CN111635402B

CN111635402B - 吡咯喹啉醌的分离纯化方法

Info

Publication number: CN111635402B
Application number: CN202010590310.9A
Authority: CN
Inventors: 赵燕; 张葵
Original assignee: CHONGQING DAXIN PHARMACEUTICAL CO LTD; Peking University Founder Group Co Ltd; PKU Healthcare Industry Group
Current assignee: CHONGQING DAXIN PHARMACEUTICAL CO LTD; New Founder Holdings Development Co ltd; Peking University Medical Management Co ltd
Priority date: 2020-06-24
Filing date: 2020-06-24
Publication date: 2021-04-30
Anticipated expiration: 2040-06-24
Also published as: CN111635402A

Abstract

本发明提供一种吡咯喹啉醌的分离纯化方法，包括：(1)预处理：将含有吡咯喹啉醌的发酵液经过滤得到的滤液在酸性条件下除蛋白质后，经超滤和纳滤浓缩，得到吡咯喹啉醌浓缩液；(2)萃取‑反萃取：向浓缩液中加入草酸，并控制体系pH为2.0‑3.0，用有机溶剂萃取，得到萃取液；用pH为2.0‑3.0的缓冲液对萃取液进行反萃取，得到反萃液；其中，草酸的加入量与浓缩液的质量体积比为(0.1‑1g):100mL；(3)结晶‑脱色‑重结晶：将反萃液进行结晶，得到粗品晶体；对粗品晶体实施脱色处理和重结晶，得到吡咯喹啉醌产品。本发明能够高效提取吡咯喹啉醌，且具有工艺简单、成本低等优点。

Description

吡咯喹啉醌的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及一种吡咯喹啉醌的分离纯化方法，属于微生物发酵制药领域。

背景技术

吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)，化学名称为4,5-二氢-4,5-二氧化-1-氢吡咯(2,3f)醌-2,7,9-三羧酸，别名Methaxatin，是一种新型辅酶。1979年Salisbury等人首次从甲基营养菌中分离，并确定其为在细菌细胞中作为膜结合脱氢酶的氧化还原辅因子，它与呼吸链电子传递，也是一种新的B族维生素。新近一些研究发现PQQ具有异常高的氧化还原循环能力，在抗神经细胞衰老和抗癌等方面有很大应用潜力。同时，2008年，美国食品和药物管理局(FDA)批准了以PQQ为主要成分的促进认知功能食品。因此，PQQ作为药物或功能食品具有很好的应用前景。其结构式如下所示：

目前，PQQ的生产方法主要是化学合成法及发酵法，化学合成法步骤多、副产物多且难以去除，在国内安全环保要求越来越严格的情况下，微生物发酵法生产PQQ具有巨大的成本优势。

从发酵液中提纯PQQ是研究重点之一，已经报道的有，武汉大学的赵永芳等人使用DEAE-葡聚凝胶吸附解吸，得到的洗脱液浓缩得到粗品，粗品结晶，再用Seppak C18柱进行吸附解吸，浓缩解吸液得到纯化品，但是此工艺使用的DEAE-葡聚凝胶和Seppak C18都比较昂贵，大规模生产成本很高；也有公开使用三菱的HP20树脂取代价格比较昂贵的DEAE-葡聚凝胶对PQQ发酵过滤液进行纯化，但是其只是对这两种填料在PQQ的回收率上进行了对比，并未给出分离后PQQ的纯度，也未提及后续的纯化，即，该纯化方法在尝试降低操作和材料成本的基础上，并未说明对于所得到PQQ纯度的影响，或者说为了解决量产问题而降低纯度要求。此外，中国专利文献CN107056782A公开了一种甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌的分离纯化方法，该方法中，将发酵液先经大孔树脂富集，依次采用缓冲液和水洗脱后，再用亲水性硅胶填料纯化，得到吡咯喹啉醌母液，随后经结晶、采用碱溶酸沉法重结晶后，得到吡咯喹啉醌；CN110698472A公开了一种吡咯喹啉醌的纯化方法，该方法中，使含有吡咯喹啉醌的发酵液经预处理得到的滤液通过聚酰胺树脂，然后用酸性水溶液冲洗，漏出液废弃，然后将聚酰胺树脂用酸和盐的混合水溶液进行解析，收集色谱纯度90％以上的解析液，对解析液依次进行超滤、纳滤浓缩、结晶、干燥，得到吡咯喹啉醌。上述两种方法采用层析手段，产品纯化周期长，且使用过后的树脂需要再生(如CN107056782A中的使用过后的大孔树脂上会有明显的死吸附，每次使用完必须用高浓度有机溶剂(例如丙酮、95％以上浓度的乙醇等)再生才能保证下次的分离性能)，洗脱液(或冲洗液)用量大，整个工艺较为复杂、成本高。中国专利文献CN105294687A公开了一种离子对双水相萃取分离吡咯喹啉醌的方法，该方法采用由离子对试剂和磷酸氢钠缓冲液组成的离子对双水相萃取体系对含有吡咯喹啉醌的混合液进行萃取，将得到的富含吡咯喹啉醌的有机层上阴离子交换树脂，依次用双蒸水、稀酸冲洗，收取稀酸部位，冷冻干燥后，将所得吡咯喹啉醌粗品用超纯水溶解，调pH3-4后，加入乙醇，搅拌后静置得吡咯喹啉醌，该方法使用含有离子对试剂的离子对双水相萃取体系，且上阴离子交换树脂冲洗，也会导致大量的双蒸水、稀酸的使用，依然存在工艺复杂、周期长、成本高等缺陷；CN104892597A公开了一种络合萃取法分离纯化发酵液中的吡咯喹啉醌，该方法使用含有三辛胺(络合剂)的双溶质萃取体系对发酵液经离心分离后的上清液进行络合萃取，然后使用氨水反萃，经减压浓缩、冷冻干燥后得吡咯喹啉醌粗品，将粗品用超纯水溶解，调pH3-4后，加入乙醇，在20-25℃搅拌5-6h，然后静置12-24h，得到吡咯喹啉醌，该过程使用含有三辛胺的双溶质萃取体系，且也需要使用大量的乙醇等有机溶剂，存在工艺复杂、成本高等缺陷。

因此，开发新的吡咯喹啉醌的分离纯化方法，简化分离纯化工艺、降低成本，并保证甚至提升吡咯喹啉醌的纯度和收率，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种吡咯喹啉醌的分离纯化方法，以至少克服现有技术所存在的工艺复杂、成本高等缺陷。

本发明提供一种吡咯喹啉醌的分离纯化方法，包括：

(1)预处理：将含有吡咯喹啉醌的发酵液经过滤得到的滤液在酸性条件下除蛋白质后，经超滤和纳滤浓缩，得到吡咯喹啉醌浓缩液；

(2)萃取-反萃取：向浓缩液中加入草酸，并控制体系pH为2.0-3.0，用有机溶剂萃取，得到萃取液；用pH为2.0-3.0的缓冲液对萃取液进行反萃取，得到反萃液；其中，草酸的加入量与浓缩液的质量体积比为(0.1-1g):100mL；

(3)结晶-脱色-重结晶：将反萃液进行结晶，得到粗品晶体；对粗品晶体实施脱色处理和重结晶，得到吡咯喹啉醌产品。

本发明提供的分离纯化方法，工艺简单、成本低，且能够保证甚至提升吡咯喹啉醌产品的纯度和收率。发明人经研究分析认为，预处理过程可初步除去滤液中的蛋白质和色素等杂质，并对滤液进行浓缩，保证后续处理的顺利进行；萃取-反萃取过程中，低浓度草酸可以沉淀浓缩液中的高价金属离子，破坏一些多羧基多氨基杂质通过金属离子与吡咯喹啉醌的交联，从而大大提高萃取效率，去除大量杂质，并提升吡咯喹啉醌的纯度和收率，同时采用与浓缩液体系pH相同的缓冲液进行反萃取，可以利用缓冲液的高盐浓度将大量与吡咯喹啉醌的极性等性质相近的杂质留在有机相中，进一步保证了吡咯喹啉醌的纯度及收率；在结晶-脱色-重结晶过程中，反萃液中含有的盐对吡咯喹啉的结晶起到盐析作用，能够提高结晶(第一次结晶)的效率，随后经脱色处理进一步除去有色杂质，并经重结晶后得到高纯度和较高收率的吡咯喹啉醌产品；此外，上述各步骤协同配合，还能够显著减少试剂/溶剂的使用量，即节约成本也减少环保压力。

研究发现，加草酸萃取及低pH缓冲液反萃取阶段可以去除大量杂质，产品纯度大幅提高，颜色去除较多，配合后续二次结晶(结晶-脱色-重结晶)，保证了高纯度吡咯喹啉醌的制备，同时兼顾其收率的提高。

进一步地，在本发明的一实施方式中，上述草酸的加入量与浓缩液的质量体积比可以为(0.1-0.5g):100mL，或(0.1-0.3g):100mL。

本发明中，所述发酵液可以是常规微生物发酵法产生PQQ的发酵液，微生物发酵法能大量产生PQQ的微生物主要有甲基杆菌属(Methylobacterium)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、食甲基菌(Methylovorus)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)等，本发明的发酵液具体可以是由该些菌发酵培养得到。

本发明可采用本领域常规方法对上述发酵液进行过滤得到上述滤液，以去除大量色素和蛋白质等固体杂质，比如上述滤液具体可以是由发酵液经陶瓷膜过滤或板框过滤得到。在本发明的具体实施过程中，一般可以控制发酵液的pH为6-8，进一步可以控制其pH为7-8，此时对发酵液实施过滤，利于提高上述滤液中吡咯喹啉醌的含量，进一步提升吡咯喹啉醌产品的纯度及收率。

经滤除大颗粒物的滤液，调节至酸性条件下进一步除蛋白质，一般是利用滤液中蛋白质的等电点，使蛋白质在接近或等于其等电点的pH条件下析出，进而可以通过过滤等方式将其除去，根据本申请的研究，滤液中大部分蛋白质的等电点pH为3-4左右，具体实施时，一般可以在pH为2.0-4.5或3.0-4.0的条件下除蛋白质。

具体地，可以通过盐析沉淀法除蛋白质，例如，在本发明的一实施方式中，除蛋白质过程可以包括：向滤液中加入无机盐，并调节体系pH为2.0-4.5或3.0-4.0，使液体中的蛋白质析出；其中，无机盐的加入量与滤液的质量体积比为(0.5-3g)：100mL。发明人研究发现，该过程中加入上述特定量的无机盐，不仅可以通过盐析作用使更多的蛋白质沉淀，还可以提高吡咯喹啉醌产品的收率及纯度，推测低浓度无机盐的存在对吡咯喹啉醌有助溶作用，可以减少蛋白质析出时夹带的吡咯喹啉醌的量，从而保证了吡咯喹啉醌产品收率及纯度的提高。具体地，上述过程中，调节体系pH后进行沉淀(使蛋白质析出)至基本不再有沉淀物析出时实施过滤，除去析出的蛋白质等沉淀物，具体实施过程中一般沉淀1小时左右；上述无机盐可以是本领域常用无机盐，比如可以是氯化钠等。

超滤和纳滤浓缩进一步去除滤液中的蛋白质和色素等杂质，并实现对滤液的浓缩，在本发明的具体实施过程中，一般可以采用截留分子量为5000Da的超滤膜进行超滤；和/或，采用截留分子量为100-200Da的纳滤膜进行纳滤浓缩。一般情况下，纳滤浓缩至所得浓缩液中吡咯喹啉醌的含量为800-1500μg/mL，利于后续处理。

本发明中，一般可以对浓缩液进行1-3次萃取；和/或，对萃取液进行1-3次反萃取。其中，萃取时所用有机溶剂具体可以包括乙酸丁酯和正丁醇等，优选正丁醇。

经进一步研究，上述缓冲液具体可以是至少由水和以下两种盐并调节pH为2.0-3.0而形成：第一种盐选自氯化钠和氯化铵中的至少一种，第二种盐选自醋酸铵、草酸铵和磷酸铵中的至少一种。其中，第二种盐主要起缓冲作用，第一种盐可以增加吡咯喹啉醌在上述pH条件的缓冲液中的溶解度，避免在反萃取过程中有析出现象。上述缓冲液可采用本领域常规方法配制，具体实施时，可以先将水和上述两种盐形成混合溶液，然后用酸调节其pH为2.0-3.0，得到上述缓冲液。

进一步地，在本发明的一实施方式中，上述缓冲液中，第一种盐的质量浓度具体可以为3-10％，进一步可以为5-8％，第二种盐的质量浓度可以为0.5-1％，可以进一步提高反萃取效率以及利于后续结晶处理。

在本发明的一实施方式中，可以将反萃液于50±5℃条件下减压浓缩至开始有晶体析出后再降温结晶，得到粗品晶体；该过程中，将反萃液减压浓缩后再降温结晶，可以利用其低pH和盐浓度自然析出晶体(呈红色)。一般情况下，可将减压浓缩至开始有晶体析出的反萃液降温至10±5℃，于该温度条件下进行结晶，利于提升得到的粗品晶体的纯度及收率；其中可控制降温过程中的降温速率为3-5℃/h。具体实施时，比如可以将减压浓缩至开始有晶体析出的反萃液置于35±5℃水浴条件下并从35±5℃开始逐渐降低水浴温度以进行上述降温过程，至降至10±5℃保温进行结晶，通常保温4-6小时即可结晶完成(基本没有晶体析出)。

进一步地，上述脱色处理和重结晶过程可以包括：将粗品晶体溶于水中，向所得溶液中加入活性炭进行脱色，得到脱色液；调节所述脱色液的pH为3.0±0.5，使吡咯喹啉醌结晶析出，得到吡咯喹啉醌产品。该过程在吡咯喹啉醌的等电点(pH＝3.0±0.5)进行结晶，利于进一步保证吡咯喹啉醌产品的纯度和收率。具体实施时，可以调节上述溶液的pH为6.0-8.5、进一步可以为7-8，利于脱色处理和吡咯喹啉醌的溶解度；一般脱色20min-1h，比如30min，可基本脱除杂质颜色，随后过滤得到脱色液；可用盐酸、硫酸等无机酸调节脱色液的pH为3.0±0.5；调节脱色液的pH为3.0±0.5后进行结晶，通常4-6小时即可结晶完成(基本没有晶体析出)。

进一步地，控制溶液中吡咯喹啉醌的浓度为5-10g/mL，进一步可以为5-9g/mL；和/或，活性炭的加入量与溶液的质量体积比为(0.1-0.5g)：100mL，更利于脱色和结晶处理。在本发明的一实施方式中，活性炭的加入量与溶液的质量体积比为(0.3-0.5g)：100mL。

本发明中，可以采用本领域常用酸或碱调节pH，比如，调节pH所用的酸可以选自盐酸、硫酸、醋酸、草酸等，调节pH所用碱可以选自氨水、氢氧化钠等。本发明中，若无特别说明，所用试剂/溶剂可商购或通过本领域常规方法自制。

本发明的实施，至少具有以下有益效果：

本发明提供的吡咯喹啉醌的分离纯化方法，整个工艺中不涉及层析，简单易操作，周期短，且各步骤协同配合，整个工艺所用试剂/溶剂的量大大减少，且所用试剂/溶剂来源广泛，成本低廉，毒性较低，能够显著降低成本并减少环保压力；并且本发明分离纯化方法能够实现对吡咯喹啉醌的高效提取，兼顾达到较高的纯度和收率，研究表明，采用本发明的分离纯化方法，从发酵液中提取吡咯喹啉醌，得到的吡咯喹啉醌产品的纯度大于99％，收率不低于60％，较多地在70％左右。因此，本发明的分离纯化方法更利于工业化生产吡咯喹啉醌。

附图说明

图1为一对比试验的反萃取过程的分层示意图；

图2为本发明一实施例的反萃取过程的分层示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

取发酵液30升，调节其pH为7.5，经板框过滤，得到板框滤液58升，用以以下实施例1-3。其中发酵液由生丝微菌属发酵培养得到。

实施例1

本实施例所用缓冲液(8％NaCl-1％NH₄Ac-PH2.0)按照如下过程配制：将水、氯化钠、醋酸铵配制成混合液，采用盐酸调节其pH为2.0，得到缓冲液；其中，氯化钠的质量浓度为8％，醋酸铵的质量浓度为1％。

取10升板框滤液，向其中加入0.05克氯化钠，调节PH为3.5后进行沉淀1小时，过滤除去沉淀物，得到滤液(约10.3升，记为沉淀后滤液)；将上述沉淀后滤液经截留分子量为5000Da的超滤膜超滤后，再经截留分子量为100-200Da的纳滤膜纳滤浓缩至体积为5升的浓缩液(浓缩液中吡咯喹啉醌的含量约为6～7克)；

向上述浓缩液中加入15克草酸，调节PH为2.0后，加入5升正丁醇进行萃取，得到萃取液；向萃取液中加入8％NaCl-1％NH₄Ac-PH2.0反萃取2次，每次缓冲液的加入量为5升，得到反萃液(约12升)；

将反萃液置于50℃、-0.09MPa真空下减压浓缩至析出红色PQQ沉淀，然后置于35℃水浴锅中并从35℃开始降温，控制降温速率为5℃/h，降至至10℃后，于10℃保温5小时(基本无晶体析出)，分离得到粗品晶体(未干燥的潮晶)；

将粗品晶体用水溶解至689毫升(8010ug/mL)，调节所得溶液(记为粗品晶体溶解液)的pH为7.5，加入约2.1g活性炭脱色30分钟，过滤，得到脱色液；调节脱色液的PH为3.0进行二次结晶(重结晶)，5小时后分离，将得到的晶体(潮晶)于60℃，-0.09MPa真空干燥，得到吡咯喹啉醌产品(约5.17克)。经检测，该吡咯喹啉醌产品的纯度约为99.55％，从板框滤液中的PQQ量算起，本实施例吡咯喹啉醌产品的总收率为70.6％，折算回发酵液(即从发酵液中的PQQ量算起)总收率为66.3％；结果具体如表1所示。

表1各样品中PQQ的含量(单位)、纯度、重量及收率结果

样品	单位(ug/mL)	纯度(％)	重量(g)	分步收率<sup>d</sup>(％)
					发酵液	1507	73.02<sup>a</sup>	45.21<sup>b</sup>	——
板框滤液	732	72.59<sup>a</sup>	42.45<sup>c</sup>	93.89
					沉淀后滤液	637	77.32<sup>a</sup>	6.59	90.0
反萃液	490	88.57<sup>a</sup>	5.92	89.83
					粗品晶体溶解液	8010	98.35<sup>a</sup>	5.52	93.24
吡咯喹啉醌产品	——	99.55	5.17	93.65

a表示采用高效液相色谱法测得上述各样品中的PQQ的纯度；b表示30升发酵液中PQQ的重量；c表示58升板框滤液中PQQ的重量；d表示分步收率的算法如下(以板框滤液对应的分步收率为例说明)：板框滤液对应的分步收率(93.89％)＝板框滤液中PQQ的重量(42.45g)/发酵液中PQQ的重量(45.21g)×100％。

实施例2

取10升板框滤液，向其中加入0.05克氯化钠，调节PH为4.0后进行沉淀1小时(使蛋白质析出)，过滤除去沉淀物，得到滤液(约10.5升，记为沉淀后滤液)；将该滤液经截留分子量为5000Da的超滤膜超滤后，再经截留分子量为100-200Da的纳滤膜纳滤浓缩至体积为4.22升的浓缩液(浓缩液中PQQ的含量约为6-7克)；

向该浓缩液中加入8.4草酸，调节PH为2.0后，加入5升正丁醇进行萃取，得到萃取液；向萃取液中加入8％NaCl-1％NH₄Ac-PH2.0反萃取2次，每次缓冲液的加入量为5升，得到反萃液(约12升)；

将反萃液置于50℃、-0.09MPa真空下减压浓缩至析出红色晶体，然后置于35℃水浴锅中并从35℃开始降温，控制降温速率为5℃/h，降至10℃后，于10℃保温5小时(基本无晶体析出)，分离得到粗品晶体(未干燥的潮晶)；

将粗品晶体用水溶解至700毫升(8231ug/ml)，调节所得溶液(记为粗品晶体溶解液)的pH为7.5，加入约2.1g活性炭脱色30分钟，过滤，得到脱色液；调节脱色液的pH为2.8二次结晶(重结晶)，5小时后分离，将得到的晶体(潮晶)于60℃，-0.09MPa真空干燥，得到吡咯喹啉醌产品(约5.38克)。经检测，该吡咯喹啉醌产品的纯度约为99.32％，从板框滤液中的PQQ量算起，本实施例吡咯喹啉醌产品的总收率为73.5％，折算回发酵液总收率为69％；结果具体如表2所示。

表2各样品中PQQ的含量、纯度、重量及收率结果

样品	单位含量(ug/mL)	纯度(％)	重量(g)	分步收率<sup>d</sup>(％)
					板框滤液	732	72.59<sup>a</sup>	42.45<sup>c</sup>	——
沉淀后滤液	651	77.01<sup>a</sup>	6.84	93.4
					反萃液	500.2	89.22<sup>a</sup>	6.06	88.60
粗品晶体溶解液	8231.2	98.29<sup>a</sup>	5.76	95.05
					吡咯喹啉醌产品	——	99.32<sup>a</sup>	5.38	93.4

a表示采用高效液相色谱法测得上述各样品中的PQQ的纯度；c表示58升板框滤液中PQQ的重量；d表示分步收率的算法如下(以沉淀后滤液对应的分步收率为例说明)：

实施例3

本实施例进行如下反萃取对比验证实验：

取10升板框滤液，向其中加入0.05克氯化钠，调节PH为3.5后进行沉淀1小时，过滤除去沉淀物，得到滤液(约10.3升)；将该滤液经截留分子量为5000Da的超滤膜超滤后，再经截留分子量为100-200Da的纳滤膜纳滤浓缩至体积为5.2升的浓缩液(浓缩液中PQQ的含量约为6-7g)；向该浓缩液中加入15g草酸，调节PH为2.0后，加入5升正丁醇进行萃取，得到萃取液；

取4升上述萃取液，将其平分成2份，编号A、B，分别进行试验1和试验2：

试验1：所用缓冲液(1％NH₄AC-PH为4.0)按照如下过程配制：将醋酸铵溶于水中，并用盐酸调节pH为4.0，得到缓冲液；其中，醋酸铵的质量浓度为1％；

向萃取液A中加入2升1％NH₄AC-PH为4.0进行反萃取，得到反萃液B；该过程中，下层颜色明显比上层颜色更深(如图1所示)。

试验2：向萃取液B中加入2升8％NaCl-1％NH₄Ac-PH2.0反萃2次，得到反萃液B。该过程中，上层颜色明显比下层颜色更深(如图2所示)。

反萃取结果如表3所示。

表3各样品中PQQ的含量、纯度、重量及收率结果

从反萃取过程中分层颜色可以直观看到，试验1和试验2将PQQ产品从有机相反萃入水相(下层)，试验2水相颜色明显降低，试验2能够去除大量色素等杂质，相对试验1可以显著提高PQQ的纯度；此外，表3结果进一步表明，采用8％NaCl-1％NH₄Ac-PH2.0对萃取液进行反萃取(试验2)，能够极大提高PQQ的纯度。

Claims

1.一种吡咯喹啉醌的分离纯化方法，其特征在于，包括：

所述除蛋白质的过程包括：向所述滤液中加入无机盐，调节体系pH为2.0-4.5，使滤液中的蛋白质析出；其中，所述无机盐的加入量与滤液的质量体积比为(0.5-3g)：100mL；

(2)萃取-反萃取：向所述浓缩液中加入草酸，并控制体系pH为2.0-3.0，用有机溶剂萃取，得到萃取液；用pH为2.0-3.0的缓冲液对所述萃取液进行反萃取，得到反萃液；其中，所述草酸的加入量与浓缩液的质量体积比为(0.1-1g):100mL；

所述有机溶剂选自乙酸丁酯和正丁醇中的至少一种；

所述缓冲液至少由水和以下两种盐并调节pH为2.0-3.0而形成：第一种盐选自氯化钠和氯化铵中的至少一种，第二种盐选自醋酸铵、草酸铵和磷酸铵中的至少一种；

(3)结晶-脱色-重结晶：将所述反萃液于50±5℃条件下减压浓缩至开始有晶体析出后再降温结晶，得到粗品晶体；对所述粗品晶体实施脱色处理和重结晶，得到吡咯喹啉醌产品；

所述脱色处理和重结晶过程包括：将粗品晶体溶于水中，调节所得溶液的pH为6.0-8.5，向所得溶液中加入活性炭进行脱色，得到脱色液；调节所述脱色液的pH为3.0±0.5，使吡咯喹啉醌结晶析出，得到吡咯喹啉醌产品。

2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，采用截留分子量为5000Da的超滤膜进行超滤，和/或，采用截留分子量为100-200Da的纳滤膜进行纳滤浓缩。

3.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，纳滤浓缩至得到的吡咯喹啉醌浓缩液中吡咯喹啉醌的含量为800-1500μg/mL。

4.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述缓冲液中，所述第一种盐的质量浓度为3-10％，第二种盐的质量浓度为0.5-1％。

5.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，控制所述溶液中吡咯喹啉醌的浓度为5-10g/L；和/或，活性炭的加入量与所述溶液的质量体积比为(0.1-0.5g)：100mL。

6.根据权利要求1-5任一项所述的分离纯化方法，其特征在于，控制所述发酵液的pH为6-8；和/或，所述滤液由发酵液经陶瓷膜过滤或板框过滤得到。