CN102482704A - 新的肽酶底物 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明涉及新的化合物,其可用作pH指示剂和/或用作检测肽酶活性的酶底物。这些底物可用于包括产生物理化学信号的酶促水解步骤的应用中,特别用于微生物学、生物化学、免疫学、分子生物学、组织学等中。本发明还涉及包含所述底物的反应培养基、所述底物或者所述培养基用于检测肽酶活性和/或区分革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌的用途,还涉及使用方法。
背景技术
目前已有大量用于检测微生物的培养基。这种检测具体地可基于使用对期望检测的微生物的酶具有特异性的特定底物。一般而言,制备酶的合成底物以使该底物与其靶酶代谢的产物具有不同的物理化学性质,从而可区分它们,并且评价是否全部或者部分的底物已被酶转化成产物。水解酶底物通常由对要显示的酶活性特异性的第一部分以及用作标记物的第二部分(通常是发色或者发荧光的)组成。因此,在细菌的情况中,通过选择底物,根据是否存在反应,可表征微生物的性质。肽酶活性可具体用来显示细菌的群、属或者种。因此,例如,丙氨酸-氨肽酶活性使得可以区分革兰氏阴性细菌与革兰氏阳性细菌。
用于检测肽酶活性的酶发色底物是本领域已知的。可具体提及的是Manafi的文章(Manafi等人,Microbiol Rev 55(3):335-348,1991),这是关于用于微生物学的酶底物的综述。但是,所述的氨肽酶底物通过水解释放扩散于培养基中的化合物(β-萘基胺,7-氨基-4-甲基香豆素)。因此,在非均相反应培养基(培养皿上的菌落、组织切片等)中,不可能准确定位水解的位置。还可提及由本申请人提交的专利申请WO 98/04735和WO 99/38995中所述的底物。但是,虽然这些底物少量扩散于培养基中,但是它们具有某些缺点:它们难以合成,纯度低,收率低,并且它们对某些微生物具有毒性。
发明内容
因此,本发明提出新的化合物的用途,其用作pH指示剂,或者用作肽酶底物,能够用来检测微生物。较之现有的底物,这些新的化合物易于合成,并且可具体地用于凝胶化的培养基中来检测微生物,因为它们产生的显色在反应培养基中少量或者根本不扩散。在用作酶底物的情况中,这使得能够在不表达肽酶活性的其他菌落或细胞器中准确地定位表达肽酶活性的菌落或者细胞器。
在进一步描述本发明之前,为了便于公开本发明而作出以下定义。
术语“酶底物”是指这样底物,其可被酶水解成允许直接或间接地检测微生物、细胞或细胞器的产物。所述底物具体地包含对要显示的酶活性特异性的第一部分以及用作标记物的第二部分。
本发明的用作底物的化合物适合用于流式细胞术,由于水解的产物主要保持位于表达酶活性的细胞中,因此可特异性地对表达此活性的细胞进行计数,乃至将它们从样品的其余部分分离。
本发明的用作底物的化合物还非常适合用于组织酶学,由于水解的产物主要保持在水解的位置处,因此可特异性地鉴定在组织内表达此活性的细胞或者细胞器。
本发明的化合物由于它们的低毒性而非常适合分别用作pH指示剂,或者监测细胞培养物中的肽酶活性。
本发明的化合物特别适合用于检测和/或鉴定培养基,因为它们产生不扩散于反应培养基中的显色或者荧光。
在本发明中,术语“显色”涵盖染色、吸收可见光谱的光或者荧光,以及在一种波长吸收(λex)并在更高的波长发射(λem,λem>λex)。
本发明的化合物可成盐,即为盐的形式,例如,氯化物、溴化物、碘化物或者三氟乙酸盐。
术语“pH指示剂”是指颜色和/或荧光随着培养基的pH改变而改变的化学物质,其中所述pH改变任选地与在所述培养基上生长的微生物的代谢相关。
术语“肽酶”是指能够通过水解切割肽的酰基残基与伯胺之间形成的酰胺基团的酶。术语“氨肽酶”是指能够通过水解切割氨基酸的酰基与伯胺之间形成的酰胺基团的酶。在本申请中,术语“肽酶”可适当地表示以上定义的肽酶和氨肽酶。
术语“肽”是指包含1-10个氨基酸,优选1-4个氨基酸的肽链。优选地,所述肽是二丙氨酸或者三丙氨酸。术语“氨基酸”是指本领域技术人员已知的任何天然的或者非天然的氨基酸。根据本发明的一具体实施方案,所述氨基酸是β-丙氨酸或L-丙氨酸或D-丙氨酸,或者甘氨酸、焦谷氨酰基等。
所述肽可包含在其N末端的封端剂。本发明的封端剂包括本领域技术人员已知的能够保护胺的任何封端剂。作为实例,可提及叔丁氧羰基(N-tBOC)、9-芴基氧基羰基、增溶剂如琥珀酰基,或者不可代谢的氨基酸,即非天然的氨基酸如2-哌啶酸,或者氨基酸的D形式如D-苯丙氨酸。封端剂并非系统地存在于本发明的化合物中。
术语“烷基基团”是指基于饱和烃基团的链,具体而言,例如,C1-C6烷基,即含有1-6个碳原子的直链或支链的烷基。作为实例,可提及甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、异戊基和己基。
术语“芳基基团”是指衍生自芳香族核,具体而言,例如C6-C10芳香族核的官能团(或取代基),特别是苯基、苄基、1-萘基或者2-萘基。
术语“羧基基团”是指,具体而言,由通过双键与第一氧原子键合并通过单键与第二氧原子键合的碳原子组成的官能团,其本身带负电荷或者与氢原子相连。取决于分子的pKa和培养基的pH,羧基基团可以是电离的形式,即不含有与第二氧原子相连的H,由此带负电荷。
术语“反应培养基”是指这样的培养基,其包含微生物、细胞或者细胞器的代谢表达和/或生长所需的所有组分。反应培养基可用于流式细胞术、组织酶学、细胞培养等,或者用作检测和/或鉴定微生物的培养基。
所述反应培养基可包含一种或者多种组分的组合,例如,氨基酸、胨、糖、核苷酸、矿物质、维生素、抗生素、表面活性剂、缓冲剂、磷酸盐、铵盐、钠盐或者金属盐。
所述培养基还可包含染料。作为染料的实例,可提及伊文思蓝、中性红、羊血、马血、遮光剂如氧化钛、硝基苯胺、孔雀石绿、亮绿等。
所述反应培养基可以是固体、半固体或者液体。术语“固体培养基”是指,例如凝胶化的培养基。琼脂是常规的凝胶剂,在微生物学中用于培养微生物,但是可使用明胶或者琼脂糖。可商购获得某些配制品,例如,Columbia琼脂、Trypcase-soy琼脂、MacConkey琼脂、Sabouraud琼脂,或者,更概括地,Handbook of Microbiological Media(CRC Press)中所述的那些。
所述反应培养基可以是检测和/或鉴定培养基,即,显示培养基或者培养且显示的培养基。在第一种情况中,微生物的培养在接种之前进行;在第二种情况中,检测和/或鉴定培养基也构成培养基。
术语“生物学样品”是指临床样品,其来源于生物学流体的样本或者食物样品,来源于任何类型的食物,或者来源于任何化妆品或药物制剂的化妆品或药物样品。因此,样品可以是液体或者固体,并且可非限制性地提及,血液、血浆、尿液或粪便的临床样品,鼻、咽喉、皮肤、伤口或者脑脊髓流体样本的临床样品,来自水、饮料如乳品或果汁、酸奶、肉类、蛋类、蔬菜、蛋黄酱、奶酪、鱼类等的食物样品;来源于动物饲料的食物样品,具体而言,例如来源于动物食物的样品。所述样品还可来源于临床环境样本、家畜样本,或者食物、化妆品或药物生产的样本。术语“环境样本”具体是指表面、液体、原料或者产品的样本。因此,术语“样品”是指样本本身(拭子、粪便、食物等)和由所述样本而得的微生物菌落(例如在凝胶化的培养基上分离后),或者包含由所述样本而得的微生物的培养基(例如用所述样本接种的富集培养液)。
对于本发明,术语“微生物”涵盖细菌、酵母、霉菌,更概括而言,有机体,其通常是单细胞的有机体,并且是裸眼不可见的,可在实验室中对其进行倍增或者操作。
作为革兰氏阴性细菌,可提及以下属的细菌:假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形菌属(Proteus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、嗜血菌属(Haemophilus)、摩根氏菌属(Morganella)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、不动杆菌属(Acinetobacter)、布兰汉氏球菌属(Branhamella)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、气单胞菌属(Aeromonas)、莫拉氏菌属(Moraxella)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、普罗威登斯菌属(Providencia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、产碱菌属(Alcaligenes)、博德特氏菌属(Bordetella)、西地西菌属(Cedecea)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas)和军团菌属(Legionella)。
作为革兰氏阳性细菌,可提及以下属的细菌:气球菌属(Aerococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、利斯特氏菌属(Listeria)、梭菌属(Clostridium)、加德纳氏菌属(Gardnerella)、库克菌属(Kocuria)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、微球菌属(Micrococcus)、Falkamia、孪生球菌属(Gemella)、片球菌属(Pediococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)和棒杆菌属(Corynebacterium)。
作为酵母,可提及以下属的酵母:假丝酵母属(Candida)、隐球菌属(Cryptococcus)、酵母属(Saccharomyces)和丝孢酵母属(Trichosporon)。
优选地,所述微生物选自:大肠杆菌(Escherichia coli)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。
在此方面,本发明涉及式(I)的化合物及其盐作为检测肽酶活性和/或pH变化的酶底物的用途:
其中:
●Y1是肽、H或者烷基;
●W1、W2、W3和W4独立地为H、Br、Cl、F、I、烷基、烷氧基、硫代甲基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基(包括其酯或酰胺)、或者上述基团的任何组合;
●n=0、1或者2;
●U和V是N、N+R或者CZ4,R是H、烷基、芳烷基、芳基、烷酰基或者烷基磺酰基。优选地,若U是CZ4,则V是N或者N+R;若V是CZ4,则U是N或者N+R;
●Z1、Z2、Z3和Z4独立地为H、Br、Cl、F、I、烷基、芳基、烷氧基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基、磺酰基,包括该羧基或者磺酰基的酯或者酰胺。
当所述式(I)的化合物仅用于检测pH变化时,Y1是H或者烷基。
当所述式(I)的化合物用于检测肽酶活性时,Y1是肽。
当所述式(I)的化合物用于检测肽酶活性和pH变化时,Y1是肽。
根据本发明的一优选实施方案,Y1是肽,优选选自甘氨酸和丙氨酸,优选丙氨酸。
根据本发明的一优选实施方案,n=1。
根据本发明的一优选实施方案,W1、W2、W3和W4独立地为H。
根据本发明的一优选实施方案,U是CZ4,优选CH。
根据本发明的一优选实施方案,V是N+R,优选N+CH3。
根据本发明的一优选实施方案,Z1、Z2、Z3和Z4是H。
根据本发明的一优选实施方案,所述化合物选自:甘氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鎓氯化物、L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鎓TFA、β-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鎓氯化物和L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)高氯酸吡啶(未被季铵化)。
根据本发明的一优选实施方案,
●所述肽是丙氨酸;
●n=1;
●W1、W2、W3和W4独立地为H;
●U是CZ4,优选CH;
●V是N+R,优选N+CH3;
●Z1、Z2、Z3和Z4是H。
本发明还涉及检测微生物中的肽酶活性和/或pH变化的方法,其特征在于所述方法包括以下步骤,或者由以下步骤组成:
a)提供检测和/或鉴定培养基,其包含式(I)的化合物及其盐:
其中:
●Y1是肽、H或者烷基;
●W1、W2、W3和W4独立地为H、Br、Cl、F、I、烷基、烷氧基、硫代甲基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基(包括其酯或酰胺)、或者上述基团的任何组合;
●n=0、1或者2;
●U和V是N、N+R或者CZ4,R是H、烷基、芳烷基、芳基、烷酰基或者烷基磺酰基。优选地,若U是CZ4,则V是N或者N+R;若V是CZ4,则U是N或者N+R;
●Z1、Z2、Z3和Z4独立地为H、Br、Cl、F、I、烷基、芳基、烷氧基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基、磺酰基,包括该羧基或者磺酰基的酯或者酰胺;
b)用要测试的生物学样品接种所述培养基;
c)进行温育;以及
d)显示至少一种肽酶活性或者pH变化的存在。
所述微生物的接种可按照本领域技术人员已知的任何接种技术进行。温育步骤可在期望检测的酶活性最佳的温度下进行,本领域技术人员可容易地根据要检测的酶活性进行选择。步骤d)可通过视觉检查或者比色法或者荧光测定法进行。在步骤d)中,可显示肽酶活性或者pH变化的存在,单独或者与至少一种其他酶活性组合。
当所述方法是仅检测pH变化的方法时,Y1是H或者烷基。
当所述方法是检测微生物中的肽酶活性的方法时,Y1是肽。
当所述方法是检测微生物中的肽酶活性和pH变化的方法时,Y1是肽。
根据本发明的一优选实施方案,Y1是肽,优选选自甘氨酸和丙氨酸,优选丙氨酸。
根据本发明的一优选实施方案,n=1。
根据本发明的一优选实施方案,W1、W2、W3和W4独立地为H。
根据本发明的一优选实施方案,U是CZ4,优选CH。
根据本发明的一优选实施方案,V是N+R,优选N+CH3。
根据本发明的一优选实施方案,Z1、Z2、Z3和Z4是H。
根据本发明的一优选实施方案,所述化合物选自:甘氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鎓氯化物、L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鎓TFA、β-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鎓氯化物和L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)高氯酸吡啶(未被季铵化)。
根据本发明的一优选实施方案,
●所述肽是丙氨酸;
●n=1;
●W1、W2、W3和W4独立地为H;
●U是CZ4,优选CH;
●V是N+R,优选N+CH3;
●Z1、Z2、Z3和Z4是H。
优选地,所述微生物选自:大肠杆菌、粘质沙雷氏菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌和粪肠球菌。
本发明还涉及区分细菌属于革兰氏阳性细菌或者革兰氏阴性细菌的方法,其特征在于所述方法包括以下步骤,或者由以下步骤组成:
a)提供检测和/或鉴定培养基,其包含式(I)的化合物及其盐作为检测肽酶活性和/或pH变化的酶底物:
其中:
●Y1是肽、H或者烷基;
●W1、W2、W3和W4独立地为H、Br、Cl、F、I、烷基、烷氧基、硫代甲基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基(包括其酯或酰胺)、或者上述基团的任何组合;
●n=0、1或者2;
●U和V是N、N+R或者CZ4,R是H、烷基、芳烷基、芳基、烷酰基或者烷基磺酰基。优选地,若U是CZ4,则V是N或者N+R;若V是CZ4,则U是N或者N+R;
●Z1、Z2、Z3和Z4独立地为H、Br、Cl、F、I、烷基、芳基、烷氧基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基、磺酰基,包括该羧基或者磺酰基的酯或者酰胺;
b)用要测试的生物学样品接种所述培养基;
c)进行温育;以及
d)显示至少一种肽酶活性的存在。
如上所述,所述微生物的接种可按照本领域技术人员已知的任何接种技术进行。温育步骤可在期望检测的酶活性最佳的温度下进行,本领域技术人员可容易地根据要检测的酶活性进行选择。步骤d)可通过视觉检查或者比色法或者荧光测定法进行。在步骤d)中,可显示肽酶活性的存在,单独或者与其他酶活性组合。在某些情况中,可有利地在酸如乙酸的存在下进行步骤d)。
当所述方法是仅检测pH变化的方法时,Y1是H或者烷基。
当所述方法是检测微生物中的肽酶活性的方法时,Y1是肽。
当所述方法是检测微生物中的肽酶活性和pH变化的方法时,Y1是肽。
根据本发明的一优选实施方案,Y1是肽,优选选自甘氨酸和丙氨酸,优选丙氨酸。
根据本发明的一优选实施方案,n=1。
根据本发明的一优选实施方案,W1、W2、W3和W4独立地为H。
根据本发明的一优选实施方案,U是CZ4,优选CH。
根据本发明的一优选实施方案,V是N+R,优选N+CH3。
根据本发明的一优选实施方案,Z1、Z2、Z3和Z4是H。
根据本发明的一优选实施方案,所述化合物选自:甘氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鎓氯化物、L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鎓TFA、β-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鎓氯化物和L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)高氯酸吡啶(未被季铵化)。
根据本发明的一优选实施方案,
●所述肽是丙氨酸;
●n=1;
●W1、W2、W3和W4独立地为H;
●U是CZ4,优选CH;
●V是N+R,优选N+CH3;
●Z1、Z2、Z3和Z4是H。
优选地,所述微生物选自:大肠杆菌、粘质沙雷氏菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌和粪肠球菌。
本发明还涉及用于检测和/或鉴定微生物的培养基,其包含用于检测肽酶活性和/或pH变化的式(I)的化合物及其盐:
其中:
●Y1是肽、H或者烷基;
●W1、W2、W3和W4独立地为H、Br、Cl、F、I、烷基、烷氧基、
硫代甲基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基(包括其酯或酰胺)、或者上述基团的任何组合;
●n=0、1或者2;
●U和V是N、N+R或者CZ4,R是H、烷基、芳烷基、芳基、烷酰基或者烷基磺酰基。优选地,若U是CZ4,则V是N或者N+R;若V是CZ4,则U是N或者N+R;
●Z1、Z2、Z3和Z4独立地为H、Br、Cl、F、I、烷基、芳基、烷氧基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基、磺酰基,包括该羧基或者磺酰基的酯或者酰胺。
当所述培养基是仅用于检测pH变化的培养基时,Y1是H或者烷基。
当所述培养基是用于检测肽酶活性的培养基时,Y1是肽。
当所述培养基是用于检测肽酶活性和pH变化的培养基时,Y1是肽。
根据本发明的一优选实施方案,Y1是肽,优选选自甘氨酸和丙氨酸,优选丙氨酸。
根据本发明的一优选实施方案,n=1。
根据本发明的一优选实施方案,W1、W2、W3和W4独立地为H。
根据本发明的一优选实施方案,U是CZ4,优选CH。
根据本发明的一优选实施方案,V是N+R,优选N+CH3。
根据本发明的一优选实施方案,Z1、Z2、Z3和Z4是H。
根据本发明的一优选实施方案,所述化合物选自:甘氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鎓氯化物、L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鎓TFA、β-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鎓氯化物和L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)高氯酸吡啶(未被季铵化)。
根据本发明的一优选实施方案,
●所述肽是丙氨酸;
●n=1;
●W1、W2、W3和W4独立地为H;
●U是CZ4,优选CH;
●V是N+R,优选N+CH3;
●Z1、Z2、Z3和Z4是H。
优选地,所述微生物选自:大肠杆菌、粘质沙雷氏菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌和粪肠球菌。
优选地,所述反应培养基是用于检测和/或鉴定微生物的培养基,所述培养基包含至少一种如上定义的用作酶底物或者pH指示剂的分子。
优选地,所述化合物,酶底物或者pH指示剂的浓度为1-1000mg/l,优选10-500mg/l。
根据本发明的一具体实施方案,本发明所述的检测和/或鉴定培养基还包含至少一种其他酶底物,所述其他酶底物对除了由本发明的分子检测的肽酶活性之外的酶活性具有特异性。
根据本发明的另一具体实施方案,本发明所述的检测和/或鉴定培养基还包含至少一种对除了由pH变化证实的酶活性之外的酶活性具有特异性的底物。
所述其他底物的酶促代谢产生可检测的信号,该信号不同于由本发明的用作酶底物或者pH指示剂的化合物产生的信号,例如,不同的显色产物或者荧光产物,由此能够证实(例如检测和/或鉴定和/或量化)一种或多种微生物。作为其他特异性底物,可使用常规用于检测微生物的任何其他底物。所述其他特异性酶底物的浓度通常为0.01-1g/l。本领域技术人员能够容易地根据所用的底物确定这样的浓度。作为示例,可将本发明的化合物与肽酶、糖苷酶、酯酶或者还原酶的酶底物组合。具体地,可将本发明的底物(其中所述肽是β-丙氨酸)与糖苷酶底物(如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷或者茜素-β-半乳糖苷)组合。还可将本发明的底物(其中所述肽是L-丙氨酸)与酯酶底物(如5-溴-6-氯-3-吲哚氧基辛酸酯或者5-溴-3-吲哚氧基磷酸酯)组合。
根据本发明的一具体实施方案,本发明所述的检测和/或鉴定培养基还包含至少一种对所述肽酶活性具有特异性或者对由本发明的用作pH指示剂的化合物检测的酶活性具有特异性的其他酶底物。因此,通过特别地选择底物,可鉴定表达相同酶活性的微生物群。所述其他特异性酶底物的浓度通常是0.01-1g/l。本领域技术人员能够容易地根据所用的底物确定这样的浓度。具体地,可将本发明的底物(其中所述肽是L-丙氨酸)与申请WO2006030119中所述的L-丙氨酸-氨肽酶底物(如L-丙氨酸-戊基-resorufamine)组合。
根据本发明的一具体实施方案,本发明所述的检测和/或鉴定培养基还包含至少一种代谢指示剂,所述代谢指示剂对除了由本发明的用作底物或者pH指示剂的化合物检测的代谢活性之外的代谢活性具有特异性。
此代谢指示剂具体地可以是任选地与显示其代谢的试剂组合的碳源或氮源。根据一具体实施方案,所述碳源或者氮源与除了本发明的用于此方面的化合物之外的pH指示剂组合。根据另一具体实施方案,所述碳源或者氮源与阳离子组合。根据另一具体实施方案,所述代谢指示剂使得可以检测色氨酸酶活性,并且将色氨酸与使得可以检测吲哚的产生的试剂组合。
实施例
作为实例给出以下实施例。
实施例1底物合成
4-(4’-氨基苯乙烯基)吡啶按照Royer(R.Royer,Joumal of the ChemicalSociety,1947,560-561)的方法制得。
为了获得具有保护的氨基酸的4-(4’-氨基苯乙烯基)芳基,按照混合酸酐法进行这些化合物的氨酰基化。
以与上述相似的方式获得的典型底物的另一实例:
二氯化的甘氨酸-N-甲基-4-(4’-氨基苯乙烯基)吡啶鎓。
1H-NMR:(DMSO)δ3.83(2H,s,>CH2),4.25(3H,s,NCH3),7.43(1H,d,J=16Hz,=CH-),7.78(4H,s,Ar-H),7.99(1H,d,J=16Hz,=CH-),8.18(2H,d,J=5Hz,Py-H),8.28(1H,宽s,>NH),8.87(2H,d,J=5Hz,Py-H)。
实施例2使用本发明的式I的底物检测pH变化
a)pH指示剂
按照实施例1中所述合成4-4’-氨基苯乙烯基吡啶。
b)配制培养基
将以下培养基高压灭菌,然后以20ml/培养皿的比例分配入直径90mm的培养皿中。
c)接种和温育
通过对10μl的悬浮液(0.5McFarland稀释至1/20)实施四区划线法,将来源于NCTC保藏并属于不同细菌种的7种微生物菌株接种在这些培养基上。使培养基在37℃下温育24小时,然后视觉检查形成的菌落。
d)读取的结果
所得的结果示于表1中。
表1:本发明的pH指示剂存在下的菌落颜色
本发明的培养基使得可以潜在地区分4种微生物群体(本实验中测试的菌株中的3种),根据它们是否通过乳糖和/或蔗糖代谢酸化培养基:pH指示剂变成黄色;以及它们是否水解5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-吡喃葡糖苷:菌落显蓝色。属于肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌和产气肠杆菌菌种并表达这2种活性的菌落呈现绿色(黄色和蓝色的混合);而属于大肠杆菌和弗氏柠檬酸杆菌菌种并通过乳糖和/或蔗糖代谢酸化培养基的那些菌落呈现黄色,属于摩氏摩根氏菌和波伊德志贺氏菌菌种并且这2种活性都不表达的那些菌落为无色。
实施例3本发明的式I的底物用于检测肽酶活性
a)肽酶底物
如实施例1中所述合成β-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鎓氯化物(β-Ala-ASPM+)。
b)配制培养基
将40mg的每种底物溶于4ml二甲亚砜(80mg,对于Asn-ASQM+)中,然后加入至400ml的预先高压灭菌的Columbia培养基中。将6份培养基以20ml/培养皿的比例分配入直径90mm的培养皿中。
c)接种和温育
将来源于保藏中心并属于不同细菌和酵母菌种的17种微生物菌株以约10000菌落形成单位多点接种。
使培养基在37℃下温育24小时,然后在添加或未添加酸的情况下,在365nm的UV灯下视觉检查形成的菌落。
d)读取的结果
所得的结果示于表2中。
表2:本发明的肽酶底物存在下的菌落颜色
Grow.:生长;Fluo.:菌落的荧光;Col.:菌落的显色;
NG:无生长;0.5:弱生长;1:中等生长;2:良好生长;-:无颜色/荧光
e)结论
通过本发明的培养基,可借助于菌落的荧光或显色检测微生物的肽酶活性。
本发明的底物允许任何类型的微生物生长:革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、酵母等。
借助于本发明的肽酶底物的各种结构变化,可区分不同的微生物群。此外,因为颜色不在反应培养基中扩散,所以可区分表达所述肽酶活性的细胞或菌落与不表达的那些细胞或菌落,并且可对所述细胞或者菌落进行计数。
Claims (11)
2.如权利要求1所述的式I的化合物的用途,其中Y1是肽,优选选自丙氨酸和甘氨酸。
3.如权利要求1或2所述的式I的化合物的用途,其中n=1。
4.如权利要求1-3中任一项所述的式I的化合物的用途,其中W1、W2、W3和W4独立地为H。
5.如权利要求1-4中任一项所述的式I的化合物的用途,其中U是CZ4,优选CH。
6.如权利要求1-5中任一项所述的式I的化合物的用途,其中V是N+R,优选N+CH3。
7.如权利要求1-6中任一项所述的式I的化合物的用途,其中Z1、Z2、Z3和Z4是H。
8.如权利要求1所述的式I的化合物的用途,其中所述化合物选自甘氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鎓氯化物、L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鎓TFA、β-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶鎓氯化物和L-丙氨酰基-4-(4’-酰氨基苯乙烯基)高氯酸吡啶(未被季铵化)。
9.检测微生物中的肽酶活性和/或pH变化的方法,其特征在于所述方法包括以下步骤:
a)提供检测和/或鉴定培养基,其包含式(I)的化合物及其盐:
其中:
●Y1是肽、H或者烷基;
●W1、W2、W3和W4独立地为H、Br、Cl、F、I、烷基、烷氧基、硫代甲基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基(包括其酯或酰胺)、或者上述基团的任何组合;
●n=0、1或者2;
●U和V是N、N+R或者CZ4,R是H、烷基、芳烷基、芳基、烷酰基或者烷基磺酰基;
●Z1、Z2、Z3和Z4独立地为H、Br、Cl、F、I、烷基、芳基、烷氧基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基、磺酰基,包括该羧基或者磺酰基的酯或者酰胺;
b)用要测试的生物学样品接种所述培养基;
c)进行温育;以及
d)显示至少一种肽酶活性或者pH变化的存在。
10.区分细菌属于革兰氏阳性细菌或者革兰氏阴性细菌的方法,其特征在于所述方法包括以下步骤:
a)提供检测和/或鉴定培养基,其包含式(I)的化合物及其盐:
其中:
●Y1是肽、H或者烷基;
●W1、W2、W3和W4独立地为H、Br、Cl、F、I、烷基、烷氧基、硫代甲基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基(包括其酯或酰胺)、或者上述基团的任何组合;
●n=0、1或者2;
●U和V是N、N+R或者CZ4,R是H、烷基、芳烷基、芳基、烷酰基或者烷基磺酰基;
●Z1、Z2、Z3和Z4独立地为H、Br、Cl、F、I、烷基、芳基、烷氧基、全氟烷基、硝基、氰基、羧基、磺酰基,包括该羧基或者磺酰基的酯或者酰胺;
b)用要测试的生物学样品接种所述培养基;
c)进行温育;以及
d)显示至少一种肽酶活性的存在。
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