JP2010517551A - 細菌を検出および/または同定するための培地 - Google Patents
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Abstract
a)細菌コロニーを得るために、トリプトファン及び大多数の大腸菌によって発現される酵素Aのための基質を含む検出培地上に大腸菌を含みやすい生物試料を接種をすること;
b)酵素Aの活性を発現しているコロニーを検出し、大腸菌としてそれらを同定すること;および
c)酵素Aの活性を発現しないコロニーを検出して、インドールテストを実施して、インドールテスト陽性を有するコロニーを大腸菌として同定することを含む、生物試料中の大腸菌(エシェリキア・コリ)を検出および/または同定する方法に関する。
Description
大腸菌(エシェリキア・コリ)という種は、消化管において最も優勢的な好気性の種である。しかしながら、水中の前記細菌の存在は糞便の混入の指示となり、特定の菌株は病原性であり、腹膜、胆管、虫垂、又は生殖器の化膿の原因となる。
大腸菌の早期の特異的な検出は、治療に関して、汚染除去、その他の適切な解決法を提案することを可能にする。
この検出は、検出することが求められる細菌の酵素活性等の標的代謝活性とされる代謝に特異的な基質を含む検出培地の使用に特に基づくことができ、すなわち基質の選択を介して、反応があるか否かに応じて、微生物の性質を特徴づけることが可能である。
しかしながら、この培地が優れた特異性を有する一方で、大腸菌の検出のためのβ‐グルクロニダーゼ基質の使用は、この活性を発現しないごく一部の大腸菌の菌株(5−10%)の存在のために不完全な感受性を呈する。さらにまた、特定のシトロバクター属の菌株も、大腸菌のコロニーと同じ色のβ−グルクロニダーゼ陽性コロニーを作ることができる。
驚くべきことに、発明者は、適切な追加テストは、大腸菌の迅速で簡単な検出を可能にすることを示した。
より具体的には、発明者は標的代謝活性を発現しない大腸菌に実施したインドールテストが、テストの感度を増大できることを示した。
この培養培地は、チューブまたはフラスコまたはシャーレ上に播種の準備ができている、液体形態または使用準備済みのゲル形態であってもよい。
本発明の目的において、検出は、液体培地、一片(a strip)または他の固体支持体で行われ得る。
基質は特に代謝基質、例えば炭素または窒素源であってもよく、代謝の生成物のうちの1つの存在下で呈色反応を生じる指示薬に結合されてもよい。
また、基質は酵素基質であってもよく、すなわち基質は微生物の直接的または間接的な検出を可能にする生成物を与えるために酵素によって加水分解され得る基質であってもよい。この基質は、明らかにされる酵素活性に特異的な第1の部分及び標識として作用する第2の部分(以下では標識部分とする)を含んでもよい。この標識部分は色素生産性、蛍光発生性、発光性等でもよい。
固体支持体(フィルター、寒天、電気泳動ゲル)に適している色素生産性基質として、オキシダーゼ(osidase)とエステラーゼ活性の検出を可能にする、インドキシルとその誘導体を主成分とした基質、及びヒドロキシキノリン又はエスクレチンとそれらの誘導体を主成分とした基質を挙げることが出来る。また、ニトロフェノール及びニトロアニリン及びその誘導体を主成分とする基質を挙げることができ、ニトロフェノールに基づく基質の場合はオキシダーゼとエステラーゼ活性を検出するためであり、ニトロアニリンに基づく基質の場合はペプチダーゼ活性を検出するためである。最後に、ナフトールとナフチルアミンとそれらの誘導体を主成分とする基質を挙げることができ、ナフトールによってオキシダーゼとエステラーゼ活性を検出することが可能であり、ナフチルアミンによってペプチダーゼ活性を検出することが可能である。この基質は、オキシダーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ等の活性のような酵素活性の検出を特に可能にすることができるが、これに制限されるものではない。
また、酵素基質は、その加水分解の生成物が直接的または間接的に検出される天然の基質であってもよい。天然の基質としては、特に、トリプトファナーゼまたはデアミナーゼ活性を検出するためのトリプトファン、デアミナーゼ活性を検出するための環状アミノ酸(トリプトファン、フェニルアラニン、ヒスチジン、チロシン)、ホスホリパーゼ活性を検出するためのホスファチジルイノシトール等を挙げることができる。
指示作用により、β−グルクロニダーゼ活性を検出するために使用する基質は、特に4−メチルウンベリフェリル−β−グルクロニド、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−グルクロニド、5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−β−グルクロニド、6−クロロ−3−インドリル−β−グルクロニド、アリザリン−β−グルクロニドまたはシクロヘキセノエスクレチン−β−グルクロニド、またはその塩類であってもよい。
β−グルコシダーゼ活性を検出するために使用する基質は、特に4−メチルウンベリフェリル−β−グルコシド、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−グルコシド、5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−β−グルコシド、6−クロロ−3−インドリル−β−グルコシド、アリザリン−β−グルコシド、シクロヘキセノエスクレチン−β−グルコシド、ニトロフェニル−β−グルコシドまたはジクロロアミノフェニルグルコシドまたはその塩類であってもよい。
α−ガラクトシダーゼ基質として、4−メチルウンベリフェリル−α−ガラクトシド、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−α−ガラクトシド、5−ブロモ−6クロロ−3−インドリル−α−ガラクトシド、6−クロロ−3−インドリル−α−ガラクトシド、アリザリン−α−ガラクトシドまたはニトロフェニル−α−ガラクトシドまたはその塩類であってもよい。
当業者は、大多数の大腸菌の菌株によって発現される多数の活性を承知している。いくつかは、特に、the Manual of Clinical Microbiology、第7版(P. R. Murray 等、1999)、更に、ビオメリュー同定生成物データベース(api 20E, ID 32E, rapid ID 32等)に記載されている。
大多数の大腸菌によって発現される酵素のために、特にβ−グルクロニダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−リボシダーゼ、ホスファターゼ、L−アラニンアミノペプチダーゼ、L−ロイシンアミノペプチダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ラクトース酸性化酵素またはトリプトファナーゼを挙げることが出来る。
また、これらの活性は当業者に知られており、それらの一部は前述の資料に記載されている。特に、β−グルコシダーゼ、N−アセチルヘキソサミニダーゼ、エステラーゼ、スルファターゼ、β−セロビオシダーゼ、α−グルコシダーゼ、デアミナーゼ、オキシダーゼ、色素合成酵素、β−アラニン・アミノペプチダーゼまたはエラスターゼを挙げることが出来る。
・β−グルクロニダーゼの場合は、好ましくはグルクロネート及びメチル−β−グルクロニドから選択されるグルクロニドを挙げることができる;
・β−ガラクトシダーゼの場合は、好ましくはラクトースとイソプロピル−β−チオガラクトシドから選択されるβ‐ガラクトシドを挙げることができる;
・β−グルコシダーゼの場合は、グルコースにβ位において結合する炭水化物で構成される炭水化物、またはβグルコシドサブユニットを有する炭水化物、特にセロビオース、セルロース、デンプン、セロトリオースまたはトレハロースを挙げることができる。また、メチル−β−グルコシド、イソプロピル−β−チオグルコシド、インドキシル−β−グルコシドまたはメチル−β−チオグルコシドを挙げてもよく、
・α−ガラクトシダーゼの場合は、好ましくはメリビオースとメチル−α−ガラクトシドから選ばれるα−ガラクトシドを挙げることができる。
a)細菌コロニーを得るために、大腸菌を含みやすい生物試料を、トリプトファンと大多数の大腸菌によって発現される酵素Aのための基質を含む検出培地上に接種をすること;
b)酵素Aの活性を発現する大腸菌を検出し、大腸菌として、それらを同定すること;及び
c)酵素Aの活性を発現しないコロニーを検出して、インドールテストを実施して、インドールテスト陽性を有するコロニーを大腸菌として同定することを含む方法に関する。
好ましくは、上記酵素Aのための基質は、10と1000mg/lとの間、好ましくは20と500mg/lとの間の濃度である。
本発明の好ましい一実施形態によれば、検出培地は、また、大多数の大腸菌によって発現されない酵素Bのための基質を含む。
本発明の好ましい一実施形態によれば、酵素Bは、β−グルコシダーゼ、N−アセチルヘキソサミニダーゼ、エステラーゼ、スルファターゼ、β−セロビオシダーゼ、α−グルコシダーゼ、デアミナーゼ、オキシダーゼ、色素合成酵素、β−アラニン・アミノペプチダーゼとエラスターゼから選択される。
好ましくは、酵素Bはβ−グルコシダーゼである。
好ましくは、β−グルコシダーゼ活性のための基質は、好ましくは10と1000mg/lとの間、好ましくは20と500mg/lとの間の濃度の、4−メチルウンベリフェリル−β−グルコシド、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−グルコシド、5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−β−グルコシド、6−クロロ−3−インドリル−β−グルコシド、アリザリン−β−グルコシド、シクロヘキセノエスクレチン−β−グルコシド、ニトロフェニル−β−グルコシドまたはジクロロアミノフェニルグルコシドまたはそれらの塩類から選択される。
好ましくは、前記酵素Bのための基質は、10と1000mg/lとの間、好ましくは20と500mg/lとの間の濃度である。
従って、2つの実施態様が可能である:
・酵素Cが酵素Aと同一である;この場合、基質は異なるべきである。酵素AとCとして、β‐ガラクトシダーゼを挙げることが出来る;この場合、培地は、例えば、酵素Aのための基質としての4−メチルウンベリフェリル−βグルクロニドを、酵素Cのための基質としての5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−βグルクロニドを含む;
・または、酵素Cは酵素Aとは異なる;例えば、酵素Aとしてβ‐ガラクトシダーゼを、酵素Cとしてのα−ガラクトシダーゼと組合わせて、挙げることが出来る。また、酵素Aとしてβ‐ガラクトシダーゼを、酵素Cとしてのβ‐グルクロニダーゼと組合わせて、挙げることが出来る。
好ましくは、酵素Cは、β‐グルクロニダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−リボシダーゼ、ホスファターゼ、L−アラニンアミノペプチダーゼ、L−ロイシン・アミノペプチダーゼ、β‐ガラクトシダーゼから選択される。
好ましくは、酵素Cはβ‐グルクロニダーゼである。好ましくは、β−グルクロニダーゼ活性のための基質は、10と1000mgとの間の濃度の4−メチルウンベリフェリル−β−グルクロニド、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−グルクロニド、5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−β−グルクロニド、6−クロロ−3−インドリル−β−グルクロニド、アリザリン−β−グルクロニドまたはシクロヘキセノエスクレチン−β−グルクロニドまたはそれらの塩類から選択される。
好ましくは、酵素Cはα−ガラクトシダーゼである。好ましくは、α−ガラクトシダーゼ活性のための基質は、10と1000mg/lとの間、好ましくは20と500mg/lとの間の濃度の、4−メチルウンベリフェリル−α−ガラクトシド、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−α−ガラクトシド、5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−α−ガラクトシド、6−クロロ−3−インドリル−α−ガラクトシド、アリザリン−α−ガラクトシドまたはニトロフェニル−α−ガラクトシドから選択される。
好ましくは、前記酵素Cのための基質は、10と1000mg/lとの間、好ましくは20と500mg/lとの間の濃度である。
本発明のこの特定の実施形態において、
・酵素Aのための基質は、好ましくは、10と1000mg/lとの間の濃度の5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−ガラクトシド、5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−β−ガラクトシド、6−クロロ−3−インドリル−β−ガラクトシドまたはアリザリン−β−ガラクトシドであり、
・酵素Bのための基質は、好ましくは、10と1000mg/lとの間の濃度の5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−グルコシド、5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−β−グルコシド、6−クロロ3−インドリル−β−グルコシドまたはアリザリン−β−グルコシドであり、
・酵素Cのための基質は、好ましくは、10と1000mg/lとの間の濃度の5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−α−ガラクトシド、5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−α−ガラクトシド、6−クロロ−3−インドリル−α−ガラクトシドまたはアリザリン−α−ガラクトシドである。
・酵素Aのための基質は、好ましくは、10と1000mg/lとの間の濃度の5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−ガラクトシド、5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−βガラクトシド、6−クロロ−3−インドリル−βガラクトシドまたはアリザリン−β−ガラクトシドであり、
・酵素Bのための基質は、好ましくは、10と1000mg/lとの間の濃度の5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−グルコシド、5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−β−グルコシド、6−クロロ−3−インドリル−β−グルコシドまたはアリザリン−β−グルコシドであり、
・酵素Cのための基質は、好ましくは、10と1000mg/lとの間の濃度の5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−グルクロニド、5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−βグルクロニド、6−クロロ−3−インドリル−β−グルクロニドまたはアリザリン−β−グルクロニドである。
本発明の好ましい一実施形態によれば、酵素A、BまたはCの誘導物質は、100ng/lと10g/lとの間、好ましくは10mg/lと3g/lとの間の濃度である。
酵素AまたはCがβ‐グルクロニダーゼである場合、上記酵素AまたはCの誘導物質は好ましくはグルクロニドであり、好ましくはグルクロネートとメチル−β−グルクロニドから選択される。
酵素AまたはCがβ‐ガラクトシダーゼである場合、上記酵素AまたはCの誘導物質は好ましくはβ−ガラクトシドであり、好ましくはラクトースとイソプロピル−βチオガラクトシドから選択される。
酵素Bがβ−グルコシダーゼである場合、酵素Bの誘導物質は好ましくはβ−グルコシドであり、好ましくはメチル−β−グルコース、セロビオース、セロトリオース、トレハロース、セルロース及びデンプンから選択される。好ましくは、酵素Bの誘導物質は、好ましくは10mg/lと10g/との間の濃度のセロビオースである。
酵素Cがα−ガラクトシダーゼである場合、酵素Cの誘導物質は、好ましくはメリビオースまたはメチル−α−ガラクトシドである。
本発明の好ましい一実施形態によれば、トリプトファン濃度は、0.02g/l以上、好ましくは0.4g/l以上である。
好ましくは、β−グルコシダーゼ活性のための基質は、好ましくは10と1000mg/lとの間、好ましくは20と500mg/lとの間の濃度の4−メチルウンベリフェリル−β−グルコシド、5−ブロモ−4−クロロ3−インドリル−β−グルコシド、5−ブロモ−6−クロロ3−インドリル−β−グルコシド、6−クロロ3−インドリル−β−グルコシド、アリザリン−β−グルコシド、シクロヘキセノエスクレチン−β−グルコシド、ニトロフェニル−β−グルコシドまたはジクロロアミノフェニルグルコシドまたはそれらの塩類から選択される。
好ましくは、β−ガラクトシダーゼ活性のための基質は、好ましくは10と1000mg/lとの間、好ましくは20と500mg/lとの間の濃度の4−メチルウンベリフェリル−β−ガラクトシド、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−ガラクトシド、5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−βガラクトシド、6−クロロ−3−インドリル−βガラクトシド、アリザリン−β−ガラクトシドまたはシクロヘキセノエスクレチン−βガラクトシドまたはそれらの塩類から選択される。
好ましくは、セロビオースは、10mg/lと10g/lとの間の濃度である。
α−ガラクトシダーゼのための基質として、20と1000mg/lとの間の濃度の4−メチルウンベリフェリル−α−ガラクトシド、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−α−ガラクトシド、5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−α−ガラクトシド、6−クロロ−3−インドリル−α−ガラクトシド、アリザリン−α−ガラクトシドまたはニトロフェニル−α−ガラクトシドを特に挙げることが出来る。
また、本発明は、大腸菌を検出するための上記の培地の使用にも関する。
三千(3000)の尿サンプルは、市販のCPS ID 3培地(ビオメリュー)に接種をされた。培地は、インキュベートされて、供給元の推奨に従って分析された:大腸菌の菌株を検出して同定するために、ピンクから赤色のコロニーは、種の大腸菌(E.coli)に属するとして前同定された。インドールテストは、この同定を確認するために実施された。平行して、本発明に従って、培地が使用されて、分析された:ピンクから赤色のコロニーは、種の大腸菌に属するとして同定された;インドールテストは、無色のコロニーにおいて実施された;反応が陽性の場合、菌株は大腸菌と同定された。全ての同定は、医学的検査研究所によって一般に使われる適切な生化学検査を使用して確認された。
表1:CPS ID3培地上の大腸菌の菌株を同定するための無色コロニーにおけるインドールテストの貢献
供給元の提案に従って、インドールテストがCPS ID 3培地上のピンクから赤色のコロニーにだけ実施された場合、大腸菌の菌株の同定感度の減少に結果としてなることは、表1から非常に明白である。一方で、この試験が無色コロニーに実施される場合、非常に高い同定感度を得ることができる。
トリプトファン、6−クロロ−3−インドリル−β−グルクロニド、5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−β−ガラクトシド及び5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−グルコシドを、それぞれ0.9g/l、0.15g/l、0.05g/l及び0.1g/l、トリプチケースソイ寒天培地(ビオメリュー)に加えた。この培地は、0.5g/lのセロビオースを補充されるか、または補充されない。これらの2つの培地は、1シャーレにつき20mlの割合で分配される。尿試料から単離された一般に微生物及び出願人のコレクションに由来する微生物は、0.5のマクファーランドを1/20に希釈した10μlの懸濁液の半定量的単離によってこれらの培地上に接種される。シャーレは37°Cで24時間インキュベートされ、次に形成されたコロニーは視覚的に調べられる。これらのコロニーの呈色反応は記録される。インドールテストは、ジェームズ試薬(ビオメリュー)を使用して無色のコロニーに実施された。結果を、下記の表2に示す:
表2:6−クロロ−3−インドリル−β−グルクロニド、5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−β−ガラクトシド及び5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−グルコシドを組合わせてなり、場合によりセロビオースで補充される培地における、大腸菌の同定に関するインドールテストの貢献
トリプトファン、6−クロロ−3−インドリル−β−グルクロニド、5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−β−ガラクトシド及び5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−グルコシドを組合せてなる培地で、セロビオースがシトロバクター009菌株と大腸菌の菌株とをより明らかに区別できることは、上の表2から明白である。さらに、トリプトファンがある場合には、無色のコロニーによるインドールの生産を調べることによって、更に特異性に損害を与えることで不利にならずに大腸菌を検出するための感度を増やすことができる。
さまざまな濃度のトリプトファン(0、0.3、0.6、0.9g/l)及び100mg/lのセロビオースは、CPS ID 3培地(ビオメリュー)に加えられる。これらの培地は、250mg/lの6−クロロ−3−インドリル−β−グルクロニド及び50mg/lの5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−グルコシドを含むこれらの培地は、1つのシャーレにつき20mlの割合で分配される。出願人のコレクションに由来する微生物は、0.5のマクファーランドを1/20に希釈した10μlの懸濁液の半定量的単離によってこれらの培地上に接種される。シャーレは37℃で24時間インキュベートされた。24時間のインキュベートの後、形成されたコロニーは視覚的に調べられる。これらのコロニーの呈色反応は、記録される。インドールテストは、ジェームズ試薬(ビオメリュー)を使用して無色のコロニーに実施される。結果を、下記の表3に示す:
表3:トリプトファン濃度の大腸菌の無色のコロニーの検出への影響
0.3g/lのトリプトファン濃度によってさえ、大腸菌の菌株によるインドールの生産を検出できることは、上の表3から明白である;にもかかわらず、反応は、より高い濃度でより記録される。
5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−α−ガラクトシド、5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−β−ガラクトシド、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−グルコシド及びイソプロピル−チオ−β−ガラクトシドは、それぞれ75mg/l、50mg/l、50mg/l及び10mg/lで、合成酵素基質を除かれたCPS ID 3培地(ビオメリュー)に加えられる。これらの培地は、1つのシャーレにつき20mlの割合で分配される。一般に尿サンプルから単離された微生物及び出願人のコレクションに由来する微生物は、0.5のマクファーランドを1/20に希釈した10μlの懸濁液の半定量的単離によってこれらの培地上に接種される。シャーレは37℃で24時間インキュベートされた。
24時間のインキュベートの後、形成されたコロニーは視覚的に調べられる。これらのコロニーの呈色反応は、記録される。インドールテストは、ジェームズ試薬(ビオメリュー)を使用して無色のコロニーに実施される。結果は、下記の表4に示される:
表4:トリプトファン濃度の大腸菌の無色コロニーの検出への影響
5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−α−ガラクトシド、5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−β−ガラクトシド及び5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−グルコシドを組合せてなる培地で、無色コロニーによるインドールの生産が大腸菌を検出するための感度を増大できることは、上の表4から明白である。
Claims (19)
- a)細菌コロニーを得るために、トリプトファン及び大多数の大腸菌によって発現される酵素Aのための基質を含む検出培地上に大腸菌を含みやすい生物試料を接種をすること;
b)酵素Aの活性を発現しているコロニーを検出し、大腸菌としてそれらを同定すること;及び
c)酵素Aの活性を発現しないコロニーを検出して、インドールテストを実施して、インドールテスト陽性を有するコロニーを大腸菌として同定することを含む、生物試料中の大腸菌(エシェリキア・コリ)を検出および/または同定する方法。 - トリプトファン濃度が0.02g/l以上、好ましくは0.4g/l以上である、請求項1に記載の方法。
- 検出培地が大多数の大腸菌によって発現されない酵素Bのための基質を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 検出培地が大多数の大腸菌によって発現される酵素Cのための基質を含む、請求項1から3の何れか一項に記載の方法。
- 酵素Aがβ−グルクロニダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−リボシダーゼ、ホスファターゼ、L−アラニンアミノペプチダーゼ、L−ロイシンアミノペプチダーゼ及びβ‐ガラクトシダーゼから選択される、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- 酵素Aがβ−グルクロニダーゼまたはβ−ガラクトシダーゼである、請求項1から5の何れか一項に記載の方法。
- 酵素Bがβ−グルコシダーゼ、N−アセチルヘキソサミニダーゼ、エステラーゼ、スルファターゼ、β−キシロシダーゼ、フォスフォリパーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、β−セロビオシダーゼ、α−グルコシダーゼ、デアミナーゼ、オキシダーゼ、色素合成酵素、β−アラニンアミノペプチダーゼ及びエラスターゼから選択される、請求項3から6の何れか一項に記載の方法。
- 酵素Bがβ−グルコシダーゼである、請求項7に記載の方法。
- 酵素Cがβ−グルクロニダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−リボシダーゼ、ホスファターゼ、L−アラニンアミノペプチダーゼ、L−ロイシンアミノペプチダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼから選択される、請求項4から8の何れか一項に記載の方法。
- 酵素Aがβ‐ガラクトシダーゼである場合に、酵素Bはβ−グルコシダーゼであり、酵素Cはα−ガラクトシダーゼである、請求項4に記載の方法。
- 酵素Aがβ−ガラクトシダーゼである場合に、酵素Bはβ−グルコシダーゼであり、酵素Cはβ−グルクロニダーゼである、請求項4に記載の方法。
- 検出培地が酵素Aの誘導物質、酵素Bの誘導物質および/または酵素Cの誘導物質を含む、請求項1から11の何れか一項に記載の方法。
- 酵素がβ−グルクロニダーゼであり、前記酵素Aの誘導物質が好ましくはグルクロネートとメチル−β−グルクロニドから選択されるグルクロニドである、請求項12に記載の方法。
- 酵素Aがβ−ガラクトシダーゼであり、前記酵素Aの誘導物質が好ましくはラクトースとイソプロピル−β−チオガラクトシドから選択されるβ−ガラクトシドである、請求項12に記載の方法。
- 酵素Bがβ−グルコシダーゼであり、酵素Bの誘導物質が好ましくはメチル−β−グルコース、セロビオース、セロトリオース、トレハロース、セルロース及びデンプンから選択されるβ−グルコシドである、請求項12から14の何れか一項に記載の方法。
- 酵素Bの誘導物質がセロビオースである、請求項15に記載の方法。
- トリプトファン、β−ガラクトシダーゼ酵素のための基質、β−グルコシダーゼ酵素のための基質及びセロビオースを含む検出培地。
- α−ガラクトシダーゼ酵素のための基質を含む、請求項16に記載の検出培地。
- 大腸菌を検出するための、請求項17または18に定義の培地の使用。
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