JP2008536492A - テスト媒体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】テスト媒体は、周囲光の下で単一のテスト媒体中の一般大腸菌、E.C、エーロモナス属およびサルモネラ菌を含み得る、特定の酵素を生成する生物実体の集合体を定量化および分化するテスト媒体が開示されている。実質的に黒色の不拡散性沈殿物を生成する新たなクラスのノンクロモゲンサブストレートが開示されている。この沈殿物は、テスト媒体中に存在する他のクロモゲンサブストレートと干渉しない。1つの実施の形態では、テスト媒体中に存在するE.Cの群体が実質的に黒色を示し、一般大腸菌の群体がテスト媒体中で青紫色を示し、テスト媒体中に存在するエーロモナス属の群体が略赤桃色を示し、またサルモネラ菌の群体は略薄緑色を示す。検出および定量化のためその他の微生物および色も可能である。抑制剤およびそれを使用するテスト媒体の調製方法も開示している。
Description
coli、以下E.Cという)は、温血動物の通常の腸内細菌の一部であるエンテロバクテリア族のグラム陰性類であり、その存在は糞便の汚染(例えば、下水汚物)を示す。このE.Cの大部分の種族は病気の実際の原因ではないが、それらの存在はこれら、赤痢、肝炎その他の腸内病気に関連する病原体の存在を示す有力な目安になる。従って、E.Cは糞便汚染の主要な指示生物であるので、E.Cを他のバクテリアから識別および特定する方法は極めて有用である。
Citrobacter)、エンテロバクタ(Enterobacter)およびクレブシラ(Klebsilla)も水および飲食物の品質を示す有力な指示生物であると考えられている。従って、一般大腸菌をE.Cから確認又は同定(identify)および分化又は区別(differentiate)するテストも極めて有用である。また、エーロモナス属(genus
Aeromonas)の多くの種族は、潜在的な病原体であるのみならず、他の指示生物と相関関係を有することが判明している(Pettibone等のJ. Appl.
Microbiol. 85:723-730(1998)参照)。エーロモナス属を類似の腸内細菌から確認、分離および計数するテスト方法は不足しており、酵素サブストレートを使用する最近のテスト方法の大部分は、生物学的プロファイルが殆ど同じであるので、エーロモナス属を腸内細菌から分離できない。β−ガラクトシド(β-galactoside)サブストレートによる一般大腸菌を特定する方法は、エーロモナス属を一般大腸菌から分化できないか又は特定の反応抑制剤(Cefsulodin等の抗生物質)を使用してサンプルからエーロモナス属を排除するかの何れかである(Brenner等によるAppl.
Envir. Microbio. 59:3534-44(1993)参照)。それらは、E.Cおよび一般大腸菌と共にエーロモナス属を分化、確認および計数できない(Landre等によるLetters
Appl. Microbiol. 26:352-354(1998年)参照)。斯かるバクテリアのタイプを効果的に確認、分化および計数する改良された方法が必要であり、迅速、正確、使用が容易且つ一層多様性のあるこの分野におけるテスト方法および装置の研究が進められている。
Appl. Microbiol. 26:352-354(1998)参照)。また、このテストは、紫外線を発生させるための特殊機器を必要とする。更に、このテストは、大腸菌およびE.Cの検出のみに使用可能である。グルクロニダーゼ陰性である種族のE.C
O157の如き他の重要な微生物は検出できないのみならず、他の非ガラクトシダーゼ‐グルクロニダーゼ生成微生物も同様である。
Methylene Blue Agar(EMBA)のストリーキングの確認のための追試を行わなければならない。
Methods for the Examination of Water and Wastewater, 20th
Edition,9-10&9-60(1998)参照)。
Envir. Microbiol. 41-130-138(1981)参照)。
Envir. Microbiol. 54:1874-1875(1988)に説明されている。類似の化合物であり、E.Cのシャープな青群体を生じるインドキシル‐β‐D‐グルクロニドは、Ley等によるCan.
J. Microbiol. 34:690-693(1987)に説明されている。
5‐ブロモ‐3‐インドリル‐β‐D‐グルクロニド(X-gluc)等のβ‐グルクロニダーゼサブストレートを含んでいる媒体に加えられる。β‐グルクロニダーゼサブストレートは、β‐ガラクトシダーゼと反応して第1色の水不溶性沈殿物を形成可能であり、一方、β‐グルクロニダーゼサブストレートは、β‐グルクロニダーゼと反応する場合の第1色と対比される第2色の水不溶性沈殿物を形成可能である。その結果、第1色の群体(β‐ガラクトシダーゼ作用を有する)の個数を数えることにより一般大腸菌の定量化が可能である。一方、E.Cは、第2色の群体(β‐ガラクトシダーゼおよびβ‐グルクロニダーゼの両機能を有する)を数えることにより定量化可能である。この技術は広くコピーされている。
Microbiol. 33(5):1395-8(1995)には、ヒドロキシキノリン‐β‐D‐グルクロニドを使用するE.Cを検出するデップスライド(dipslide)が開示されている。同様に、8‐ヒドロキシキノリン‐β‐D‐グルクロニドを使用する寒天ベース媒体中のE.Cの検出技術は、James等によるZentrabl
Bakteriol Mikrobiol Hgy [A], 267(3):316-21 (1988)に開示されている。
特に、第1生物実体の集合体は、この形態では第1および第2サブストレートの両方に応答するけれども、これらの集合体はテスト媒体中では実質的に黒色を示す。即ち、クロモゲンサブストレートは、実質的に黒色と干渉しない。そこで、クロモゲンサブストレートのこの特性により、単一のテスト媒体中で幾つかの生物実体の特定および分化が可能になり、各生物実体の集合体は、それぞれ目視で区別可能な色を有する。
本発明によるテスト媒体の実施の形態による他の効果は、周囲光の下で、単一テストサンプルを使用する単一のテスト媒体中で同時に4種の異なるバクテリアの定量化、特定および分化を可能にする。それらに付随する追試による余分な時間およびコストが回避可能である。本発明によるテスト媒体は、単なる有無(P/A)テストとして純粋に定性目的でも使用可能であること勿論である。
本発明の1実施の形態において、テスト媒体中で得られる色識別は、E.Cを一般大腸菌から特定および分化のために強化可能である。1つのテスト媒体において、E.Cの群体は実質的に黒色を呈し、一方一般大腸菌は赤桃色を呈するので、これらの区別は従来のテスト媒体における場合に比して一層明瞭である。これら両色間の混乱は大幅に減少される。
(定義)
(特定生物実体用のテスト媒体のデザイン)
5‐ブロモ‐4‐クロロ‐3‐インドリル‐β‐D‐ガラクトピラノシド(X-gal)は、β‐ガラクトシドと反応するとき略薄緑色を有する不溶性沈殿物を生成する市販のβ‐ガラクトシダーゼサブストレートであって、米国イリノイ州ナッパビルのバイオシンスインターナショナル社から入手可能である。
6‐クロロ‐3‐インドリル‐β‐D‐グルクロニドは、マジェンタ色を有する不溶性沈殿物を生成する化合物であり、上記の会社の米国特許第5210022号公報にその製法が開示され、米国オハイオ州クリーブランドのリサーチオーガにクス社から入手可能である。
5‐ブロモ‐4‐クロロ‐3‐インドリル‐β‐D‐グルクロニド(X-gluc)化合物は、β‐グルクロニドと反応すると略薄緑色を有する不溶性の沈殿物を生成する市販のβ‐グルクロニド化合物である。同様に、インドリル‐β‐グルクロニドも同様の化合物であり、上述したLey等によるCan
J. Microbiol.の記事中にその製法が説明されており、この説明書をここに参考文献として組み込む。
本発明を実施するためのサブストレートとして好適な他の化合物は、米国特許第5210022号公報に開示されているので、この公報の全てをここに参考資料として組み入れる。
8‐ヒドロキシキノリン‐β‐D‐グルクロニドサブストレートは、市販のβ‐グルクロニドであり、鉄等の金属イオンの存在下でβ‐グルクロニダーゼと反応し且つ他のα‐又はβ‐ガラクトシドサブストレートの存在下で、実質的に黒色の不溶性沈殿物を生成する。8‐ヒドロキシキノリン‐β‐D‐グルクロニドは、米国イリノイ州ナッパビルのバイオシンスインターナショナル社から入手可能である。
更に、本発明と共に使用するのに好適なイオンを提供する塩は、鉄クエン酸アンモニウムであり、米国ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社から入手可能である。シクロヘキサノエスクレチンサブストレートは、James等のAppl. & Envir. Micro. 62:3868-3870 (1996)に説明されており、鉄イオンの存在下で実質的に黒色の不溶性沈殿物を生成する。
2‐ニトロフェニル‐β‐D‐ガラクトピラノシドの如きニトロフェニルサブストレートは、上述したバイオシンスインターナショナル社から入手可能である。同様に、ニトロアニリン化合物は、上述したシグマケミカル社から入手可能である。
実質的に黒色を生成するその他のサブストレートは、シクロヘキサノエスクレチン‐β‐D‐ガラクトシドの如きエスクレチンサブストレートを含み、これは上述したJames等の文献に説明されている。8‐ヒドロキシキノリン‐β‐D‐ガラクトピラノシドおよび8‐ヒドロキシキノリン‐β‐D‐グルクロニドの如きキノリンサブストレートは、上述したバイオシンスインターナショナル社から入手可能である。
5‐イオド‐3‐インドリル‐β‐D‐ガラクトピラノシドの如きイオド‐インドリルサブストレートは、上述したバイオシンスインターナショナル社から入手可能である。
(テスト媒体の調製)
8‐ヒドロキシキノリン‐β‐D‐グルクロニド、5‐ブロモ‐4‐クロロ‐3‐インドリル‐α‐D‐ガラクトピラノシドおよび6‐クロロ‐3‐インドリル‐β‐D‐ガラクトピラノシドサブストレートをそれぞれ250mg/1.70mg/l および175mg/lの媒体内に加える。これらのサブストレートは、殺菌前にブレンダ内で高温(75℃−85℃)の媒体に直接加える。
膵臓消化カゼイン 5.0gm
イースト抽出物 3.0gm
燐酸ジポタジウム 0.3gm
非イオン化水 990ml
クエン酸鉄アンモニウム 800mg(非イオン化水10ml当たり)
(他の成分とは別個に殺菌処理)
次に、121℃で15分間殺菌処理する。この媒体は、pHが7.0になるように調製される。殺菌処理されたアガー媒体は、水バス中で45℃の温度に降下させ、上述の如く調製されたサブストレートを含む殺菌処理された溶液を加える。この媒体は、満遍なく混合され、20mg/プレートの量で殺菌ペトリプレート(ペトリ皿)に注がれる。
(テスト媒体のサンプルへの接種)
(テスト媒体の培養)
(テスト媒体の検査と微生物の計数)
(オプションの構成要素)
(抑制剤)
acid)を使用して実質的に同じ効果が得られることが判明した。ナリディック酸は、テスト媒体が自己分裂するまでに約120℃の温度が必要であるので、有効である。従って、セフスロディンと異なり、ナリディック酸を殺菌の前の初期段階のテスト媒体の調製段階でテスト媒体の一部として加えることが可能である(上述したテスト媒体の調製を参照)。これにより、厳しい環境条件にもナリディック酸が耐えられるので、セフスロディンの場合に比較して長時間の保存が可能になるという付加効果も得られる。
(誘導物質)
(具体例)
(例2)
(例3A)
(例3B)
(例3C)
(例4)
(例5)
(例6)
(例7)
(例8)
(例9)
(例10)
(例11)
(例12)
(例13)
(例14)
(例15)
(例16)
(例17)
(例18)
(例19)
(例20)
(例21)
(例22)
(例23)
(例24)
(例25)
(例26)
Claims (36)
- 一般大腸菌、E.C、エーロモナス属およびサルモネラ菌を検出、定量化又は分化するテスト媒体において、
E.Cの存在下において周囲光の元で視覚可能な第1生成物を形成するβ-D-グルクロニドクロモゲン又は非クロモゲンサブストレートと、
サルモネラ菌、E.Cおよびその他の大腸菌の存在下において周囲光の元で視覚可能な第2生成物を形成するα-D-ガラクトシドクロモゲンサブストレートと、
エーロモナス属、E.Cおよびその他の大腸菌の存在下において周囲光の元で視覚可能な第3生成物を形成するβ-D-ガラクトシドクロモゲンサブストレートと、
β-D-グルクロニドサブストレート、α-D-ガラクトシドサブストレート又はβ-D-ガラクトシドサブストレートのうちの1つであり、E.C、一般大腸菌サルモネラ菌又はエーロモナス属の少なくとも1つの存在下において紫外線の元で蛍光を発する生成物を形成する第4サブストレートとを備え、
前記α-D-ガラクトシドおよび前記β-D-ガラクトシドサブストレートの生成物は、一般大腸菌およびE.Cの存在下で合成色を形成し、前記一般大腸菌、E.C、エーロモナス属およびサルモネラ菌は相互に区別可能であることを特徴とするテスト媒体。 - 前記第4サブストレートはβ-D-グルクロニドサブストレートであり、前記第4サブストレートがE.Cの存在下で形成した生成物は紫外線の元で蛍光を生じることを特徴とする請求項1に記載のテスト媒体。
- 前記第4サブストレートはα-D-ガラクトシドサブストレートであり、E.C、一般大腸菌および/又はサルモネラ菌の存在下で形成される第4サブストレートの生成物は紫外線の元で蛍光を生じることを特徴とする請求項1に記載のテスト媒体。
- 前記第4サブストレートはβ-D-ガラクトシドサブストレートであり、E.C、一般大腸菌および/又はエーロモナス属の存在下で形成された生成物は紫外線の元で蛍光を生じることを特徴とする請求項1に記載のテスト媒体。
- 前記β-D-グルクロニドクロモゲン又は非クロモゲンサブストレートは発色し、前記α-D-ガラクトシドクロモゲンサブストレート又は前記β-D-ガラクトシドクロモゲンサブストレートは前記クロモゲン又は非クロモゲンβ-D-グルクロニドサブストレートと同じ色成分を含むことを特徴とする請求項1に記載のテスト媒体。
- 前記β-D-グルクロニドクロモゲン又は非クロモゲンサブストレートと前記α-D-ガラクトシドクロモゲンサブストレート又は前記β-D-ガラクトシドクロモゲンサブストレートは等量存在することを特徴とする請求項5に記載のテスト媒体。
- 前記β-D-グルクロニドサブストレートと前記α-D-ガラクトシドクロモゲンサブストレート又は前記β-D-ガラクトシドクロモゲンサブストレートとは、異なる量存在することを特徴とする請求項5に記載に記載のテスト媒体。
- 前記β-D-グルクロニドサブストレートが同じ色成分の前記α-D-ガラクトシドクロモゲンサブストレート又は前記β-D-ガラクトシドクロモゲンサブストレートよりも多いことを特徴とする請求項7に記載のテスト媒体。
- 前記第4サブストレートは、蛍光成分である4-メチルアンベリフェリルを含むことを特徴とする請求項1に記載のテスト媒体。
- 生物実体を検出、特定及び定量化又は定性化するテスト媒体において、
栄養剤ベース媒体と、
第1生物実体の存在下で第1生成物を形成する第1サブストレートと、
第2生物実体の存在下で第2生成物を形成する第2サブストレートと、
第3生物実体の存在下で第3生成物を形成する第3サブストレートとを備え、
前記第2および第3サブストレートは第4生物実体の存在下で合成生成物を形成し、前記第1生物実体は前記第2および第3サブストレートの存在下で合成生成物を形成することを特徴とするテスト媒体。 - 前記第1および前記第2サブストレートは、同じ色形成成分を含み、前記第1生物実体が前記サブストレートの全てと反応するとき、前記第1生物実体は前記第4生物実体よりも暗く見えることを特徴とする請求項10に記載のテスト媒体。
- 前記第1サブストレートは、前記第2サブストレートより多くの色形成成分を含むことを特徴とする請求項10に記載のテスト媒体。
- 前記第1および前記第3サブストレートは同じ色形成成分を含み、且つ前記第1生物実体が前記サブストレートの全てと反応するとき、前記第1生物実体は前記第4生物実体よりも暗く見えることを特徴とする請求項10に記載のテスト媒体。
- 前記第1サブストレートは、前記色形成成分を前記第3サブストレートよりも多く含むことを特徴とする請求項11に記載のテスト媒体。
- 前記生物実体の1つの存在下において紫外線の元で蛍光を発する生成物を形成する第4サブストレートを含むことを特徴とする請求項10に記載のテスト媒体。
- 前記第1サブストレートはβ-D-グルクロニドクロモゲン又は非クロモゲンサブストレートであり、前記第1生物実体はE.Cであり、第2サブストレートはα-D-ガラクトシドクロモゲンサブストレートであり、前記第2生物実体はサルモネラ菌であり、前記第3サブストレートはβ-D-ガラクトシドクロモゲンサブストレートであり、第3生物実体はエーロモナス属であり、且つ前記第4生物実体は一般大腸菌であることを特徴とする請求項15に記載のテスト媒体。
- 生物実体を検出、特定又は定量化するテスト媒体において、
栄養剤ベース媒体と、
クロモゲン又は非クロモゲンサブストレートであり、第1生物実体の存在下において周囲光の元で視覚可能な生成物を形成する第1サブストレートと、
第1生物実体の存在下において紫外線の元で蛍光を発する生成物を形成する第2サブストレートと
を備えることを特徴とするテスト媒体。 - 前記第1サブストレートはβ-D-グルクロニドサブストレートであり、且つ前記第1生物実体はE.Cであることを特徴とする請求項17に記載のテスト媒体。
- 前記第2サブストレートは4-メチルアンベリフェリルβ-D-グルクロニドサブストレートであることを特徴とする請求項18に記載のテスト媒体。
- 前記媒体はE.Cの存在の二重検証を行い、第1検証は紫外線の元でE.Cの蛍光であり、第2検証は前記クロモゲン又は非クロモゲンサブストレートからの生成物の周囲光の元での目視検証であることを特徴とする請求項19に記載のテスト媒体。
- 紫外線の元での蛍光による前記E.Cの検証は、前記クロモゲン又は非クロモゲンサブストレートからの目視検証の前に検出可能であることを特徴とする請求項20に記載のテスト媒体。
- 前記第1サブストレートはα-D-ガラクトピラノシドであり、且つ前記第2サブストレートはβ-D-ガラクトピラノシドであることを特徴とする請求項17に記載のテスト媒体。
- 前記第1生物実体は大腸菌全体であり、且つ前記第2サブストレートはエーロモナス属の存在下で紫外線の元で蛍光を発する生成物を生成することを特徴とする請求項22に記載のテスト媒体。
- 前記第1サブストレートは5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-α-D-ガラクトピラノシドであり、大腸菌全体の存在下において形成される生成物は薄緑色であり、且つサルモネラ菌の存在下でも薄緑の生成物が形成されることを特徴とする請求項23に記載のテスト媒体。
- 前記第1サブストレートはβ-D-ガラクトピラノシドであり、前記第2サブストレートはα-D-ガラクトピラノシドであることを特徴とする請求項17に記載のテスト媒体。
- 前記第1生物実体は大腸菌全体であり、前記第2サブストレートはサルモネラ菌の存在下において紫外線の元で蛍光を発する生成物を生成することを特徴とする請求項25に記載のテスト媒体。
- 前記第1サブストレートは5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシドであり、大腸菌全体の存在下で形成される生成物は薄緑色で且つ薄緑色の生成物はエーロモナス属の存在下でも形成されることを特徴とする請求項26に記載のテスト媒体。
- 更に前記第1および第2サブストレートと異なる1以上の付加酵素に特定であり且つ前記第1生物実体以外の生物実体の存在下において周囲光の元で可視又は紫外線の元で蛍光を発する生成物を生成する1以上の付加サブストレートを含み、前記生成物の全ては目視により相互に区別可能であることを特徴とする請求項17に記載のテスト媒体。
- 前記第1サブストレートはβ-D-グルクロニドサブストレートであり、且つ前記第1生物実体はE.Cであることを特徴とする請求項28に記載のテスト媒体。
- 前記第2サブストレートは4-メチルアンベリフェリルβ-D-グルクロニドサブストレートであることを特徴とする請求項28に記載のテスト媒体。
- 前記付加サブストレートの1つはβ-D-グルクロニドサブストレートであることを特徴とする請求項28に記載のテスト媒体。
- 前記第1サブストレートは5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-グルクロニドであり、前記第2サブストレートは4-メチルアンベリフェリル-β-D-グルクロニドであり、且つ前記付加サブストレートは6-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシドであり、前記第1生物実体はE.Cであり、且つ前記付加生物実体はE.C以外の一般大腸菌族であることを特徴とする請求項28に記載のテスト媒体。
- 前記媒体はE.Cの存在の二重検証を行い、第1検証は第1サブストレートからの生成物の周囲光の元での目視特定であり、且つ前記第2検証は紫外線の元でのE.Cの蛍光であり、一般大腸菌族は前記6-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド付加サブストレートの効果で桃色又は赤色の群体のように見え、E.Cは前記5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-グルクロニドおよび前記5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシドサブストレートの組み合わせにより周囲光の元で青/紫群体のように見えることを特徴とする請求項32に記載のテスト媒体。
- 紫外線の元での蛍光による前記E.Cの検証はクロモゲンサブストレートからの目視検証の前に検出されることを特徴とする請求項34に記載のテスト媒体。
- 更に5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-α-D-グラクトシドサブストレートを含み、第3生物実体はサルモネラ菌族であり、且つ第4生物実体はエーロモナス属であることを特徴とする請求項32に記載のテスト媒体。
- E.Cは周囲光の元で青/紫に見え且つ紫外線の元で蛍光を発し、一般大腸菌は周囲光の元で青灰色に見え、サルモネラ菌は周囲光の元で薄青緑に見え、エーロモナス属は周囲光の元で桃色/赤色に見え、E.C、一般大腸菌、サルモネラ菌及びエーロモナス属は、相互に目視で区別可能であることを特徴とする請求項35に記載のテスト媒体。
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