single bond to a second oxygen atom, itself negatively charged or connected to a hydrogen atom.
  • the carboxyl group may be in ionized form, ie without H bonded to the second oxygen atom, which is then negatively charged.
  • reaction medium is meant a medium comprising all the elements necessary for the expression of a metabolism and / or the growth of microorganisms, a cell or an organelle. This reaction medium can be used in flow cytometry, histoenzymology, cell culture ... or as a medium for the detection and / or identification of microorganisms.
  • the reaction medium may be solid, semi-solid or liquid.
  • solid medium is meant for example a gelled medium.
  • Agar is the traditional gelling agent in microbiology for the cultivation of microorganisms, but it is possible to use gelatin or agarose.
  • a number of preparations are commercially available, for example Columbia agar, Trypcase-soy agar, Mac Conkey agar, Sabouraud agar or, more generally, those described in US Pat. Handbook of Microbiological Media (CRC Press ).
  • the reaction medium may comprise one or more elements in combination, such as amino acids, peptones, carbohydrates, nucleotides, minerals, vitamins, antibiotics, surfactants, buffers, phosphate salts, ammonium, sodium, metals.
  • the medium may also include a dye.
  • a dye of Evans blue, neutral red, sheep blood, horse blood, an opacifier such as titanium oxide, nitroaniline, malachite green, brilliant green ...
  • the reaction medium may be a detection and / or identification medium, that is to say a revelation medium, or a culture and revelation medium.
  • a detection and / or identification medium that is to say a revelation medium, or a culture and revelation medium.
  • the culture of the microorganisms is carried out before seeding, and in the second case, the detection and / or identification medium also constitutes the culture medium.
  • biological sample is meant a clinical sample, from a sample of biological fluid or a food sample, from any type of food or a cosmetic or pharmaceutical sample from any cosmetic or pharmaceutical preparation.
  • This sample may thus be liquid or solid and may be mentioned in a nonlimiting manner, a clinical sample of blood, plasma, urine, faeces, nose samples, throats, skin, wounds, cerebrospinal fluid, a food sample of water, beverages such as milk, fruit juice; yogurt, meat, eggs, vegetables, mayonnaise, cheese; fish ..., a food sample from a feed intended for animals, such as in particular a sample from animal meal.
  • the sample may also come from a collection of the clinical environment, livestock or food production, cosmetic or pharmaceutical.
  • sampling environment means in particular a sample of surface, liquid, raw material or product.
  • sample we mean the collection itself (swab, stool, food, ...) as well as colonies of microorganisms from said sample (for example after isolation on a gelled culture medium, or in a broth of enrichment seeded with said sample).
  • microorganism covers bacteria, in particular Gram-negative and Gram-positive bacteria, yeasts, molds, and more generally, generally unicellular organisms, invisible to the naked eye, which can be multiplied and manipulated in the laboratory.
  • gram-negative bacteria As gram-negative bacteria, mention may be made of the following genera: Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Campylobacter, Haemophilus, Morganella, Vibrio, Yersinia, Acinetobacter, Branhamella, Neisseria, Burkholderia , Citrobacter, Hafnia, Edwardsiella, Aeromonas, Moraxella; Pasteurella, Providencia, Actinobacillus, Alcaligenes, Bordetella, Cedecea, Erwinia, Pantoea, Ralstonia, Stenotrophomonas, Xanthomonas and Legionella.
  • Gram-positive bacteria mention may be made of the following genera: Aerococcus, Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Lactobacillus, Listeria, Clostridium, Gardnerella, Kocuria, Lactococcus, Leuconostoc, Micrococcus, Falkamia, Gemella, Pediococcus, Mycobacterium and Corynebacterium.
  • yeasts that may be mentioned include yeasts of the following genera: Candida, Cryptococcus, Saccharomyces and Trichosporon.
  • the microorganisms belong to the genera Escherichia, Shigella, Salmonella, Serratia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia, Vibrio, Pseudomonas, Acinetobacter, Enterococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Listeria, Bacillus, Candida, Cryptococcus, Saccharomyces .
  • this relates to the use of a compound of formula (I) as indicated above, as an enzymatic substrate for the detection of a nitroreductase activity, and an indicator of a pH variation.
  • n 1.
  • W 1 , W 2 , W 3 and W 4 are independently H.
  • X is S or CZ 5 Z 6 , preferably CCH 3 CH 3 .
  • Y is N or N + CH 3 .
  • Z 1 , Z 2 , Z 3 and Z 4 are H.
  • said compound is chosen from 2- (4'-Nitrostyryl) -benzothiazole, 2- (4'-Nitrostyryl) -N-methyl-benzothiazolium chloride, 2- (4'-Nitrostyryl) ) 1,3,3-trimethylindolinium dibromide.
  • n 1.
  • W 1 , W 2 , W 3 and W 4 are independently H.
  • X is S or CZ 5 Z 6 , preferably CCH 3 CH 3 .
  • Y is N or N + CH 3 .
  • Z 1 , Z 2 , Z 3 and Z 4 are H.
  • said compound is chosen from 2- (4'-Nitrostyryl) -benzothiazole, 2- (4'-Nitrostyryl) -N-methyl-benzothiazolium chloride, 2- (4'-Nitrostyryl) ) 1,3,3-trimethylindolinium dibromide.
  • the seeding of the microorganisms can be carried out by all the seeding techniques known to those skilled in the art.
  • An incubation step can be carried out at a temperature for which the enzymatic activity that one wishes to detect is optimal, that the person skilled in the art can easily choose according to the enzymatic activity to be detected.
  • Step d) can be carried out by visual examination, colorimetry or fluorimetry. During step d), the presence of the nitroreductase activity can be revealed, alone or in combination with at least one other enzymatic activity.
  • n 1.
  • W 1 , W 2 , W 3 and W 4 are independently H.
  • X is S or CZ 5 Z 6 , preferably CCH 3 CH 3 .
  • Y is N or N + CH 3 .
  • Z 1 , Z 2 , Z 3 and Z 4 are H.
  • said compound is chosen from 2- (4'-Nitrostyryl) -benzothiazole, 2- (4'-Nitrostyryl) -N-methyl-benzothiazolium chloride, 2- (4'-Nitrostyryl) ) 1,3,3-trimethylindolinium dibromide.
  • said reaction medium is a detection and / or identification medium for microorganisms, said medium comprising at least one molecule used as an enzymatic substrate as defined above.
  • said compound is at a concentration of between 1 and 1000 mg / l, preferably between 10 and 500 mg / l.
  • said reaction medium is a medium for the detection and / or identification of microorganisms, said medium also comprising at least one compound whose metabolism causes a variation in pH.
  • said compound is a sugar, an amino acid or an organic acid.
  • said compound is a pentose, a hexose, a dioside, a trioside or a polysaccharide.
  • said compound is at a concentration of between 0.1 and 100 g / l, preferably between 1 and 50 g / l.
  • said compound is at a concentration of between 5 and 30 g / l.
  • said detection and / or identification medium according to the invention further comprises at least one other enzymatic substrate, specific for an enzymatic activity different from the nitroreductase activity detected by the molecule according to the invention.
  • the enzymatic metabolism of the other substrate (s) generates a detectable signal, different from the signal generated by the compound according to the invention used as an enzymatic substrate, such as, for example, different colored or fluorescent products, to enable detection as well as detection. and / or identification and / or quantification of one or more microorganisms.
  • a detectable signal different from the signal generated by the compound according to the invention used as an enzymatic substrate, such as, for example, different colored or fluorescent products, to enable detection as well as detection. and / or identification and / or quantification of one or more microorganisms.
  • any other substrate conventionally used in the detection of microorganisms can be used.
  • the concentration of the other specific enzymatic substrate is generally between 0.01 and 1 g / l. Those skilled in the art can easily determine such a concentration depending on the substrate used.
  • said detection and / or identification medium according to the invention further comprises at least one other enzymatic substrate specific for the nitroréducase activity.
  • the concentration of the other specific enzymatic substrate is generally between 0.01 and 1 g / l. Those skilled in the art can easily determine such a concentration depending on the substrate used.
  • said detection and / or identification medium according to the invention also comprises at least one metabolic indicator, specific for a metabolic activity different from that detected by the compound according to the invention. invention.
  • This metabolic indicator may in particular be a source of carbon or nitrogen associated or not with a reagent revealing its metabolism.
  • Iodinated 2- (4-Nitrostyryl) -1,3,3-trimethylindolinium was synthesized from iodinated 1,3,3-trimethyl-indolinium according to the method of Bruer et al. ( C. Bruer, J. Dale, J. Fain, E. Franklin, J. Goan, W. Stump, M. West and J. Wilson, Journal of Organic Chemistry, 1957, 22, 1110 ).
  • 40 mg of the substrate were dissolved in 4 ml of dimethylsulfoxide and added to 400 ml of previously autoclaved Columbia medium.
  • the medium was distributed in a petri dish 90 mm in diameter at a rate of 20 ml per dish.
  • Ten strains of microorganisms from collections belonging to different species of bacteria and yeasts are inoculated in spots of about 10,000 colony forming units.
  • the media is incubated 24 hours at 37 ° C, and the colonies formed are examined visually.
  • the nitroreductase substrates according to the invention it is possible to distinguish different groups of microorganisms and obtain different colors of colonies.
  • the staining does not diffuse in the reaction medium, it is possible to distinguish and count the cells or colonies expressing the nitroreductase activity independently of those not expressing it.

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Description

  • La présente invention concerne de nouveaux substrats enzymatiques pour la détection d'activité nitroréductase. Ces substrats sont utilisables dans les applications comportant une étape de réduction enzymatique produisant un signal physico-chimique notamment en microbiologie, biochimie, immunologie, biologie moléculaire, histologie, etc.
  • Il existe actuellement de très nombreux milieux permettant la détection de microorganismes. Cette détection peut être basée notamment sur l'utilisation de substrats particuliers, spécifiques d'une enzyme du microorganisme que l'on souhaite détecter. D'une manière générale, les substrats synthétiques d'enzymes sont constitués de telle façon que le substrat et le produit de son métabolisme par l'enzyme cible possèdent des propriétés physico-chimiques différentes, permettant de les distinguer et d'évaluer si tout ou partie du substrat a été converti en produit par l'enzyme. Par exemple le produit du métabolisme enzymatique peut être chromogène ou fluorescent. Ainsi dans le cas des bactéries, par le choix des substrats, selon qu'il y a réaction ou non, il est possible de caractériser la nature d'un microorganisme. Une activité nitroréductase peut notamment être utilisée pour révéler un groupe, un genre ou une espèce de bactéries. Il peut également être utilisé pour suivre le métabolisme réducteur de microorganismes, par exemple lié à leur croissance ou à l'inhibition de cette croissance.
  • La capacité de certaines bactéries de réduire les composés nitro-aromatiques est connue depuis de nombreuses années. Asnis (1957) a rapporté l'isolation d'une flavoproteine à partir d'extraits d'E. coli qui était capable de réduire l'acide p-nitrobenzoique. Depuis ce rapport, l'activité nitroaryl-réductase a été identifiée dans diverses variétés d'organismes. Ceci inclut des aérobies strictes tels que Pseudomonas spp. (Won et al. 1974) et Nocardia spp. (Villanueva 1964), des anaérobies strictes tels que Clostridium spp. (Ancermaier & Simon 1983) et Veillonella spp. (McCormick et al. 1976), ou encore des champignons (Masuda & Ozaki 1993) et des parasites eucaryotes (Douch 1975). II existe une gamme de substrats qui ont été désignés comme étant susceptibles d'être réduits par des nitroaryl-reductases bactériennes. Il s'agit surtout de composés nitro-aromatiques tels que l'acide p-nitrobenzoique, le p-nitrophénol, la p-nitroaniline et le 2,4,6-trinitrotoluène (McCormick et al. 1976).
  • D'une manière générale, la détection de l'activité enzymatique nitroréductase est réalisée par des méthodes indirectes telles que le suivi de la disparition du substrat ou d'un cofacteur. Par exemple, Kitamura et al. (1983) ont étudié la réduction du méthyl p-nitrobenzoate et d'une gamme d'autres composés aromatiques nitrés avec des extraits d'E. coli. Toutefois, cette méthode est peu sensible et n'est pas adaptée à une détection en milieu hétérogène. On peut citer également la demande WO 00/28073 qui décrit un substrat fluorogène à base de nitrocoumarine pour la détection directe des activités nitroaryl-réductases. Ce type de composé nitro-aromatique est capable de produire, après réduction, un composé très fluorescent qui est donc facilement détectable. Toutefois ce substrat n'est pas bien adapté à une détection en milieu hétérogène. D'autres substrats enzymatiques de nitroréductase sont décrits dans la demande de brevet FR2916762 .
    La présente invention se propose donc d'améliorer les substrats de nitroréductase permettant la détection de microorganismes. Comparativement aux substrats existants, ces nouveaux substrats sont de synthèse aisée, et peuvent être utilisés notamment en milieux gélifiés pour la détection de micro-organismes car ils produisent une coloration ne diffusant pas dans le milieu réactionnel.
  • En outre, la présente invention contribue à améliorer l'état de la technique en ce que les composés selon l'invention permettent la détection de microorganismes présentant conjointement une activité nitroréductase et un métabolisme entrainant une variation de pH du milieu.
  • Avant d'aller plus avant dans la description de l'invention, les définitions ci dessous sont données afin de faciliter l'exposé de l'invention.
  • Par substrat enzymatique, on entend un substrat pouvant être modifié par une enzyme en un produit permettant la détection, directe ou indirecte d'un microorganisme, d'une cellule ou d'une organelle. Dans le cas des substrats de nitroréductase, ce substrat comprend notamment une fonction nitrate qui est partiellement ou totalement réduite par l'activité enzymatique à révéler, la réduction de cette fonction nitrate modifiant certaines propriétés physicochimiques de la molécule, permettant de suivre cette réduction.
  • Les substrats selon l'invention sont adaptés à une utilisation en cytométrie en flux, car le produit de la réduction restant principalement localisé dans la cellule exprimant l'activité enzymatique, il est possible de compter spécifiquement les cellules exprimant cette activité, voire de les séparer du reste de l'échantillon.
  • Les substrats selon l'invention sont également bien adaptés à une utilisation en histoenzymologie, car le produit de la réduction restant principalement localisé sur le lieu de la réduction, il est possible d'identifier spécifiquement les cellules ou organelles exprimant cette activité au sein d'un tissu.
  • Du fait de leur faible toxicité, les substrats selon l'invention sont bien adaptés au suivi d'activité nitroréductase de culture cellulaire.
  • Les substrats selon l'invention sont particulièrement bien adaptés à une utilisation en milieu de détection et/ou d'identification car ils produisent une coloration ou une fluorescence ne diffusant pas dans le milieu réactionnel. Dans la présente demande, le terme coloration est employé pour couvrir une coloration dans le spectre visible, absorption de lumière, ou une fluorescence, absorption à une longueur d'onde (λex) et émission à une longueur d'onde supérieure (λem, λem > λex).
  • Les substrats de l'invention peuvent être salifiés, c'est à dire sous forme de sel tel que chlorure, bromure, iodure, potassium ou trifluoroacétate.
  • Par indicateur de pH, on entend une substance chimique dont la couleur et/ou la fluorescence varie en fonction des modifications de pH du milieu, lesdites modifications étant liées ou non au métabolisme du ou des microorganismes en croissance sur ledit milieu.
  • Par nitroréductase, on entend une enzyme pouvant réduire totalement ou partiellement un groupement NO2.
  • Par groupement alkyle, on entend une chaîne de groupements hydrocarbonés saturés, tel que notamment un alkyle en C1-C6, c'est a dire un alkyle droit ou ramifié ayant de 1 à 6 atomes de carbone. A titre d'exemple, on peut citer le méthyle, l'éthyle, le propyle, l'iso-propyle, le butyle, le t-butyle, le pentyle, l'iso-pentyle et l'hexyle.
  • Par groupement aryle, on entend un groupement fonctionnel (ou substituant) qui dérive d'un noyau aromatique tel que notamment un noyau aromatique en C6-C10, notamment phényle, benzyle, 1-naphtyle ou 2-naphtyle.
  • Par groupement carboxyle, on entend notamment un groupe fonctionnel composé d'un atome de carbone, lié par une double liaison à un premier atome d'oxygène, et par une liaison simple à un second atome d'oxygène, lui-même chargé négativement ou relié à un atome d'hydrogène. En fonction du pKa de la molécule et du pH du milieu, le groupement carboxyle peut être sous forme ionisée, c'est à dire sans H lié au second atome d'oxygène, qui est alors chargé négativement.
  • Par milieu réactionnel, on entend un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à l'expression d'un métabolisme et/ou à la croissance de microorganismes, d'une cellule ou d'une organelle. Ce milieu réactionnel peut être utilisé en cytométrie en flux, histoenzymologie, culture cellulaire ... ou en tant que milieu de détection et/ou d'identification de microorganismes.
  • Le milieu réactionnel peut être solide, semi-solide ou liquide. Par milieu solide, on entend par exemple un milieu gélifié. L'agar est l'agent gélifiant traditionnel en microbiologie pour la culture des microorganismes, mais il est possible d'utiliser de la gélatine ou de l'agarose. Un certain nombre de préparations sont disponibles dans le commerce, comme par exemple l'agar Columbia, la gélose Trypcase-soja, la gélose Mac Conkey, la gélose Sabouraud ou plus généralement celles décrites dans le Handbook of Microbiological Media (CRC Press).
  • Le milieu réactionnel peut comprendre un ou plusieurs éléments en combinaison, tels que des acides aminés, des peptones, des hydrates de carbone, des nucléotides, des minéraux, des vitamines, des antibiotiques, des tensioactifs, des tampons, des sels de phosphate, d'ammonium, de sodium, de métaux.
  • Le milieu peut comprendre également un colorant. A titre indicatif, on peut citer comme colorant le bleu d'Evans, du rouge neutre, du sang de mouton, du sang de cheval, un opacifiant tel que l'oxyde de Titane, de la nitroaniline, du vert malachite, du vert brillant...
  • Le milieu réactionnel peut être un milieu de détection et/ou d'identification, c'est à dire un milieu de révélation, ou un milieu de culture et de révélation. Dans le premier cas, la culture des microorganismes est effectuée avant ensemencement et, dans le deuxième cas, le milieu de détection et/ou d'identification constitue également le milieu de culture.
  • Par échantillon biologique, on entend un échantillon clinique, issu d'un prélèvement de liquide biologique ou un échantillon alimentaire, issu de tout type d'aliment ou un échantillon cosmétique ou pharmaceutique issu de toute préparation cosmétique ou pharmaceutique. Cet échantillon peut être ainsi liquide ou solide et on peut citer d'une manière non limitative, un échantillon clinique de sang, de plasma, d'urines, de fécès, de prélèvements de nez, de gorges, de peaux, de plaies, de liquide céphalo-rachidien, un échantillon alimentaire d'eau, de boissons tels que le lait, un jus de fruits; de yaourt, de viande, d'oeufs, de légumes, de mayonnaise, de fromage ; de poisson..., un échantillon alimentaire issu d'une alimentation destinée aux animaux, tel que notamment un échantillon issu de farines animales. L'échantillon peut également être issu d'un prélèvement de l'environnement clinique, d'élevage ou de production alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique. Par prélèvement d'environnement, on entend notamment un prélèvement de surface, de liquide, de matière première ou de produit. Par échantillon, on entend donc le prélèvement en lui même (écouvillon, selles, aliments, ...) aussi bien que des colonies de microorganismes issus dudit prélèvement (par exemple après isolement sur un milieu de culture gélifié, ou dans un bouillon d'enrichissement ensemencé avec ledit prélèvement).
  • Au sens de la présente invention, le terme microorganisme recouvre les bactéries, notamment à Gram négatif et à Gram positif, les levures, les moisissures, et plus généralement, les organismes généralement unicellulaire, invisibles à l'oeil nu, qui peuvent être multipliés et manipulés en laboratoire.
  • A titre de bactéries à Gram négatif, on peut citer les bactéries des genres suivants : Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Campylobacter, Haemophilus, Morganella, Vibrio, Yersinia, Acinetobacter, Branhamella, Neisseria, Burkholderia, Citrobacter, Hafnia, Edwardsiella, Aeromonas, Moraxella; Pasteurella, Providencia, Actinobacillus, Alcaligenes, Bordetella, Cedecea, Erwinia, Pantoea, Ralstonia, Stenotrophomonas, Xanthomonas et Legionella.
  • A titre de bactéries à Gram positif, on peut citer les bactéries des genres suivants : Aerococcus, Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Lactobacillus, Listeria, Clostridium, Gardnerella, Kocuria, Lactococcus, Leuconostoc, Micrococcus, Falkamia, Gemella, Pediococcus, Mycobacterium et Corynebacterium.
  • A titre de levures, on peut citer les levures des genres suivants : Candida, Cryptococcus, Saccharomyces et Trichosporon.
  • Préférentiellement, les microorganismes appartiennent aux genres Escherichia, Shigella, Salmonella, Serratia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia, Vibrio, Pseudomonas, Acinetobacter, Enterococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Listeria, Bacillus, Candida, Cryptococcus, Saccharomyces.
  • A ce titre, l'invention concerne l'utilisation d'un composé de la formule (1) suivante, comme substrat enzymatique pour la détection d'une activité nitroréductase :
    Figure imgb0001
     selon laquelle :
    • W1, W2, W3 et W4 sont indépendamment H, Br, Cl, F, I, alkyle, alkoxy, thiométhyle, perfluoroalkyle, nitro, cyano, carboxyle (incluant ses esters ou amides) ou toute combinaison de ceux-ci.
    • n = 0, 1 ou 2
    • X est NR, CZ5Z6, S ou O, R étant H, alkyle, aralkyle, aryle, alcanoïque ou alkylsulfonique, Z5 et Z6 étant un alkyle
    • Y est N ou N+R, R étant alkyle, aralkyle, aryle, alcanoïque ou alkylsulfonique
    • Z1, Z2, Z3 et Z4 étant indépendamment H, Br, Cl, F, I, alkyle, aryle, alkoxy, perfluoroalkyle, nitro, cyano, carboxyle, sulfonyle, incluant les esters ou amides de carboxyle ou sulfonyle
    et leurs sels.
  • Selon un autre mode de réalisation de l'invention, celle-ci concerne l'utilisation d'un composé de formule (I) telle qu'indiquée supra, comme substrat enzymatique pour la détection d'une activité nitroréductase, et indicateur d'une variation de pH.
  • Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, n = 1.
  • Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, W1, W2, W3 et W4 sont indépendamment H.
  • Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, X est S ou CZ5Z6, préférentiellement CCH3CH3.
  • Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, Y est N ou N+CH3.
  • Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, Z1, Z2, Z3 et Z4 sont H.
  • Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit composé est choisi parmi 2-(4'-Nitrostyryl)-benzothiazole, 2-(4'-Nitrostyryl)-N-methyl-benzothiazolium chloride, 2-(4'-Nitrostyryl)-1,3,3-triméthyl-indolinium dibromide.
  • L'invention concerne également un procédé pour la détection chez des micro-organismes d'une activité nitroréductase, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
    1. a) disposer d'un milieu de détection et/ou d'identification comprenant un composé de formule (I)
      Figure imgb0002
       selon laquelle :
      • W1, W2, W3 et W4 sont indépendamment H, Br, Cl, F, I, alkyle, alkoxy, thiométhyle, perfluoroalkyle, nitro, cyano, carboxyle (incluant ses esters ou amides) ou toute combinaison de ceux-ci.
      • n = 0, 1 ou 2
      • X est NR, CZ5Z6, S ou O, R étant H, alkyle, aralkyle, aryle, alcanoïque ou alkylsulfonique, Z5 et Z6 étant un alkyle
      • Y est N ou N+R, R étant alkyle, aralkyle, aryle, alcanoïque ou alkylsulfonique
      • Z1, Z2, Z3 et Z4 étant indépendamment H, Br, Cl, F, I, alkyle, aryle, alkoxy, perfluoroalkyle, nitro, cyano, carboxyle, sulfonyle, incluant les esters ou amides de carboxyle ou sulfonyle
      et leurs sels ;
    2. b) ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester,
    3. c) laisser incuber, et
    4. d) révéler la présence d'au moins une activité nitroréductase.
  • Selon un autre mode de réalisation de l'invention, celle-ci concerne également un procédé pour la détection d'une activité nitroréductase chez des microorganismes, et d'une variation de pH, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
    1. a) disposer d'un milieu de détection et/ou d'identification comprenant un composé de formule (I) telle qu'indiquée supra ;
    2. b) ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester ;
    3. c) laisser incuber ;
    4. d) observer un changement de couleur et/ou de fluorescence du milieu de détection et/ou d'identification, révélant la présence d'au moins une activité nitroréductase, et une variation de pH dans ledit milieu de détection et/ou d'identification.
  • Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, n = 1.
  • Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, W1, W2, W3 et W4 sont indépendamment H.
  • Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, X est S ou CZ5Z6, préférentiellement CCH3CH3.
  • Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, Y est N ou N+CH3.
  • Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, Z1, Z2, Z3 et Z4 sont H.
  • Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit composé est choisi parmi 2-(4'-Nitrostyryl)-benzothiazole, 2-(4'-Nitrostyryl)-N-methyl-benzothiazolium chloride, 2-(4'-Nitrostyryl)-1,3,3-triméthyl-indolinium dibromide.
  • L'ensemencement des microorganismes peut être réalisé par toutes les techniques d'ensemencement connues de l'homme du métier. Une étape d'incubation peut être réalisée à une température pour laquelle l'activité enzymatique que l'on souhaite détecter est optimale, que l'homme du métier peut choisir aisément selon l'activité enzymatique à détecter. L'étape d) peut s'effectuer par un examen visuel, par colorimétrie ou fluorimétrie. Lors de l'étape d), on peut révéler la présence de l'activité nitroréductase, seule ou en combinaison avec au moins une autre activité enzymatique.
  • L'invention concerne également un milieu de détection et/ou d'identification de microorganismes comprenant un composé de la formule (I) suivante:
    Figure imgb0003
     selon laquelle :
    • W1, W2, W3 et W4 sont indépendamment H, Br, Cl, F, I, alkyle, alkoxy, thiométhyle, perfluoroalkyle, nitro, cyano, carboxyle (incluant ses esters ou amides) ou toute combinaison de ceux-ci.
    • n = 0, 1 ou 2
    • X est NR, CZ5Z6, S ou O, R étant H, alkyle, aralkyle, aryle, alcanoïque ou alkylsulfonique, Z5 et Z6 étant un alkyle
    • Y est N ou N+R, R étant alkyle, aralkyle, aryle, alcanoïque ou alkylsulfonique
    • Z1, Z2, Z3 et Z4 étant indépendamment H, Br, Cl, F, I, alkyle, aryle, alkoxy, perfluoroalkyle, nitro, cyano, carboxyle, sulfonyle, incluant les esters ou amides de carboxyle ou sulfonyle
    et leurs sels.
  • Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, n = 1.
  • Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, W1, W2, W3 et W4 sont indépendamment H.
  • Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, X est S ou CZ5Z6, préférentiellement CCH3CH3.
  • Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, Y est N ou N+CH3.
  • Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, Z1, Z2, Z3 et Z4 sont H.
  • Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit composé est choisi parmi 2-(4'-Nitrostyryl)-benzothiazole, 2-(4'-Nitrostyryl)-N-methyl-benzothiazolium chloride, 2-(4'-Nitrostyryl)-1,3,3-triméthyl-indolinium dibromide.
  • Préférentiellement, ledit milieu réactionnel est un milieu de détection et/ou d'identification de microorganismes, ledit milieu comprenant au moins une molécule utilisée à titre de substrat enzymatique telle que définie ci avant.
  • Préférentiellement, ledit composé est à une concentration comprise entre 1 et 1000 mg/l, préférentiellement entre 10 et 500 mg/l.
  • Préférentiellement, ledit milieu réactionnel est un milieu de détection et/ou d'identification de microorganismes, ledit milieu comprenant en outre au moins un composé dont le métabolisme entraîne une variation de pH. Préférentiellement ledit composé est un sucre, un acide aminé ou un acide organique. Préférentiellement ledit composé est un pentose, un hexose, un dioside, un trioside ou un polyoside. Préférentiellement, ledit composé est à une concentration comprise entre 0,1 et 100 g/l, préférentiellement entre 1 et 50 g/l. Préférentiellement, ledit composé est à une concentration comprise entre 5 et 30 g/l.
  • Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit milieu de détection et/ou d'identification selon l'invention comprend en outre au moins un autre substrat enzymatique, spécifique d'une activité enzymatique différente de l'activité nitroréductase détectée par la molécule selon l'invention.
  • Le métabolisme enzymatique du ou des autres substrats génère un signal détectable, différent du signal généré par le composé selon l'invention utilisé à titre de substrat enzymatique, comme par exemple des produits colorés ou fluorescents différents, pour permettre la mise en évidence comme la détection et/ou l'identification et/ou la quantification d'un ou plusieurs microorganismes. A titre d'autre substrat spécifique, on peut utiliser tout autre substrat classiquement utilisé dans la détection des microorganismes. La concentration de l'autre substrat enzymatique spécifique est généralement comprise entre 0,01 et 1 g/l. L'homme du métier pourra déterminer facilement une telle concentration en fonction du substrat utilisé. A titre indicatif, il est possible de combiner les composés selon l'invention avec des substrats enzymatiques de peptidase, d'osidase, d'estérase ou de réductase.
  • Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit milieu de détection et/ou d'identification selon l'invention comprend en outre au moins un autre substrat enzymatique spécifique de l'activité nitroréducase. Par le choix particulier de substrats, il est alors possible d'identifier des groupes de microorganismes exprimant une même activité enzymatique. La concentration de l'autre substrat enzymatique spécifique est généralement comprise entre 0,01 et 1 g/l. L'homme du métier pourra déterminer facilement une telle concentration en fonction du substrat utilisé.
  • Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit milieu de détection et/ou d'identification selon l'invention comprend en outre au moins un indicateur métabolique, spécifique d'une activité métabolique différente de celle détectée par le composé selon l'invention.
  • Cet indicateur métabolique peut notamment être une source de Carbone ou d'Azote associée ou non à un réactif révélant son métabolisme.
  • Les exemples ci dessous sont donnés à titre explicatif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention.
    • EXEMPLES Exemple - Utilisation de substrats de formule I selon l'invention pour détecter une activité nitroréductase a) Substrats de nitroréductase
  • Le 2-(4-Nitrostyryl)-1,3,3-trimethyl-indolinium iodé, a été synthétisé à partir de 1,3,3-Triméthyle-indolinium iodé suivant la méthode de Bahner et al. (C. Bahner, J. Dale, J. Fain, E. Franklin, J. Goan, W. Stump, M. West et J. Wilson, Journal of Organic Chemistry, 1957, 22, 1110).
    • b) Préparation du milieu
  • 40 mg du substrat ont été dissous dans 4ml de Diméthylsulfoxide et ajoutés à 400 ml de milieu Columbia préalablement autoclavé. Le milieu a été réparti en boîte de Pétri de 90 mm de diamètre à raison de 20 ml par boîte.
    • c) Ensemencement et incubation
  • Dix souches de micro-organismes issues de collections et appartenant à différentes espèces de bactéries et levures sont ensemencées en spot d'environ 10 000 unités formant colonies.
  • Les milieux sont incubés 24 heures à 37°C, puis les colonies formées sont examinées visuellement.
    • d) Lecture des résultats
  • Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau suivant.
    Croissance Coloration
    E. coli NCTC 10418 ++ -
    S. marcescens NCTC 10211 ++ -
    Ps. aeruginosa NCTC 10662 ++ -
    B. cepacia 1222 + -
    Y. enterocolitica NCTC 11176 ++ -
    S. typhimurium NCTC 74 + -
    C. freundii 46262 (wild) ++ -
    M. morganii 462403 (wild) ++ -
    E. cloacae NCTC 11936 ++ Rose pâle
    P. rettgeri NCTC 7475 ++ Rose pâle
    • e) Conclusions
  • Sur les milieux selon l'invention, il est possible de détecter une activité nitroréductase de micro-organismes E. cloacae et P. rettgeri grâce à la coloration des colonies.
  • Par les différentes variations de structure des substrats de nitroréductase selon l'invention, il est possible de distinguer différents groupes de microorganismes et d'obtenir différentes couleurs de colonies. De plus, la coloration ne diffusant pas dans le milieu réactionnel, il est possible de distinguer et de compter les cellules ou colonies exprimant l'activité nitroréductase indépendamment de celles ne l'exprimant pas

Claims (12)

  1. Utilisation d'un composé de la formule (I) suivante, comme substrat enzymatique pour la détection d'une activité nitroréductase :
    Figure imgb0004
     selon laquelle :
    • W1, W2, W3 et W4 sont indépendamment H, Br, Cl, F, I, alkyle, alkoxy, thiométhyle, perfluoroalkyle, nitro, cyano, carboxyle (incluant ses esters ou amides) ou toute combinaison de ceux-ci.
    • n = 0, 1 ou 2
    • X est NR, CZ5Z6, S ou O, R étant H, alkyle, aralkyle, aryle, alcanoïque ou alkylsulfonique, Z5 et Z6 étant un alkyle
    • Y est N ou N+R, R étant alkyle, aralkyle, aryle, alcanoïque ou alkylsulfonique
    • Z1, Z2, Z3 et Z4 étant indépendamment H, Br, Cl, F, I, alkyle, aryle, alkoxy, perfluoroalkyle, nitro, cyano, carboxyle, sulfonyle, incluant les esters ou amides de carboxyle ou sulfonyle
    et leurs sels.
  2. Utilisation d'un composé de formule (I) suivante, comme substrat enzymatique pour la détection d'une activité nitroréductase et indicateur d'une variation de pH :
    Figure imgb0005
     selon laquelle :
    • W1, W2, W3 et W4 sont indépendamment H, Br, Cl, F, I, alkyle, alkoxy, thiométhyle, perfluoroalkyle, nitro, cyano, carboxyle (incluant ses esters ou amides) ou toute combinaison de ceux-ci
    • n = 0, 1 ou 2
    • X est NR, CZ5Z6, S ou O, R étant H, alkyle, aralkyle, aryle, alcanoïque ou alkylsulfonique, Z5 et Z6 étant un alkyle
    • Y est N ou N+R, R étant alkyle, aralkyle, aryle, alcanoïque ou alkylsulfonique a Z1, Z2, Z3 et Z4 étant indépendamment H, Br, Cl, F, I, alkyle, aryle, alkoxy, perfluoroalkyle, nitro, cyano, carboxyle, sulfonyle, incluant les esters ou amides de carboxyle ou sulfonyle
    et leurs sels.
  3. Utilisation d'un composé de formule (I) selon la revendication 1 ou 2 selon laquelle n = 1.
  4. Utilisation d'un composé de formule (I) selon l'une des revendications précédentes selon laquelle W1, W2, W3 et W4 sont indépendamment H
  5. Utilisation d'un composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications précédentes selon laquelle X est S ou CZ5Z6, préférentiellement CCH3CH3.
  6. Utilisation d'un composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications précédentes selon laquelle Y est N ou N+CH3.
  7. Utilisation d'un composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications précédentes selon laquelle Z1, Z2, Z3 et Z4 sont H.
  8. Utilisation d'un composé de formule (I) selon la revendication 1 ou 2 selon laquelle ledit composé est choisi parmi 2-(4'-Nitrostyryl)-benzothiazole, 2-(4'-Nitrostyryl)-N-methyl-benzothiazolium chloride, 2-(4'-Nitrostyryl)-1,3,3-triméthyl-indolinium dibromide.
  9. Procédé pour la détection chez des micro-organismes d'une activité nitroréductase, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
    a) disposer d'un milieu de détection et/ou d'identification comprenant un composé de formule (I)
    Figure imgb0006
     selon laquelle :
    • W1, W2, W3 et W4 sont indépendamment H, Br, Cl, F, I, alkyle, alkoxy, thiométhyle, perfluoroalkyle, nitro, cyano, carboxyle (incluant ses esters ou amides) ou toute combinaison de ceux-ci
    • n = 0, 1 ou 2
    • X est NR, CZ5Z6, S ou O, R étant H, alkyle, aralkyle, aryle, alcanoïque ou alkylsulfonique, Z5 et Z6 étant un alkyle
    • Y est N ou N+R, R étant alkyle, aralkyle, aryle, akanoïque ou alkylsulfonique
    • Z1, Z2, Z3 et Z4 étant indépendamment H, Br, Cl, F, I, alkyle, aryle, alkoxy, perfluoroalkyle, nitro, cyano, carboxyle, sulfonyle, incluant les esters ou amides de carboxyle ou sulfonyle
    et leurs sels ;
    b) ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester,
    c) laisser incuber, et
    d) révéler la présence d'au moins une activité nitroréductase.
  10. Procédé pour la détection d'une activité nitroréductase chez des microorganismes et d'une variation de pH, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
    a) disposer d'un milieu de détection et/ou d'identification comprenant un composé de formule (I)
    Figure imgb0007
     selon laquelle :
    • W1, W2, W3 et W4 sont indépendamment H, Br, Cl, F, I, alkyle, alkoxy, thiométhyle, perfluoroalkyle, nitro, cyano, carboxyle (incluant ses esters ou amides) ou toute combinaison de ceux-ci
    • n = 0, 1 ou 2
    • X est NR, CZ5Z6, S ou O, R étant H, alkyle, aralkyle, aryle, alcanoïque ou alkylsulfonique, Z5 et Z6 étant un alkyle
    • Y est N ou N+R, R étant alkyle, aralkyle, aryle, alcanoïque ou alkylsulfonique
    • Z1, Z2, Z3 et Z4 étant indépendamment H, Br, Cl, F, I, alkyle, aryle, alkoxy, perfluoroalkyle, nitro, cyano, carboxyle, sulfonyle, incluant les esters ou amides de carboxyle ou sulfonyle
    et leurs sels ;
    b) ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester,
    c) laisser incuber, et
    d) observer un changement de couleur et/ou de fluorescence du milieu de détection et/ou d'identification, révélant la présence d'au moins une activité nitroréductase, et une variation de pH dans ledit milieu.
  11. Milieu de détection et/ou d'identification de microorganismes comprenant un composé de la formule (I) suivante:
    Figure imgb0008
     selon laquelle :
    • W1, W2, W3 et W4, sont indépendamment H, Br, Cl, F, I, alkyle, alkoxy, thiométhyle, perfluoroalkyle, nitro, cyano, carboxyle (incluant ses esters ou amides) ou toute combinaison de ceux-ci.
    • n = 0, 1 ou 2
    • X est NR, CZ5Z6, S ou O, R étant H, alkyle, aralkyle, aryle, alcanoïque ou alkylsulfonique, Z5 et Z6 étant un alkyle
    • Y est N ou N+R, R étant alkyle, aralkyle, aryle, alcanoïque ou alkylsulfonique
    • Z1, Z2, Z3 et Z4 étant indépendamment H, Br, Cl, F, I, alkyle, aryle, alkoxy, perfluoroalkyle, nitro, cyano, carboxyle, sulfonyle, incluant les esters ou amides de carboxyle ou sulfonyle
    et leurs sels.
  12. Milieu de détection et/ou d'identification de microorganismes selon la revendication 11, comprenant en outre au moins un composé dont le métabolisme entraîne une variation de pH dudit milieu, ledit composé étant un sucre, un acide aminé ou un acide organique.
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