CN102482707B - 硝基还原酶的新型酶底物 - Google Patents

硝基还原酶的新型酶底物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及具有式(I)的化合物及其盐在作为检测硝基还原酶活性的酶底物中的用途：其中：W1、W2、W3和W4独立地是H、Br、Cl、F、I、烷基、烷氧基、硫代甲基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基(包括其酯或酰胺)或它们的任意组合；n＝0、1或2；X是NR、CZ5Z6、S或O，R是H、烷基、芳烷基、芳基、烷酰基或烷基磺酰基，Z5和Z6是烷基；Y是N或N+R，R是烷基、芳烷基、芳基、烷酰基或烷基磺酰基；Z1、Z2、Z3和Z4独立地是H、Br、Cl、F、I、烷基、芳基、烷氧基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基、磺酰基，包括羧基或磺酰基的酯或酰胺。

Description

硝基还原酶的新型酶底物
技术领域
本发明涉及用于检测硝基还原酶活性的新型酶底物。这些底物可用在特别是微生物学、生物化学、免疫学、分子生物学、组织学等包括产生物理化学信号的酶还原步骤的应用中。
背景技术
目前存在非常多的能够检测微生物的培养基。该检测可特别地基于特定底物的使用，所述底物对于期待检测的微生物中的酶具有特异性。通常，对酶的合成性底物的制备方式是使底物和它通过靶酶代谢的产物具有不同的物理化学性质，所述性质使得能够将它们区分，并能够评价是否所有或部分的底物已通过酶转化为产物。例如，酶代谢的产物可以是生色或荧光的。由此，在细菌的情况中，通过底物的选择，根据是否存在反应，可表征微生物的性质。硝基还原酶活性可特别地用于鉴定细菌群、属或种。还可将其用于监测微生物的还原性代谢，如与它们的生长或抑制这样的生长相关的还原性代谢。
多年来已知一些细菌具有还原硝基芳族化合物的能力。Asnis(1957)报道了从大肠杆菌提取物中分离黄素蛋白，黄素蛋白能够还原对硝基苯甲酸。从这篇报道开始，在各种生物体中已鉴定出硝基芳基还原酶活性。这包括严格需氧菌如假单胞菌属(Pseudomonas)(Won等人，1974)和诺卡菌属(Nocardia)(Villanueva，1964)、严格厌氧菌如梭菌属(Clostridium)(Ancermaier和Simon，1983)和韦荣氏球菌属(Veillonella)(McCormick等人，1976)或真菌(Masuda和Ozaki，1993)和真核寄生虫(Douch，1975)。存在着一些被指认能够被细菌性硝基芳基还原酶还原的底物。这些底物尤其为硝基芳族化合物，例如对硝基苯甲酸、对硝基苯酚、对硝基苯胺及2，4，6-三硝基甲苯(McCormick等，1976)。
通常通过间接方法如监测底物或共因子的消失对硝基还原酶的酶活性进行检测。例如，Kitamura等人(1983)已研究了对硝基苯甲酸甲酯和一些其他的硝基芳族化合物与大肠杆菌提取物的还原。但是，该方法不是非常灵敏，并且不适于在非均相培养基中的检测。还可提及申请WO 00/28073，其描述了用于直接检测硝基芳基还原酶活性的基于硝基香豆素的荧光底物。该类型的硝基芳族化合物能够在还原后产生较强荧光的化合物，因此该化合物可易于检测。但是，该底物不能很好地适于非均相培养基中的检测。
发明内容
因此，本发明提出对可进行微生物检测的硝基还原酶底物的改进。相对于现有的底物，这些新型底物易于合成，并且可以特别地用于微生物检测的凝胶培养基，因为它们产生在反应培养基中不扩散的颜色。
此外，本发明相对于现有技术的改进在于本发明的化合物可进行的微生物检测，同时显示出硝基还原酶活性和引起培养基的pH变化的代谢。
在进一步描述本发明之前，给出以下定义以有助于本发明的公开。
“酶底物”是指这样的底物，其可被酶改变成允许直接或间接地检测微生物、细胞或细胞器的产物。在硝基还原酶底物的情况中，该底物特别包括硝酸酯官能团，该官能团可被待检测的酶活性部分或全部地还原，这样的硝酸酯官能团的还原改变分子的某些物理化学性质，使得能够监测该还原。
本发明的底物适用于流式细胞术，因为由于其还原产物主要保留在表达酶活性的细胞内，可以特定地对表达该活性的细胞计数，或者甚至将它们从样品的其余部分中分离。
本发明的底物还较好地适用于组织酶学，这是因为由于还原产物主要保留在还原位点处，所以可特异性地鉴定在组织中表达该活性的细胞或细胞器。
由于它们的低毒性，本发明的底物较好地适于对细胞培养物的硝基还原酶活性的监测。
本发明的底物特别良好地适用于培养基的检测和/或鉴定，这是因为它们产生在反应培养基中不扩散的颜色或荧光。在本申请中，术语“颜色”包括在可见光谱中的颜色、光吸收或在某波长(λex)下吸收且在更高波长下
Figure BPA00001498990600031
激发的荧光。
本发明的底物可以是盐化的，即可以为如氯盐、溴盐、碘盐、钾盐或三氟乙酸盐的盐形式。
术语“pH指示剂”应理解是指颜色和/或荧光根据培养基的pH变化而改变的化学物质，所述变化与在所述培养基上生长的微生物的代谢相关或不相关。
“硝基还原酶”应理解是指可全部或部分还原NO2基的酶。
“烷基”应理解是指饱和烃基链，例如特别是C1-C6烷基，即碳原子数为1-6的直链或支链的烷基。例如，可提及甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、异戊基和己基。
“芳基”应理解是指从芳环衍生的官能团(或取代基)，芳环特别是如芳族C6-C10环，尤其是苯基、苯甲基、1-萘基或2-萘基。
“羧基”应理解特别是指由通过双键与第一氧原子连接，并且通过单键与第二氧原子连接的碳原子构成的官能团，第二氧原子带负电荷或与氢原子连接。取决于分子的pKa和培养基的pH，羧基可以是离子化的形式，即不具有与第二氧原子连接的H，其从而是带负电荷的。
“反应培养基”应理解是指这样的培养基，其包含用于微生物、细胞或者细胞器的代谢表达和/或生长所需的所有成分。这样的反应培养基可用于流式细胞术、组织酶学、细胞培养等，或作为用于检测和/或鉴定微生物的培养基。
所述反应培养基可以是固体、半固体或液体。术语“固体培养基”应理解是指例如凝胶培养基。琼脂是用于微生物培养的微生物学常规胶凝剂，但可使用明胶或琼脂糖。一些制品是市售的，如Columbia琼脂、胰酪蛋白胨大豆琼脂、MacConkey琼脂、Sabouraud琼脂或更通常而言描述于Handbook of Microbiological Media(CRC Press)中的那些。
所述反应培养基可包含一种成分或多种组合的成分，例如氨基酸、蛋白胨、碳水化合物、核苷酸、矿物质、维生素、抗生素、表面活性剂、缓冲剂、磷酸盐、铵盐、钠盐、金属盐。
所述培养基还可包含染色剂。例如，可提及伊文思蓝、中性红、羊血(sheep blood)、马血(horse blood)、遮光剂如二氧化钛、硝基苯胺、孔雀绿、亮绿等。
所述反应培养基可以是“检测和/或鉴定培养基”，即是可视化培养基或培养且可视化培养基。在第一种情况中，在接种之前培养微生物，而在第二种情况中，所述检测和/或鉴定培养基还构成培养培养基。
“生物样品”应理解表示这样的临床样品，其源自生物学流体样本或者食物样品、源自任何类型的食物、或源自任何化妆品或药物制剂的化妆品或药物样品。该样品因此可以是液体或固体，并且可以非限制性地提及临床的血液、血浆、尿液或粪便样品，来自鼻子、喉咙、皮肤、伤口或脑脊髓液的样品，来自水或如奶、果汁的饮料、酸奶、肉、蛋、蔬菜、蛋黄酱、奶酪、鱼等的食品样品，由动物饲料而得到的食品样品，例如尤其从骨粉得到的样品。所述样品还可以是取自临床环境、家畜、或食品、化妆品或药物产品的样品。术语“取自某环境的样品”应理解尤其表示表面样品、液体样品、原料样品或产品样品。
术语“样品”因此应理解表示样品本身(药签、粪便、食品等)和从所述样品得到的微生物菌落(如在凝胶培养培养基上分离之后或使用所述样品接种的增菌液)。
出于本发明的目的，术语“微生物”包括细菌、尤其为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌、酵母、霉菌和更通常而言是普通单细胞的、肉眼看不见的生物体，其可以在实验室中增殖和操作。
作为革兰氏阴性菌，可以提及如下属的细菌：假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏杆菌(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、摩根氏菌属(Morganella)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、不动杆菌属(Acinetobacter)、布兰汉氏球菌属(Branhamella)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、伯克氏菌属(Burkholderia)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、气单胞菌属(Aeromonas)、摩拉克氏菌属(Moraxella)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、普罗威登斯菌(Providencia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、产碱菌属(Alcaligenes)、博德特氏菌(Bordetella)、西地西菌属(Cedecea)、欧文氏菌(Erwinia)、泛生菌属(Pantoea)、劳尔氏菌属(Palstonia)、狭长平胞菌(Stenotrophomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas)和军团菌属(Legionella)。
作为革兰氏阳性菌，可以提及如下属的细菌：气球菌属(Aerococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、李斯特菌属(Listeria)、梭菌属(Clostridium)、加德纳菌属(Gardnerella)、考克斯菌属(Kocuria)、乳球菌(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、微球菌(Micrococcus)、Falkamia、兼性双球菌属(Gemella)、小球菌属(Pediococcus)、分支杆菌属(Mycobacterium)和棒状杆菌属(Corynebacterium)。
作为酵母，可以提及如下属的酵母：假丝酵母(Candida)、隐球酵母(Cryptococcus)、糖酵母(Saccharomyces)和毛孢子菌属(Trichosporon)。
优选地，所述微生物属于以下属：埃希氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、肠杆菌属、柠檬酸细菌属、克雷伯氏杆菌、变形杆菌属、普罗威登斯菌属、摩根氏菌属、耶尔森氏菌属、弧菌属、假单胞菌属、放线杆菌属、肠球菌属、葡萄球菌属、链球菌属、李斯特菌属、芽孢杆菌属、假丝酵母、隐球酵母、糖酵母。
对此，本发明涉及下式(I)的化合物及其盐作为检测硝基还原酶活性的的酶底物中的用途：
Figure BPA00001498990600051
其中，
●W1、W2、W3和W4独立地是H、Br、Cl、F、I、烷基、烷氧基、硫代甲基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基(包括其酯或酰胺)或它们的任意组合，
●n＝0、1或2，
●X是NR、CZ5Z6、S或O，R是H、烷基、芳烷基、芳基、烷酰基或烷基磺酰基，Z5和Z6是烷基，
●Y是N或N+R，R是烷基、芳烷基、芳基、烷酰基
Figure BPA00001498990600061
或烷基磺酰基(alkylsulfonique)，
●Z1、Z2、Z3和Z4独立地是H、Br、Cl、F、I、烷基、芳基、烷氧基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基、磺酰基，包括羧基或磺酰基的酯或酰胺。
根据本发明的另一个实施方案涉及如上所述的式(I)的化合物作为检测硝基还原酶活性的酶底物和pH变化的指示剂的用途。
根据本发明的一个优选实施方案，n＝1。
根据本发明的另一个优选实施方案，W1、W2、W3和W4独立地是H。
根据本发明的另一个优选实施方案，X是S或CZ5Z6，优选是CCH3CH3。
根据本发明的另一个优选实施方案，Y是N或N+CH3。
根据本发明的另一个优选实施方案，Z1、Z2、Z3和Z4是H。
根据本发明的又一个优选实施方案，所述化合物选自2-(4’-硝基苯乙烯基)苯并噻唑、2-(4’-硝基苯乙烯基)-N-甲基苯并噻唑鎓氯化物、2-(4’-硝基苯乙烯基)-1，3，3-三甲基吲哚鎓(indolinium)二溴化物。
本发明还涉及检测微生物中的硝基还原酶活性的方法，其特征在于其包括以下步骤：
a)提供检测和/或鉴定培养基，其包含式(I)的化合物及其盐
Figure BPA00001498990600062
其中，
●W1、W2、W3和W4独立地是H、Br、Cl、F、I、烷基、烷氧基、硫代甲基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基(包括其酯或酰胺)或它们的任意组合，
●n＝0、1或2，
●X是NR、CZ5Z6、S或O，R是H、烷基、芳烷基、芳基、烷酰基或烷基磺酰基，Z5和Z6是烷基，
●Y是N或N+R，R是烷基、芳烷基、芳基、烷酰基或烷基磺酰基，
●Z1、Z2、Z3和Z4独立地是H、Br、Cl、F、I、烷基、芳基、烷氧基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基、磺酰基，包括羧基或磺酰基的酯或酰胺。
b)使用待测试的生物样品接种所述培养基，
c)进行温育，和
d)检测至少一种硝基还原酶活性的存在。
根据本发明的另一个实施方案，其还涉及检测微生物中硝基还原酶活性和pH变化的方法，其特征在于其包括以下步骤：
a)提供检测和/或鉴定培养基，其包含上述的式(I)化合物；
b)使用待测试的生物样品接种所述培养基，
c)进行温育，和
d)观察检测和/或鉴定培养基的颜色和/或荧光的变化，检测至少一种硝基还原酶活性的存在和在所述检测和/或鉴定培养基中的pH变化。
根据本发明的一个优选实施方案，n＝1。
根据本发明的另一个优选实施方案，W1、W2、W3和W4独立地是H。
根据本发明的另一个优选实施方案，X是S或CZ5Z6，优选是CCH3CH3。
根据本发明的另一个优选实施方案，Y是N或N+CH3。
根据本发明的另一个优选实施方案，Z1、Z2、Z3和Z4是H。
根据本发明的又一个优选实施方案，所述化合物选自2-(4’-硝基苯乙烯基)苯并噻唑、2-(4’-硝基苯乙烯基)-N-甲基苯并噻唑鎓氯化物、2-(4’-硝基苯乙烯基)-1，3，3-三甲基吲哚鎓二溴化物。
可通过任何本领域技术人员知晓的接种技术进行所述微生物的接种。温育步骤可在期望检测的酶活性为最佳温度下进行，本领域技术人员易于根据要检测的酶活性对此温度进行选择。可通过目测、通过比色计或荧光计进行步骤d)。在步骤d)中，可单独检测硝基还原酶活性的存在，或与至少一种其他的酶活性一起检测。
本发明还涉及用于检测和/或鉴定微生物的培养基，其包含下式(I)的化合物及其盐：
Figure BPA00001498990600081
其中，
●W1、W2、W3和W4独立地是H、Br、Cl、F、I、烷基、烷氧基、硫代甲基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基(包括其酯或酰胺)或它们的任意组合，
●n＝0、1或2，
●X是NR、CZ5Z6、S或O，R是H、烷基、芳烷基、芳基、烷酰基或烷基磺酰基，Z5和Z6是烷基，
●Y是N或N+R，R是烷基、芳烷基、芳基、烷酰基或烷基磺酰基，
●Z1、Z2、Z3和Z4独立地是H、Br、Cl、F、I、烷基、芳基、烷氧基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基、磺酰基，包括羧基或磺酰基的酯或酰胺。
根据本发明的一个优选实施方案，n＝1。
根据本发明的另一个优选实施方案，W1、W2、W3和W4独立地是H。
根据本发明的另一个优选实施方案，X是S或CZ5Z6，优选是CCH3CH3。
根据本发明的另一个优选实施方案，Y是N或N+CH3。
根据本发明的另一个优选实施方案，Z1、Z2、Z3和Z4是H。
根据本发明的又一个优选实施方案，所述化合物选自2-(4’-硝基苯乙烯基)苯并噻唑、2-(4’-硝基苯乙烯基)-N-甲基苯并噻唑鎓氯化物、2-(4’-硝基苯乙烯基)-1，3，3-三甲基吲哚鎓二溴化物。
优选地，所述反应培养基是用于检测和/或鉴定微生物的培养基，所述培养基包含至少一种用作上述酶底物的分子。
优选地，所述化合物的浓度在1-1000mg/l之间，优选在10-500mg/l之间。
优选地，所述反应培养基是用于检测和/或鉴定微生物的培养基，所述培养基还包含至少一种因代谢而造成pH变化的化合物。优选地，所述化合物是糖、氨基酸或有机酸。优选地，所述化合物是戊糖、己糖、二糖、三糖或多糖。
优选地，所述化合物的浓度在0.1-100mg/l之间，优选在1-50mg/l之间。优选地，所述化合物的浓度在5-30mg/l之间。
根据本发明的一个具体实施方案，本发明的检测和/或鉴定培养基还包含至少一种其他的酶底物，其对于不同于通过本发明的分子检测的硝基还原酶的活性的酶活性具有特异性。
所述其他底物的酶代谢产生可检测的信号，其不同于由本发明用作酶底物的化合物所产生的信号，如不同的着色或荧光的产物，以使对一种或多种微生物的检测和/或鉴定和/或定量能够可视化。对于其他特异性的底物，可使用任意的常规用于微生物检测的其他底物。所述其他的特异性酶底物的浓度通常在0.01-1g/l之间。根据所使用的底物，本领域技术人员能够容易地确定该浓度。例如，可将本发明的化合物与肽酶、氧化酶(osidase)、酯酶或还原酶的底物联用。
根据本发明的一个具体实施方案，根据本发明的所述检测和/或鉴定培养基还包含至少一种对硝基还原酶活性具有特异性的其他酶底物。通过对底物的特定选择，则可鉴定出表达相同酶活性的微生物群。所述其他的特异性酶底物的浓度通常在0.01-1g/l之间。根据所使用的底物，本领域技术人员能够容易地确定该浓度。
根据本发明的一个具体实施方案，根据本发明的所述检测和/或鉴定培养基还包含至少一种代谢指示剂，其对于不同于通过本发明的化合物检测的代谢活性具有特异性。
该代谢指示剂可以特别是与检测该代谢的试剂相关或不相关的碳源或氮源。
以下以说明的方式给出实施例，并且所述实施例是非限制性的。所述实施例可以更好地理解本发明。
实施例
实施例-使用本发明的式I的底物检测硝基还原酶的活性
a)硝基还原酶底物
根据Bahner等人(C.Bahner，J.Dale，J.Fain，E.Franklin，J.Goan，W.Stump，M.West和J.Wilson，Journal of Organic Chemistry，1957，22，1110)的方法从碘化的1，3，3-三甲基吲哚鎓合成碘化的2-(4-硝基苯乙烯基)-1，3，3-三甲基吲哚鎓。
b)培养基的制备
将40mg底物溶于4ml二甲亚砜中，并加至400ml预先经高压处理的Columbia培养基中。将培养基以20ml/培养皿的比例分配入直径90mm的培养皿中
c)接种和温育
将10株得自保藏品且属于不同种类的细菌和酵母的微生物菌种以约10,000个菌落形成单位的菌斑进行接种。
将培养基在37℃下温育24小时，然后目测所形成的菌落。
d)读取结果
下表中给出所得结果。
Figure BPA00001498990600101
e)结论
凭借本发明的培养基，在菌落颜色的辅助下可检测微生物：阴沟肠杆菌和雷氏普罗威登斯菌的硝基还原酶的活性。
使用本发明的硝基还原酶底物的各种结构变化，可区分不同的微生物群，并且可以得到不同的菌落颜色。此外，由于该颜色不在反应培养基中扩散，因此可区分表达所述硝基还原酶活性的细胞或菌落与不表达的那些细胞或菌落，并且可对所述细胞或者菌落进行计数。

Claims (6)

1.下式(I)的化合物及其盐作为检测硝基还原酶活性的酶底物的用途：
Figure FDA0000393959460000011
其中，
·W1、W2、W3和W4独立地是H，
·n=1，
·X是CZ5Z6或S，Z5和Z6是CH3，
·Y是N或N+CH3，
·Z1、Z2、Z3和Z4独立地是H。
2.根据权利要求1所述的式(I)化合物的用途，其中所述化合物选自2-(4’-硝基苯乙烯基)苯并噻唑、2-(4’-硝基苯乙烯基)-N-甲基苯并噻唑鎓氯化物、2-(4’-硝基苯乙烯基)-1,3,3-三甲基吲哚鎓二溴化物。
3.检测微生物中的硝基还原酶活性的方法，其特征在于其包括以下步骤：
a)提供检测和/或鉴定培养基，其包含式(I)的化合物及其盐
Figure FDA0000393959460000012
其中，
·W1、W2、W3和W4独立地是H，
·n=1，
·X是CZ5Z6或S，Z5和Z6是CH3，
·Y是N或N+CH3，
·Z1、Z2、Z3和Z4独立地是H，
b)使用待测试的生物样品接种所述培养基，
c)进行温育，和
d)检测至少一种硝基还原酶活性的存在。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述化合物选自2-(4’-硝基苯乙烯基)苯并噻唑、2-(4’-硝基苯乙烯基)-N-甲基苯并噻唑鎓氯化物、2-(4’-硝基苯乙烯基)-1,3,3-三甲基吲哚鎓二溴化物。
5.用于检测和/或鉴定微生物的培养基，其包含下式(I)的化合物及其盐：
Figure FDA0000393959460000021
其中，
·W1、W2、W3和W4独立地是H，
·n=1，
·X是CZ5Z6或S，Z5和Z6是CH3，
·Y是N或N+CH3，
·Z1、Z2、Z3和Z4独立地是H。
6.根据权利要求5所述的培养基，其中所述化合物选自2-(4’-硝基苯乙烯基)苯并噻唑、2-(4’-硝基苯乙烯基)-N-甲基苯并噻唑鎓氯化物、2-(4’-硝基苯乙烯基)-1,3,3-三甲基吲哚鎓二溴化物。
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