CN107841471A - 一种结晶紫降解菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种结晶紫降解菌，菌种为西地西菌(Cedeceadavisae)，用于结晶紫染料脱色以及用于结晶紫染料降解。本发明获取结晶紫降解菌的方法简单，稳定，可操作性好。获得的西地西菌种能够快速对结晶紫染料进行脱色和降解，净化水质，比化学方法更安全，没有二次污染。

Description

一种结晶紫降解菌及其应用
技术领域
本发明涉及染料降解菌领域，尤其涉及一种结晶紫降解菌。
背景技术
随着印染工业的迅猛发展，染料废水污染日显严重，其碱性大、有机物含量高，甚至还含有重金属等特点，成为最难处理的环境污染问题之一。
结晶紫染料是继偶氮染料、蒽醌染料之后，使用最广泛的第三大类染料。其排放肯定会造成水体和土壤的严重污染，对人类健康造成重大的伤害。研究含结晶紫废水的降解对染料废水降解具有重要意义。
西地西菌是杆状细胞，0.5～0.6μm×1～2μm，符合肠杆菌一般属的定义。大多数菌株运动。兼性厌氧。发酵葡萄糖产酸，通常产气。硝酸盐还原到亚硝酸盐。大多数菌株脂酶阳性(玉米油)。DNA酶和明胶酶阴性。它对于粘菌素和先锋霉素有抗性。西地西菌在染料脱色和降解中的应用还未见报道。
发明内容
本发明目的一是提供一种结晶紫降解菌，菌种为西地西菌(Cedeceadavisae)，用于结晶紫染料脱色。
本发明目的二是提供一种结晶紫降解菌，菌种为西地西菌(Cedeceadavisae)，用于结晶紫染料降解。
本发明目的二是提供所述结晶紫降解菌的分离方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种结晶紫降解菌，菌种为西地西菌(Cedeceadavisae)，用于结晶紫染料脱色。
一种结晶紫降解菌，菌种为西地西菌(Cedeceadavisae)，用于结晶紫染料降解。
所述结晶紫为三苯甲烷类染料结晶紫，结构式为：
所述结晶紫降解菌的分离方法，其具体步骤为：
取受染料污染土壤样品3.0g置于100mL含初始结晶紫浓度为5mg/L的无机盐培养基中，于30℃、130r/min条件下振荡培养；每隔2d观察结晶紫脱色情况，取5ml脱色效果最好菌悬液转接至新鲜含结晶紫培养液，并逐渐提高结晶紫的质量浓度依次为10、20、40、60、80、100mg/L，进行菌种驯化，测定结晶紫的降解脱色效果；将能使100mg/L结晶紫溶液脱色的驯化菌悬液，涂布在含30mg/L结晶紫的固体染料平板上，进行结晶紫降解菌的分离,进行菌株鉴定，即得结晶紫降解菌。
所述无机盐培养基组分为：葡萄糖3g、MgSO40.3g、(NH4)2SO40.5g、NaCl0.3g、FeSO4.7H2O0.03g、K2HSO42g、MnSO40.03g、蒸馏水1L，将各组分混合后在121℃下灭菌2h即得无机盐培养基。
所述固体染料培养基为：葡萄糖3g、MgSO40.3g、(NH4)2SO40.5g、NaCl0.3g、FeSO4.7H2O0.03g、K2HSO42g、MnSO40.03g、结晶紫0.03g、琼脂10-12g、蒸馏水1L、分装后121℃灭菌2h。
本发明的优点是：本发明获取结晶紫降解菌的方法简单，稳定，可操作性好。获得的西地西菌种能够快速对结晶紫染料进行脱色和降解，净化水质，比化学方法更安全，没有二次污染。
附图说明
图1：LRJ菌株形态
图2：LRJ菌株的16SrRNA基因序列系统发育树
图3：LRJ菌株处理不同浓度的结晶紫染料
图4：LRJ菌株降解不同浓度结晶紫UV254变化
图5：不同碳源对结晶紫脱色率的影响
图6：不同葡萄糖浓度对结晶紫脱色率的影响
图7：不同氮源对结晶紫脱色率的影响
图8：温度对结晶紫脱色的影响
图9：不同pH对结晶紫脱色率的影响
图10：不同金属离子对结晶紫脱色率的影响
具体实施方式
下面通过具体实例和附图进一步对本发明进行阐述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例
结晶紫降解菌的驯化、分离
取长期受到染料的污染土壤样品3.0g置于100mL含初始结晶紫浓度为5mg/L的无机盐培养基中，于30℃、130r/min条件下振荡培养；每隔2d观察结晶紫脱色情况，取5ml脱色效果最好菌悬液转接至新鲜含结晶紫培养液，并逐渐提高结晶紫的质量浓度依次为10、20、40、60、80、100mg/L，进行菌种驯化，测定结晶紫的降解脱色效果；将能使100mg/L结晶紫溶液脱色的驯化菌悬液，涂布在含30mg/L结晶紫的固体染料平板上，进行结晶紫降解菌的分离,进行菌株鉴定，即得结晶紫降解菌。
所述无机盐培养基组分为：葡萄糖3g、MgSO40.3g、(NH4)2SO40.5g、NaCl0.3g、FeSO4.7H2O0.03g、K2HSO42g、MnSO40.03g、蒸馏水1L，将各组分混合后在121℃下灭菌2h即得无机盐培养基。
所述固体染料培养基为：葡萄糖3g、MgSO40.3g、(NH4)2SO40.5g、NaCl0.3g、FeSO4.7H2O0.03g、K2HSO42g、MnSO40.03g、结晶紫0.03g、琼脂10-12g、蒸馏水1L、分装后121℃灭菌2h。
所述结晶紫为三苯甲烷类染料结晶紫。
菌株鉴定
(1)革兰氏染色鉴定：取对数生长期的菌种，涂片、固定；在涂菌部位滴加结晶紫染液，1～2min，倾倒染液、用水清洗至流出水呈无色：用卢戈氏碘液媒染1min，洗净；用95％乙醇脱色，当流出液无色时立即用水洗去乙醇；再用番红复染2min，自然干燥镜检。
(2)生理生化特性鉴定：生理生化特性实验参照《Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology》方法进行。
(3)16SrDNA分子鉴定：提取结晶紫脱色菌株基因组DNA，利用引物B101F(5'－TGGCGGACGGGTGAGTAA－3')和BA534R(5'－ATTACCGCGGCTGCTGG－3')。扩增菌株的16SrDNA。PCR程序如下:94预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经纯化后直接用ocr产物测序。基因测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，测序结果在NCBI数据库的BLASR中进行同源性比较。经过分析、整理后，选用MEGA5.0软件构建系统发育树，创建方法选择邻接法(Neighbor-Joining)，对菌株的序列进行同源性分析并构建其系统发育树。
所获菌株对结晶紫脱色效果
在无机盐培养基中分别加入5、20、40、60、100mg/L的结晶紫溶液，接种1ml菌悬液(处于对数生长期的菌株，OD600值为0.8)，放在30℃、130rpm/min振荡培养箱中振荡培养，每隔2h取样一次，离心之后测其吸光度。
菌株对结晶紫溶液UV254变化及COD的去除
利用所获得LRJ菌株制成菌悬液来处理结晶紫溶液，测定其脱色率，具体方法：培养14h后，将菌悬液放在8000r/min离心机上，离心10min，取上清液，在最大吸收波长589nm处，测其吸光度值，按如下公式计算脱色率
式中A为未接种菌液的结晶紫培养基OD值；B为接种菌液的结晶紫培养基OD值。
COD值采用重铬酸钾法测定；COD去除率＝(COD0-COD1)/COD0×100％，式中COD0为结晶紫染料溶液COD值；COD1为加入菌液反应一段时间后COD值。
在无机盐培养基中分别加入5、10、20、30、40mg/L的结晶紫溶液，在未接种菌株前，分别测不同浓度结晶紫溶液的UV254和COD的值。然后在接种5％的脱色菌，于30℃130rpm/min振荡培养箱中振荡培养反应，直至结晶紫完全脱色，取样离心，测定上清UV254和COD的值。
结晶紫降解菌的脱色、降解适宜条件
在250mL的三角瓶中分别加入100mL的无机盐培养液(灭菌后)，再加入40mg/L的结晶紫，加入1ml菌悬液(处于对数生长期的菌株，OD600值为0.8)，下振荡培养箱中振荡培养(pH＝7，130rpm/min)，利用不同环境因子，测定菌株脱色效果，每隔2h取样离心，测定其吸光度并记录。
(1)温度设定温度20℃、25℃、30℃、35℃、40℃。
(2)pH设定pH值为4、5、6、7、8。
(3)碳源设定碳源蔗糖、乳糖、葡萄糖，以不加碳源作对照，质量浓度为3.0g/L。另外，添加0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0g/L葡萄糖为碳源，研究碳源浓度对脱色效果的影响。
(4)氮源设定氮源为NaNO3、NH4SO4、NH4NO3、NH4Cl、乙胺四乙酸、尿素，以不加氮源作对照，各设三个重复，温度30℃、130rpm/min、pH为7。
(5)金属离子添加相同浓度的Mg2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+,以不加金属离子的培养基作对照,设三个重复，于30℃、130rpm/min摇床上振荡培养，研究金属离子对脱色的影响。
结果和分析
结晶紫降解菌株的获得
菌株的形态及生理生化特征
将垃圾填埋场土壤样品放在含结晶紫的培养基中进行富集培养，进行驯化、分离，结果发现含结晶紫染料培养基能够明显脱色。对该菌群进行反复划线分离纯化后，发现其中一株菌株能够使结晶紫染料显著脱色，标记为LRJ。
菌株LRJ在染料培养基中生长24h后，其菌落乳白色、半透膜、光滑、圆形、表面湿润粘稠，直径为1～1.5mm。其革兰氏染色图片见图1，短杆状，革兰氏染色为阴性。
菌株的分子鉴定(16SrDNA测序分析)
LRJ菌株片段有1433bp，对其进行16SrDNA测序分析。将获得的序列在GenBank中使用Blast软件进行同源性分析，结果表明该序列与CedeceaneteriGTC1717(17)的16SrDNA序列的同源性高达99％。再将获得的序列与西地西菌属内及肠杆菌科内相关菌株的16SrDNA用MEGA5.0软件的MultiplesequenceAligment程序，选用ClustalW法进行多序列比对分析，然后采用邻近法构建系统发育树如图2，结果表明该菌在系统发育树上与Cedeceadavisae相似度达99％。所以LRJ菌株经16SrDNA鉴定为西地西菌(Cedeceadavisae)。
菌株LRJ对结晶紫脱色效果
菌株LRJ对不同浓度结晶紫脱色率变化
分别移取菌悬液1ml加入到结晶紫染料初始浓度分别为5、20、40、60、100mg/L的无机盐培养基中，在摇床上振荡培养14h(30℃、130rpm/min、pH＝7)，每隔2h取样离心测其吸光度，计算脱色率。另外选择40mg/L的结晶紫溶液，接入相同量的菌液，测定不同时段溶液中结晶紫的残留量，结果如图3。
从图3可以看出，菌株LRJ能够使40mg/L以内结晶紫染料脱色显著，脱色率能够达到95％。且随着染料的浓度增大，脱色率也逐渐增大。当染料浓度在40mg/L时，脱色率达到最大的97.2％，脱色效果最好。但是随着初始染料浓度的增高，脱色率不断的下降。染料初始浓度在60mg/L时，脱色率达到84.2％。而染料初始浓度达到100mg/L时，脱色率8.3％，说明高浓度的染料对菌株LRJ生长具有抑制作用。
菌株LRJ降解初始浓度为40mg/L的结晶紫，测定溶液中结晶紫的残留量。由图3可看出，降解3h、6h、9h、12h、15h后溶液中结晶紫的残留量分别为21mg/L、8.41mg/L、2.64mg/L、1.8mg/L、1.35mg/L，随着降解时间越长，溶液中结晶紫的残留量就越少，菌株LRJ可使40mg/L的结晶紫9h脱色完全。
LRJ菌株对结晶紫的降解效果
菌株LRJ降解不同浓度结晶紫溶液COD的去除
分别向0、10、20、30、40、50mg/L的结晶紫溶液中加入相同量的菌悬液，在摇床上振荡条件下培养(30℃、130rpm/min、pH＝7)。
由表1可知，菌株LRJ对结晶紫溶液COD的去处效果较为显著。随着染料浓度的增加，结晶紫溶液中COD的值也逐渐增大。培养14h后，此时不同浓度的结晶紫溶液脱色率都达到了90％以上，但是此COD去除率达到了80％左右。此后COD去除趋于平缓，48h后测定不同浓度结晶紫溶液最终COD的值，COD最终去除率基本上达到了92％左右，而此时对照组(不加结晶紫)溶液COD最终去除率达到了99.73％。在降解的初始阶段，去除速率较快，说明一些中间产物能够被微生物所降解，或者说在染料分子中能够快速地加入氧元素，致使培养液中COD的值迅速降低。
表1LRJ菌株降解结晶紫前后COD的变化
LRJ菌株降解不同浓度结晶紫UV254的变化
UV254值表示的是水中一些有机物在254nm波长下的吸光度，反映的是水中存在的腐殖质类大分子有机物以及含有C＝C双键和C＝O双键的芳香族化合物。
图4是LRJ菌株降解不同浓度结晶紫14h后UV254的变化。LRJ菌株降解14h后，其结晶紫溶液中UV254的值显著下降。这说明LRJ菌株对结晶紫具有一定的降解作用，溶液中C＝C双键和C＝O双键的芳香族化合物显著降解。在供试浓度范围内其UV254可降至0.3。
LRJ菌株对结晶紫染料脱色的适宜环境因子
外加碳源对脱色效果的影响在结晶紫初始浓度为40mg/L时，以无外加碳源作为参考，外加碳源分别为葡萄糖、蔗糖、乳糖，在相同的培养条件下(30℃、130rpm/min、pH为7.0、装液量100mL)振荡培养14h。另外，选择葡萄糖为外加碳源，设计不同葡萄糖浓度，研究不同碳源对结晶紫脱色效果的影响，结果如图5所示。
由图5可知，不同外加碳源对菌株脱色效果产生显著影响，蔗糖效果没有显著作用，乳糖和葡萄糖对结晶紫脱色产生显著促进作用，特别是葡萄糖，对结晶紫可使脱色率达到97.84％，而乳糖脱色率达到46.68％。
不同葡萄糖浓度对脱色效果的影响
如图6所示，当体系中不加葡萄糖时，直接以结晶紫染料作为碳氮源时，此时脱色率才8.7％。当葡萄糖质量浓度为1g/L时，脱色率有明显上升，达到了76.1％。当葡萄糖质量浓度为2g/L时，脱色率达到了88.4％。当葡萄糖质量浓度为3g/L时，脱色率达到最高的97.5％。葡萄糖质量浓度逐渐增加到4g/L、5g/L、6g/L时，脱色率稳定在92％左右，可能是因为容易降解的葡萄糖添加过多，造成菌株对葡萄糖的依赖，反而影响了对结晶紫染料的代谢能力。由此，西地西菌(Cedeceadavisae)对结晶紫的脱色降解所需要的外加碳源以葡萄糖最好，浓度3g/L。
外加氮源对脱色效果的影响
在结晶紫初始浓度为40mg/L时，以无外加氮源作为对照，外加氮源分别为NaNO3、(NH4)2SO4、NH4NO3、二胺四乙酸、尿素和NH4Cl(含氮量相同)。在相同的培养条件下(30℃、130rpm/min、pH为7.0、锥形瓶装量100mL)振荡培养14h,研究不同氮源对结晶紫脱色效果的影响，结果如图7所示。
由图7可知，不同氮源对结晶紫的脱色具有不同的促进作用，具体顺序：(NH4)2SO4＞NH4Cl＞NH4NO3＞NaNO3＞尿素＞二胺四乙酸＞不加氮源。当外加氮源为二胺四乙酸时，与对照组(不加氮源)相比，差异不显著，此时菌株不能对结晶紫进行脱色。当外加氮源为二胺四乙酸时的脱色率为3.03％，对照组的脱色率为2.52％。当外加氮源为(NH4)2SO4时，脱色效果最好，达到97.84％。另外，铵态氮的脱色效果明显高于硝态氮。
不同温度对脱色效果的影响
结晶紫初始浓度为40mg/L，菌株分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃温度下对结晶紫进行脱色反应14h(130rpm/min、pH为7.0、锥形瓶装量100mL)。研究不同温度对结晶紫脱色率的影响，结果如图8所示。
由图8可知，LRJ菌株在不同温度下对结晶紫的脱色较为显著。温度在20℃，脱色率为仅7.4％，温度在40℃时，脱色率为17.1％，而当温度在25℃～35℃时，脱色率能够达到92％以上，其中温度在30℃时，脱色率能够达到最高的97.5％。可见LRJ菌株适宜脱色温度范围为25℃～35℃，西地西菌(Cedecea davisae)对结晶紫的脱色降解所需的最适温度为30℃。
不同pH对脱色效果的影响
结晶紫初始浓度为40mg/L，菌株分别在pH为4、5、6、7、8、9下对结晶紫进行脱色反应14h(130rpm/min、30℃、锥形瓶装量100mL)。研究不同pH对结晶紫脱色率的影响，结果如图9所示。
由图9可知，LRJ菌株适合在中性条件下生长，中性条件下对结晶紫的脱色效果较为明显。当体系的pH值为4或9时，此时没有显著脱色效果。当体系的pH值为5时，此时脱色率有较大幅度的上升，达到了63.99％。当体系的pH值为6～8时，此时脱色率基本上都能达到90％以上，其中在pH值为7时，脱色率达到最高的97.62％。
菌株LRJ脱色适宜pH范围为6-8。
不同金属离子对脱色效果的影响
分别考察Mg2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+对LRJ菌株脱色能力的影响，以不加金属离子的培养基作对照,结果如图10所示。
从图10可以看出，LRJ菌株降解结晶紫过程中，添加不同的金属离子对LRJ菌株脱色效果产生显著影响。Mg2+、Mn2+和Cu2+等对结晶紫的脱色作用显著促进LRJ菌株对结晶紫的脱色，其中，Mg2+对结晶紫的脱色效果最佳，脱色率达到了95.72％，而供试的Mn2+、Cu2+对结晶紫的脱色率分别达到了88.72％、92.13％。此时，对照组对结晶紫的脱色率达到了72.32％。供试金属离子中Zn2+对结晶紫的脱色没有显著作用，其中供试Zn2+对结晶紫的脱色率达到了74.56％。而供试金属离子中Ca2+对结晶紫的脱色作用与对照组(不加金属离子)相比，差异显著，脱色率达到了60.23％，Ca2+对LRJ菌株的脱色产生抑制作用。

Claims (6)

1.一种结晶紫降解菌，菌种为西地西菌(Cedeceadavisae)，其特征在于：用于结晶紫染料脱色。
2.一种结晶紫降解菌，菌种为西地西菌(Cedeceadavisae)，其特征在于：用于结晶紫染料降解。
3.如权利要求1或2所述的结晶紫降解菌，其特征在于：所述结晶紫为三苯甲烷类染料结晶紫，结构式为：
4.如权利要求3所述的所述结晶紫降解菌的分离方法，其特征在于：其具体步骤为：
取受染料污染土壤样品3.0g置于100mL含初始结晶紫浓度为5mg/L的无机盐培养基中，于30℃、130r/min条件下振荡培养；每隔2d观察结晶紫脱色情况，取5ml脱色效果最好菌悬液转接至新鲜含结晶紫培养液，并逐渐提高结晶紫的质量浓度依次为10、20、40、60、80、100mg/L，进行菌种驯化，测定结晶紫的降解脱色效果；将能使100mg/L结晶紫溶液脱色的驯化菌悬液，涂布在含30mg/L结晶紫的固体染料平板上，进行结晶紫降解菌的分离,进行菌株鉴定，即得结晶紫降解菌。
5.如权利要求3所述的西地西菌(Cedeceadavisae)的分离方法，其特征在于：所述无机盐培养基组分为：葡萄糖3g、MgSO4 0.3g、(NH4)2SO4 0.5g、NaCl0.3g、FeSO4.7H2O0.03g、K2HSO4 2g、MnSO4 0.03g、蒸馏水1L，将各组分混合后在121℃下灭菌2h即得无机盐培养基。
6.如权利要求3所述的西地西菌(Cedeceadavisae)的分离方法，其特征在于：所述固体染料培养基为：葡萄糖3g、MgSO4 0.3g、(NH4)2SO4 0.5g、NaCl0.3g、FeSO4.7H2O0.03g、K2HSO42g、MnSO4 0.03g、结晶紫0.03g、琼脂10-12g、蒸馏水1L、分装后121℃灭菌2h。
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