CN113433120B - 一种大肠杆菌浓度检测方法及其系统 - Google Patents

一种大肠杆菌浓度检测方法及其系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌浓度检测方法及其系统，包括以下步骤：比色标准组溶液配置步骤：将多组大肠杆菌悬浮液分别与第一L‑Trp溶液混合，形成多组第一标准混合溶液；将多组第一标准混合溶液放置在黑暗环境下，并以第一预设转速、第一预设温度下振荡培养至第一预设时间后，分别加入第一对二甲氨基苯甲醛溶液形成多组第二标准混合溶液，根据第二预设时间进行振荡得到比色标准组溶液；待测样品预处理步骤：将待测样品原溶液分别与第二L‑Trp溶液混合形成第一原混合溶液；结合第二对二甲氨基苯甲醛溶液处理第一待测混合溶液；比色步骤：通过比色得到大肠杆菌预测浓度值。本发明提出的大肠杆菌浓度检测方法通过定量比色分析酶底物达到更准确的检测效果。

Description

一种大肠杆菌浓度检测方法及其系统
技术领域
本发明涉及光学传感检测领域，具体涉及一种大肠杆菌浓度检测方法及其系统。
背景技术
致病菌可引起传染病和食物中毒，严重威胁人类生命安全，已成为当今世界面临的重大 挑战。根据世界卫生组织的数据，与细菌有关的疾病每年造成约170万人死亡。其中，大肠 杆菌是最危险的致病菌之一，通过污染食物和水，可以诱发出血性腹泻、溶血性尿毒症和其 他严重疾病，甚至导致死亡。因此迫切需要建立一种快速、简单、经济、灵敏的大肠杆菌浓 度检测方法。
目前致病菌检测方法主要包括培养技术、基于聚合酶链式反应(PCR)和免疫学的分子检 测方法，但这些方法存在着操作复杂、仪器昂贵、假阳性高等局限性。因此，研究一种简单、 快速、灵敏、高选择性的检测方法对致病菌进行监控具有十分重要的现实意义。
发明内容
为了克服现有技术存在的缺陷与不足，本发明的第一目的在于提出了一种大肠杆菌浓度 检测方法，该方法通过定量比色分析酶底物以达到更准确的检测效果。
本发明的第二目的在于一种大肠杆菌浓度检测系统。
本发明的第三目的在于一种定量比色分析装置。
为了达到上述第一目的，本发明采用以下技术方案：
一种大肠杆菌浓度检测方法，包括以下步骤：
比色标准组溶液配置步骤：将多组大肠杆菌悬浮液分别与第一L-Trp溶液混合，形成多 组第一标准混合溶液；
所述多组大肠杆菌悬浮液分别为基于Tris-HCl缓冲体系的不同浓度的大肠杆菌配置溶 液，所述多组大肠杆菌悬浮液采用Tris-HCl缓冲液，pH值为9.0，浓度为20mM，第一L-Trp 溶液的浓度采用40μg/mL；
将多组第一标准混合溶液放置在黑暗环境下，并在第一预设转速、第一预设温度下振荡 培养至第一预设时间后，分别加入第一对二甲氨基苯甲醛溶液形成多组第二标准混合溶液， 根据第二预设时间进行振荡得到比色标准组溶液，所述第一对二甲氨基苯甲醛溶液的浓度为 10mg/mL，第一对二甲氨基苯甲醛溶液中的稀盐酸比例为10％；
待测样品预处理步骤：将待测样品原溶液分别与第二L-Trp溶液混合形成第一原混合溶 液，所述第二L-Trp溶液与第一L-Trp溶液相同；
将第一待测混合溶液放置在黑暗环境下，并在第二预设转速、第二预设温度下振荡培养 至第一预设时间后，加入第二对二甲氨基苯甲醛溶液中形成第二原混合溶液，根据第二预设 时间进行振荡得到待测溶液，所述第二对二甲氨基苯甲醛溶液与第一对二甲氨基苯甲醛溶液 相同；
所述第一预设转速设置为180～200rpm/min，所述第二预设转速与第一预设转速相同， 所述第一预设温度设置为37～45℃，所述第二预设温度与第一预设温度相同，所述第一预设 时间设置为1～1.5h，所述第二预设时间设置为2～3min；
比色步骤：将待测溶液分别与比色标准组溶液进行比色得到大肠杆菌预测浓度值。
作为优选的技术方案，所述多组大肠杆菌悬浮液与L-Trp溶液在容量配置上等量，所述 多组大肠杆菌悬浮液、L-Trp溶液和对二甲氨基苯甲醛溶液采用3:3:1、3:3:2、3:3:3中的 任一配比。
作为优选的技术方案，所述多组大肠杆菌悬浮液具体浓度分别为0，5×104cfu/mL,105 cfu/mL,5×105cfu/mL,106cfu/mL,5×106cfu/mL,107cfu/mL。
作为优选的技术方案，所述比色步骤，具体步骤包括：根据比色拟合曲线对待测溶液进 行预测得到大肠杆菌预测浓度值；
所述比色拟合曲线为溶液像素颜色面积与大肠杆菌浓度映射关系的拟合曲线，所述比色 拟合曲线具体通过比色标准组溶液进行图像处理得到。
作为优选的技术方案，所述比色拟合曲线具体通过比色标准组溶液进行图像处理得到， 具体步骤包括：
图像获取步骤：拍摄比色标准组溶液得到多组比色标准图像；
离散数据提取步骤：将多组比色标准图像分别依次进行图像旋转与裁剪、ROI区域裁剪、 色彩平衡、颜色阈值处理、数据测量分析，得到离散比色标准溶液浓度数据，离散溶液浓度 数据包括比色标准溶液像素颜色面积与对应的大肠杆菌浓度；
所述图像旋转与裁剪用于调整图片的形状和角度；
所述ROI区域裁剪用于将样品从图片背景中分离出来，并保证各个样品图片的形状和大 小一致；
所述色彩平衡用于增加颜色响应和图像背景之间的对比度；
所述颜色阈值处理用于将与待测样品浓度相关的色彩响应和图像背景分离；
曲线拟合步骤：利用曲线拟合将离散比色标准溶液浓度数据形成比色拟合曲线，所述比 色拟合曲线用于分析待测样品的大肠杆菌浓度。
作为优选的技术方案，所述根据比色拟合曲线对待测溶液进行预测得到大肠杆菌预测浓 度值，具体包括以下步骤：
离散待测样品像素颜色面积提取步骤：拍摄待测溶液得到待测图像，将待测溶液依次进 行图像旋转与裁剪、ROI区域裁剪、色彩平衡、颜色阈值处理、数据测量分析，得到离散待 测样品像素颜色面积；
所述图像旋转与裁剪用于调整图片的形状和角度；
所述ROI区域裁剪用于将样品从图片背景中分离出来，并保证各个样品图片的形状和大 小一致，以便提取其相关数据信息；
所述色彩平衡用于增加颜色响应和图像背景之间的对比度；
所述颜色阈值处理用于将与待测样品浓度相关的色彩响应和图像背景分离；
预测步骤：根据离散待测样品像素颜色面积在比色拟合曲线的位置得到大肠杆菌预测浓 度值。
为了达到上述第二目的，本发明采用以下技术方案：
一种大肠杆菌浓度检测系统，包括比色标准组溶液配置模块、待测样品预处理模块以及 比色模块；
所述比色标准组溶液配置模块用于配置比色标准组溶液；
所述待测样品预处理模块用于配置待测溶液；
比色模块用于将待测溶液分别与比色标准组溶液进行比色得到大肠杆菌预测浓度值；
所述比色标准组溶液具体通过以下步骤处理得到：
将多组大肠杆菌悬浮液分别与第一L-Trp溶液混合，形成多组第一标准混合溶液；
所述多组大肠杆菌悬浮液分别为基于Tris-HCl缓冲体系的不同浓度的大肠杆菌配置溶 液，所述多组大肠杆菌悬浮液采用Tris-HCl缓冲液，pH值为9.0，浓度为20mM，第一L-Trp 溶液的浓度采用40μg/mL；
将多组第一标准混合溶液放置在黑暗环境下，并在第一预设转速、第一预设温度下振荡 培养至第一预设时间后，分别加入第一对二甲氨基苯甲醛溶液形成多组第二标准混合溶液， 根据第二预设时间进行振荡得到比色标准组溶液；
所述第一对二甲氨基苯甲醛溶液的浓度为10mg/mL，第一对二甲氨基苯甲醛溶液中的稀 盐酸比例为10％；
所述待测溶液具体通过以下步骤处理得到：
将待测样品原溶液分别与第二L-Trp溶液混合形成第一原混合溶液，所述第二L-Trp溶 液与第一L-Trp溶液相同；
将第一待测混合溶液放置在黑暗环境下，并在第二预设转速、第二预设温度下振荡培养 至第一预设时间后，加入第二对二甲氨基苯甲醛溶液中形成第二原混合溶液，根据第二预设 时间进行振荡得到待测溶液，所述第二对二甲氨基苯甲醛溶液与第一对二甲氨基苯甲醛溶液 相同；
所述第一预设转速设置为180～200rpm/min，所述第二预设转速与第一预设转速相同， 所述第一预设温度设置为37～45℃，所述第二预设温度与第一预设温度相同，所述第一预设 时间设置为1～1.5h，所述第二预设时间设置为2～3min。
作为优选的技术方案，所述比色模块具体根据比色拟合曲线对待测溶液进行预测得到大 肠杆菌预测浓度值；
所述比色拟合曲线具体通过比色标准组溶液进行图像处理得到，将多组比色标准图像分 别依次进行图像旋转与裁剪、ROI区域裁剪、色彩平衡、颜色阈值处理、数据测量分析，得 到离散比色标准溶液浓度数据，离散溶液浓度数据包括比色标准溶液像素颜色面积与对应的 大肠杆菌浓度；
所述图像旋转与裁剪用于调整图片的形状和角度；
所述ROI区域裁剪用于将样品从图片背景中分离出来，并保证各个样品图片的形状和大 小一致，以便提取其相关数据信息；
所述色彩平衡用于增加颜色响应和图像背景之间的对比度；
所述颜色阈值处理用于将与待测样品浓度相关的色彩响应和图像背景分离。
为了达到上述第三目的，本发明采用以下技术方案：
一种定量比色分析装置，设有图像处理装置和观测装置；
所述图像处理装置用于获取观测装置内的待测图像、根据比色拟合曲线对待测溶液进行 预测得到大肠杆菌预测浓度值；
所述图像处理装置设有处理器、显示器以及摄像装置，处理器分别与显示器、摄像装置 连接；摄像装置用于拍摄观测装置内的待测图像；
所述处理器用于将待测溶液依次进行图像旋转与裁剪、ROI区域裁剪、色彩平衡、颜色 阈值处理、数据测量分析，得到离散待测样品像素颜色面积，根据离散待测样品像素颜色面 积在比色拟合曲线的位置得到大肠杆菌预测浓度值；
所述显示器用于显示观测图像以及大肠杆菌预测浓度值；
所述观测装置用于放置待测溶液、观测待测溶液。
作为优选的技术方案，所述观测装置包括底座、与底座活动连接的样品支架、与样品支 架固定连接的置物板、与底座进行可拆卸连接的容纳腔室、设置在容纳腔室内的光源基座、 与光源基座固定连接的聚光透镜、与容纳腔室可拆卸连接的顶盖、固定设置在顶盖处的LED 光源部件以及设置在顶盖的适配夹持装置；
所述置物板用于存放待测溶液和比色标准组溶液；
所述容纳腔室为黑色，容纳腔室在内部两侧边分别设置安装槽口，所述安装槽口用于与 光源基座进行可嵌入连接；
在容纳腔室内，两侧的LED光源部件分别与对应的聚光透镜处于相同垂直面，使得透过 聚光透镜后在置物板上形成光照均匀区域；
所述光照均匀区域在容纳腔室底部所在水平面的长度与聚光透镜距离光照均匀区域的高 度相等，两侧的LED光源部件经过聚光透镜后分别与光照均匀区域的边缘部形成的入射夹角 相等且均为45°。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
(1)本发明提出的大肠杆菌浓度检测方法通过定量比色分析酶底物从而达到更准确的检 测效果，基于酶底物的检测方法表现出优异的选择性、稳定性和灵活性，且不需任何化学合 成；本发明基于大肠杆菌所分泌的色氨酸酶可特异性地降解L-色氨酸，降解产物吲哚可与4- 二甲氨基苯甲醛反应形成玫瑰红加合物，进而利用比色法检测大肠杆菌的浓度，本发明进一 步采用图像处理和最小二乘法对比色标准溶液像素颜色面积与对应的大肠杆菌浓度之间的关 系进行拟合形成比色拟合曲线，从而达到更准确地预测待测样品的大肠杆菌浓度。
(2)本发明提出的定量比色分析装置作为一种生物传感器的检测装置，具有便携性高的 优势，可满足食品安全和质量监控的现场检测要求，利用处理器对获取的数字图像进一步处 理，不仅可以为复杂食品基质中的目标分析物提供高度特异性和高灵敏度的检测，而且通过 适配夹持装置进行调整，使得与便携式设备更方便地兼容。
(3)本发明提出的定量比色分析装置，采用黑盒提供优良的拍照环境，该装置采用模块 化结构设计，各部分之间相互组合而又各自独立，便于部件的更换以适用不同的反应体系和 测试需求；通过更换不同波长的LED灯珠，便能够适用于多种不同的反应体系的拍照需求， 操作简便快捷，适用范围广，成本低廉，稳定性好。
(4)本发明提出的定量比色分析装置采用了ImageJ进行数字图像分析，在图像处理时 操作简单，无需深奥繁复的学科知识背景，对编程能力无要求，对来自测量和量化ROI的原 始数据统计分析和可视化，使得使用者能够更方便地操作。
附图说明
图1为本发明实施例1中大肠杆菌浓度检测方法的步骤流程图；
图2为本发明实施例1中检测大肠杆菌比色的原理示意图；
图3为本发明实施例4中定量比色分析装置；
图4为本发明实施例4中容纳腔室内的光路示意图；
图5为本发明实施例4中将智能手机采集到的数字图像通过ImageJ进行处理分析的流程 图；
图6为本发明实施例4中进行图像的旋转与裁剪的示意图；
图7为本发明实施例4中进行ROI区域裁剪的示意图；
图8为本发明实施例4中进行色彩平衡处理的示意图；
图9为本发明实施例4中进行颜色阈值处理的示意图；
图10为本发明实施例4中进行数据测量分析的示意图；
图11为本发明实施例4中Tris-HCl缓冲体系中不同浓度大肠杆菌存在下对ROI区域处 理的图像示意图；
图12(a)为本发明实施例4中Tris-HCl缓冲体系中不同浓度大肠杆菌存在下的紫外- 可见吸收光谱图；
图12(b)为本发明实施例4中标准组溶液的吸光度差值与大肠杆菌浓度的对数之间的 线性关系示意图；
图13(a)为本发明实施例5中稀释牛奶样品中里不同大肠杆菌浓度存在下的紫外-可见 吸收光谱图；
图13(b)为本发明实施例5中稀释牛奶样品组溶液的吸光度差值与大肠杆菌浓度的对 数之间的线性关系示意图；
图14为本发明实施例5中稀释牛奶样品中不同浓度大肠杆菌存在下对ROI区域处理的图 像示意图；
图15为本发明实施例5中稀释牛奶样品中吸光度通道与颜色阈值通道之间的线性关系示 意图。
其中，1-底座，2-样品支架，3-置物板，4-容纳腔室，5-光源基座，6-聚光透镜，7-顶盖，8-LED光源部件，9-适配夹持装置。
具体实施方式
在本公开的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本公开和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、 以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本公开的限制。
此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对 重要性。同样，“一个”、“一”或者“该”等类似词语也不表示数量限制，而是表示存在至少一个。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现在该词前面的元素或者物件涵盖出现在该词后面列举的元素或者物件及其等同，而不排除其他元素或者物件。“连接”或者“相连”等类似的词语并非限定于物理的或者机械的连接，而是可以包括电性的连接，不管是直接的还 是间接的。
在本公开的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，否则术语“安装”、“相 连”、“连接”应做广义理解。例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接； 可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以 是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本 公开中的具体含义。此外，下面所描述的本公开不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此 之间未构成冲突就可以相互结合。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发 明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用 于限定本发明。
实施例
实施例1
如图1所示，本实施例提供了一种大肠杆菌浓度检测方法，该方法包括以下步骤：
比色标准组溶液配置步骤：将多组大肠杆菌悬浮液(150μL)分别与L-Trp(L-色氨酸)溶 液(40μg/mL，150μL)混合，形成多组第一标准混合溶液；实际应用时，多组大肠杆菌悬 浮液分别为基于Tris-HCl缓冲体系的不同浓度的大肠杆菌配置溶液，其具体浓度分别为0， 5×104cfu/mL,105cfu/mL,5×105cfu/mL,106cfu/mL,5×106cfu/mL,107cfu/mL。多 组大肠杆菌悬浮液采用Tris-HCl缓冲液，pH值为9.0，浓度为20mM；
将多组第一标准混合溶液放置在黑暗环境下，并以200rpm/min的转速、45℃下振荡培 养1.5h后，分别加入对二甲氨基苯甲醛溶液(100μL，10mg/mL，10％稀盐酸)中，形成多组 第二标准混合溶液，振荡3min得到比色标准组溶液；
待测样品预处理步骤：将待测样品原溶液(150μL)分别与L-Trp溶液(40μg/mL，150μL) 混合形成第一原混合溶液；
将第一待测混合溶液放置在黑暗环境下，并以200rpm/min的转速、45℃下振荡培养1.5h 后，加入对二甲氨基苯甲醛溶液(100μL，10mg/mL，10％稀盐酸)中，形成第二原混合溶液， 振荡3min得到待测溶液；
比色步骤：将待测溶液分别与比色标准组溶液进行比色得到大肠杆菌预测浓度值。
在本实施例中，多组大肠杆菌悬浮液与L-Trp溶液在容量配置上等量，多组大肠杆菌悬 浮液、L-Trp溶液和对二甲氨基苯甲醛溶液采用3:3:1、3:3:2、3:3:3中的任一配比均可， 其中采用3:3:2的配比时的检测效果最佳。本领域技术人员可根据实际情况采用不同配比进 行检测大肠杆菌浓度。
如图2所示，特定酶底物L-Trp具有和细菌分泌的酶之间具有酶促反应。本实施例经过 研究发现在大肠杆菌存在的情况下，大肠杆菌所分泌的色氨酸酶可特异性地降解L-色氨酸， 降解产物吲哚可与4-二甲氨基苯甲醛反应形成玫瑰红加合物，进而利用比色法检测大肠杆菌 的浓度，实现基于反应所得加合物的量对大肠杆菌进行定量检测。
实施例2
本实施例2在实施例1的基础上对比色步骤进行改进，利用图像处理进行比色得到更准 确的大肠杆菌预测浓度值。
结合图1所示，比色步骤，具体步骤包括：根据比色拟合曲线对待测溶液进行预测得到 大肠杆菌预测浓度值。
在本实施例中，比色拟合曲线为溶液像素颜色面积与大肠杆菌浓度映射关系的拟合曲线， 比色拟合曲线具体通过比色标准组溶液进行图像处理得到。
结合图1所示，比色拟合曲线具体通过比色标准组溶液进行图像处理得到，具体步骤包 括：
图像获取步骤：拍摄比色标准组溶液得到多组比色标准图像；
离散数据提取步骤：将多组比色标准图像分别依次进行图像旋转与裁剪、ROI区域裁剪、 色彩平衡、颜色阈值处理、数据测量分析，得到离散比色标准溶液浓度数据，离散溶液浓度 数据包括比色标准溶液像素颜色面积与对应的大肠杆菌浓度。实际应用时，图像旋转与裁剪 用于调整图片的形状和角度；ROI区域裁剪用于将样品从图片背景中分离出来，并保证各个 样品图片的形状和大小一致，以便提取其相关数据信息；色彩平衡用于增加颜色响应和图像 背景之间的对比度；颜色阈值处理用于将与待测样品浓度相关的色彩响应和图像背景分离。
曲线拟合步骤：利用曲线拟合将离散比色标准溶液浓度数据形成比色拟合曲线，比色拟 合曲线用于分析待测样品的大肠杆菌浓度。
在本实施例中，根据比色拟合曲线对待测溶液进行预测得到大肠杆菌预测浓度值，具体 包括以下步骤：
离散待测样品像素颜色面积提取步骤：拍摄待测溶液得到待测图像，将待测溶液依次进 行图像旋转与裁剪、ROI区域裁剪、色彩平衡、颜色阈值处理、数据测量分析，得到离散待 测样品像素颜色面积；
预测步骤：根据离散待测样品像素颜色面积在比色拟合曲线的位置得到大肠杆菌预测浓 度值。
实施例3
本实施例提出了一种大肠杆菌浓度检测系统，该系统包括比色标准组溶液配置模块、待 测样品预处理模块以及比色模块；
在本实施例中，比色标准组溶液配置模块用于配置比色标准组溶液，比色标准组溶液具 体通过以下步骤处理得到：
将多组大肠杆菌悬浮液(150μL)分别与L-Trp溶液(40μg/mL，150μL)混合，形成多组第一标准混合溶液，其中多组大肠杆菌悬浮液采用Tris-HCl缓冲液，pH值为9.0，浓度 为20mM；将多组第一标准混合溶液放置在黑暗环境下，并以200rpm/min的转速、45℃下 振荡培养1.5h后，分别加入对二甲氨基苯甲醛溶液(100μL，10mg/mL，10％稀盐酸)中，形 成多组第二标准混合溶液，振荡3min得到比色标准组溶液。
在本实施例中，待测样品预处理模块用于配置待测溶液，待测溶液具体通过以下步骤处 理得到：
将待测样品原溶液(150μL)分别与L-Trp溶液(40μg/mL，150μL)混合形成第一原混合溶液；
将第一待测混合溶液放置在黑暗环境下，并以200rpm/min的转速、45℃下振荡培养1.5h 后，加入对二甲氨基苯甲醛溶液(100μL，10mg/mL，10％稀盐酸)中，形成第二原混合溶液， 振荡3min得到待测溶液。
在本实施例中，比色模块用于将待测溶液分别与比色标准组溶液进行比色得到大肠杆菌 预测浓度值。
本实施例还利用图像处理进行比色得到更准确的大肠杆菌预测浓度值，比色模块具体根 据比色拟合曲线对待测溶液进行预测得到大肠杆菌预测浓度值，比色拟合曲线具体通过比色 标准组溶液进行图像处理得到。
实施例4
如图3所示，本实施例提供了一种定量比色分析装置，该装置为用于检测大肠杆菌浓度 的便携式设备。
在本实施例中，该检测装置设有图像处理装置和观测装置。
在本实施例中，图像处理装置用于获取观测装置内的待测图像、根据比色拟合曲线对待 测溶液进行预测得到大肠杆菌预测浓度值。图像处理装置设有处理器、显示器以及摄像装置， 处理器分别与显示器、摄像装置连接。
摄像装置用于拍摄观测装置内的待测图像；
处理器用于将待测溶液依次进行图像旋转与裁剪、ROI区域裁剪、色彩平衡、颜色阈值 处理、数据测量分析，得到离散待测样品像素颜色面积，根据离散待测样品像素颜色面积在 比色拟合曲线的位置得到大肠杆菌预测浓度值。
显示器用于显示观测图像以及大肠杆菌预测浓度值。
结合图3所示，观测装置用于放置待测溶液、观测待测溶液。观测装置包括底座1、与 底座1活动连接的样品支架2、与样品支架2固定连接的置物板3、与底座1进行可拆卸连接 的容纳腔室4、设置在容纳腔室4内的光源基座5、与光源基座5固定连接的聚光透镜6、与容纳腔室4可拆卸连接的顶盖7、固定设置在顶盖7处的LED光源部件8以及设置在顶盖7 的适配夹持装置9。
实际应用时，底座1的尺寸为160×158×68mm，样品支架2的尺寸为148×94×48mm， 容纳腔室4的尺寸为160×158×134mm，顶盖7的尺寸为160×158×18mm，光源基座5的 尺寸为20×15×15mm，适配夹持装置9的尺寸为77×26×24mm。LED光源部件8包括LED灯珠和用于为LED灯珠供电的供电装置。LED灯珠采用5V白光，供电装置采用5V可充电 电池组作为电源模块，聚光透镜6采用90°，φ20×11.5mm的规格。此外本领域技术人员 可根据实际情况改变各部件、装置的尺寸或规格，本实施例在此不做限制。
在本实施例中，样品支架2的两侧分别设有凸槽，相应地，底座1在内侧设有凹槽，通 过凸槽与凹槽的嵌合实现滑动，进而实现活动连接。
在本实施例中，置物板3具体采用96孔板，用于存放待测溶液和比色标准组溶液。
在本实施例中，容纳腔室4为黑色，以使拍摄得到光照均匀的图像；容纳腔室4在内部 两侧边分别设置安装槽口，该安装槽口用于与光源基座5进行可嵌入连接。
实际应用时，容纳腔室4内部的光路具体如图4所示，两侧的LED光源部件8分别与对 应的聚光透镜6处于相同垂直面，使得透过聚光透镜6后在置物板3上形成光照均匀区域。 光照均匀区域在容纳腔室4底部所在水平面的长度与聚光透镜6距离光照均匀区域的高度相 等，两侧的LED光源部件8经过聚光透镜6后分别与光照均匀区域的边缘部形成的入射夹角 相等且均为45°，以保证该装置能获得稳定均匀的光照强度，进而在采样过程中获得光照均 匀的高质量样品图像。其中两个入射夹角分别为α、β，光照均匀区域在容纳腔室4底部所 在水平面的长度为L，聚光透镜6距离光照均匀区域的高度为H，本实施例设置L＝H＝110mm， 此外本领域技术人员可根据实际情况设置不同数值。
在本实施例中，适配夹持装置9设有两个L型固定部件，第一L型固定部件与顶盖7固 定连接，第二L型固定部件通过调节部件与第一L型固定部件连接。调节部件采用调节式螺 栓，调节式螺栓的末端嵌入并穿出第二L型固定部件的内部形成滑动连接，调节式螺栓的末 端在与第二L型固定部件的穿出处还与第一L型固定部件进行可嵌入连接。适配夹持装置9 用于固定摄像装置，通过调整两个L型固定部件至摄像装置的宽度进行夹持。
实际应用时，摄像装置采用智能手机，处理器为运行ImageJ软件的服务器，适配夹持装 置9采用手机适配器。智能手机通过数据线将图像数据传输至服务器进行离线图像处理。
此外，本领域技术人员还可根据实际情况利用该定量比色分析装置实现别的反应体系的 定量比色分析实验，比如以红甘蓝的花青素作为天然pH指示剂用于比色检测幽门螺杆菌、以 酶-无机杂化纳米花作为探针定量比色检测过氧化氢等类似用数字图像进行比色分析检测的 体系，在捕捉数字图像的过程中使用该装置以获取均匀光照下的数字图像。
如图5所示，该定量比色分析装置中的容纳腔室4为基于3D打印得到的黑盒，本实施例 将Tris-HCl缓冲体系中不同浓度的大肠杆菌悬浮液(150μL)，分别与L-Trp溶液(40μg/mL， 150μL)混合。然后将混合物在黑暗中以200rpm/min的转速，45℃下振荡培养1.5h。然后，将混合物加入到对二甲氨基苯甲醛溶液(100μL，10mg/mL,10％稀盐酸)中，振荡3min 得到比色标准组溶液。随后，取不同浓度下的350μL比色标准组溶液分别放入96孔板中。 然后将其放入黑盒中，用智能手机捕捉样品的数字图像。将捕捉的数字图像通过Image进行 裁剪、色彩平衡、Y'UV色彩空间阈值处理。最后测量过滤后的数字图像的有效颜色响应的区域面积，并通过OriginPro将这些数据与大肠杆菌的浓度进行函数拟合，从而实现对大肠杆菌的定量检测。本发明的实验条件温和、操作简便，重现性和稳定性好，能实现对牛奶样品中大肠杆菌的快速定量比色检测。
结合图5所示，本实施例进一步以利用ImageJ软件进行数字图像处理为例进行说明：
分别取不同浓度下的350μL比色标准组溶液置于96孔板中，将含有样品的96孔板放 入拍照黑盒，打开光源，用智能手机捕捉样品图像。之后将数字图像导入ImageJ中通过图像 旋转与裁剪、ROI区域裁剪、色彩平衡、颜色阈值处理、数据测量分析等步骤对捕捉的数字 图像进行处理分析，最后将得到的数据导出用OriginPro进行曲线拟合用于待测样品的分析。
实际应用时，对比色标准组溶液：
首先，利用智能手机拍摄得到多组比色标准图像，将多组比色标准图像导入ImageJ软件 中，分别对图像整体进行裁剪和旋转调整预处理，以初步优化图像的尺寸，具体如图6所示；
然后对图像中感兴趣的目标区域(region of interest，ROI)进行选择性细化和裁剪得 到ROI区域，具体如图7所示；
接着通过调整色彩平衡和颜色阈值对ROI区域进行过滤，具体结合图8和图9所示；
最后，结合图10和图11所示，测量经过颜色阈值过滤后的ROI区域的像素面积，得到 离散待测样品像素颜色面积，基于最小二乘法进行绘制比色拟合曲线。
结合图11所示，A处图像为原始图像；B处图像为色彩平衡处理后的ROI区域；C处图像为颜色阈值处理后的图像；D处为颜色阈值的校准曲线。其中设置Minimum＝125，Maximum＝180；Y'＝95–255，U＝0–135，V＝135–255；样本测量次数n＝3。
结合图12(a)所示，以波长为x轴，以吸光度为y轴，其中沿纵坐标由下至上依次为标准组溶液浓度从0-107cfu/mL的紫外吸收光谱，具体浓度数值分别为0、5×104、105、5×105、 106、5×106、107cfu/mL。
结合图12(b)所示，为标准组溶液的吸光度差值(A-A0)与大肠杆菌浓度的对数之间的 线性关系，吸光度在565nm处，样本测量次数n＝3，结果表明：R2＝0.97，即二者检测结果具 有良好的线性关系。
结合图13(a)所示，以波长为x轴，以吸光度为y轴，其中沿纵坐标由下至上依次为牛奶样品组溶液浓度从0-107cfu/mL的紫外吸收光谱，具体浓度数值分别为0、5×104、105、5×105、106、5×106、107cfu/mL。
结合图13(b)所示，为稀释牛奶样品组溶液的吸光度差值(A-A0)与大肠杆菌浓度的对 数之间的线性关系，吸光度在565nm处，样本测量次数n＝3，结果表明：R2＝0.99，即二者检 测结果具有良好的线性关系。
实际应用时，对待测溶液：首先，利用智能手机拍摄得到待测图像，将待测图像导入ImageJ 软件中，分别对图像整体进行裁剪和旋转调整预处理，以初步优化图像的尺寸；然后对图像 中感兴趣的目标区域进行选择性细化和裁剪得到ROI区域；接着通过调整色彩平衡和颜色阈 值对ROI区域进行过滤；最后，测量经过颜色阈值过滤后的ROI区域的像素面积，得到离散 待测样品像素颜色面积，根据离散待测样品像素颜色面积在比色拟合曲线的位置得到大肠杆 菌预测浓度值。
此外，本领域技术人员还可以根据实际情况采用云服务器作为处理器，云服务器与摄像 装置无线连接，进而实现云端图像处理，或者将显示器、摄像装置以及处理器集成一体，将 图像处理装置与适配夹持装置9进行连接，即利用智能手机实现上述实施例1-3提及的方法 及系统，本实施例在此不做限制。
实施例5
本实施例5以牛奶样品为例进行验证实施例1-4涉及的大肠杆菌浓度检测方法。具体用 Tris-HCl稀释100倍的牛奶样品用同样的方案做真实样品检测，以验证该检测方案的实用性。 其验证步骤具体包括以下：
将牛奶样品稀释100倍，加入不同浓度的大肠杆菌，涡旋1.5～2min，使大肠杆菌和牛 奶样品充分混合，得到混有不同浓度大肠杆菌的牛奶样品溶液。将含有不同浓度大肠杆菌的 牛奶样品(150μL)，分别与L-Trp溶液(40μg/mL，150μL)混合。然后将混合物在黑暗中以 200rpm/min的转速，45℃下振荡培养1.5h。然后，将混合物加入到对二甲氨基苯甲醛溶液 (100μL，10mg/mL，10％稀盐酸)中，振荡3min。
彩色数字图像的处理分析过程：
S1、数字图像的捕捉：数字图像的捕捉是利用智能手机的CMOS光学摄像头配合基于3D 打印设计制造的辅助黑盒实现。将实验样品放入样品架上，通过手机适配器固定好智能手机， 然后将打开智能手机的专业拍照模式，通过调整感亮度、快门时间、焦距等参数从而捕捉到 高质量的样品图片，即RGB数字图像。实际应用时，设置相关参数ISO：160、曝光时间：1/50s、 焦距：5mm、放大倍数为：×2。
S2、数字图像的旋转与裁剪：主要目的是调整图片的形状和角度以便后续的处理，整体 流程如图5所示。ImageJ的工作界面具体如图5所示，依次点击菜单栏的File—>Open—> 选中智能手机获取的样品图片，依次点击菜单栏的Image—>Transform—>Rotate，通过调整 图中箭头所示的参数，其中Grid lines为参考线的条数以便能更好的对齐样品图片，Angle 为旋转调整的角度，选中Preview则是预览调整的状态，最后通过工具栏中的矩形选择工具 初步裁剪旋转调整后的数字图片。实际应用时，设置Grid lines＝10,Angle＝－0.7°。
S3、数字图像ROI区域的裁剪：主要目的是将各个样品从整个图片中分离出来，并保证 各个样品图片的形状和大小一致，以便提取其相关数据信息。整体流程如图6所示。根据目 标样品区域的形状不同选择工具，选定选择工具后粗选ROI区域，依次点击菜单栏中的 Edit—>Selection—>Specify，调整其中的详细参数对ROI区域的形状和尺寸进行细化，本 实施例选中圆形选择工具，并设置width和height均为159；依次点击菜单栏中的Image—>Duplicate得到ROI区域；依次点击菜单栏中的Edit—>Clear Outside清除边缘区域，进一步细化ROI区域。
S4、数字图像的色彩平衡处理：如图14所示，色彩平衡主要是增加颜色响应和图像背景 之间的对比度，以便后续的色彩阈值处理，整体流程如图5所示。选中细化处理后的ROI图 片，依次点击菜单栏中的Image—>Adjust—>Color Balance，Auto控件可以快速调整对比度， 通过设置Minimum和Maximum的值细化色彩对比度的参数，实际应用时，设置Minimum＝125 Maximum＝185，其效果如图所示。此处的色彩平衡处理可以在ROI细化裁剪后对每个样品图 片进行相同参数的调整，也可以先对整个预处理后的图片进行色彩平衡处理再细化裁剪每个 样品的ROI区域。此外如果样品图片本身的颜色阈值能够直接分割，则不需要进行色彩平衡 的预处理。
S5、数字图像的色彩阈值处理：结合图14所示，其主要目的是将与待测样品浓度相关的 色彩响应和图像背景分离，建立颜色响应的区域面积与样品浓度间的线性关系，从而通过色 彩响应预测待测样品的物质浓度。选中色彩平衡处理后的细化ROI区域，依次点击菜单栏的 Image—>Adjust—>Color threshold。首先选择Color space默认情况下为HSB，因Y'UV和 Lab颜色空间在视觉上更直观，因此依次设置Y'UV三个阈值窗口的值。实际应用时，设置Y' ＝95～255，U＝0～135，V＝135～255。然后点击Select应用用户定义的阈值，有效的将像 素划分为有效区域和无效区域。结合图9所示，标记区域为有效区域。最后点击Edit—>Clear Outside清除无效区域得到各个不同浓度样品所对应的颜色区域响应。
S6、图像的数据测量与分析：结合图14所示，其目的是将样品浓度与色彩响应区域面积 进行函数曲线拟合，从而根据待测样品的颜色响应预测大肠杆菌的浓度，实现对大肠杆菌的 定量检测。通过前面的色彩平衡和颜色阈值处理后得到各个样品的有效色彩响应图像。依次 选中每张样品图片并点击ImageJ菜单栏中的Analysis—>measure得到各个样品图片的详细 数据，对各个样品区域进行3次测量，选择其中Area相关数据，通过OriginPro进行线性曲 线拟合，拟合函数为：y＝3.63x–14.03R2＝0.99。线性相关系数R2充分说明了样品浓 度和颜色响应具有较高的相关性，其拟合曲线能够用于对大肠杆菌的定量分析。
此外，本领域技术人员可根据实际情况进行调整相关参数，本实施例在此不做限制。
如图14所示，为稀释牛奶样品中不同浓度大肠杆菌存在下对ROI区域处理的图像：A处 图像为原始图像；B处图像为色彩平衡处理后的ROI区域；C处图像为颜色阈值处理后的图像； D处为颜色阈值的校准曲线。其中设置Minimum＝125，Maximum＝180；Y'＝95–255，U＝0–135， V＝135–255；样本测量次数n＝3。
如图15所示，稀释牛奶样品中具有不同大肠杆菌浓度的吸光度通道和颜色阈值通道之间 的关系，其中以吸光度通道设为x轴，以颜色阈值通道设为y轴。由结果表明，R2＝0.99， 即二者检测结果具有良好的线性关系，该双通道检测结果可以相互验证，保证了基于智能手 机的检测系统在实际应用中的可靠性。
实施例6
本实施例6在上述实施例1-5的基础上，调整转速、温度、培养时间、振荡时间：本实施例在比色标准组溶液配置步骤中设置转速为180rpm/min，温度设置为37℃，培养时间设置为1h，振荡时间设置为2min。相应地，待测样品预处理步骤也进行对应调整。
此外，本领域技术人员还可根据实际情况调整转速在180～200rpm/min，调整温度在37～45℃，调整培养时间为1～1.5h，调整振荡时间：2～3min，本实施例在此不做限定。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应 为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种大肠杆菌浓度检测方法，所述检测方法采用了定量比色分析装置进行检测，其特征在于，所述定量比色分析装置设有图像处理装置和观测装置；
所述图像处理装置用于获取观测装置内的待测图像、根据比色拟合曲线对待测溶液进行预测得到大肠杆菌预测浓度值；
所述图像处理装置设有处理器、显示器以及摄像装置，处理器分别与显示器、摄像装置连接；摄像装置用于拍摄观测装置内的待测图像；
所述处理器用于将待测溶液依次进行图像旋转与裁剪、ROI区域裁剪、色彩平衡、颜色阈值处理、数据测量分析，得到离散待测样品像素颜色面积，根据离散待测样品像素颜色面积在比色拟合曲线的位置得到大肠杆菌预测浓度值；
所述显示器用于显示观测图像以及大肠杆菌预测浓度值；
所述观测装置用于放置待测溶液、观测待测溶液；
所述观测装置包括底座、与底座活动连接的样品支架、与样品支架固定连接的置物板、与底座进行可拆卸连接的容纳腔室、设置在容纳腔室内的光源基座、与光源基座固定连接的聚光透镜、与容纳腔室可拆卸连接的顶盖、固定设置在顶盖处的LED光源部件以及设置在顶盖的适配夹持装置；
所述置物板用于存放待测溶液和比色标准组溶液；
所述容纳腔室为黑色，容纳腔室在内部两侧边分别设置安装槽口，所述安装槽口用于与光源基座进行可嵌入连接；
在容纳腔室内，两侧的LED光源部件分别与对应的聚光透镜处于相同垂直面，使得透过聚光透镜后在置物板上形成光照均匀区域；
所述光照均匀区域在容纳腔室底部所在水平面的长度与聚光透镜距离光照均匀区域的高度相等，两侧的LED光源部件经过聚光透镜后分别与光照均匀区域的边缘部形成的入射夹角相等且均为45°；
检测方法包括以下步骤：
比色标准组溶液配置步骤：将多组大肠杆菌悬浮液分别与第一L-Trp溶液混合，形成多组第一标准混合溶液；
所述多组大肠杆菌悬浮液分别为基于Tris-HCl缓冲体系的不同浓度的大肠杆菌配置溶液，所述多组大肠杆菌悬浮液采用Tris-HCl缓冲液，Tris-HCl缓冲液pH值为9.0，浓度为20mM，第一L-Trp溶液的浓度采用40μg/mL；
将多组第一标准混合溶液放置在黑暗环境下，并在第一预设转速、第一预设温度下振荡培养至第一预设时间后，分别加入第一对二甲氨基苯甲醛溶液形成多组第二标准混合溶液，根据第二预设时间进行振荡得到比色标准组溶液，所述第一对二甲氨基苯甲醛溶液的浓度为10mg/mL，第一对二甲氨基苯甲醛溶液中的稀盐酸比例为10％；
待测样品预处理步骤：将待测样品原溶液分别与第二L-Trp溶液混合形成第一原混合溶液，所述第二L-Trp溶液与第一L-Trp溶液相同；
将第一待测混合溶液放置在黑暗环境下，并在第二预设转速、第二预设温度下振荡培养至第一预设时间后，加入第二对二甲氨基苯甲醛溶液中形成第二原混合溶液，根据第二预设时间进行振荡得到待测溶液，所述第二对二甲氨基苯甲醛溶液与第一对二甲氨基苯甲醛溶液相同；
所述第一预设转速设置为180～200rpm，所述第二预设转速与第一预设转速相同，所述第一预设温度设置为37～45℃，所述第二预设温度与第一预设温度相同，所述第一预设时间设置为1～1.5h，所述第二预设时间设置为2～3min；
比色步骤：将待测溶液分别与比色标准组溶液进行比色得到大肠杆菌预测浓度值。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌浓度检测方法，其特征在于，所述多组大肠杆菌悬浮液与L-Trp溶液在容量配置上等量，所述多组大肠杆菌悬浮液、L-Trp溶液和对二甲氨基苯甲醛溶液采用体积比为3:3:1、3:3:2、3:3:3中的任一配比。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌浓度检测方法，其特征在于，所述多组大肠杆菌悬浮液具体浓度分别为0，5×104cfu/mL,105cfu/mL,5×105cfu/mL,106cfu/mL,5×106cfu/mL,107cfu/mL。
4.根据权利要求1-3任一所述的大肠杆菌浓度检测方法，其特征在于，所述比色步骤，具体步骤包括：根据比色拟合曲线对待测溶液进行预测得到大肠杆菌预测浓度值；
所述比色拟合曲线为溶液像素颜色面积与大肠杆菌浓度映射关系的拟合曲线，所述比色拟合曲线具体通过比色标准组溶液进行图像处理得到。
5.根据权利要求4所述的大肠杆菌浓度检测方法，其特征在于，所述比色拟合曲线具体通过比色标准组溶液进行图像处理得到，具体步骤包括：
图像获取步骤：拍摄比色标准组溶液得到多组比色标准图像；
离散数据提取步骤：将多组比色标准图像分别依次进行图像旋转与裁剪、ROI区域裁剪、色彩平衡、颜色阈值处理、数据测量分析，得到离散比色标准溶液浓度数据，离散溶液浓度数据包括比色标准溶液像素颜色面积与对应的大肠杆菌浓度；
所述图像旋转与裁剪用于调整图片的形状和角度；
所述ROI区域裁剪用于将样品从图片背景中分离出来，并保证各个样品图片的形状和大小一致；
所述色彩平衡用于增加颜色响应和图像背景之间的对比度；
所述颜色阈值处理用于将与待测样品浓度相关的色彩响应和图像背景分离；
曲线拟合步骤：利用曲线拟合将离散比色标准溶液浓度数据形成比色拟合曲线，所述比色拟合曲线用于分析待测样品的大肠杆菌浓度。
6.根据权利要求4所述的大肠杆菌浓度检测方法，其特征在于，所述根据比色拟合曲线对待测溶液进行预测得到大肠杆菌预测浓度值，具体包括以下步骤：
离散待测样品像素颜色面积提取步骤：拍摄待测溶液得到待测图像，将待测溶液依次进行图像旋转与裁剪、ROI区域裁剪、色彩平衡、颜色阈值处理、数据测量分析，得到离散待测样品像素颜色面积；
所述图像旋转与裁剪用于调整图片的形状和角度；
所述ROI区域裁剪用于将样品从图片背景中分离出来，并保证各个样品图片的形状和大小一致，以便提取其相关数据信息；
所述色彩平衡用于增加颜色响应和图像背景之间的对比度；
所述颜色阈值处理用于将与待测样品浓度相关的色彩响应和图像背景分离；
预测步骤：根据离散待测样品像素颜色面积在比色拟合曲线的位置得到大肠杆菌预测浓度值。
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