CN113637651B - 一种亚硝酸还原酶的制备方法及应用 - Google Patents

一种亚硝酸还原酶的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种亚硝酸还原酶的制备方法及应用。本发明提供了一种新的制备亚硝酸还原酶的方法，具体为使用不动杆菌在含有亚硝酸盐的发酵培养基中培养，培养一定时间后，离心或过滤收集菌体，将菌体混悬于破胞抽提液中破胞，离心或利用膜分离得到破胞上清液即为含亚硝酸还原酶的粗酶液。本申请提供的方法，得到的亚硝酸还原酶粗酶液中，每毫升粗酶液所产酶活性高于2000U(酶活单位)，甚至达到2500U，显著高于现有技术的水平，为亚硝酸还原酶的工业化生产提供了更高效的技术方法，且本发明提供的制备方法工艺简单、条件温和。

Description

一种亚硝酸还原酶的制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种亚硝酸还原酶的制备方法及应用。
背景技术
亚硝酸盐广泛存在于咸鱼、腌制肉类和腌制蔬菜中。过量的亚硝酸盐除了能与人体内蛋白质的降解物结合生成强致癌物质亚硝胺外，还可与血红蛋白结合而造成正铁血红肮症，对人体危害极大。近几年，各地区亚硝酸盐中毒事件的报道逐年增加，因此食品中亚硝酸盐的污染情况及其控制已成为食品安全相关领域研究的一大热点。同时由于环境污染等问题，亚硝酸盐广泛存在于各类水体等环境中，污染环境与水源是环境修复需要解决的问题之一。在农产品原料以及饲料中也有大量的亚硝酸盐残留。随着人们对健康、食品安全、环境要求的提高，如何快速、安全地降解亚硝酸盐已成为食品加工、环境修复、水源保护等急需解决的问题。
亚硝酸还原酶(NiRs)是一类能够高效、快速、安全降解亚硝酸及亚硝酸盐的酶。亚硝酸还原酶不仅可以用于降解食品加工类产品的亚硝酸盐残留，还可以用于环境及水体中亚硝酸盐污染物控制，以及用于构建快速检测亚硝酸及亚硝酸盐的生物传感器。
目前，本领域中获取亚硝酸还原酶的方法多是利用微生物发酵制备亚硝酸还原酶，例如：申请号为CN200810101083.8，发明名称为《亚硝酸还原酶的制备及亚硝酸还原酶制剂的制备方法》的中国发明专利，利用巨大芽孢杆菌发酵制备亚硝酸还原酶。申请号为CN200910055120.0，发明名称为《亚硝酸盐还原酶的制备方法及其酶制品》的中国发明专利，利用乳酸菌发酵制备亚硝酸还原酶。申请号为CN201410437877.7，发明名称为《一种干酪乳杆菌鼠李糖亚种的亚硝酸盐还原酶的制备方法》的中国发明专利，利用干酪乳杆菌鼠李糖亚种发酵制备亚硝酸还原酶。申请号为CN201610895015.8，发明名称为《一种从金针菇中制备亚硝酸盐还原酶的方法》的中国发明专利，将金针菇粉碎后，超声提取亚硝酸盐还原酶。
上述获取亚硝酸还原酶的方法存在的主要问题有：发酵的酶活不高，所报道的粗酶液中每mL发酵液酶活一般在28U至320U；工艺过程复杂，有的需要制备两级种子再发酵；发酵时间长，有的需要72h的发酵时间。因此，寻找或开发新的生产亚硝酸还原酶的技术，对亚硝酸还原酶的制备具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种亚硝酸还原酶的制备方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，不动杆菌在制备亚硝酸还原酶中的应用。
本发明还提供了一种制备亚硝酸还原酶的方法，包括以下步骤：将不动杆菌种子接种于发酵培养基中，好氧发酵，发酵结束后，收集菌体破胞，上清液为含亚硝酸还原酶的粗酶液。
进一步地，所述发酵培养基中含亚硝酸盐。培养不动杆菌的种子培养基含有微生物生长所必须的碳源、氮源、以及无机盐，另外也可以加一定量的亚硝酸盐。发酵培养基中除含有微生物生长所必须的碳源、氮源、以及无机盐外，还在一般的有机氮源基础上添加一定量的亚硝酸盐。
进一步地，所述好氧发酵温度为30-40℃。优选为35-37℃。
进一步地，所述好氧发酵时间为12h以上。优选为24-48h。
进一步地，种子接种比例为0.5％-10％。
进一步地，还包括对粗酶液浓缩、分离纯化或干燥的步骤，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂产品。
发酵结束后利用离心(或者过滤)收集菌体。收集的菌体利用生理盐水洗涤，得到的细胞悬混于破胞抽提液(破胞抽提液P)利用高压匀浆(或者超声破胞)破胞。破胞液利用高速离心(或者膜分离)收集破胞清液。所得到的破胞清液为亚硝酸还原酶酶液。
进一步地，将不动杆菌菌种接种于种子液体培养基中，好氧培养得到一级种子液，一级种子液接种于发酵培养基中。具体地，从菌种管中把不动杆菌接种于琼脂平面培养基(培养基A)中活化菌种，在微生物培养箱中35-37℃培养12-24h得到活化的菌种。活化菌种接种于种子液体培养基(培养基B)中，在摇床中35-37℃好氧培养12-24h得到一级种子液。
本申请还提供了利用上述的方法制备的亚硝酸还原酶。其酶学特性为在28-35℃、pH6-8下具有较好的酶活性，最适条件为30℃下、pH7.5。Km值为407.68nmol/mL，Vmax值为18.45nmol/min。
本申请还提供了一种促进如上述的亚硝酸还原酶酶活的方法，包括使用Mg2+和/或Fe2+促进酶活性。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明提供了一种新的制备亚硝酸还原酶的方法，具体为使用不动杆菌在含有亚硝酸盐的发酵培养基中培养，培养一定时间后，离心或过滤收集菌体，将菌体混悬于破胞抽提液中破胞，离心或利用膜分离得到破胞上清液即为含亚硝酸还原酶的粗酶液。本申请中的改进点不仅在于不动杆菌的使用，还包括对利用不动杆菌发酵制备亚硝酸还原酶的发酵条件参数的优化。
本申请中对不动杆菌发酵得到的粗酶液进行SDS-PAGE检测，电泳结果显示，在预期位置出现清晰条带，说明粗酶液具有亚硝酸还原酶；同时，利用米氏方程模拟其动力学方程，各实施例产品的Km值和Vmax值相一致。
现有技术中已经存在利用不动杆菌处理氨氮的相关技术，但是并没有利用不动杆菌制备亚硝酸还原酶的相关内容。现有技术中利用其他微生物制备亚硝酸还原酶时，所得粗酶液中酶活仅有28U至320U；而本申请提供的方法，得到的亚硝酸还原酶粗酶液中，每毫升粗酶液所产酶活性高于2000U(酶活单位)，甚至达到2500U，显著高于现有技术的水平，为亚硝酸还原酶的工业化生产提供了更高效的技术方法，且本发明提供的制备方法工艺简单、条件温和。
本申请中还发现，利用不动杆菌制备的亚硝酸还原酶最适反应温度为30℃，最适为pH7.5，并且有少数金属离子能够对得到的亚硝酸还原酶表现出促进作用，如Mg2+和Fe2+。这对亚硝酸还原酶的产业化应用具有重要启示。
附图说明
图1是不同pH下相对酶活；
图2是不同温度下相对酶活；
图3是金属离子对酶活的影响；
图4是亚硝酸还原酶SDS-PAGE电泳图；M泳道为蛋白Marker，1号泳道为实施例1中获得的粗酶液；2号泳道为实施例2中获得的粗酶液。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
本发明披露了一种亚硝酸还原酶的制备方法及应用。本发明的技术方案适用的微生物为不动杆菌，属于革兰氏阴性菌，包括从保藏中心或其他商业途径获取的不动杆菌，如CGMCC1.12996、CGMCC 1.9045、ATCC 29064、ATCC 55587、DSM 6962、ACCC 11040、CICC21948等。该类菌能利用亚硝酸及其盐，每mL培养液所产酶活性高于2000U(酶活单位)。发酵液经过分离、提取、复配可制备出各种酶制剂产品。
本发明中涉及的培养基或试剂包括：
培养基A：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、琼脂1.5g、NaNO2 0.5g、去离子水1000mL，pH7.0。
培养基B：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、去离子水1000mL，pH7.0。
发酵培养基F1：胰蛋白胨5-10g、酵母提取物1-5g、NaCl 10g、Na2S2O4 0.2-1g、NaNO2 5-20g，去离子水1000mL，pH7.0。
发酵培养基F2：柠檬酸钠5-20g、七水磷酸氢二钠10g、亚硝酸钠5-20g、磷酸二氢钾15.0g、硫酸镁1.0g，去离子水1000mL，pH7.0。
发酵培养基F3：淀粉15-30g/L、玉米浆干粉6-14g/L、亚硝酸钠5-20g、磷酸氢二钾4-8g/L、硫酸铵2-5g/L、七水合硫酸镁0.1-0.4g/L，去离子水1000mL，pH7.0。
破胞抽提液P：pH7.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液，含有终浓度为0.1mg/mL的二硫苏糖醇(DTT)和苯甲基磺酰氟(PMSF)。
本申请中的酶活性测定方法参考Martínez-Espinosa(Martínez-Espinosa M R，et al，FEMS Microbiology Letters，2001，196(2)：113-118)的方法，该方法也是本领域中对亚硝酸还原酶进行检测的标准通用方法。反应体系为200μL：100μL酶液、40μL pH7.0K2HPO4-KH2PO4缓冲液、20μL 0.01mol/L Na2S2O4、10μL 0.01mol/L NaCl、10μL 0.01mol/L甲基紫精、20μL 500μg/mL的NaNO2底物。底物和酶液分别在30℃下预热2min，加入底物后在30℃下反应10min，加水补足到5mL，并加入0.2mL格利似试剂显色利用比色法在528nm测定亚硝酸盐变化。亚硝酸浓度按照国家标准GB 5009.33-2016测定。
酶活定义：每分钟消耗1ng的NaNO2所需的酶量为1U。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
1、按照上述配方配制菌种活化培养基A、种子培养基B、发酵培养基F1和破胞抽提液P。其中，发酵培养基F1：胰蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、NaCl 10g、Na2S2O4 0.5g、NaNO25g，去离子水1000mL，pH7.0。121℃下灭菌30min。
2、菌种活化、种子制备、发酵产酶
从保藏的菌种管中把不动杆菌(CGMCC 1.12996)接种于琼脂平面培养基(培养基A)中活化菌种，在微生物培养箱中35℃培养12h得到活化的菌种。
活化菌种接种于25mL种子液体培养基(培养基B)中(250mL锥形瓶)，在摇床中35℃好氧培养12h得到一级种子液。
种子液按照0.5％的接种量接种至发酵培养基(培养基F1)中(500mL锥形瓶含50mL培养基，或者发酵罐装液量在75％-90％)，在35℃好氧发酵18h，不动杆菌合成亚硝酸(亚硝酸盐)还原酶。
3、菌体收集及破胞制备粗酶液
发酵结束后利用离心机15000g×10min离心收集菌体。收集的菌体利用生理盐水洗涤，得到的细胞悬混于破胞抽提液(破胞抽提液P)，利用超声破胞仪在冰浴条件下破胞，超声破胞仪工作功率为500W，每次工作3s，间隔5s，总破胞时长8min。破胞液在4℃下利用高速离心机25000g×15min离心收集收集破胞清液。所得到的破胞清液为亚硝酸(亚硝酸盐)还原酶粗酶液。参考Martínez-Espinosa的方法，测定产物的酶活。1mL发酵液所收集的菌体破胞后酶活为2100U。
4、酶制剂
将所得到的粗酶液进一步利用截留分子量为10kD超滤膜浓缩，利用硫酸铵沉淀分离纯化，利用0.01MPa下30℃减压蒸发干燥得到固体酶。
根据用途与使用条件制备成各种不同活性、纯度和剂型的酶制剂产品。
实施例2
1、按照上述配方配制菌种活化培养基A、种子培养基B、发酵培养基F2和破胞抽提液P。其中，发酵培养基F2：柠檬酸钠10g、七水磷酸氢二钠10g、亚硝酸钠10g、磷酸二氢钾15.0g、硫酸镁1.0g，去离子水1000mL，pH7.0。121℃下灭菌30min。
2、菌种活化、种子制备、发酵产酶
从保藏的菌种管中把不动杆菌(ATCC 29064)接种于琼脂平面培养基(培养基A)中活化菌种，在微生物培养箱中37℃培养24h得到活化的菌种。
活化菌种接种于25mL种子液体培养基(培养基B)中(250mL锥形瓶)，在摇床中35℃好氧培养12h得到一级种子液。
种子液按照0.5％的接种量接种至发酵培养基(培养基F2)中(500mL锥形瓶含50mL培养基，或者发酵罐装液量在75％-90％)，在37℃好氧发酵48h，不动杆菌合成亚硝酸(亚硝酸盐)还原酶。
3、菌体收集及破胞制备粗酶液
发酵结束后利用离心机15000g×10min离心收集菌体。收集的菌体利用生理盐水洗涤，得到的细胞悬混于破胞抽提液(破胞抽提液P)，利用高压匀浆机下破胞。破胞液在4℃下利用高速离心机25000g×15min离心收集收集破胞清液。所得到的破胞清液为亚硝酸(亚硝酸盐)还原酶酶液。参考Martínez-Espinosa的方法，测定产物的酶活。1mL发酵液所收集的菌体破胞后酶活为2500U。
4、酶制剂
将所得到的粗酶液进一步利用截留分子量为10kD超滤膜浓缩，利用硫酸铵沉淀分离纯化，利用0.01MPa下30℃减压蒸发干燥得到固体酶。
根据用途与使用条件制备成各种不同活性、纯度和剂型的酶制剂产品。
实施例3
1、按照上述配方配制菌种活化培养基A、种子培养基B、发酵培养基F3和破胞抽提液P。其中，发酵培养基F3：淀粉20g/L、玉米浆干粉10g/L、亚硝酸钠10g、磷酸氢二钾5g/L、硫酸铵5g/L、七水合硫酸镁0.4g/L，去离子水1000mL，pH7.0。121℃下灭菌30min。
2、菌种活化、种子制备、发酵产酶
从保藏的菌种管中把不动杆菌(DSM 6962)接种于琼脂平面培养基(培养基A)中活化菌种，在微生物培养箱中37℃培养24h得到活化的菌种。
活化菌种接种于25mL种子液体培养基(培养基B)中(250mL锥形瓶)，在摇床中35℃好氧培养12h得到一级种子液。
种子液按照0.5％的接种量接种至发酵培养基(培养基F)中(500mL锥形瓶含50mL培养基，或者发酵罐装液量在75％-90％)，在37℃好氧发酵48h，不动杆菌合成亚硝酸(亚硝酸盐)还原酶。
3、菌体收集及破胞制备粗酶液
发酵结束后利用离心机15000g×10min离心收集菌体。收集的菌体利用生理盐水洗涤，得到的细胞悬混于破胞抽提液(破胞抽提液P)，利用高压匀浆机下破胞。破胞液在4℃下利用高速离心机25000g×15min离心收集收集破胞清液。所得到的破胞清液为亚硝酸(亚硝酸盐)还原酶酶液。参考Martínez-Espinosa的方法，测定产物的酶活。1mL发酵液所收集的菌体破胞后酶活为2500U。
实施例4亚硝酸还原酶酶学特性分析
分别以pH 7.0、温度30℃条件下测定的酶活为100％酶活，检测亚硝酸还原酶在不同pH及温度下的相对酶活。
结果如图1和图2所示，由图1可以看出，当pH为7.5时，其相对酶活达到146.43％，而当pH为6.0时，其相对酶活仅为32.145％。温度方面，由图2可以看出，以30℃下酶活为100％酶活时，各温度下测得的相对酶活均低于100％，且随着温度的升高，酶活下降趋势加快。
本实施例中还探索了金属离子对亚硝酸还原酶的影响：6种不同金属离子对亚硝酸还原酶活性的影响如图3所示，以不加金属离子时的酶活力为100％(图中以Blank指代)，当离子浓度为1mM时，金属离子对亚硝酸盐还原酶活力表现出不同的作用，其中Mg2+和Fe2+表现出促进作用，且Mg2+>Fe2+，而Zn2+、Mn2+、Ca2+、K+表现出抑制作用，且抑制大小为K+>Ca2+>Zn2+>Mn2+。
综上：亚硝酸还原酶的最适反应温度为30℃，最适pH为7.5，金属离子Mg2+和Fe2+对酶活表现促进作用，而Zn2+、Mn2+、Ca2+、K+有不同程度的抑制作用。
本实施例中还利用米氏方程模拟其动力学方程，各实施例的产品动力学参数相一致，Km值为407.7±5.7nmol/mL，Vmax值为18.5±1.2nmol/min。
此外，亚硝酸还原酶的蛋白分子量大小约为92.4kDa，本申请中对获得的粗酶液进行SDS-PAGE电泳检测，结果显示，在92.4kDa处出现条带，与预期相符，电泳图见图4所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种制备亚硝酸还原酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：将不动杆菌菌种接种于种子液体培养基中，好氧培养得到一级种子液，一级种子液接种于发酵培养基中，接种比例为0.5％-10％，好氧发酵，发酵结束后，收集菌体破胞，上清液为含亚硝酸还原酶的粗酶液；所述不动杆菌为不动杆菌CGMCC 1.12996、ATCC 29064或DSM 6962；所述发酵培养基中含亚硝酸盐；所述好氧发酵温度为30-40℃，时间为12h以上。
2.根据权利要求1所述的制备亚硝酸还原酶的方法，其特征在于：还包括对粗酶液浓缩、纯化或干燥的步骤。
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