CN103898011B

CN103898011B - 一种甲基营养菌及其发酵生产吡咯喹啉醌的方法

Info

Publication number: CN103898011B
Application number: CN201410087026.4A
Authority: CN
Inventors: 郑璞; 姚红涛
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Zhentian (Shanghai) Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2014-03-11
Filing date: 2014-03-11
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2034-03-11
Also published as: CN103898011A

Abstract

本发明公开了一种甲基营养菌及其发酵生产吡咯喹啉醌的方法，属于生物技术领域。本发明从土壤中筛选分离到一株新菌株Methylopilasp.YHT-1，该菌能够生产吡咯喹啉醌，已于2014年1月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2014016。该菌株在以甲醇为碳源的培养基中好氧培养3-4天，产吡咯喹啉醌50-113mg/L。本发明首次报道了Methylopilasp.能过量产生PQQ并能分泌到胞外，为发酵法制备PQQ提供了新菌种。

Description

一种甲基营养菌及其发酵生产吡咯喹啉醌的方法

技术领域

本发明涉及一种甲基营养菌及其发酵生产吡咯喹啉醌的方法，属于生物技术领域。

背景技术

吡咯喹啉醌（Pyrroloquinolinequinone，PQQ），化学名称为4，5-二氢-4，5-二氧化-1-氢吡咯（2，3f）醌-2，7，9一三羧酸，别名Methaxatin，是1979年由Salisbury等人发现的，最初描述是在细菌细胞中作为膜结合脱氢酶的氧化还原辅因子。目前，在许多不同生物体内都发现存在PQQ，它可以防止活细胞被体内或体外的氧损伤；还可作为营养因子和维生素促进细胞生长和提高细菌在极端条件下的耐受性；哺乳动物细胞分化中诱导蛋白激酶的产生；通过增加不溶性磷酸盐的可利用性和作为生物防治剂来提高作物生产力；利用氧化还原特性应用于生物传感器；众多发现已经将PQQ具有异常高的氧化还原循环能力和它在抗神经细胞衰老、抗癌、药剂、作为信号分子等方面的潜力关联起来，其应用一旦成功，PQQ将发挥不可替代的重要作用。总之，吡咯喹啉醌有多种功能，作为营养因子或维生素参与多种生命活动（Journalofbiosciences,2012,37(2):313-325.），在农业、医药、轻工业和食品业等方面具有重要的开发价值。

目前，化学法生产PQQ步骤繁杂、产率低、副产物多、提取纯化步骤多，并用到有毒化学试剂，污染严重且后续处理困难（JournaloftheAmericanChemicalSociety,1981,103:5599-2600.）。微生物发酵法具有降低生产成本，清洁低碳、温和可控等优势；同时发酵法一般以甲醇为唯一碳源，培养基以无机盐为主，这有利于产品的提取。

迄今发现的能过量产生PQQ的野生菌包括：无色杆菌属（Achromobacter）、交替单胞菌属（Alteromonas）、弯杆菌属（Ancylobacter）、生丝微菌属（Hyphomicrobium）、甲烷单胞菌属（Methanomonas）、甲基菌属（Methylobacillus)、甲基单胞菌属（Methylomonas）、嗜甲基菌属（Methylophilus）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、微环菌属（Microcyclus）、枝动菌属（Mycoplana）、假单胞菌属（Pseudomonas）、精朊杆菌属（Protaminobacter）、原单胞菌属（Protomonas）、硫杆菌（Thiobacillus）、黄色杆菌属（Xanthobacter）（生物技术通讯,2009,20(6):874-879.），以及粘球菌属（Myxococcus）（生物技术通报,2013,1:029.）和副球菌属（Paracoccus）（海洋渔业,2012,34(1):89-95.）等。其中以甲基营养型细菌的PQQ生物合成水平最高。专利US4,994,382公布了副球菌IFO13301、精朊杆菌IFO3708和假单胞菌FERMP-7596发酵制备PQQ，产物浓度分别为4.5mg/L、5.8mg/L、30mg/L；US5,344,768公布了甲基杆菌、弯杆菌、生丝微菌等属的29株菌种，其PQQ生产水平也只为0.07mg/L-7mg/L；WO2012/118225A1公开了通过基因工程手段将M.extorquensstrainAM1和H.denitrificansstrainATCC51888两株菌进行修饰，改造后最高产量分别才为114mg/L和10.9mg/L。中国专利CN102061278A公开了食甲基菌Methylovorussp.MP688(CGMCCNo.4096），在常规培养基和培养条件下，PQQ产量达到125mg/L；虽然CN103224965A公布了经优化后在7.5L罐上的PQQ产量可达2g/L，但是，多数野生菌的PQQ产量在2-3mg/L，筛选高产菌株仍是发酵制备PQQ工业化的关键。

本发明从江苏无锡锡南农药厂周围土壤分离筛选得到一株甲基营养菌YHT-1，属于PQQ产生菌新菌属，其产量明显高于一般野生菌株，通过优化培养基和培养条件进一步提高产物浓度，并且通过一步纯化发酵上清液就可得到纯度较高的PQQ产物。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种Methylopilasp.YHT-1菌株，是一株甲基营养菌。

所述Methylopilasp.YHT-1已于2014年1月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2014016。

所述Methylopilasp.YHT-1与和其同源性99%的两株菌MethylopilajiangsuensisstrainJZL-4、Methylopilasp.MUSA相比，具有不同分类学特性：YHT-1无鞭毛，氧化酶、吲哚反应、淀粉水解呈阴性，不利用果糖，对链霉素无抗性。

所述Methylopilasp.YHT-1在K培养基平板上，菌落呈乳白色，半透明，粘稠的，中间凸起，边缘整齐，直径1-2mm。电镜照片表明，菌体为杆状或（椭）球状，不产生芽孢，有荚膜，无鞭毛；大小约为0.5-0.7×0.9-1.4μm。兼性厌氧，革兰氏阴性，适宜生长温度范围25-37℃；适宜生长pH范围6.5-8.0；能较好利用甲醇、甲基胺，微利用D-葡萄糖、醋酸盐、丙酮酸盐；能够利用铵盐、硝酸盐以及牛肉膏、蛋白胨等复杂氮源。

所述K培养基：硫酸铵2.0g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，氯化钠0.5g/L，七水硫酸镁0.125g/L，七水硫酸亚铁0.002g/L，甲醇8g/L，pH7.2。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种应用所述甲基营养菌Methylopilasp.YHT-1发酵产PQQ的方法：将原始菌株接种于斜面培养基，25～37℃培养2～3天，进行活化；将活化好的菌株接种于种子培养基，在25～37℃、120～220rpm条件下震荡培养10～30小时；然后将种子液按1％～10％（v/v）接种到含有发酵培养基的三角瓶或发酵罐发酵3～5天。

所述三角瓶发酵是用250mL三角瓶装50mL发酵培养基，接种量1％～10％（v/v），发酵温度为25～37℃、转速120～220rpm。

所述发酵罐发酵时，发酵罐装液1/3～2/3（v/v），转速300～500rpm，接种量、温度同三角瓶发酵。

所述种子培养基组成为：无机氮源1～3g/L，硫酸镁0.3～3g/L，磷酸二氢钾1.4～4.2g/L，磷酸氢二钠3～9g/L，酵母膏3～5g/L，甲醇7～17g/L；初始pH7.2～7.5。所述无机氮源包括氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾或其组合。

所述发酵培养基组成为：氮源1～5g/L，硫酸镁0.3～2.4g/L，磷酸二氢钾1.4～2.8g/L，磷酸氢二钠3～6g/L，氯化锰5～10mg/L，叶酸0.05～0.5mg/L，甲醇7～50g/L；初始pH6.5～7.2。所述氮源可以是氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾、酵母膏或牛肉膏，也可以是其组合。

本发明从江苏无锡锡南农药厂周围土壤分离筛选得到一株甲基营养菌YHT-1，属于PQQ产生菌新菌属，与一般的PQQ产生菌相比，具有更广泛的发酵温度（25℃～37℃），可以利用酵母膏等复杂氮源，短时间内生长达到较高的生物量和PQQ产量。通过对发酵条件的初步优化，该菌在3L发酵罐中PQQ产量可达113mg/L，且发酵液经一步纯化及能得到纯度较高的PQQ。此外，Methylopilasp.是1998年发现的分类位置未定的新菌属（《伯杰氏系统细菌学手册》(第二版,2004)），该菌属还没有关于合成PQQ的报道。

生物材料保藏

Methylopilasp.YHT-1已于2014年1月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2014016。

附图说明

图1为纯化产物的HPLC分析结果，其中左图是PQQ标准品，右图是纯化产物。

图2为纯化产物的紫外吸收光谱。

图3为菌株YHT-1的扫描电镜照片。

图4为发酵罐中菌体生长曲线及PQQ浓度变化。

具体实施方式

以下是有关Methylopilasp.YHT-1菌株的实施例，并结合附图详细介绍本发明，但本发明并不限于所列出的几个实例。

产物的纯化与提取：

纯化仪器如AKTAavant蛋白纯化仪，将发酵上清液膜虑后以1mL/min流速经过DEAE阴离子交换柱，接着用2～5倍柱体积的柠檬酸钠缓冲液（pH5.5）洗涤平衡，再以含有lMNaCl的柠檬酸钠缓冲液（pH5.5）进行梯度洗脱，洗脱体积为10～20CV，得到初步纯化后的呈红色的PQQ产物。

产物分析方法：

（1）NBT－Gly化学法：见《3种检测吡咯喹啉醌的方法比较》（生物技术通讯,2011,22(4):544-547.）。

（2）HPLC分析：流动相为12.5mM磷酸二氢钾溶液：甲醇=85：15（v/v）；进样量10～20μL；流速0.8～1.2mL/min；检测波长254nm；柱温30℃；检测器为DAD；色谱柱为WatersSunFire^TMC18反向柱（5μm，4.6mm×250mm）。

（3）紫外吸收光谱分析：利用紫外-可见光分光光度计，对PQQ标准品和纯化后的PQQ溶液直接进行220-400nm的波长扫描，测定二者的紫外吸收光谱是否一致。

实施例1PQQ产生菌的筛选

斜面培养基和平板筛选培养基：为K培养基，见《伯杰氏系统细菌学手册》（第二版,2004,第二卷,PartC,P421.）。K培养基：硫酸铵2.0g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，氯化钠0.5g/L，七水硫酸镁0.125g/L，七水硫酸亚铁0.002g/L，甲醇8g/L，pH7。

筛选时所用发酵培养基：硫酸铵3.0g/L，磷酸二氢钾1.4g/L，磷酸氢二钠3.0g/L，硫酸镁0.2g/L，柠檬酸铁30mg/L，氯化钙30mg/L，氯化锰5.0mg/L，硫酸锌5.0mg/L，硫酸铜0.5mg/L，甲醇6g/L；pH7.0。

从无锡及周边地区共采集80多个土样或水样，并制成适当浓度的稀释液，直接涂布于K培养基筛选平板，30℃培养3-5天，分别挑取不同形态的单菌落接种于装有发酵培养基的试管，30℃、200rpm震荡培养3-5天，离心取发酵上清液。在96孔板中利用NBT－Gly化学法快速初筛，测定上清中PQQ含量。从250多个菌落中检测到30株可以产生PQQ。

取初筛得到的菌株分别接种于装有5mL发酵培养基的试管中，30℃震荡培养2天。然后转接到装有50mL发酵培养基的三角瓶，30℃、200rpm发酵3-5天。如表1所示，用HPLC法精确测定发酵上清中PQQ的含量，其中编号为YHT-1的菌株产量最高，达30mg/L。

表1部分筛菌株的产PQQ情况

实施例2菌株Methylopilasp.YHT-1的鉴定

对YHT-1按《伯杰氏系统细菌学手册》（第二版，2004）和该属菌株的原文献进行形态特征及生理生化特征（表2）的鉴定。在K培养基平板上划线培养2天，菌落为乳白色，圆形，半透明，表面光滑，粘稠的，中间凸起，边缘整齐，直径1-2mm。电镜照片表明（图3），菌体为杆状或（椭）球状，大小为0.5-0.7×0.9-1.4μm；该菌株不产生芽孢，有荚膜，无鞭毛，不运动。兼性厌氧，革兰氏阴性，适宜生长温度范围25-37℃；适宜生长pH范围6.5-8.0；能够在不添加氮源的液体培养基中微生长。按照细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN公司）提取YHT-1的染色体DNA，用细菌通用引物27F/1492R（27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），PCR扩增16srDNA序列，委托上海生工有限公司测序，将得到的16SrRNA基因序列片段提交至GenBank(GenBankKJ017968），并进行BLAST比对（表3）。

基于形态特征、生理生化特性和16SrRNA序列分析，Methylopilasp.YHT-1与同源性最高的两株菌MethylopilajiangsuensisstrainJZL-4和Methylopilasp.MUSA比较，都不同的是：YHT-1无鞭毛，氧化酶、吲哚反应、淀粉水解呈阴性，不利用果糖，对链霉素无抗性；与两株菌在革兰氏染色、过氧化氢酶、产H₂S、MR、VP、碳源利用（如甲醇、甲胺、二氯甲烷等）、氨苄西林抗性等方面完全相同；其它方面不同于其中的一株。因此，认为YHT-1属于Methylopilasp.nov新菌株，拟命名为Methylopilasp.YHT-1。此菌株已于2014年1月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCNO：M2014016。

表2生理生化特征对照表

实验项目	YHT-1	1	2
				鞭毛	-	+	+
芽孢	-	-	-

革兰氏染色	-	-	-
				硝酸盐还原	-	+	-
氧化酶	-	+	+
				脲酶	w	+	+
过氧化氢酶	+	+	+
				吲哚反应	-	+	未
产H₂S	-	-	-
				明胶水解	-	-	未
淀粉水解	-	+	未
				MR	-	-	-
VP	-	-	-
				生长是否需要生长因子	-	-	-
在营养琼脂（LB）上生长	+	+	+
				碳源利用：
甲醇	+	+	+
				甲胺	+	+	+
乙醇	-	-	-
				丁醇	-	-	-
二氯甲烷	-	-	-
				甘油	-	+	-
蔗糖	-	+	-
				麦芽糖	-	+	-
D-果糖	-	+	+
				D-山梨醇	-	+	-
L-阿拉伯糖	-	+	-
				琥珀酸盐	-	+	-
苹果酸盐	-	+	-
				柠檬酸盐	-	-	未
抗生素抗性：
				链霉素	-	+	未
氨苄西林	+	+	未

注：1，MethylopilajiangsuensisstrainJZL-4；2，Methylopilasp.MUSA；+，阳性；w，微阳性；-，阴性；未，实验未做。

表3同源性分析表

菌株名称	NCBI编号	相似性
			MethylopilajiangsuensisstrainJZL-4	FJ502233.3	99％
Methylopilasp.MUSA	JQ173144.1	99％
			Methylopilasp.2395A	KC243676.1	97％
Methylopilasp.LYBFD3-16A2	HM447243.1	97％
			MethylopilacapsulatastrainIM1	NR_024843.1	96％
AlbibactermethylovoransstrainDM10	NR_104754.1	96％

HansschlegeliaplantiphilastrainS2	DQ404189.1	96％
			HansschlegeliaplantiphilastrainS1	DQ404188.1	95％
RhizobialesbacteriumCCBAU25323	HM107186.1	94％
			RhizobialesbacteriumCCBAU45351	GU591893.1	94％
AlphaproteobacteriumNYO	KF135669.1	94％
			AlphaproteobacteriumNWO	KF135667.1	94％
MethylosulfonomonasmethylovorastrainM2	U62893.1	94％
			Stappiastellulata	AB680962.1	93％
Albobactermethylovorans	AF273213.1	93％
			Methylocystisparvus	AJ458508.1	93％
Ancylobactersp.Bmb13	JQ977614.1	93％
			MethylopilahelveticastrainDM9(T)	AF227126.1	87％
HyphomicrobiumdenitrificansATCC51888	NR_074189.1	82％
			MethylovorusmaysstrainC（MP606）	AY486132.1	77％
Methylovorussp.MP688	NR_074780.1	72％

实施例3产物的纯化与确定：

先用20mM柠檬酸钠缓冲液（pH5.5）洗涤柱子，再将经过微孔滤膜过滤后的YHT-1发酵上清液以1mL/min流速经过20mLDEAE阴离子交换柱，接着用2～5倍柱体积的柠檬酸钠缓冲液（pH5.5）洗涤平衡，再以含有lMNaCl的柠檬酸钠缓冲液（pH5.5）进行0-100％梯度洗脱，洗脱体积为10～20倍柱体积，最后得到初步纯化后的呈红色的PQQ产物。

纯化产物的分析：

HPLC分析：用与纯化产物相同浓度的柠檬酸钠缓冲液溶解PQQ标样（购自武汉诺辉医药化工有限公司，纯度≧98％），使两者溶剂一致，对纯化产物进行HPLC分析（图1），与标样保留时间同为3.3min。

测定紫外吸收光谱：利用紫外-可见光分光光度计，对PQQ标准品和纯化后的PQQ溶液直接进行220-400nm的波长扫描，二者吸收光谱几乎一样（图2），在248nm和330nm左右都有两个特征吸收峰。

实施例4氮源的选择

将活化好的YHT-1菌株接种于种子培养基，在25～37℃、120～220rpm条件下震荡培养10～30小时，然后将种子液按1％～10％（v/v）接种到含有发酵培养基的三角瓶，250mL三角瓶装液50mL，25～37℃、120～220rpm条件下发酵3天。其中用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、硝酸钾、硝酸铵、氯化铵、硫酸铵分别作为发酵培养基的氮源。结束后测定生物量（OD600)，同时用NBT－Gly化学法快测定发酵上清液中PQQ含量，结果如表4。

种子培养基组成为：无机氮源1～3g/L，硫酸镁0.3～3g/L，磷酸二氢钾1.4～4.2g/L，磷酸氢二钠3～9g/L，酵母膏3～5g/L，甲醇7～17g/L；初始pH7.2～7.5。种子培养基中无机氮源可以是氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾或其组合。

发酵培养基组成为：氮源1～5g/L，硫酸镁0.3～2.4g/L，磷酸二氢钾1.4～2.8g/L，磷酸氢二钠3～6g/L，氯化锰5～10mg/L，叶酸0.05～0.5mg/L，甲醇7～19g/L；初始pH6.5～7.2。

表4YHT-1利用不同氮源发酵产PQQ

氮源	牛肉膏	蛋白胨	酵母膏	硝酸钾	硝酸铵	氯化铵	硫酸铵
								PQQ浓度（mg/L）	14.6	7.6	23.5	14.9	19.8	21.9	19.3
OD₆₀₀	4.4	2.7	4.2	3.3	2.8	2.9	2.8

实施例5发酵温度选择

以硫酸铵代替实施例4中发酵培养基的氮源，分别置于25℃、30℃、35℃、37℃进行发酵，其它条件同实施例4。发酵5天后测定生物量（OD₆₀₀)和上清液中PQQ含量，结果如表5：

表5YHT-1不同温度下发酵制备PQQ

温度	25℃	30℃	35℃	37℃
					PQQ浓度（mg/L）	37.3	26.6	47.1	28.9
OD₆₀₀	3.6	4.2	6.6	4.1

实施例6发酵培养基初始pH选择

以硫酸铵代替实施例4发酵培养基的氮源，将初始pH分别调为6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、8.0，其他条件相同，发酵5天后结果如表6：

表6菌株YHT-1在不同初始pH下发酵制备PQQ

初始pH	5.5	6.0	6.5	7.0	7.2	7.5	8.0
								PQQ浓度（mg/L）	2.6	22.0	37.3	46.6	38.8	32.9	0.7
OD₆₀₀	0.8	3.0	3.7	4.3	6.2	6.4	4.9

实施例73L发酵罐发酵制备PQQ

以氯化铵和酵母膏（5g：1g）代替实施例4中发酵培养基的氮源。按实施例4所述的方法培养YHT-1菌株的种子液，然后按4％（v/v）接种于装有2L发酵培养基的3L发酵罐中，恒温控制为35℃，转速为300rpm，通气量为120L/h。发酵过程中，每当溶解氧升高到初始值左右时（说明菌体停止生长），适当补加碳源甲醇（8g左右）；当发酵液pH下降到5.5以下时，滴加浓氨水将pH控制在5.5左右。定时取样测，定菌体量（OD₆₀₀）和PQQ浓度。发酵4天后，PQQ浓度达到113mg/L，生物量（OD₆₀₀）达到14（图4）。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一株Methylopilasp.YHT-1菌株，于2014年1月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2014016。

2.应用权利要求1所述Methylopilasp.YHT-1菌株发酵生产吡咯喹啉醌的方法。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将菌株活化后接种于种子培养基，在25～37℃、120～220rpm条件下震荡培养10～30小时；然后将种子液按体积比1％～10％接种到含有发酵培养基的三角瓶，250mL三角瓶装50mL发酵培养基，发酵温度为25～37℃、转速120～220rpm，发酵3-5天。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将菌株活化后接种于种子培养基，在25～37℃、120～220rpm条件下震荡培养10～30小时；然后将种子液按体积比1％～10％接种到含有发酵培养基的发酵罐，发酵罐装液量1/3～2/3(v/v)，转速300～500rpm，发酵温度为25～37℃，发酵3-5天。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述种子培养基组成为：无机氮源1～3g/L，硫酸镁0.3～3g/L，磷酸二氢钾1.4～4.2g/L，磷酸氢二钠3～9g/L，酵母膏3～5g/L，甲醇7～17g/L；初始pH7.2～7.5。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述无机氮源是氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾或其组合。

7.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基组成为：氮源1～5g/L，硫酸镁0.3～2.4g/L，磷酸二氢钾1.4～2.8g/L，磷酸氢二钠3～6g/L，氯化锰5～10mg/L，叶酸0.05～0.5mg/L，甲醇7～50g/L；初始pH6.5～7.2。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述氮源是氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾、酵母膏、牛肉膏或其组合。