CN104897556A - 基于智能终端和微流控芯片的牛奶体细胞计数装置及方法 - Google Patents

Abstract

一种基于智能终端和微流控芯片的牛奶体细胞计数装置及方法，装置有用于采集生鲜奶样图像的智能终端，一端与智能终端中的摄像头对应设置的用于对生鲜奶样进行放大的微型光学放大光路，与微型光学放大光路另一端对应设置的用于对图像数据中生鲜奶样的体细胞进行计数处理的微流控芯片。方法：将生鲜奶样稀释5～50倍，进行染色处理，然后滴加5～50uL样品到微微流控芯片的入口；利用微型光学放大电路对微流控芯片上图像采样区域进行放大利用智能终端自带的摄像头对图像采样区域拍照；利用配套的APP应用程序，对图像数据中的体细胞进行计数处理。本发明保证了视野范围内的体细胞基本处于同一高度的焦平面内，有利于成像过程中的对焦，得到清晰的显微图像。

Description

基于智能终端和微流控芯片的牛奶体细胞计数装置及方法

技术领域

本发明涉及一种牛奶体细胞计数装置与方法。特别是涉及一种基于智能终端和微流控芯片的牛奶体细胞计数装置与方法。

背景技术

牛奶体细胞数(somatic cell count，SCC)是指每毫升牛奶中的细胞总数，多数是白细胞，约占体细胞数的95％，体细胞数反映了牛奶质量及奶牛的健康状况。在正常情况下，牛奶中体细胞数一般在2万～20万个/mL。若其含量超过50万个/mL，则奶牛呈现乳腺炎的临床症状。体细胞数在20～50万个/mL时，奶牛多患有隐形乳腺炎，在症状上不易察觉，但严重影响鲜奶的品质和口感。

现行技术多采用直接镜检法、电导率法、荧光染色法、流式细胞术等检测手段，需要较为专业的仪器设备和技术人员来完成检测。本专利将国际公认的体细胞计数标准方法(直接显微镜计数法)，与计算机图形识别技术相结合，利用微流控芯片技术，通过微型光学放大装置和智能手机摄像头，完成样品的准备和体细胞计数的全部过程。该技术基于智能手机或平板电脑等智能终端设备平台，配合自主研发的微流控芯片和相关硬件，可实现对牛奶中体细胞计数的“傻瓜式”操作。硬件系统便携，检测过程仅需一滴牛奶，操作仅需几分钟，整个过程无需专业技术人员指导。借助于智能手机网络，可实现对广域范围内奶牛隐形乳腺炎大数据的云端共享，可应用于牧场、奶站、食品安全检测机构等部门。

中国申请201020649185.6专利(便携式牛奶体细胞计数仪)提供了一种便携式牛奶体细胞计数测试仪的设计方案，仪器本身亦作为盛奶容器，检测过程绿色环保，但其测试信号依赖于牛奶溶液的电化学参数。由于电化学参数受环境因素和奶牛的个体差异影响，会导致检测结果的稳定性逊色于直接镜检法。中国申请201110454277.8(牛奶体细胞检测平台)和中国申请201210047807.1(一种基于计算机视觉的牛奶体细胞计数方法)和201210174266.9专利(基于计算机视觉的牛奶体细胞计数装置)给出的测试装置由玻片运动装置、取像装置、图像分析装置等组成，通过控制运动平台的运动间接控制玻片的运动，动态采集牛奶体细胞的放大图像，可以根据图像分析的数据给出牛奶体细胞的含量。但此装置用到了两台步进电机、工控机或单片机等部件，且采集的图像数据为动态数据，电机的运动速度受动态图像处理算法的限制。中国申请专利201210351183.2(基于云计算与RFID的牛乳质量监测系统及监测方法)提出了由检测终端、牛奶检测设备、通信基站、监测服务云平台组成的牛奶检测系统，需要建设专业的基站和监测平台，需要较大的硬件成本和人力投入。中国申请201010173697.4(牛奶体细胞检测试剂盒及方法)提到的由样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸、反应支持物等组成的试剂盒，检测过程中需用到胶体金标记的乳牛体细胞单克隆抗体等IgG来完成显色，且操作步骤繁琐。中国申请201220232862.3(牛奶体细胞4孔检测试纸)给出了三明治结构的纸基检测试纸，用于牛奶体细胞检测，但此方法显色的深浅依赖于试纸上的反应底物和相应的反应酶，且必须借助于分光光度计才能估测体细胞的含量，为间接测试法，影响了检测结果的可靠性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种无需外加传感器和工控设备，能够直接镜检的基于智能终端和微流控芯片的牛奶体细胞计数装置及方法。

本发明所采用的技术方案是：一种基于智能终端和微流控芯片的牛奶体细胞计数装置，包括有用于采集生鲜奶样图像的智能终端，还设置有一端与所述智能终端中的摄像头对应设置的用于对生鲜奶样进行放大的微型光学放大光路，以及与所述的微型光学放大光路另一端对应设置的用于对图像数据中生鲜奶样的体细胞进行计数处理的微流控芯片。

所述的光学放大光路的放大倍数为40～200倍，具体包括有分别设置在镜筒内与所述的智能终端中的摄像头对应设置的第一透镜组和与所述的微流控芯片对应设置的第二透镜组，设置在镜筒外侧上的调焦旋钮。

所述的微流控芯片包括有基底和设置在所述基底上的微流通道单元板，所述的微流通道单元板上形成有一组用于承载被测生鲜奶样流体的微流通道。

所述的微流通道包括有：用于注入经过预处理的待测生鲜奶样流体的入口，一端连接在所述入口上并与所述的入口相连通的2～6个通道，所述2～6个通道的另一端分别各连接一个用于收集检测后废液的集液腔，每一条通道上都等间隔的设置有2～6个与所述的通道相连通的用于放置待测生鲜奶样流体的微腔。

所述的微腔为圆形微腔或方形微腔，当所述的微腔为圆形微腔时，所述圆形微腔的直径为0.1～5mm，高度为10～100um，当所述的微腔为方形微腔时，所述方形微腔的边长为0.1～5mm，高度为10～100um，所述的入口和集液腔均为上下贯通的贯通孔，所述贯通孔的孔径为1～10mm，高度即为微流通道单元板的厚度，为0.1～2cm。

所述的微流控芯片包括有基底和设置在所述基底上的微流通道单元板，所述的微流通道单元板上形成有M×N组结构相同的用于承载被测生鲜奶样流体的微流通道，其中M为5以上的整数，N为1以上的整数，所述的基底是长为1～10cm、宽为1～10cm及高为0.1～2cm的平板结构。

所述的微流通道包括有：用于注入经过预处理的待测生鲜奶样流体的入口，一端连接在所述入口上并与所述的入口相连通的2～6个通道，所述2～6个通道的另一端分别各连接一个用于收集检测后废液的集液腔，每一条通道上都等间隔的设置有2～6个与所述的通道相连通的用于放置待测生鲜奶样流体的微腔。

所述的微腔为圆形微腔或为方形微腔，当所述的微腔为圆形微腔时，所述圆形微腔的直径为0.1～5mm，高度为10～100um；当所述的微腔为方形微腔时，所述方形微腔的边长为0.1～5mm，高度为10～100um，所述的入口和集液腔均为上下贯通的贯通孔，所述贯通孔的孔径为1～10mm，高度即为微流通道单元板的厚度，为0.1～2cm。

一种用于基于智能终端和微流控芯片的牛奶体细胞计数装置的计数方法，包括如下步骤：

1)奶样的预处理，将生鲜奶样稀释5～50倍，并进行染色处理，然后滴加5～50uL样品到微微流控芯片的入口，使样品分别流入微流控芯片的微腔；

2)图像放大与采集，利用微型光学放大电路对微流控芯片上图像采样区域进行放大并利用智能终端自带的摄像头对图像采样区域拍照；

3)数据处理和结果显示，利用配套的APP应用程序，对图像数据中的体细胞进行计数处理，并换算得到体细胞浓度。

所述的对图像数据中的体细胞进行计数处理，并换算得到体细胞浓度包括如下步骤：

判断步骤2)所拍照的图像是否清晰，清晰进入第步，否则返回步骤2)；

通过手动进行细胞计数，并对已计过数的细胞用颜色作上标记；

计算细胞总数和浓度的均值，并保存；

(4)判断细胞总数是否小于20万/ml，是则浓度正常，否则进入下一步；

(5)判断细胞总数是否大于50万/ml，是则浓度超标，为显性乳房炎，否则为隐性乳房炎，进行预警。

本发明的基于智能终端和微流控芯片的牛奶体细胞计数装置及方法，由于所采用的微流控芯片使体细胞在微腔中的分布受微腔的高度所限制，保证了视野范围内的体细胞基本处于同一高度的焦平面内，有利于成像过程中的对焦，得到清晰的显微图像，进而实现准确计数。所以本发明具有如下特点：

(1)微流控芯片属于廉价耗材，同一片子上可实现多次检测，检测成本低。

(2)将微流控芯片与智能终端相结合，操作简便，无需专业培训。

(3)微流控芯片、光学系统、与智能终端，尺寸均较小，可实现检测仪器的便携化，易于实现现场检测。

附图说明

图1是本发明的整体结构示意图；

图2是本发明微流控芯片第一实施例的整体结构示意图；

图3是本发明微流控芯片第二实施例的整体结构示意图；

图4是本发明微流控芯片第三实施例的整体结构示意图；

图5是本发明微流控芯片第三实施例中微流通道的结构示意图；

图6是本发明微流控芯片第三实施例中微流通道的结构示意图；

图7是本发明基于智能终端和微流控芯片的牛奶体细胞计数方法的流程图；

图8是配套软件APP界面示意图；

图9是细胞计数结果demo示意图。

图中

1：智能终端                      11：机身

12：摄像头                       2：微型光学放大光路

21：第一透镜组                   22：第二透镜组

23：镜筒                         24：调焦旋钮

3：微流控芯片                    31：基底

32：微流通道单元板               33：微流通道

331：入口                        332：通道

333：微腔                        334：集液腔

311：基底                        312：微流通道单元板

313：微流通道                    3131：入口

3132：通道                       3133：微腔

134：集液腔

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明的基于智能终端和微流控芯片的牛奶体细胞计数装置及方法做出详细说明。

本发明的基于智能终端和微流控芯片的牛奶体细胞计数装置及方法，是首先设计并加工具有一定微结构的微流控芯片，将奶样滴加到芯片后，微腔阵列中的牛奶体细胞经由微型光学放大光路，进行放大成像。然后通过智能终端设备自带的摄像头对放大后的体细胞图像拍照，利用智能终端APP应用程序，可完成对每个微腔中体细胞数目的平均值计算，并根据微腔的体积换算得到牛奶体细胞浓度水平。

如图1所示，本发明的基于智能终端和微流控芯片的牛奶体细胞计数装置，包括有用于采集生鲜奶样图像的智能终端1，还设置有一端与所述智能终端1中的摄像头12对应设置的用于对生鲜奶样进行放大的微型光学放大光路2，以及与所述的微型光学放大光路2另一端对应设置的用于对图像数据中生鲜奶样的体细胞进行计数处理的微流控芯片3。所述的智能终端1为智能手机或平板电脑或PC机等。

如图2所示，所述的光学放大光路2的放大倍数为40～200倍，具体包括有分别设置在镜筒23内与所述的智能终端1中的摄像头12对应设置的第一透镜组21和与所述的微流控芯片3对应设置的第二透镜组22，设置在镜筒23外侧上的调焦旋钮24。

所述的微流控芯片3包括有基底31和设置在所述基底31上的微流通道单元板32，所述的微流通道单元板32上形成有一组用于承载被测生鲜奶样流体的微流通道33。基底31和微流通道单元板32的材质可为玻璃、石英、亚克力、ABS、PDMS等材质，尺寸参照载玻片，基底31和微流通道单元板32通过热键合、压力键和、或等离子键合的方式完成封装。

所述的微流通道33包括有：用于注入经过预处理的待测生鲜奶样流体的入口331，一端连接在所述入口331上并与所述的入口31相连通的2～6个通道332，所述2～6个通道332的另一端分别各连接一个用于收集检测后废液的集液腔334，所述的入口331和集液腔334均为上下贯通的贯通孔，所述贯通孔的孔径为1～10mm，高度即为微流通道单元板32的厚度，为0.1～2cm。每一条通道332上都等间隔的设置有2～6个与所述的通道332相连通的用于放置待测生鲜奶样流体的微腔333。

如图2、图3所示，所述的微腔333为圆形微腔或方形微腔，当所述的微腔333为圆形微腔时，所述圆形微腔的直径为0.1～5mm，高度为10～100um，当所述的微腔333为方形微腔时，所述方形微腔的边长为0.1～5mm，高度为10～100um。

在实际应用中，可按照图2和图3所示的微流通道结构设计加工微流控芯片，完成奶样的单次检测。

亦可按照图4所示使图案阵列得到M×N个微流通道结构，在同一微流控芯片上实现对多种奶样的检测，除上述键合方式可以得到微流控芯片外，该结构亦可通过注塑或者3D打印技术一次成型得到。

如图4所示，所述的微流控芯片3还可以是包括有基底311和设置在所述基底311上的微流通道单元板312，所述的微流通道单元板312上形成有M×N组结构相同的用于承载被测生鲜奶样流体的微流通道313，其中M为5以上的整数，N为1以上的整数，所述的基底11是长为1～10cm、宽为1～10cm及高为0.1～2cm的平板结构。

所述的微流通道313包括有：用于注入经过预处理的待测生鲜奶样流体的入口3131，一端连接在所述入口3131上并与所述的入口3131相连通的2～6个通道3132，所述2～6个通道3132的另一端分别各连接一个用于收集检测后废液的集液腔3134，所述的入口331和集液腔334均为上下贯通的贯通孔，所述贯通孔的孔径为1～10mm，高度即为微流通道单元板312的厚度，为0.1～2cm。每一条通道3132上都等间隔的设置有2～6个与所述的通道3132相连通的用于放置待测生鲜奶样流体的微腔3133。

所述的微腔3133为圆形微腔或为方形微腔，当所述的微腔3133为圆形微腔时，所述圆形微腔的直径为0.1～5mm，高度为10～100um；当所述的微腔3133为方形微腔时，所述方形微腔的边长为0.1～5mm，高度为10～100um。

本发明的用于基于智能终端和微流控芯片的牛奶体细胞计数装置的计数方法，包括如下步骤：

1)奶样的预处理，将生鲜奶样稀释5～50倍，并进行染色处理，然后滴加5～50uL样品到微微流控芯片的入口，使样品分别流入微流控芯片的微腔；以图2为例体细胞随流体流经图2中所示的9个圆形微腔，分别在9个微腔中分布。

2)图像放大与采集，利用微型光学放大电路对微流控芯片上图像采样区域进行放大并利用智能终端自带的摄像头对图像采样区域拍照；

3)数据处理和结果显示，利用配套的APP应用程序，对图像数据中的体细胞进行计数处理，并换算得到体细胞浓度。通过求取9个微腔中体细胞计数的平均值，并根据微腔容积，可实现对奶样中体细胞浓度水平的估算和奶牛乳房炎的诊断。

所述的对图像数据中的体细胞进行计数处理，并换算得到体细胞浓度包括如下步骤：

1)奶样的预处理，将生鲜奶样稀释5～50倍，并进行染色处理，然后滴加5～50uL样品到微微流控芯片的入口，使样品分别流入微流控芯片的微腔；

2)图像放大与采集，利用微型光学放大电路对微流控芯片上图像采样区域进行放大并利用智能终端自带的摄像头对图像采样区域拍照；

3)数据处理和结果显示，利用配套的APP应用程序，对图像数据中的体细胞进行计数处理，并换算得到体细胞浓度，具体包括如下步骤：

(1)判断步骤2)所拍照的图像是否清晰，清晰进入第(2)步，否则返回步骤2)；

(2)通过手动进行细胞计数，并对已计过数的细胞用颜色作上标记；

(3)计算细胞总数和浓度的均值，并保存；

(4)判断细胞总数是否小于20万/ml，是则浓度正常，否则进入下一步；

(5)判断细胞总数是否大于50万/ml，是则浓度超标，为显性乳房炎，否则为隐性乳房炎，进行预警。

图7为安装于智能终端的APP应用程序操作界面示意图，九宫格对应图2或图3中的9个观察微腔的位置。在IOS或Andriod等操作系统成功加载APP应用程序后，在操作界面的“设置”菜单中设置微流控芯片中设计的用于盛放待测奶样的微腔的面积和高度、鲜奶稀释倍数等参数。点击相机标志，可根据需要选择“拍照”、“从相册中选择”两个子菜单，调入奶样的显微放大图像。图8为调入图像后APP操作界面的示意图，此时点击九宫格中的图像，可出现“计数”、“重新拍照”、“重新计数”三个子菜单，选择“计数”，可设置计数标记的颜色和大小，在图像中的细胞处添加计数标签。计数完成后，内置程序会求取多次测量的平均值，并根据微腔尺寸和稀释倍数换算得到待测奶样中体细胞的浓度。界面中的“保存”和“分享”菜单，可分别保存或分享历次测量的数据，便于数据的导出和网络共享。上述过程中，操作界面可显示视野内体细胞的总数和换算后的细胞浓度，并给出该浓度范围的预警度。检测结果处于绿色(<20万/mL)段内表示奶样合格，处于红色(>50万/mL)段内表示奶样中的体细胞浓度超标，奶牛极有可能患有显性乳房炎。处于橙色(20～50万/mL)，表明奶牛可能患有隐形乳房炎，需进行进一步的临床诊断。

实例1：

(1)染色剂的配置与奶样的稀释：每毫升生理盐水中滴加150uL碘酊，颠倒混合均匀，配置染色剂。将奶样与上述染色剂按照体积比1:19的比例混合，颠倒摇匀。

(2)溶液进样：将1uL上述稀释完毕的溶液滴加到微流控芯片的进样口，观察腔内充满待检测溶液。

(3)牛奶体细胞成像：搭建双凸透镜显微放大光路，调整放大倍数至60倍，利用智能手机摄像头，对每个观察腔进行清晰成像。

(4)图像与数据处理：调用手机安装的APP应用程序，得到牛奶体细胞浓度和奶牛乳腺炎患病概率等相关数据，利用网络分享检测结果。

实例2：

(1)奶样的预处理。将生鲜奶样稀释30倍，并利用碘酊进行染色处理，然后滴加2uL样品到微流控芯片的入口。

(2)图像放大与采集。利用微型光学放大电路(放大倍数100倍)对微流控芯片上图像采样区域进行放大并利用智能终端自带的摄像头对其拍照。

(3)数据处理和结果显示。利用配套的APP应用程序，对图像数据中的体细胞进行计数处理，并换算得到体细胞浓度和奶牛乳腺炎患病概率等相关数据，利用网络分享检测结果。

Claims (10)

1.一种基于智能终端和微流控芯片的牛奶体细胞计数装置，包括有用于采集生鲜奶样图像的智能终端(1)，其特征在于，还设置有一端与所述智能终端(1)中的摄像头(12)对应设置的用于对生鲜奶样进行放大的微型光学放大光路(2)，以及与所述的微型光学放大光路(2)另一端对应设置的用于对图像数据中生鲜奶样的体细胞进行计数处理的微流控芯片(3)。

2.根据权利要求1所述的基于智能终端和微流控芯片的牛奶体细胞计数装置，其特征在于，所述的光学放大光路(2)的放大倍数为40～200倍，具体包括有分别设置在镜筒(23)内与所述的智能终端(1)中的摄像头(12)对应设置的第一透镜组(21)和与所述的微流控芯片(3)对应设置的第二透镜组(22)，设置在镜筒(23)外侧上的调焦旋钮(24)。

3.根据权利要求1所述的基于智能终端和微流控芯片的牛奶体细胞计数装置，其特征在于，所述的微流控芯片(3)包括有基底(31)和设置在所述基底(31)上的微流通道单元板(32)，所述的微流通道单元板(32)上形成有一组用于承载被测生鲜奶样流体的微流通道(33)。

4.根据权利要求3所述的基于智能终端和微流控芯片的牛奶体细胞计数装置，其特征在于，所述的微流通道(33)包括有：用于注入经过预处理的待测生鲜奶样流体的入口(331)，一端连接在所述入口(331)上并与所述的入口(331)相连通的2～6个通道(332)，所述2～6个通道(332)的另一端分别各连接一个用于收集检测后废液的集液腔(334)，每一条通道(332)上都等间隔的设置有2～6个与所述的通道(332)相连通的用于放置待测生鲜奶样流体的微腔(333)。

5.根据权利要求4所述的基于智能终端和微流控芯片的牛奶体细胞计数装置，其特征在于，所述的微腔(333)为圆形微腔或方形微腔，当所述的微腔(333)为圆形微腔时，所述圆形微腔的直径为0.1～5mm，高度为10～100um，当所述的微腔(333)为方形微腔时，所述方形微腔的边长为0.1～5mm，高度为10～100um，所述的入口(331)和集液腔(334)均为上下贯通的贯通孔，所述贯通孔的孔径为1～10mm，高度即为微流通道单元板(32)的厚度，为0.1～2cm。

6.根据权利要求1所述的基于智能终端和微流控芯片的牛奶体细胞计数装置，其特征在于，所述的微流控芯片(3)包括有基底(311)和设置在所述基底(311)上的微流通道单元板(312)，所述的微流通道单元板(312)上形成有M×N组结构相同的用于承载被测生鲜奶样流体的微流通道(313)，其中M为5以上的整数，N为1以上的整数，所述的基底(11)是长为1～10cm、宽为1～10cm及高为0.1～2cm的平板结构。

7.根据权利要求6所述的基于智能终端和微流控芯片的牛奶体细胞计数装置，其特征在于，所述的微流通道(313)包括有：用于注入经过预处理的待测生鲜奶样流体的入口(3131)，一端连接在所述入口(3131)上并与所述的入口(3131)相连通的2～6个通道(3132)，所述2～6个通道(3132)的另一端分别各连接一个用于收集检测后废液的集液腔(3134)，每一条通道(3132)上都等间隔的设置有2～6个与所述的通道(3132)相连通的用于放置待测生鲜奶样流体的微腔(3133)。

8.根据权利要求7所述的基于智能终端和微流控芯片的牛奶体细胞计数装置，其特征在于，所述的微腔(3133)为圆形微腔或为方形微腔，当所述的微腔(3133)为圆形微腔时，所述圆形微腔的直径为0.1～5mm，高度为10～100um；当所述的微腔(3133)为方形微腔时，所述方形微腔的边长为0.1～5mm，高度为10～100um，所述的入口(331)和集液腔(334)均为上下贯通的贯通孔，所述贯通孔的孔径为1～10mm，高度即为微流通道单元板(32)的厚度，为0.1～2cm。

9.一种用于权利要求1－8所述的基于智能终端和微流控芯片的牛奶体细胞计数装置的计数方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)奶样的预处理，将生鲜奶样稀释5～50倍，并进行染色处理，然后滴加5～50uL样品到微微流控芯片的入口，使样品分别流入微流控芯片的微腔；

2)图像放大与采集，利用微型光学放大电路对微流控芯片上图像采样区域进行放大并利用智能终端自带的摄像头对图像采样区域拍照；

3)数据处理和结果显示，利用配套的APP应用程序，对图像数据中的体细胞进行计数处理，并换算得到体细胞浓度。

10.根据权利要求9所述的用于基于智能终端和微流控芯片的牛奶体细胞计数装置的计数方法，其特征在于，所述的对图像数据中的体细胞进行计数处理，并换算得到体细胞浓度包括如下步骤：

(1)判断步骤2)所拍照的图像是否清晰，清晰进入第(2)步，否则返回步骤2)；

(2)通过手动进行细胞计数，并对已计过数的细胞用颜色作上标记；

(3)计算细胞总数和浓度的均值，并保存；

(4)判断细胞总数是否小于20万/ml，是则浓度正常，否则进入下一步；

(5)判断细胞总数是否大于50万/ml，是则浓度超标，为显性乳房炎，否则为隐性乳房炎，进行预警。