DE60126756T2

DE60126756T2 - Verfahren zur erkennung eines analyten durch fluoreszenz

Info

Publication number: DE60126756T2
Application number: DE60126756T
Authority: DE
Inventors: Mary A. Wilmington REPPY; Sarah A. Wilmington SPORN; Charles F. Esconidido SALLER
Original assignee: Analytical Biological Services Inc Wilmington; Analytical Biological Services Inc
Current assignee: Analytical Biological Services Inc Wilmington; Analytical Biological Services Inc
Priority date: 2000-03-20
Filing date: 2001-03-20
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2021-03-21
Also published as: EP1279023A1; DE60126756D1; CA2403549A1; EP1279023B1; EP1279023A4; IL151674A; ATE354793T1; WO2001071317A1; AU2001250883A1; US20030175812A1; US20040110223A1; US6984528B2; IL151674A0; JP2003528309A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines Analyten in einer Probe und genauer gesagt ein Verfahren, das die Überwachung der Veränderung einer Fluoreszenz involviert. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Array, der ein Polydiacetylengrundgerüst mit einem Substrat in den Array inkorporiert, verwendet.
Hintergrund der Erfindung
Polydiacetylene sind konjugierte Polymere mit Grundgerüsten aus alternierenden Doppelt- und Dreifachbindungen, gebildet aus der 1,4-Additionspolymerisation von 1,3-Diacetylenen (1). Polydiacetylene absorbieren allgemein im sichtbaren Bereich des Spektrums gut und sind daher stark gefärbt, in einem Bereich von blau bis gelb. Es gab ein intensives Interesse an den nicht linearen optischen Eigenschaften von Polydiacetylenen und intensive Studien wurden sowohl im Hinblick auf die solvo-chromatischen (solvo-chromic) Eigenschaften löslich gemachter Polydiacetylene als auch die thereto-chromatischen Eigenschaften von Polydiacetylenfilmen und Einzelkristallen durchgeführt. Es ist wohlbekannt, dass zur Bildung von Polydiacetylen die Diacetylenmonomere in geordneter Packung vorliegen müssen, um das Auftreten der Polymerisation zu ermöglichen. Es scheint allgemein akzeptiert zu werden, obwohl die Erfinder nicht daran gebunden sein wollen, dass eine Störung der Packung der Seitenketten die Konjugationslänge des Grundgerüsts beeinflussen kann und daher die chromatischen Eigenschaften.
Diacetylenmonomere wurden verwendet, um verschiedene geordnete Systeme einschließlich von Kristallen, Flüssigkristallen, Liposomen und Filme zu bilden, die dann zur Bildung des Polymers polymerisiert wurden. Liposomen wurden aus Monomeren mit zwei Diacetylenketten und polaren Kopfgruppen (siehe Phosphatidylcholinen und die Analoga davon) und aus Monomeren mit einzelnen Diacetylenketten hergestellt. Die Liposomen können mit UV-Licht oder γ-Bestrahlung polymerisiert werden. Monomerfilme wurden durch die Langmuir Blodgett-Verfahren gebildet oder aus Lösungsmitteln gegossen und dann ebenfalls mit UV-Licht oder γ-Bestrahlung polymerisiert. Die Wahl der Monomerstruktur, die Bedingungen der Liposom- oder Filmbildung und die Polymerisationsbedingungen beeinflussen alle die Konjugationslänge des Diacetylengrundgerüsts und daher die Farbe des Systems. Bei Erwärmung können diese polymerisierten Systeme eine Veränderung in der effektiven Konjugationslänge durchlaufen, von der längeren Längenformen (blau und lila) bis zu den kürzeren Längenformen (rot und gelb). Diese Veränderung wurde den Seitenketten zugeordnet, die sich bei Erwärmung bewegen und neu packen. Lösliche Polydiacetylene zeigen ein solvo-chromatisches Verhalten und Polydiacetylenfilme verändern häufig bei Aussetzung gegenüber Lösungsmitteldämpfen ihre Farbe. Polydiacetylenfilme und Liposomen, gebildet aus Diacetylentensiden, verändern ebenfalls häufig ihre Farbe bei einer Veränderung des pHs. Im Fall von gepackten Polymerarrays, die die Filme und Liposomen bilden, wird allgemein akzeptiert, dass Veränderungen in der Umgebung, die die Organisation und Packung der Seitenketten beeinflussen, die vom konjugierten Grundgerüst her kommen, die Konjugationslänge und daher die chromatischen und elektronischen Eigenschaften des Polymers beeinflussen können.
Diese Polydiacetylenfilme und Liposomen sollen für chromogene Assays geeignet sein, die von der Farbveränderung abhängen (Charych et al., US Patent 6,001,556; Charych et al., US Patent 6,180,135; WO 98/39632; Charych et al., US Patent 6,080,423; Charych, US Patent 6,183,772; Charych et al., US Patent 6,022,748). Es wurde die Hypothese aufgestellt, und zwar von Charych (Okada S. et al., Acc. Chem. Res., 1998, 31, 229–239), dass die Bindung an einen Liganden, inkorporiert in blaue Polydiacetylenfilme oder Liposomen, die Seitenketten des Polydiacetylens stört und daher die Konjugationslänge des Polydiacetylens und die Farbe des Films oder der Liposomen in rot verändert. Die Farbveränderung soll entweder durch das Auge oder durch ein UV-/VIS-Spektrophotometer gemessen werden und durch einen Vergleich der Absorption bei einer Wellenlänge oberhalb von 600 nm und der Absorption einer Wellenlänge unterhalb von 600 nm.
Das Phänomen der Fluoreszenz unterscheidet sich von den Absorptionseigenschaften, die Systeme ihre Farben verleihen. Um fluoreszent zu sein, muss das System eine Wellenlänge von Licht absorbieren und dann eine andere emittieren. Bei Absorption des Lichts wird das System auf einen höheren Energiezustand angeregt. Es kann dann durch eine Vielzahl von Mechanismen zum Grundzustand zurückkehren, wobei die meisten davon nicht zu einer Fluoreszenz führen werden. Diese alternativen nicht strahlenden Mechanismen zur Rückkehr zum Grundzustand führen dazu, dass viele stark absorbierende Arten nicht fluoreszent sind, und erschweren die Vorhersage, welche Spezies fluoreszent sein wird und sind daher für den Fachmann auf dem Gebiet nicht offensichtlich.
Während einige organische Systeme mit verlängerter Konjugation z.B. eine Fluoreszenz zeigen, tun diese viele weitere nicht.
Entlang diesen Dingen absorbieren allgemeine Spezies Licht im ultravioletten und sichtbaren Bereich. Der ultraviolette Wellenlängenbereich liegt bei ungefähr 190 bis 380 nm; der sichtbare Lichtbereich bei ungefähr 380 bis 800 nm. Bei Absorption des Lichts bewegt sich die Art zu einem elektronisch angeregten Zustand mit höherer Energie. Was dann passiert, bestimmt, ob die Spezies fluoreszent ist. Wenn eine Spezies Licht in einer Wellenlänge absorbiert, wird sie auf einen höheren Energiezustand angeregt, wenn sie dann Licht in einer unterschiedlichen Wellenlänge emittiert und in den Grundzustand zurückkehrt, ist sie fluoreszent (oder phosphoreszent). Damit die Fluoreszenz auftritt, muss die angeregte Spezies dazu in der Lage sein, Licht zu emittieren; allgemein muss das emittierte Licht von einer unterschiedlichen Wellenlänge sein als das der Anregung, damit die Fluoreszenz messbar ist. Der Stokes-Shift ist der Unterschied zwischen den Anregungs- und Emissionswellenlängen. Die meisten Spezies, die Licht absorbieren, sind nicht zu einer Lichtemission in der Lage; sie kehren durch eine Vielzahl nicht strahlender Mechanismen in den Grundzustand zurück. Außerdem absorbieren fluoreszierende Arten häufig Wellenlängen von Licht, die nicht zu einer Fluoreszenz führen, wie auch, dass sie Wellenlängen absorbieren, die zu einer Fluoreszenz führen. Kurz gefasst ist die Absorption von Licht notwendig für eine Fluoreszenz, garantiert diese jedoch nicht.
Andererseits ist die Farbe eine Absorptionseigenschaft; die Farben, die wir sehen, stehen zu den Wellenlängen von Licht in Beziehung, die die Spezies absorbiert. Wenn die Spezies beispielsweise Licht im Wesentlichen bei 650 nm absorbiert, werden wir sie blau sehen, während, wenn sie im Wesentlichen bei 550 nm absorbiert, wir dies als rot sehen. Die Farbe ergibt sich aus der Absorption von Licht im sichtbaren Bereich. Die meisten gefärbten Spezies sind nicht fluoreszierend. Wenn eine gefärbte Spezies fluoreszent ist, wird sie normalerweise als eine Farbe erscheinen, wenn sie jedoch angeregt ist und zwar mit der geeigneten Wellenlänge, wird sie mit der Farbe des emittierten Lichts glühen. Ein Fluorophor kann beispielsweise wie ein oranges Pulver aussehen, jedoch unter einer UV-Lampe grün glühen.
Polydiacetylene können eine Fluoreszenz zeigen. Ihre Fähigkeit zur Fluoreszenz hängt jedoch von der strukturellen Form und Organisation der Polymere ab (insbesondere der Konjugationslänge und dem Aggregationszustand), abhängig davon, ob sie in Lösung oder einem Film sind oder in Liposomen oder andere dreidimensionale Strukturen gebildet wurden.
Es ist bekannt, dass Polydiacetylenfilme eine innere Fluoreszenz aufweisen, wenn sie in roter oder gelber Form erzeugt werden, und nicht fluoreszierend sind (durch konventionelle Messungen), wenn der Film in der blauen Form hergestellt wird (Yasuda A. et al., Chem. Phys. Lett., 1993, 209 (3), 281–286). Diese fluoreszierende Eigenschaft der Filme wird für eine mikroskopische Abbildung von Filmdomänen und Defekten verwendet.
Ribi et al. haben zwei Sensoren unter Verwendung von Polydiacetylenfilmfluoreszenzen vorgeschlagen. Der erste Sensor (Saul et al, U. S. Patent 5,415,999 und US Patent 5,618,735) verwendet einen roten fluoreszierenden Polydiacetylenfilm, beschichtet mit einem Fluoreszenzmodulationsreagens, das mit dem Film nicht kovalent assoziiert ist, das die gemessene Emission des Films moduliert, z.B. durch Absorption des emittierten Lichts in Gegenwart eines Analyten. Der fluoreszierende Zustand des Films verändert sich während des Assays nicht; stattdessen wird die Emission durch Wirkung des Fluoreszenzmodulationsmittels überlagert oder aufgedeckt. Der zweite vorgeschlagene Sensor (Ribi, U. S. Patent 5,622,872) verwendet einen Film einer spezifischen Zusammensetzung zum Nachweis eines Analyten zur Veränderung der Fluoreszenz eines Films dieser Zusammensetzung. Die Filme in den Nachweisverfahrensansprüchen umfassen einen polymerisierten Film, polymerisiert aus Diacetylenmonomeren der definierten Formulierung (A)_a(D)_aC_x(C C)₂C_yLB, worin A eine funktionelle Gruppe ist, verwendet, um den Film mit einem darunter liegenden Substrat zu verbinden, a ist 0 oder 1, C ist Kohlenstoff, x und y sind 1 oder mehr und (x + y) liegt im Bereich von 4 bis 32, D und L sind gebundene oder Verbindungsgruppen und B ist eine spezifisches Bindungsglied, das an einen spezifischen Analyten bindet, wobei ein Ende von jedem Monomer dem unterliegenden Substrat nahe ist und das andere Ende B umfasst (d.h. der Film ist ein Monolayer, wobei jede Polydiacetylenseitenkette entweder in Nachbarschaft zu dem darunter liegenden Substrat oder in einem Bindungsglied endet). Die US A 5,268,305 offenbart ein multioptisches System zum Nachweis von Analyten unter Verwendung einer polyungesättigten polymerisierten Lipidschicht, die anisotrop ist, ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares aufweist, gebunden an eine Ende der Lipide und deren optische Eigenschaften durch Komplexbildung zwischen dem spezifischen Bindungspaarmitglied und dem komplementären Glied modifiziert werden. Weder Ribi noch andere haben unserer Kenntnis nach einen Nachweis von Analyten unter Verwendung dreidimensionaler Arrays von Polydiacetylenen (z.B. Liposomen oder Röhrchen) vorgeschlagen und Messungen der Veränderung der Fluoreszenz, die sich aus der Interaktion des Analyten und dem dreidimensionalen Polydiacetylen-Array ergibt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Sensorverfahren bereit, das fluoreszente Veränderungen in Polydiacetylenfilmen misst, wenn sie sich aus der nicht-fluoreszierenden Form (allgemein blau oder lila) in die fluoreszierenden Formen (im allgemeinen rot bis gelb) umwandeln. Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung den Nachweis eines Analyten in einer Probe bereit, umfassend das Kontaktieren der zu testenden Probe mit einem dreidimensionalen Array eines Polydiacetylengrundgerüsts mit einem Substrat (z.B. einem Liganden oder reaktiven Substrat) kovalent oder nicht-kovalent inkorporiert. Der Ligand oder das reaktive Substrat hat eine direkte Affinität für den Analyten oder kann als Bindemittel an den Analyten wirken oder kann eine chemische oder biologische Reaktion oder ein Prozess mit dem Analyten durchlaufen. Die Veränderung der Fluoreszenz wird gemessen oder nachgewiesen, um die Gegenwart des Analyten anzuzeigen.
Die zwei- und dreidimensionalen Polydiacetylenarrays der vorliegenden Erfindung verändern entweder ihren fluoreszierenden Zustand bei Wechselwirkung mit dem Analyten oder verändern ihre Fluoreszenzpolarisation bei Wechselwirkung mit dem Analyten. Die Veränderung von nicht fluoreszierenden Formen zu den fluoreszierenden Formen des Polydiacetylens des Arrays tritt auf Grund der Wechselwirkung des interessierenden Analyten mit dem in den Array inkorporierten Substrat auf. Die Messung des Anstiegs der Fluoreszenz des Arrays, wenn der Array sich von dem nicht fluoreszierenden in den fluoreszierenden Zustand ändert, kann diese Wechselwirkungen als neues Nachweisverfahren überwachen, das sensitiver ist als die Überwachung der Farbveränderung. Dieser Anstieg der Sensitivität ist für das Nachweissystem notwendig, damit es eine tatsächliche Nützlichkeit als Sensor für viele Anwendungen aufweist. Es ist auch möglich, mit dem Array teilweise in fluoreszierenden Form zu beginnen und den Anstieg der Fluoreszenz zu messen, wenn die Wechselwirkung mit dem Analyten stattfindet. Diese Arrays können auch Hilfsfluoreszenzarten (Fluorophore) enthalten und die Fluoreszenz dieser Fluorophore kann durch den Polydiacetylenarray moduliert werden und verändert sich so, wenn das Polydiacetylen sich in seine fluoreszierende Form verändert.
Das Assay-Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht eine kontinuierliche Überwachung der Bindung des Analyten. Der Analyt wird dem Array zugefügt und die Fluoreszenz kann über die Zeit gemessen werden. Da keine Waschschritte nötig sind, ist das erfindungsgemäße Verfahren relativ einfach und preisgünstig in der Durchführung.
Zusammenfassung der Zeichnungen
1 illustriert die Bildung von Polydiacetylen aus Diacetylenmonomeren.
2 illustriert das Fluoreszenzspektrum der nicht fluoreszierenden oder fluoreszierenden Form eines Polydiacetylenliposoms, verwendet in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung.
3 illustriert die Veränderungen der Absorption und der Fluoreszenz von Polydiacetylenliposomen, wenn sie sich von einer Form in die andere umwandeln.
4 illustriert die Fluoreszenz von Polydiacetylenliposomen mit und ohne eingebaute Fluorophore.
5 illustriert die Fluoreszenzspektren eines Polydiacetylenarrays mit Fluorophoren und eingebauten Antichlamydia-Antikörpern, beschichtet auf eine nanoporöse Membran, vor und nach Aussetzung gegenüber Chlamydia Elementarkörpern.
Beste und verschiedene Ausführungsformen der Erfindung
Um das Verständnis der vorliegenden Erfindung zu erleichtern, werden die folgenden Definitionen, die hier verwendet werden, angeboten:

– Substrat: eine chemische oder biologische Einheit
– reaktives Substrat: ein Substrat, das eine chemische oder biologische Reaktion oder einen Prozess durchlaufen kann
– Ligand: Eine Einheit oder ein Substrat, das vorzugsweise mit einem Analyten durch eine kovalente oder nicht kovalente Bindungswechselwirkung in Wechselwirkung treten kann
– Analyt: jede Einheit (physikalisch, chemisch oder biologisch), die nachgewiesen werden soll
– nicht fluoreszierende Form: niedrige Gesamtfluoreszenz oberhalb von 500 nm des Polydiacetylens im Vergleich mit der korrespondierenden fluoreszierenden Form.

Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten dreidimensionalen Arrays umfassen ein Polydiacetylengrundgerüst. Eingebaut in das Polydiacetylengrundgerüst ist ein Ligand oder ein reaktives Substrat, das eine direkte Affinität für den Analyten aufweist oder als kompetitives Bindemittel an den Analyten wirken kann oder mit dem Analyten reagieren kann. Der Ligand oder das reaktive Substrat sind lipophil oder enthalten lipophile Teile oder sind an eine nicht polare oder polare Art konjugiert, die das Gesamtkonjugat lipophil macht. Die lipophilen oder nicht polaren Teile können Diacetylene oder andere polymerisierbare Gruppen enthalten, jedoch ist dies nicht notwendig. Die Arrays werden durch Polymerisation von Vorläuferdiacetylenarrays hergestellt. Die dreidimensionalen Diacetylenvorläufer-Arrays können auch nicht-Substratspezies enthalten, die nicht Diacetylene sind.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Polydiacetylengrundgerüste sind bekannt und müssen hier nicht im Detail beschrieben werden und können von Oligomeren (aus der Reaktion von drei oder mehr Monomeren) bis zu Polymeren reichen. Beispielsweise offenbart das US Patent 6,001,556 an Charych et al. entsprechende, die hier durch In-Bezugnahme inkorporiert sind. Die Auswahl eines gewünschten Polydiacetylens für eine bestimmte Anwendung kann durch Fachmänner auf dem Gebiet bestimmt werden, die sich der Offenbarung dieser Anmeldung bewusst sind, und zwar ohne unnötige Experimente.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist der Ligand oder das reaktive Substrat an das Polydiacetylengrundgerüst vorzugsweise über einen linearen strukturellen Linker gebunden. Die linearen Strukturlinker haben typischerweise zwei terminale Enden, wobei die Linker mit ihren ersten terminalen Enden an den Liganden oder reaktive Substratbestandteile angehaftet sind, ein Teil der Mitte des Linkers in das Polydiacetylengrundgerüst inkorporiert ist und der Rest, einschließlich dem zweiten terminalen Ende, eine Seitenkette des Polydiacetylens wird. Es ist auch möglich, dass das zweite terminale Ende in das Polydiacetylengrundgerüst eingebaut ist. In dieser Ausführungsform wird das Polydiacetylen aus der Polymerisation eines drei- oder zweidimensionalen Arrays von Diacetylenen gebildet, umfassend eine Mischung auf Diacetylenen und Diacetylenen, bei denen die Liganden oder reaktiven Substratbestandteile kovalent an die polymerisierbare Diacetylengruppe angebunden sind. Der Array kann auch Nicht-Diacetylenarten enthalten.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind Ligand oder reaktive Substrate in den Polydiacetylenarray ohne kovalente Anbindung zwischen Polydiacetylengrundgerüst und Ligand oder reaktivem Substrat eingebaut. Der Array kann auch andere Nicht-Diacetylenspezies enthalten.
Außerdem sind Seitenketten mit ordnenden Kopfgruppen typischerweise an das Polydiacetylengrundgerüst gebunden. Die Kopfgruppen sind typischerweise polar.
Das Polydiacetylengrundgerüst befindet sich vorzugsweise in seiner nicht fluoreszierenden Form.
Die Arrays werden durch polymerisierende Arrays von Diacetylenmonomeren gebildet. Die typischen Monomere sind einzel- oder vielschwänzige Diacetylentenside mit polaren Kopfgruppen. Noch typischererweise werden einzel- bis zweischwänzige Diacetylentenside mit polaren Kopfgruppen verwendet. Die Erfindung hängt nicht von der Verwendung irgendeines spezifischen Diacetylentensids, einer Schwanzstruktur oder einer polaren Kopfgruppe ab, kann jedoch mit irgendeinem Diacetylenmonomer verwendet werden, das polymerisiert werden kann, um Polydiacetylen in der nicht fluoreszierenden Form oder Polydiacetylen in einer fluoreszierenden Form zu ergeben, die in eine fluoreszierende Form mit unterschiedlicher Emission und vorzugsweise einer höheren Emission bei Wechselwirkung mit dem Analyten umgewandelt werden kann.
Materialien, die typischerweise als Kopfgruppen in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, beinhalten Carbonsäuren, Carboxylatsalze, Amide, Ethanolamid, Amine, Ammoniums, Amine, Amide, Alkohole, Carbamate, Carbonate, Thio-carbamate, Hydrazide, Hydrazone, Phosphate, Phosphonate, Phosphoniums, Thiole, Sulfate, Sulfonate, Sulfonsäuren, Sulfonamine, Sulfonamide, Aminosäuren, Peptide, nitrofunktionalisierte Einheiten, Kohlenhydrate, Cholin, Ethylenglycol, oligomerisches Ethylenglycol, Poly(ethylenglycol), Propylenglycol, oligomerisches Propylenglycol, und Poly(propylenglycol), und Kombinationen davon, sind jedoch nicht hierauf begrenzt.
Die Liganden und die reaktiven Substrate, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können von einer breiten Vielzahl von Materialien abstammen und sind hier als Arten definiert, die in die Polydiacetylenarrays inkorporiert sind, die mit den Analyten in Wechselwirkung treten. Das Hauptkriterium ist dasjenige, dass der Ligand oder das reaktive Substrat eine Affinität für den gewählten Analyten aufweist. Ligand oder reaktives Substrat können von einem breiten Bereich gewählt sein, beispielsweise wenn eine Klasse von Materialien überprüft werden soll. Geeignete Liganden beinhalten: Peptide, Proteine, Antikörper, Antikörperfragmente, Antigene und Epitope davon, Enzyme, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren, Aminosäuren, Kronenether, cage compounds, kleine Moleküle, organometallische Verbindungen, Salze oder irgendwelche biologischen oder organischen Verbindungen oder Arten, die an die Analyten binden, sind jedoch nicht auf darauf begrenzt. Geeignete reaktive Substrate beinhalten Phospholipide, Peptide, Proteine, Proteasesubstrate, Kinasesubstrate, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren, Aminosäuren oder irgendwelche biologischen, organischen oder organometallischen Verbindungen oder Arten, die eine chemische oder biologische Reaktion oder einen Prozess durchlaufen können. Die Analyten beinhalten Membranen, Rezeptoren, Zellen, Bakterien, Viren, Toxine, Proteine, Enzyme, Proteasen, Kinasen, Antigene, Antikörper, Nukleinsäuren, kleine Moleküle und alle biologischen, organischen oder organometallischen Arten, die mit einem Liganden oder reaktiven Substrat interagieren können, sind jedoch nicht darauf begrenzt.
Einige spezifische Liganden beinhalten G_M1-Gangliosid, Sialinsäure, Serotonin, Diactadecylglycerylether-β-Glucosid, Anti-Salmonella Antikörper, Anti-Listeria Antikörper, Anti-Campylobacter Antikörper, Anti-Chlamydia Antikörper, Anti-Cryptosporidium Antikörper, Anti-Escherica coli Antikörper, HIV-Proteasesubstrate, MAP-Kinasesubstrate, MEK-Kinasesubstrate, und Hexokinase. Einige spezifische reaktive Substrate beinhalten Dimyristoylphosphatidylcholin, Dipalmitolylphosphatidylcholin, Peptide, enthaltend Myelin-basische Protein-Restsequenzen, Peptide, enthaltend Tyrosinhydroxylase-Restsequenzen, Peptide, enthaltend MAP-Kinase-Restsequenzen, und Phosphatidylinositol-4,5-biphosphonatsubstrat für Phosphoinositid-3-kinase. Einige spezifische Analyten beinhalten Influenzavirus, Choleratoxin, Phospholipasen wie Phospholipase A2, HIV-Protease, MAP-Kinasen, MEK-Kinasen, Phosphoinositid-3-kinasen, Salmonella, Listeria, Escherichia coli, Chlamydia, Cryptosporidium, und Campylobacter.
Wenn die Arrays der vorliegenden Erfindung an eine stützende Oberfläche gesichert oder verankert werden sollen, können die Schwänze der Lipide so gewählt werden, um diese Funktion bereitzustellen.
Die dreidimensionalen Arrays der vorliegenden Erfindung können in jeder Anzahl von Formen gebildet werden. Eine der geeigneten dreidimensionalen Arrayformen, die erzeugt werden kann, sind Liposomen. Die Liposomen können in einer Anzahl unterschiedlicher Größen und Arten gebildet werden. Es ist beispielsweise möglich, die Liposomen als einfache Bilayerstrukturen zu bilden. Zusätzlich können sie in einer zwiebelartigen Struktur vielschichtig ausgebildet sein. Ihre Größe kann ebenfalls variieren. Eine geeignete zweidimensionale Arrayform, die erzielt werden kann, ist ein Film. Der Film kann ein Monolayer sein, eine Doppelschicht oder ein Multilayer.
Vielzählige andere Formen können ebenfalls erzeugt werden. Lamellen (Rhodes et al., Langmuir, 1994, 10, 267–275), hohle Röhrchen und Flechten (Frankel et al., J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 10057–10069), Kristalle, lyotrope und thermotrope flüssigkristalline Phasen, Gels und amorphe Strukturen befinden sich unter den anderen Formen, die gebildet werden können. Wenn diese Anordnungen immobilisiert werden, können sie kollektiv sogar größere Konstruktionen bilden.
Diacetylenliposomen können in Röhren vor der Polymerisation durch kontrolliertes Abkühlen, Konzentrationsveränderungen oder Zugabe von Ethanol umgewandelt werden. Die Röhren können photopolymerisiert werden, um die nicht fluoreszierende Form von Polydiacetylen zu ergeben, und dann in Assays mit Fluoreszenzüberwachung verwendet werden. Das Polydiacetylen kann ebenfalls als blaue oder rote Gels mit einer Netzwerkstruktur aggregatierter Fasern gebildet werden. Polydiacetylene werden bei der Bildung von Kompositmaterialien einschließlich einer Schichtung mit anorganischen Tonen verwendet.
Dreidimensionale Arrays von langkettigen Diacetylenmonomeren werden mit Liganden oder Substraten, inkorporiert zur Verwendung in chemischen Reaktionen hergestellt. Diese Liganden oder Substrate können funktionalisierte Diacetylene sein oder einfach ausreichend lipophil, um sich mit den Diacetylenmonomeren zu vermischen. Die Arrays befinden sich üblicherweise in der Form eines Monolayers oder von Multilayerfilmen oder Liposomen in Lösung. Filmarrays von Diacetylenen oder Polydiacetylenen können in freier Form oder gestützt auf Glas, Keramik, Polymer, Papier, Metall oder anderen Oberflächen verwendet werden. Die Träger können porös sein, einschließlich aber nicht begrenzt auf nano- und mikroporöse Membranen. Diacetylenbeschichtungen können auch auf Glas, Keramik-Polymer, Papier, Metall oder andere Oberflächen gegossen werden und photopolymerisiert werden, um den oben beschriebenen Polydiacetylenarray zu ergeben.
Diacetylen- und Polydiacetylenliposomen können an Feststoffe angehaftet werden, von diesen gestützt werden oder darin absorbiert sein, einschließlich aber nicht begrenzt auf: Polymere wie Polystyrol, Polycarbonat, Polyethylen, Polypropylen und Polyfluorkohlenstoffe wie Teflon^®; Siliciumchips; Kügelchen; Filter and Membranen; Glas; Gold; Siliciumoxid; Sephadex; Sepharose; poröse oder schwellende Feststoffe wie Polyacrylate und Polyacetonitril; und Sol-Gels. Im Fall von Diacetylenliposomen und Filmarrays werden sie nach Einbau mit oder Anhaftung an den festen Träger polymerisiert.
Eine bevorzugte Ausführungsform von Feststoff-gestützten Polydiacetylenen ist ein Array auf nanoporösen Membranen. Eine noch bevorzugtere Ausführungsform ist ein Array auf nanoporösen Polycarbonatmembranen.
Wir haben entdeckt, dass Diacetylenliposomen in und auf Membranen gezwungen werden können, beinhaltend 100, 200 und 400 nm Membranen, und photopolymerisiert werden können, um nicht fluoreszierendes Polydiacetylen zu erzeugen. Diese Membranen sind bei Raumtemperatur, an Luft und gegenüber Licht für mindestens 12 Monate stabil. Der Polydiacetylenarray zeigt einige Resistenz gegenüber einem Abrieb. Es erscheint möglich, obwohl die Erfinder nicht daran gebunden sein wollen, dass die Diacetylenliposomen teilweise durch größere Poren auf den Membranoberflächen passieren, bevor sie durch die kleineren Poren darin gefangen werden. Die Polydiacetylenarrays können aus der nicht fluoreszierenden in die fluoreszierende Form umgewandelt werden, wenn sie den geeigneten Reagentien ausgesetzt werden.
Nanoporöse Membranen sind in vielen Materialien erhältlich, einschließlich: Aluminiumoxid, Polyfluorkohlenwasserstoffe wie Teflon^®, Nylon, Polycarbonat, Glas und Polyvinylendifluorid (PVDF) und auch in einer Vielzahl von Porengrößen. Wir betrachten die Verwendung jeder dieser Membrantypen mit Porengrößen von bis zu ungefähr 600 nm zur Herstellung festkörpergestützter Polydiacetylene. Die Polydiacetylen-beschichteten Membranen können dann in Filter und Flusszellen eingebaut werden, als Tupfer oder Teststreifen verwendet werden oder an irgendeinem festen Träger angehaftet werden.
Eine Ausführungsform der Erfindung verwendet einen Filter oder eine Flusszelle, enthaltend eine nicht fluoreszierende Form des Polydiacetylenarrays mit einem eingebauten Substrat, in/auf einer Membran. Eine Lösung eines Analyten wird durch den Filter oder die Flusszelle passiert und erst dann wird die Fluoreszenz der Membran abgelesen. Der Array kann Fluorophoren enthalten, die nicht optisch oder elektronisch mit dem Polydiacetylen interagieren. Die Fluoreszenzemission dieser Fluorophoren kann getrennt als innerer Kalibrierungsstandard überwacht werden. Der Array kann auch Fluorophoren enthalten, die optisch oder elektronisch oder durch Resonanzkopplung mit dem Polydiacetylen interagieren.
Die dreidimensionalen Diacetylenstrukturen werden mit UV-Licht oder γ-Bestrahlung photopolymerisiert, um organisierte Polydiacetylene mit den längeren Konjugationslängen zu ergeben, gekennzeichnet durch ein Absorptionsmaximum im Bereich von 500 bis 800 nm, vorzugsweise im Bereich von 600 bis 750 nm und einer blauen bis lila Farbe. Die Photopolymerisation führt zu der Erzeugung von im Wesentlichen der nicht fluoreszierenden Form und zeigt daher eine niedrige Gesamtfluoreszenz relativ zum Hintergrund. Die Bezeichnung „nicht fluoreszierende Form" wie hier verwendet bezieht sich auch auf diejenigen Polymere, die eine niedrige Gesamtfluoreszenz aufweisen und ein fluoreszentes Signal von oberhalb 500 nm aufweisen, das nur ungefähr 1- bis 3-mal so hoch ist wie das des Hintergrunds und weniger als das der korrespondierenden Fluoreszenzform. Typischerweise zeigt die „nicht fluoreszente Form" eine fluoreszente Emission oberhalb von 500 nm, die mindestens ungefähr 10% niedriger und noch typischer ungefähr 50% niedriger liegt als diejenige der korrespondierenden fluoreszenten Form. Einige dreidimensionale Diacetylen-Arrays ergeben Polydiacetylen in der fluoreszenten Form bei Photopolymerisation; diese können immer noch in den Assays verwendet werden, wenn die Wechselwirkung mit dem Analyten die Arrays in eine fluoreszierende Form umwandelt, die eine unterschiedliche messbare Emission aufweist und vorzugsweise von einer niedriger fluoreszierenden Form zu einer höher fluoreszierenden Form.
Die Fluoreszenz der polymerisierten Assays wird gemessen, sie werden dem Analyten von Interesse für eine ausreichende Zeitspanne ausgesetzt, so dass entweder eine Bindung oder eine chemische/biologische Reaktion auftreten kann, und dann wird die Fluoreszenz wiederum gemessen. Die Bindung oder chemische/biologische Reaktion löst eine Umwandlung des Arrays von der nicht fluoreszierenden Form in eine fluoreszierende Form aus, gekennzeichnet durch Absorptionsmaxima unterhalb von 590 nm, und eine rote, orange, grüne oder gelbe Farbe. Die Polydiacetylenfluoreszenz der fluoreszenten Form kann durch Licht mit Wellenlängen zwischen 300 und 600 nm angeregt werden und besteht aus einer breiten Fluoreszenz oberhalb von 500 nm mit ein oder zwei Maxima, obwohl die Erfindung nicht an diese spezifischen Einzelheiten gebunden ist. Ein Anstieg der Polydiacetylenfluoreszenz nach oder während der Aussetzung gegenüber Analyten oder Spezies von Interesse zeigt eine Bindung oder Reaktion an. Die Fluoreszenz kann auch periodisch während der Aussetzung gemessen werden, um den Verlauf der Interaktion zu verfolgen und die Kinetik zu erhellen.
Dieses Sensorverfahren kann ebenfalls verwendet werden, um die Inhibition der Bindung an die Liganden zu messen oder eine Reaktion mit dem Substrat, durch aktive Verbindungen. Im Fall von Inhibitionsmessungen wird der Inhibitor oder die Testverbindung den Polydiacetylenarrays zugefügt. Die aktive Spezies, die entweder an einen Liganden binden kann oder mit einem reaktiven Substrat reagiert, wird ebenfalls zugefügt. Wenn die Proben einen Anstieg der Fluoreszenz ähnlich zum Anstieg der Fluoreszenz zeigen, der in Kontrollproben auftritt, die ohne die Testverbindung bereitgestellt werden, zeigt dies an, dass der potentielle Inhibitor die Aktivität der aktiven Spezies nicht unterdrückt. Wenn die Proben ein niedriges Fluoreszenzniveau aufrechterhalten, und zwar im Bezug auf die Kontrollproben, oder sich die Fluoreszenz nur um eine Fraktion des Anstiegs erhöht, der bei den Kontrollproben beobachtet wird, zeigt dies eine Inhibition der Aktivität der aktiven Spezies durch das Testmaterial an.
Die Bedingungen, die zu einer Umwandlung in die fluoreszente Form führen, können auch zu chromatischen Veränderungen führen, die gegenüber dem Auge als blau-zu-rot-Verlagerung erscheinen und durch Messung des UV/VIS-Absorptionsspektrums quantifiziert werden können. Eine Veränderung der Fluoreszenz und eine Veränderung der Absorption bei spezifischen Wellenlängen muss nicht notwenigerweise linear korrelieren (3). Es scheint wahrscheinlich, obwohl die Erfinder nicht daran gebunden sein wollen, dass der Anstieg der Fluoreszenzemission sich entweder aus einem Anstieg der Population von Polydiacetylengrundgerüsten mit kürzeren Konjugationslängen oder eine Abnahme im Quenching von Polydiacetylengrundgerüsten mit längeren Konjugationslängen oder beides ergeben kann. Die relative Veränderung der Fluoreszenz kann eine Größenordnung oder mehr sein als die relativen Veränderungen, gemessen im UV/VIS-Absorptionsspektrum bei dieser Transformation. Dies bedeutet, dass die Fluoreszenz eine sensiblere Messung der Veränderung in den Liposomen als die direkte chromatische Reaktion bereitstellen kann. Dieser Anstieg der Sensibilität macht das neue Fluoreszenznachweisverfahren nützlich in vielen Bereichen, wo ein colorimetrischer Nachweis einfach nicht ausreichen würde. Dies beinhaltet Arzneimittel-Entdeckungsassays und den Nachweis von Pathogenen. Für Filme können die fluoreszenten/nicht fluoreszenten Eigenschaften der Polydiacetylene als neues chemisches Sensorverfahren verwendet werden und würden auch eine verbesserte Sensibilität im Vergleich mit einem colorimetrischen Nachweis in immobilisierten Sensorsystemen bereitstellen. Der Fluoreszenznachweis ermöglicht es auch Sensorplattformen, opaque Träger zu verwenden, während ein colorimetrischer Nachweis klare (z.B. Quarzglas oder UV/VIS-transparent Kunststoff-)Träger nötig macht.
Die Fluoreszenz kann mit jeder bekannten Ausrüstung auf dem Gebiet fluoreszenter Messungen abgelesen werden, einschließlich jedoch nicht begrenzt auf Fluorometer mit einer Küvette und faseroptischen Anhaftungen, Plattenablesern, Handheld-Ablesevorrichtungen, Fluoreszenzmikroskopen, CDC-Kameras und durch das Auge. Dieses Sensorverfahren kann einfach für die Formate mit Mikrotiterplatten mit vielen Vertiefungen für eine Screening mit hohem Durchsatz verwendet werden.
Dieses neue Sensorverfahren kann mit geeigneten Liganden, inkorporiert in die Polydiacetylenarrays zum Nachweis einer breiten Vielzahl chemischer und biologischer Spezies an Luft und in Lösungen verwendet werden, einschließlich aber nicht begrenzt auf: kleine organische Stoffe (Molekulargewicht < 1000 g/mol), Lösungsmittel, Toxine, Peptide, Proteine, Viren, Bakterien, chemische und biologische Kriegswaffen und ähnliche. Das Verfahren kann mit geeigneten Substraten, inkorporiert in die Polydiacetylenarrays zum Nachweis einer breiten Varietät chemisch und biologisch reaktiver Spezies an Luft und in Lösung verwendet werden, einschließlich aber nicht begrenzt auf: Basen, Säuren, Lewis-Säuren, Lewis-Basen, Nukleophile, Elektrophile, Oxidationsmittel, Reduktionsmittel und Enzyme. Dieses Verfahren kann auch zur Messung der Inhibition einer Bindung oder Reaktivität verwendet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf Gebieten verwendet werden, die die Arzneimittelentdeckung, medizinische Diagnostik, Nahrungsmittelsicherheit, Pathogennachweis, Umweltüberwachung (einschließlich einer Überwachung der Produktion, Lagerung und Verwendung chemischer und biologischer Kampfmittel) und Grundlagenforschung beinhaltet, ist jedoch nicht darauf begrenzt.
Es wird angenommen, dass der Anstieg der Trennung konjugierter Polymerketten die Fluoreszenz der fluoreszenten Form des Polydiacetylens weiter verstärken kann. Die Abtrennung der Polymerketten soll die Fluoreszenz durch Verminderung der Menge an Selbst-Quenching erhöhen. Es wurde in der Kristallform von Polydiacetylen gezeigt, dass die Fluoreszenz nur durch Abtrennung der Polymerketten erreicht werden kann (Lecuiller R. et al., Phys. Rev. Lett., 1998, 80 (18), 4068–4071). Es ist möglich den Polymerarray mit anderen Nicht-Diacetylentensidspezies zu verdünnen, während immer noch Liposomen oder Filmstruktur erhalten bleibt. Alternativ können die Seitenketten mit großen Gruppen funktionalisiert werden, um die Polymergrundgerüste auf eine gegebene Distanz zu beabstanden oder das Polydiacetylen kann als Copolymer mit entweder einem konjugierten oder nicht konjugierten Polymer hergestellt werden. Ein weiterer Ansatz ist die Reduktion des Ausmaßes der Polymerisation, so dass die Polydiacetylensegmente in einem Array von Diacetylenmonomeren isoliert sind.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die Polydiacetylenarrays andere fluoreszente Spezies inkorporieren. Diese Fluorophoren können organische, biologische, anorganische oder Polymerverbindungen, Komplexe oder Teilchen sein. Die Fluorophoren können die Größenordnung der Veränderung der Fluoreszenz der Polydiacetylenarrays erhöhen, wenn sie sich von der nicht fluoreszierenden zu der fluoreszierenden Form verändern. Die Fluoreszenz der Fluorophoren kann während der Umwandlung überwacht werden, entweder als inneren Standard, wenn die Fluorophorenfluoreszenz nicht durch Veränderung im Polydiacetylen beeinflusst wird oder als zusätzliche Messung der Umwandlung, wenn sich die Fluorophorenfluoreszenz verändert. Zusätzlich können bestimmte Fluorophoren angeregte Zustands-Energietransferprozesse durchlaufen, die die Gesamtfluoreszenz des Arrays verändern und die Quantenausbeute erhöhen.
Viele der Fluorophoren sind lipophil und es wird angenommen, dass sie sich in den Alkylbereich des Liposoms inkorporieren, während andere polar sind oder geladen, und es wird erwartet, dass sie im Kopfgruppenbereich/der wässrigen Grenzfläche enden oder in der Wasserlösung. Die Veränderung sowohl in der Fluoreszenz der Liposomen als auch der Fluoreszenz der zugefügten Fluorophoren wurde, wenn die Liposomen sich von der nicht fluoreszierenden zu der fluoreszierenden Form unter Einwirkung von Wärme, chemischen Reaktionen veränderten, oder während dem Analytennachweis überwacht. Verschiedene Fluorophorenadditive hatten eine Wirkung zur Erhöhung der prozentualen Veränderung der Liposomen-Fluoreszenzreaktion bei Veränderung von der nicht fluoreszierenden zu der fluoreszierenden Form. Die Fluoreszenz des zugefügten Fluorophors wurde ebenfalls überwacht und zeigt auch die Veränderung in der Liposomen-Form, wobei einige einen Anstieg in der Fluoreszenz und andere eine Abnahme zeigten.
Die zugefügten Fluorophoren können optisch und/oder elektronisch mit dem Polydiacetylenpolymer interagieren. Es gibt etliche Wege, dass Fluorophoren und Array optisch/elektronisch in Wechselwirkung treten, einschließlich aber nicht begrenzt auf die folgenden Mittel:

(1) Dadurch, dass die Fluorophoren die Fluoreszenz des Arrays absorbieren oder dass der Array die Fluoreszenz des Fluorophors absorbiert.
(2) Dadurch, dass das Fluorophor das Anregungslicht absorbiert, angeregt wird und dann Energie aus dem angeregten Zustand auf den Polydiacetylenarray überträgt und dadurch bei ihm zu einer Fluoreszenz führt. Dieses Verfahren ist als Resonanzenergietransfer (RET) und auch als Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) bekannt. Dieses RET-Verfahren ermöglicht es, dass die Polydiacetylenfluoreszenz Zeitverfallseigenschaften des Fluorophors aufweist.
(3) Durch den Polydiacetylenarray in der fluoreszenten Form, der Anregungslicht absorbiert und die Energie aus dem angeregten Zustand auf das Fluorophor überträgt, was zu einem Fluoreszieren des Fluorophors führt. Dieses RET-Verfahren kann zu einem Anstieg des effektiven Stokes-Shifts des Systems führen und auch die Gesamtquantenausbeute erhöhen.
(4) Durch den angeregten Zustand des Fluorophors, das ein Elektron auf den Array überträgt oder durch den angeregten Zustand des Arrays, der ein Elektron auf das Fluorophor überträgt. Dieses Verfahren ist als photoinduzierter Elektronentransfer (PET) bekannt.
(5) Dadurch, dass der Array das Anregungslicht absorbiert, das für die Fluorophorenfluoreszenz benötigt wird oder dadurch, dass das Fluorophor das Anregungslicht absorbiert, das für die Arrayfluoreszenz benötigt wird.
(6) Dadurch, dass das Fluorophor die Fluoreszenz des Arrays auslöscht.
(7) Dadurch, dass der Array die Fluoreszenz des Fluorophors auslöscht.

Die Zugabe von Fluorophoren zu dem Polydiacetylenarray ermöglicht es, das Ausmaß der Veränderung der Fluoreszenz des Arrays während eines Assays zu erhöhen und so die Assayempfindlichkeit zu erhöhen und auch die Fluoreszenz des Fluorophors während des Assays als zweites Maß der Veränderung im Polydiacetylenarray, ausgelöst durch den Analyten, zu überwachen. Die RET-Interaktion zwischen Fluorophor und Polydiacetylenarray wird unten diskutiert.
Fluoreszenzresonanzenergiertransfer (RET)
Während die Fluoreszenzüberwachung unter Verwendung der inneren Fluoreszenz des Polydiacetylens eine Verbesserung gegenüber der Absorption (d.h. der colorimetrischen) Überwachung ist, ist das Polydiacetylen ein relativ schwaches Fluorophor. Fluoreszente Polymere sind häufig schlechte Fluorophore, da die konjugierten Ketten als Fallen für den angeregten Zustand wirken können und Mechanismen für eine nicht strahlende Entspannung aus dem angeregten Zustand bereitstellen, was zu einem Auslöschen der Fluoreszenz führt (Warta R. et al, J. Chem. Phys., 1988, 1, 95–99). Es wird die Theorie aufgestellt, dass die langen Konjugationslängen von blauem Polydiacetylen sehr effektive Fallen für die angeregten Zustände bereitstellen, was der Grund dafür ist, dass die blaue Form effektiv nicht fluoreszent ist (Morgan J. et al., Chem. Phys. Lett., 1992, 196, 455–461). Rote und gelbe Polydiacetylenarrays enthalten tatsächlich Mischungen von Polymerketten unterschiedlicher Konjugationslängen und es ist so sehr wahrscheinlich, dass ein Interketten-Quenching wie auch ein Intraketten-Quenching die Fluoreszenz der kürzeren Konjugationslängen reduziert.
Die Gesamtfluoreszenz der Polydiacetylenarrays kann durch Inkorporation bestimmter Fluorophore in die Lipidbereiche, an den Lipid/Wassergrenzflächen und der Wasserlösung selbst, erhöht werden. Die Erfinder haben die These aufgestellt, obwohl sie nicht hieran gebunden sind, dass bestimmte Fluorophore Energie von den angeregten fluoreszenten PDA-Ketten über einen Resonanzenergietransfer (RET a.k.a. FRET) akzeptieren und dann fluoreszieren. Der RET-Prozess scheint ein Kurzschluss von Innerketten-Quenching-Mechanismen zu sein und führt zu einem 20- bis 30-fachen Anstieg der Fluoreszenzintensität des Systems. Der RET-Prozess mit bestimmten Fluorophoren erhöht auch signifikant der Stokes-Shift von weniger als 100 nm auf mehr als 200 nm. Dies ist wichtig, wenn Plattenablesevorrichtungen verwendet werden, um die Fluoreszenz zu messen, da sie häufig weniger als optimale optische Eigenschaften aufweisen oder wenn die Fluoreszenz von Feststoffen abgelesen wird, wo es einen üblicherweise höheren Hintergrund aus der Reflexion des Anregungslichts von der Oberfläche gibt. Die eingebauten Fluorophoren werden direkt durch die Wellenlängen angeregt, die verwendet werden, um das Polydiacetylen anzuregen, und zwar nur in einem geringen Ausmaß, und so werden sie die nicht fluoreszenten Polydiacetylenarrays, die diese Fluorophoren enthalten, nicht signifikant fluoreszent machen.
Es ist auch möglich, dass die Fluorophoren Energie aus ihren angeregten Zuständen auf die fluoreszente Form des Polydiacetylenarrays übertragen und so zu einem Fluoreszieren führen. Ein Fluorophor kann bei einer Wellenlänge angeregt werden, durch die das Polydiacetylen nicht angeregt wird, und dann wird der Transfer von Energie auf das Polydiacetylen zu einem Fluoreszieren des Polydiacetylens führen. Dies kann auch der effektive Stokes-Shift des gesamten Polydiacetylenarrays erhöhen. Wenn das Fluorophor eine lange Lebenszeit aufweist, beispielsweise weisen bestimmte Terbium- und Europium-Verbindungen lange angeregte Zustandsverfallszeiten auf, wird die Polydiacetylenfluoreszenzverfallszeit ebenfalls eine ähnliche Lebenszeit haben. Dies ermöglicht es, zeitaufgelöste Fluoreszenz(TRF)-Messungen unter Verwendung von Polydiacetylenarrays und üblichen TRF-Ablesevorrichtungen (z.B. Victor²V) durchzuführen.
Ein zusätzliches Assay-Verfahren misst Veränderungen der Polarisation von fluoreszenten Polydiacetylenliposomen, um eine Bindung und eine Reaktion von Analyten von Interesse mit den Liposomen nachzuweisen. Für dieses Verfahren wird die Veränderung der Polarisation der Liposomenfluoreszenz an Stelle der Veränderung der Intensität der Fluoreszenz gemessen.
Fluoreszenzpolarisation für den Nachweis
Das Fluoreszenzpolarisationsnachweisverfahren hängt von einer Veränderung der Rotation (oder dem Taumeln) fluoreszenter Polydiacetylenliposomen oder anderer fluoreszenter dreidimensionaler Arrays ab, wenn die interessierenden Analyte an die Arrays binden oder mit diesen reagieren.
Die dreidimensionalen fluoreszenten Polydiacetylenarrays werden mit polarisiertem Licht angeregt. Wenn die Arrays Licht emittieren, bevor sie rotieren, wird die Emission ebenfalls polarisiert sein. Ein Polarisator wird in den Emissionsweg platziert und wird jedes emittierte Licht (d.h. Fluoreszenz) ausfiltern, das nicht die geeignete Polarität aufweist. wenn die Arrays ausreichend Zeit haben, um signifikant nach der Anregung und vor der Emission zu rotieren, wird die Emission depolarisiert. Nachdem ein Analyt an die Arrays bindet, sollte eine signifikante Reduktion der Taumelrate vorliegen, wenn die Analyten in ungefähr derselben Größe vorliegen oder größer als die Arrays. Dies wird dazu führen, dass die Emission polarisierter wird. Es ist auch möglich, dass der Analyt an multiple Arrays binden wird; dies würde die Rotation weiter verzögern und die Polarisation erhöhen. Wenn die Arrays an multiple Analyten binden, sollte sich die Polarisation ebenfalls erhöhen. Wenn der Analyt die Struktur des Liposoms oder anderer dreidimensionaler Polydiacetylenarrays abbaut oder verändert oder Cluster von Liposomen oder anderer dreidimensionaler Polydiacetylenarrays desaggregiert, durch Reaktion mit einem reaktiven Substrat, das in den Array inkorporiert ist, sollte dies die Taumelrate des Arrays verändern und daher seine Fluoreszenzpolarisation. Wenn der Analyt Cluster von Liposomen oder anderer dreidimensionaler Polydiacetylenarrays desaggregiert und zwar durch Reaktion mit oder Bindung an Substrate, die in die Arrays inkorporiert sind, sollte dies die Taumelrate der Arrays verändern und daher die gemessene Fluoreszenzpolarisation. Wenn der Analyt an eine Oberfläche gebunden ist, einschließlich der Oberfläche eines Mikrokügelchens (Durchmesser typischerweise im Nanometer- und Mikrometerbereich bis zu 1 mm) oder der Oberfläche eines Makrokügelchens (Durchmesser typischerweise im Millimeter- und noch größeren Bereich) oder an ein kolloidales Teilchen und ein dreidimensionales Polydiacetylenarray an den Analyten bindet, kann sich die Fluoreszenzpolarisation des Arrays ebenfalls verändern.
Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Nachweisverfahrens verwendet fluoreszente Polydiacetylenliposomen, die Liganden und/oder reaktive Substrate inkorporieren, als dreidimensionale Arrays.
Die Veränderung der Polarisation wird durch Messung der Emissionsintensität durch einen Polarisator bestimmt, der parallel (I_p) ist und die Emission durch einen Polarisator, der senkrecht (I_s) zum Anregungspolarisator ist. Die Polarisation wird wie folgt berechnet: P = (I_p – I_s)/(I_p + I_s); wenn die Bindung auftritt, erhöht sich I_p und I_s vermindert sich und die Polarisation steigt. Ein vergleichbares Verfahren ist das Verfolgen der Anisotropie, r = (I_p – I_s)/(I_p + 2I_s) anstelle der Polarisation.
Beispiele
Die folgenden nicht begrenzenden Beispiele werden präsentiert, um das Verständnis der vorliegenden Erfindung weiter zu erleichtern.
In den folgenden Beispielen wurden die Diacetylenfettsäuren, wenn nicht anders festgehalten, von Farchan oder GFS erworben oder selbst synthetisiert. Die Acetylenverbindungen wurden von GFS oder Lancaster erworben. Die Reagentien wurden von Aldrich and Fisher Scientific erworben. Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC), 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylethanolaminocarproylmaleimid, Bienengiftphospholipase A2(PLA₂), Monosialogangliosid G_M1, und Choleratoxin B Untereinheit wurden von Sigma erworben. Organische Fluorophore wurden von Molecular Probes und Aldrich erworben; Terbium- und Europiumsalze von Alfa Aesar. Chlamydia trachomatis Antikörper (anti-MOMP) wurden von ViroStat arhalten; Chlamydia trachomatis Elementarkörper (EBs) wurden von Advanced Biotechnologies erworben. H₂O wurde durch Ultrafiltration durch ein Millipore Milli-Q Plus System gereinigt. Die Lösungsmittel wurden von Fisher Scientific in Optima-Grad, wenn nicht anders festgehalten, erhalten; wasserfreie Lösungsmittel wurden von Aldrich erhalten.
Eine Sondenbestrahlung wurde unter Verwendung eines Imaging Products Sonic 300 V/T, ausgerüstet mit einer Mikrospitze mit einer ungefähr auf 25% eingestellten Kraft erreicht. Eine Badbeschallung wurde unter Verwendung eines Fisher Scientific FS140H Beschallers erreicht, gefüllt mit Wasser und auf die geeignete Temperatur erwärmt. Die Photopolymerisation wurde unter Verwendung eines UV-Ofens, der kalibrierte Energiedosen von UV-Licht um 254 nm zuführen kann, erreicht. Fluoreszenzspektren wurden in Küvetten und in Platten mit 96 Vertiefungen (schwarzes und weißes unbehandeltes Polystyrol) mit einer SPEX Fluoromax-2 mit einer MicroMax Plattenablesevorrichtung gemessen. UV/VIS-Spektren wurden in Platten mit 96 Vertiefungen mit einem Molecular Devices Spectramax-250 Plattenableser gemessen. Die Assaydaten wurden unter Verwendung sowohl von dem Fluoromax-2 Plattenableser, als auch Wallach Victor² und Victor²V-Ablesevorrichtungen gesammelt. ¹H und ¹³C-Spektren wurden durch Acorn NMR, Livermore CA, erhalten.
Diacetylenfettsäuren, die nicht kommerziell erhältlich waren, wurden gemäß Literaturverfahren durch die Kupfer(I)-vermittelte Kupplung des geeigneten 1-Iod-1-ynkohlenwasserstoffs und der ω-yn-carbonsäure (Tieke B. et al, Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 1976,15 (12), 764–765) synthetisiert. Der 1-Iod-1-yn-Kohlenwasserstoff wurde durch Deprotonierung des korrespondierenden 1-yn-Kohlenwasserstoffs mit einem Äquivalent Butyllithium in wasserfreiem Hexan bei Raumtemperatur unter Argon für eine Stunde, gefolgt von Zugabe von 1,02 Äquivalenten Iod hergestellt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 6 Stunden gerührt, gefolgt von 15 Stunden bei –20°C. Die Reaktion wurde mit 1 M Salzsäure gelöscht und das Produkt in Ethylether extrahiert. Die kombinierten Etherextrakte wurden mit gesättigter Natriumthiosulfatlösung fünfmal gewaschen, zweimal mit gesättigtem Natriumchlorid, mit Magnesiumsulfat getrocknet und gefiltert. Das Lösungsmittel wurde unter Partialdruck entfernt, um ein rohes 1-Iod-1-alkyn mit 98% Ertrag zu ergeben. Das Rohprodukt wurde mit Isopropylalkohol verdünnt und in der nächsten Reaktion innerhalb von 2 Stunden verwendet oder in unverdünnter Form bei –20°C für nicht mehr als ungefähr 20 Stunden gelagert.
Ein Äquivalent der ω-Yn-carbonsäure wurde in 1 M Kaliumhydroxidlösung, enthaltend 1,3 Äquivalent KOH, unter Argon gelöst. Eine katalytische Menge (ungefähr 0,1 Äquivalent) Hydroxyammoniumchlorid wurde der Lösung zugefügt. Kupfer(I)chlorid, 0,25 Äquivalente, wurde in 70% Ethylamin in Wasser, enthaltend 4,4 Äquivalente Ethylamin, gelöst. Diese Lösung wurde der deprotonierten Fettsäurelösung zugefügt und die Mischung in einem Eiswasserbad gekühlt. Das rohe 1-Iod-1-alkyn (1,05 Äquivalente) wurde in Isopropylalkohol (ungefähr 2 Volumen Iod-Alkinlösung zu einem Volumen Reaktionsmischung) zugefügt, der Kolben mit Folie geschützt, um den Inhalt vor Licht zu schützen, und die Reaktion eine Stunde bei 0°C gerührt. Die Reaktion wurde dann auf Raumtemperatur erwärmt und für weitere ungefähr 20 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde mit 1 M Schwefelsäure gelöscht und das Produkt in Ethylether extrahiert. Die kombinierten Etherextrakte wurden mit jeweils den folgenden gewaschen: Wasser, gesättigtem Natriumthiosulfat und gesättigtem Natriumchlorid wiederholt und dann über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Mischung wurde gefiltert und das Lösungsmittel unter Partialdruck entfernt, um das Rohprodukt in quantitativem Ertrag zu ergeben. Die Diacetylenfettsäuren wurden entweder durch wiederholtes Umkristallisieren aus Chloroform Hexan und Hexan gereinigt oder durch Flash-Säulenchromatographie auf Siliciumoxid, eluiert mit einem ansteigenden Prozentsatz Isopropanol in Chloroform, gefolgt von Umkristallisation aus Hexan. Die Reinheit wurde durch Dünnschichtchromatographie auf Siliciumoxid bestimmt (eluiert mit 5% Methanol in Chloroform) und ¹HNMR und ¹³CNMR-Analyse.
Chloroformlösungen von Diacetylentensiden wurden durch Lösen der geeigneten Menge Tensid in Chloroform zur Herstellung einer 2,0 mM Lösung hergestellt und dann durch Filtern der Lösung durch 0,22 μm Poren-PTFE-Filter zur Entfernung von jeglichem Polymer. Diacetylenliposomenlösungen wurden gemäß den allgemeinen Verfahren hergestellt, präsentiert in der Literatur (Hupfer B. et al., Chem. Phys. Lipids, 1983, 33, 355–374; Spevak et al., J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 1146-supplementary materials; Reichart A. et al., J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 829-supplementary materials) durch Trocknen organischer Lösungen der Diacetylentenside zusammen mit irgendwelchen Additiven (z.B. Liganden oder reaktiven Substraten und/oder Fluorophoren), Zugabe von Wasser oder Puffer, um die kombinierten Materialien auf ungefähr insgesamt 1 mM zu bringen, Sondenbeschallung zur Dispersion der Materialien, Filtration durch einen 0,8 μm Porengröße-Zelluloseacetatfilter und Kühlen bei 4 oder 10°C über Nacht.
Chlamydia trachomatis-Antikörper (anti-MOMP) wurde in identische Hälften durch Reduktion der Hinge-Disulfidbindungen mit 2-Mercaptoethylaminhydrochlorid (MEA) (Hermanson G., Bioconjugate Techniques, 1996, Academic Press, San Diego, S. 83) gespalten. Die Antikörperlösung (0,950 mL, zur Verfügung gestellt als 4–5 mg/mL in 2 mM KH₂PO₄/8 mM Na₂HPO₄/155 mM NaCl, pH 7,2) wurde mit 0,02 mL 2 mM KH₂PO₄, 0,08 mL 8 mM Na₂HPO₄ und 0,02 mL 500 mM EDTA kombiniert, bei pH 7,4. MEA (6 mg) wurde zugefügt und das Reaktionsrohr mit Argon gespült und bei 37°C 90 Minuten inkubiert. Die Reaktionslösung wurde entfernt und ungefähr 20 Stunden (10.000 MWCO-Dialysekassette) gegen 0,1 M Na₂HPO₄/0,15 M NaCl Puffer bei pH 7,2 (3 Änderungen von ungefähr 750 mL) dialysiert.
Die freien Thiolgruppen wurden verwendet, um die Antikörperhälften an 1,2-Distearoylsn-glycero-3-phosphorylethanolaminocarproylmaleimid (PE-M) zu konjugieren, um die Antikörper mit Lipidschwänzen zu versehen (Hermanson G., ibid, S. 463–465). PE-M (0,21mg) wurde den dialysierten gespaltenen Antikörperhälften zugefügt, das Reaktionsrohr mit Argon gespült und dann im Bad bei 37°C mit gelegentlichem Vortexmischen über 2 Stunden beschallt, um das PE-M zu dispergieren. Das Rohr wurde dann bei 37°C eine Stunde inkubiert und die Lösung darauf folgend ungefähr 20 Stunden dialysiert (10,000 MWCO Dialysekassette), und zwar gegen 1,5 mM KH₂PO₄/1 mM Na₂HPO₄/137 mM NaCl/2,7 mM KCl bei pH 7,1 (3 Änderungen von ungefähr 750 mL).
Anti-Chlamydia trachomatis-Antikörperhälften, konjugiert an PE-M, wurden in nicht polymerisierte Diacetylenliposomen über Detergensdialyse unter Verwendung von Deoxycholat (Huang A. et al, J. Biol. Chem., 1980, 255 (17), 8015–8018) inseriert. Die Liposomenlösung (1,0 mL, 1 mM im Lipid) wurde mit 6 bis 7 μL der konjugierten Antikörperhälftenlösungen, 56 μL der Deoxycholatlösung (12,5% in Wasser) and 100 μL 15 mM KH₂PO₄/10 mM Na₂HPO₄/1,37 M NaCl/27 mM KCl bei pH 7,4 kombiniert. Die Mischung wurde dann bei 4°C für ungefähr 20 Stunden gegen 10 mM KCl/1,5 mM KH₂PO₄/1 mM Na₂HPO₄, bei pH 7,1 dialysiert, unter Verwendung einer 10,000 MWCO-Kassette und drei Veränderungen bei ungefähr 750 ml.
Beispiel 1
Die Liposomen wurden aus 10,12-Pentacosadyinsäure (PDA) (10,12-pentacosadiynoic acid) in Wasser gebildet und mit 400 mJ/cm² UV-Energie bei ungefähr 254 nm photopolymerisiert. Die Lösung wurde auf 0,1 mM in Originallipid verdünnt und das Fluoreszenzspektrum gemessen. Die Lösung wurde für 10 Minuten auf 63°C erwärmt und das Fluoreszenzspektrum wiederum gemessen. Die Fluoreszenz der beiden Maxima stieg um 350 und 400%. Dies zeigt die Umwandlung aus der nicht fluoreszenten in die fluoreszente Form der Polydiacetylenliposomen unter Erwärmung.
Beispiel 2
Zusätzliche Lösungen polymerisierter Liposomen wurden wie für Beispiel 1 mit Fluorophoren, dem PDA bei 5% molarer Konzentration zugefügt, hergestellt. Die Fluoreszenzspektren wurden genommen, sowohl von der polymerisierten Liposomenfluoreszenz als auch der Fluorophorenfluoreszenz, die Proben auf 63 bis 65°C für 10 bis 15 Minuten erwärmt und die Spektren wieder gemessen. Die Daten werden in Tabelle 1 präsentiert. Die Liposomenfluoreszenz stieg um das bis zu 13-fache und die Fluorophorenfluoreszenz variierte auch von einem Abfall von 16% auf einen Anstieg um das 20,3-fache (2,030%).
Tabelle 1: Veränderung der Fluoreszenz nach 10 bis 15 m bei 63 bis 65°C
Beispiel 3
PDA-Liposomen wurden in Wasser hergestellt und wie für Beispiel 1 photopolymerisiert. Verdünnte Lösungen wurden unter Verwendung gleicher Volumina mit H₂O und 25 mM Natriumbicarbonat auf ungefähr 0,1 mM in Originallipid hergestellt. Die Liposomenfluoreszenzspektren der mit Wasser verdünnten Proben wurden gemessen und nach 30 Minuten wurden auch die Spektren der Basen-verdünnten Proben gemessen. Die prozentuale Veränderung der Fluoreszenz des 560 nm Maximums variierte von einem 55%-igen Anstieg für die einfachen Poly-PDA-Liposomen zu einem 565%-igen Anstieg für eines der Liposomen mit Fluorophorenproben (Tabelle 2).
Tabelle 2: Veränderungen der Poly(PDA)liposomenfluoreszenz mit Base
Beispiel 4
Liposomen wurden aus PDA in Wasser hergestellt und wie für Beispiel 2 photopolymerisiert. Die Poly-PDA-Liposomenlösung wurde 1:1 mit 25 mM Natriumbicarbonat auf ungefähr 0,1 mM in Originallipid verdünnt. Ein Teil der Probe wurde in eine Quarz-Mikrozelle (250 μL) des Fluoromax2 platziert und die Fluoreszenzemission bei 560 nm über 2 Stunden überwacht. Die Absorption eines anderen Teils bei 650 nm, 560 nm und 490 nm wurde simultan über 2 Stunden überwacht. Die prozentualen Veränderungen der Messungen von den anfänglichen Werten wurden für jeden Datenpunkt (prozentuale Veränderung = 100 × [(V (t) – V(0))/(V(0)] berechnet, wobei V(t) der gemessene Wert zum Zeitpunkt t ist, und v(0) der Anfangswert ist. Die prozentualen Veränderungsdaten für Fluoreszenz und Absorption der Poly(PDA)liposomen sind in 3 dargestellt und zeigen deutlich, dass die Veränderung des Fluoreszenzsignals signifikant größer war als die Veränderung der Absorption.
Beispiel 5
1 μM und 5 μM Lösungen von Poly(PDA)liposomen wurden durch geeignete Verdünnung eines Grundstocks polymerisierter Liposomenlösung (siehe Beispiel 1) mit 25 mM NaHCO₃ hergestellt, was die Umwandlung der Poly(PDA)liposomen in fluoreszente Formen auslöste. Die UV/VIS-Absorption der Proben (jeweils 100 μL) wurde unter Verwendung einer Molecular Devices-Plattenablesevorrichtung mit einer Costar UV/VIS-Platte mit 96 Vertiefungen gemessen. Es wurde keine Absorption für irgendeine der Proben oberhalb eines Wasserhintergrunds bei 650 nm, 620 nm, 560 nm und 490 nm spezifisch gemessen und über ein Raster von 350 bis 750 nm im Allgemeinen. Die Fluoreszenzspektren der Lösungen wurden unter Verwendung des SPEX Fluoro- Max 2 gemessen mit einer Quarz-Mikrozelle und einer Anregung bei 490 nm. Fluoreszenzsignale bei 560 nm von ungefähr dem 4- bis 5-fachen Wasserhintergrund wurden für die 1 μM- bzw. 5 μM-Lösungen gemessen. Wenn die Fluoreszenz der Lösungen in einer schwarzen Griener-Platte mit 96 Vertiefungen (jeweils 100 μL) mit dem Viktor²-Plattenableser gemessen wurde, mit einer Anregung von 485 nm, zeigten die 1 μM- und die 5 μM-Liposomenlösungen beide signifikante Signale bei 642 nm über dem Wasserhintergrund von 3-mal dem Hintergrund bzw. 5-mal dem Hintergrund. Dies demonstriert den Anstieg der Empfindlichkeit der Fluoreszenzmessungen gegenüber UV/VIS.
Beispiel 6
Liposomen wurden in Wasser aus einer Mischung von 10,12-Tricosadiynsäure (TRCDA) (10,12-tricosadiynoic acid) und Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) in einem 7:2 molaren Verhältnis hergestellt. Die Liposomen wurden mit 200 mJ/cm² UV-Energie bei 254 nm polymerisiert. Phospolipase A₂ (PLA₂) wurde in Wasser mit 1,0 mg/ml gelöst. Eine gemischte Pufferlösung wurde aus Tris (50 mM) und NaCl (150 mM) bei pH 7,7 hergestellt und mit der PLA₂-Lösung mit 9 Teilen Puffer zu einem Teil PLA₂-Lösung kombiniert. Diese Lösung wurde der Liposomenlösung zugefügt, wobei sie zu 0,091 mM in Liposomen verdünnt wurde („PLA₂-Probe") und die Fluoreszenz wurde über eine Stunde überwacht. Eine Kontrolllösung von 9 Teilen Mischpuffer zu einem Teil H₂O wurde ebenfalls hergestellt. Die Kontrolllösung wurde verwendet, um die Liposomenlösung auf 0,091 mM zu verdünnen („Kontrolllösung") und die Fluoreszenzemssion bei 635 nm wurde über eine Stunde überwacht. Doppel-PLA₂- und Kontrollproben wurden hergestellt und die Absorption bei 650 und 490 nm überwacht und das 650/490 nm-Absorptionsverhältnis zu jedem Zeitpunkt berechnet. Die prozentuale Veränderung der Emission bei 635 nm und das 650 nm/490 nm-Absorptionsverhältnis wurden wie in Beispiel 4 beschrieben berechnet. Nach 5 Minuten war die Emission der PLA₂-Lösung um 42% gestiegen, während die Emission der Kortrolllösung um 14% gestiegen war. Das Absorptionsverhältnis der PLA₂-Lösung war um 29% abgefallen, während das Verhältnis für die Kontrolle um 23% abgefallen war. Nach einer Stunde war die Emission der PLA₂-Probe um 187% gestiegen, die der Kontrollprobe um 130%; das Absorptionsverhältnis der PLA₂-Lösung war um 56% gefallen, während das der Kontrolllösung um 44% gefallen war.
Beispiel 7
Liposomen wurden in Wasser aus einer Mischung aus 10,12-Tricosadiynsäure (TRCDA) und Dimyristoylphosphatidycholin (DMPC) in einem 7:2-molaren Verhältnis mit einem inkorporierten Fluorophor BODIPY^TM TR-Cadaverin in einem Verhältnis von 1 Fluorophor zu 200 TRCDA hergestellt. Die Liposomen wurden mit 200 mJ/cm² UV-Energie bei 254 nm polymerisiert. Phospholipase A2 (PLA₂) wurde in Wasser mit 1,0 mg/ml gelöst. Eine Mischpufferlösung wurde aus Tris (50 mM) und NaCl (150 mM) bei pH 7,7 hergestellt und mit der PLA₂-Lösung mit 9 Teilen Puffern zu einem Teil PLA₂-Lösung kombiniert. Diese Lösung wurde der Liposomenlösung zugefügt, verdünnte diese auf 0,091 mM in Liposomen („PLA₂-Probe") und die Fluoreszenz wurde über eine Stunde überwacht. Eine Kontrolllösung von 9 Teilen Mischpuffer zu einem Teil H₂O wurde ebenfalls hergestellt. Die Kontrolllösung wurde verwendet, um die Liposomenlösung auf 0,091 mM zu verdünnen („Kontrolllösung") und die Fluoreszenzemssion bei 635 nm wurde über eine Stunde überwacht. Die prozentualen Veränderungen der Emission bei 635 nm wurden wie in Beispiel 4 beschrieben berechnet. Nach 5 Minuten war die Emission der PLA₂-Lösung um 46% gestiegen, während diejenige der Kontrolllösung um 10% gestiegen war. Nach einer Stunde war die Emission der PLA₂-Probe um 255% gestiegen und die der Kontrollprobe um 152%.
Beispiel 8
Liposomenlösungen wurden in Wasser aus Mischungen aus 10,12-Tricosadiynsäure (TRCDA) und Dimyristoylphosphatidycholin (DMPC) in einem 7:2-molaren Verhältnis hergestellt, wobei Fluorophoren in einem Verhältnis von ungefähr einem Fluorophor zu 200 TRCDA zugefügt wurden. Jede Präparation hatte ein anderes zugefügtes Fluorophor. Die Liposomen wurden mit 40 mJ/cm² UV-Energie bei 254 nm polymerisiert. Phospholipase A₂ (PLA₂) wurde in wasser mit 1,2 mg/ml gelöst. Eine Mischpufferlösung wurde aus Tris (894 mM), NaCl (150 mM) und CaCl₂ (4,5 mM) bei pH 7,1 hergestellt und mit der PLA₂-Lösung mit 9 Teilen Puffern zu einem Teil PLA₂-Lösung kombiniert. Diese Lösung wurde den Liposomenlösungen zugefügt, verdünnte diese auf 0,091 mM in Liposomen („PLA₂-Probe") und die Fluoreszenz der Liposomen wurde über eine Stunde bei 630 nm überwacht. Eine Kontrolllösung von 9 Teilen Mischpuffer zu einem Teil H₂O wurde ebenfalls hergestellt. Die Kontrolllösung wurde verwendet, um die Liposomenlösung auf 0,091 mM zu verdünnen und die Fluoreszenzemssion der Liposomen wurde über eine Stunde überwacht. Ein zweites Kontrollexperiment bestand aus einer Verdünnung der Liposomenlösungen auf 0,091 mM mit H₂O und Überwachung der Fluoreszenz über eine Stunde. Die Daten werden in Tabelle 3 präsentiert. Es kann beobachtet werden, dass die Liposomenfluoreszenz für die Proben, die PLA ausgesetzt waren, stieg, und signifikant weniger stieg oder abnahm für die Proben, die der Kontrollpufferlösung und einfachem Wasser ausgesetzt waren.
Tabelle 3: Prozentuale Veränderung der Liposomenfluoreszenz bei einer 630 nm Emission nach einer Stunde
Beispiel 9
Liposomen wurden aus 5,7-Docosadiynsäure mit 5 Molar% Monosialogangliosid G_M1 und 0,5 Molar% DIC-18(5) inkorporiert hergestellt, 1 mM Gesamtlipid in H₂O und unter N₂ mit 2,4 J/cm² photopolymerisiert. Die Liposomenlösung (20 μL) wurde mit 10 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,25 (55 μL) in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte bei 96 Vertiefungen kombiniert. Nach 40 Minuten wurden entweder H₂O (25 μL) oder 10 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7,0 (25 μL) oder Choleratoxin B-Untereinheit (CTB)-0,74 mg/mL in 10 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7,0 (25 μL) jeder Vertiefung zugefügt. Die Fluoreszenzintensität bei 680 nm wurde periodisch über 4 Stunden gemessen. Die Vertiefungen mit CTB zeigten einen durchschnittlichen Anstieg von 193% in der Fluoreszenz nach 4 Stunden, die Vertiefungen mit zugefügtem Puffer zeigten einen durchschnittlichen Anstieg von 129% und die Vertiefungen mit zugefügtem H₂O zeigten eine durchschnittliche Veränderung von –2%. Ein Doppelassaylauf mit einer Überwachung der Absorption bei 620 nm und 490 nm zeigte durchschnittliche Veränderungen in den 620/490 nm-Absorptionsverhältnissen von –12% für CTB, –9% für Puffer und –2% mit H₂O.
Beispiel 1.0
Liposomen wurden aus PDA mit 0,5 Molar% DIC-18(5) inkorporiert hergestellt. Anti-Chlamydia trachomatis-Antikörperhälften, konjugiert mit 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylethanolamincaproylmaleimid wurden über Detergensdialyse unter Verwendung von Deoxycholat wie oben beschrieben inseriert. Die Liposomen wurden mit 600 mJ/cm² polymerisiert, um Polydiacetylenliposomen in nicht fluoreszenter Form zu ergeben. Die Liposomenlösung (10 μL) wurde mit H₂O (80 μL) in einer Platte mit 96 Vertiefungen verdünnt und Chlamydia trachomatis-Elementarkörperlösung (10⁸/mL in 10 mM Na-Phosphat/154 mM NaCl bei pH 7,4, 10 μL) zugefügt. Puffer ohne Elementarkörper wurde der Kontrollvertiefung zugefügt. Die Proben wurden mit 475 nm Licht angeregt und die Fluoreszenzintensitäten bei 635 nm (Polydiacetylenemission) und 680 nm (Fluorophoremission) wurden überwacht. Nach einer Stunde betrug die Fluoreszenzintensität bei 635 nm 3168 für die Kontrolle und 3466 für die aktive Probe; die Fluoreszenzintensität bei 680 nm lag bei 2512 für die Kontrolle und 3738 für die aktive Probe.
Beispiel 11
Nicht polymerisierte TRCDA-Liposomen wurden in Wasser hergestellt, auf 4°C abgekühlt und die Lösung durch einen gekühlten in der Hand zu haltenden Extruder (Avestin Inc., Lipo-Fast Basic), ausgerüstet mit einer 100 nm Poren-Polycarbonatmembran, passiert. Die Membran wurde entfernt, 5 Minuten bei 4°C gekühlt und dann mit 100 mJ/cm² UV-Energie (254 nm) photopolymerisiert. Die Membran veränderte sich in ein tiefes Blau und erhielt sich die Farbe über 2 Monate, gelagert an Luft und gegenüber Licht ausgesetzt. Nach 2 Monaten wurde die Fluoreszenz der Membran abgelesen, die Membran in 25 mM NaHCO₃ eine Minute eingeweicht und die Fluoreszenz wieder abgelesen – sie war um 216% angestiegen, wie dargestellt in 4. Ähnliche Membranen hatten ihre ursprüngliche Farbe und den nicht fluoreszenten Zustand für über 12 Monate beibehalten und konnten immer noch in die fluoreszente Form umgewandelt werden.
Beispiel 12
Liposomen wurden aus TRCDA hergestellt und Anti-Chlamydia-Antikörper, konjugiert an 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylethanolaminocaproylmaleimid, wurden wie oben beschrieben inseriert. Die Liposomenlösung wurde für ungefähr 40 Stunden bei 4°C gekühlt. Ungefähr 1,5 mL der Lösung wurden in eine Spritze aufgenommen, ein Spritzenfilterhalter, enthaltend eine 200 nm-Poren dunkelgraue Polycarbonatmembran (Poretics) wurde an der Spritze angebracht und die Lösung durch die Membran gefiltert, um die Liposomen auf/in der Oberfläche abzulagern. Die Membran wurde kurz bei –20°C gekühlt, dann mit 0,05 J/cm² 254 nm UV-Licht belichtet. Dies erzeugte eine dunkelblaue Beschichtung auf der Membran.
Die Membran wurde auf einem schwarzen Metallstreifen angebracht, der diagonal in einer Quarz-Zelle (ungefähr 2 mL Volumen) platziert war. Die Zelle wurde mit Lösung (A) gefüllt, hergestellt aus einem Teil 10 mM Natriumphosphat/154 mM NaCl pH 7,4 zu 9 Teilen Wasser. Die Zelle wurde in einer Haltevorrichtung mit einem 550 nm long pass-Filter platziert, angebracht auf der Emissionsseite in dem Fluoromax 2-Fluorometer. Die Probe wurde mit 450 nm Licht angeregt und die Emission bei 615 nm jede Minute für eine Stunde als Kontrollexperiment gemessen; es wurde kein Anstieg der Emission beobachtet. Die Emission wurde als S/R gemessen = fluoreszentes Signal geteilt durch ein Referenzsignal, direkt genommen von der Anregungslampe; der Referenzwert beträgt weniger als 1 und kompensiert die Fluktuation der Lampenintensität. Die Kontrolllösung wurde dann entfernt und durch Chlamydia-Elementarkörper (EBs) bei ungefähr 10⁷/mL in Lösung (A) ohne Entfernung der Quarz-Zelle oder Probe ersetzt. Die Probe wurde angeregt und die Emission bei 615 nm wie vorher für eine Stunde überwacht und zeigte einen Anstieg. Die Probe blieb dann 16 Stunden in der Lösung und die Emission wurde wieder gemessen und zeigte einen weiteren Anstieg. Nach einer Stunde in dar Kontrolllösung betrug die Probenemission (S/R) 99,556; nach einer Stunde in der Pufferlösung betrug die Probenemission (S/R) 112472 und 123928 nach 16 Stunden.
Beispiel 13
Liposomen wurden aus PDA mit eingebauten 0,5 Molar% DIC-18(5) hergestellt. Anti-Chlamydia trachomatis-Antikörper, konjugiert an 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3phosphorylethanolaminocaproylmaleimid wurden über Detergensdialyse wie oben beschrieben inseriert. Die Liposomen wurden auf einer weißen Polycarbonatmembran mit 100 nm Poren wie in Beispiel 12 beschrieben abgelagert. Die Membran wurde bei –20°C gekühlt und die Beschichtung photopolymerisierte mit 0,08 J/cm² UV-Energie bei 254 nm. Die Membran wurde angebracht und zunächst gegenüber der Kontrolllösung für eine Stunde und dann gegenüber der EB-Lösung ausgesetzt, wie in Experiment 12 beschrieben. Die Fluoreszenzemission (S/R) des inkorporierten Fluorophors wurde bei 676 nm. (550 nm long pass-Filter) überwacht: nach einer Stunde in der Kontrolllösung hatte sie sich um –1% geändert, während sie nach einer Stunde in der EB-Lösung um 63%, nach 4 Stunden um 332% gestiegen war.
Beispiel 14
Liposomen wurden aus 5,7-Tetracosadiynsäure mit 0,5 Molar% DIC-18(5) inkorporiert hergestellt. Anti-Chlamydia trachomatis-Antikörper, konjugiert an 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylethanolaminocaproylmaleimid, wurden über Detergensdialyse wie oben beschrieben inseriert. Die Liposomen wurden auf weißen Polycarbonatmembranen mit 200 nm Poren wie in Beispiel 12 beschrieben abgelagert; 1 mL nicht polymerisierte Liposomenlösung pro 13 mm Membran. Die Membranen wurden bei –20°C gekühlt und die Beschichtungen mit 0,20 J/cm2 UV-Fnergie bei 254 nm photopolymerisiert.
Chlamydia-Elementarkörper (EBs) bei ungefähr 10⁸/mL in 10 mM Na-Phosphat/154 mM NaCl bei pH 7,4 wurden auf ungefähr 10⁶/mL mit Wasser verdünnt. Eine vergleichbare Puffermenge wurde ähnlich wie eine Kontrolllösung verdünnt. Zwei beschichtete Membranen wurden in Spritzenfilterkartuschen platziert, jeweils auf eine unbeschichtete 200 nm-Poren-Polycarbonatmembran. Die Kontrolllösung (2 mL) wurde durch eine Membran geführt und die EB-Lösung (2 mL) durch eine andere, wobei eine 3 mL-Plastikspritze zum unter Druck Setzen der Flüssigkeit verwendet wurde. Die Filtration benötigte 15 bis 20 Minuten. Die Membranen wurden aus den Kartuschen entfernt und auf schwarze Metallstreifen angebracht, die dann in eine Quarz-Zelle wie in Beispiel 12 beschrieben platziert wurden. Die Fluoreszenzemission (550 nm long pass-Filter) wurde für beide Proben gescannt und die Fluoreszenz bei 688 nm (Beschichtungsfluoreszenz) wurde mit der Fluoreszenz bei 560 nm (im Wesentlichen Hintergrundreflexion) verglichen: das 688nm/560nm-Emissionsverhältnis betrug 0,60 für die Membran, die verwendet wurde, um die EB-Lösung zu filtern, und 0,49 für die Membran, die verwendet wurde, um die Kontrolllösung zu filtern.
Weitere Beispiele
Die folgenden zusätzlichen Beispiele illustrieren einige weitere fluoreszente Nachweissysteme gemäß der vorliegenden Erfindung:
Nachweis von Choleratoxin oder von Cholera unter Verwendung von Poly(PDA)-Filmen mit G_M1-Gangliosid und Diacetylenen mit Sialinsäurekopfgruppen inkorporiert und mit oder ohne Fluorophoren in den Filmen.
Nachweis von Influenzavirus unter Verwendung von Poly(PDA)-Liposomen mit Diacetylenen mit Sialinsäurekopfgruppen inkorporiert und mit oder ohne Fluorophoren in den Liposomen.
Nachweis von Influenzavirus unter Verwendung von Poly(PDA)-Filmen mit Diacetylenen mit Sialinsäurekopfgruppen inkorporiert und mit oder ohne Fluorophoren in den Filmen.
Nachweis von PLA₂ mit Poly(TRCDA)-Filmen mit inkorporiertem DMPC und mit oder ohne Fluorophoren in den Filmen.
Nachweis von Escherichia coli mit Poly(TRCDA)-Liposomen mit Diactadecylglycerylether-β-glucosiden inkorporiert und mit oder ohne Fluorophoren in den Liposomen.
Nachweis von Escherichia coli mit Polydiacetylenliposomen mit Antikörpern für Escherichia coli inkorporiert und mit oder ohne Fluorophoren in den Liposomen.
Nachweis von Escherichia coli mit Poly(TRCDA)-Filmen mit Diactadecylglycerylether-β-glucosiden inkorporiert und mit oder ohne Fluorophoren in den Filmen.
Nachweis von Escherichia coli mit Polydiacetylenfilmen mit Antikörpern für Escherichia coli inkorporiert und mit oder ohne Fluorophoren in den Liposomen.
Nachweis von Salmonella mit Polydiacetylenliposomen mit Antikörpern für Salmonella inkorporiert und mit oder ohne Fluorophoren in den Liposomen.
Nachweis von Salmonella mit Polydiacetylenfilmen mit Antikörpern für Salmonella inkorporiert und mit oder ohne Fluorophoren in den Filmen.
Nachweis von Listeria mit Polydiacetylenliposomen mit Antikörpern für Listeria inkorporiert und mit oder ohne Fluorophoren in den Liposomen.
Nachweis von Listeria mit Polydiacetylenfilmen mit Antikörpern für Listeria inkorporiert und mit oder ohne Fluorophoren in den Filmen.
Nachweis von Campylobacter mit Polydiacetylenliposomen mit Antikörpern für Campylobacter inkorporiert und mit oder ohne Fluorophoren in den Liposomen.
Nachweis von Campylobacter mit Polydiacetylenfilmen mit Antikörpern für Campylobacter inkorporiert und mit oder ohne Fluorophoren in den Filmen.
Nachweis von Glucose mit Poly(N-hydroxysuccinimid PDA-PDA)-Filmen mit Hexokinase inkorporiert auf die Oberfläche und mit oder ohne Fluorophoren in den Filmen.
Nachweis von Glucose mit Poly(N-hydroxysuccinimid PDA-PDA)-Liposomen mit Hexokinase inkorporiert auf die Oberfläche und mit oder ohne Fluorophoren in den Liposomen.
Nachweis von Antigenen mit Polydiacetylenliposomen mit Antikörpern oder Antikörperfragmenten inkorporiert, mit oder ohne Fluorophoren zugefügt zu den Liposomen.
Nachweis von Antigenen mit Polydiacetylenfilmen mit Antikörpern oder Antikörperfragmenten inkorporiert, mit oder ohne Fluorophoren zugefügt zu den Filmen.
Nachweis von Proteasen einschließlich HIV-Protease mit Polydiacetylenliposomen mit Proteasesubstrat inkorporiert, mit oder ohne Fluorophoren zugefügt zu den Liposomen.
Nachweis von Proteasen einschließlich HIV-Protease mit Polydiacetylenfilmen mit Proteasesubstrat inkorporiert, mit oder ohne Fluorophoren zugefügt zu den Filmen.
Nachweis von Kinasen einschließlich MAP-Kinasen mit Polydiacetylenliposomen mit Kinasesubstrat inkorporiert, mit oder ohne Fluorophoren zugefügt zu den Liposomen.
Nachweis von Kinasen einschließlich MAP-Kinasen mit Polydiacetylenfilmen mit Kinasesubstrat inkorporiert, mit oder ohne Fluorophoren zugefügt zu den Filmen.
Nachweis von Choleratoxin unter Verwendung von Poly(5,7-docosadiynsäure) mit G_M1-Gangliosid inkorporiert und mit oder ohne Fluorophoren beschichtet auf eine nanoporöse Membran.
Nachweis von Choleratoxin unter Verwendung von Poly(PDA) mit G_M1-Gangliosid und Diacetylenen mit Sialinsäurekopfgruppen inkorporiert und mit oder ohne Fluorophoren beschichtet auf eine nanoporöse Membran.
Nachweis von Influenzavirus mit Poly(PDA mit Diacetylenen mit Sialinsäurekopfgruppen inkorporiert) und mit oder ohne Fluorophoren beschichtet auf eine nanoporöse Membran.
Nachweis von PLA₂ mit Poly(TRCDA) mit DMPC inkorporiert und mit oder ohne Fluorophoren beschichtet auf eine nanoporöse Membran.
Nachweis von Escherichia coli mit Poly(TRCDA) mit Diactadecylglycerylether-β-Glucosiden inkorporiert und mit oder ohne Fluorophoren beschichtet auf eine nanoporöse Membran.
Nachweis von Escherichia coli mit Polydiacetylen mit Antikörpern für Escherichia coli inkorporiert und mit oder ohne Fluorophoren beschichtet auf eine nanoporöse Membran.
Nachweis von Salmonella mit Polydiacetylen mit Antikörpern für Salmonella inkorporiert und mit oder ohne Fluorophoren beschichtet auf eine nanoporöse Membran.
Nachweis von Listeria mit Polydiacetylen mit Antikörpern für Listeria inkorporiert und mit oder ohne Fluorophoren beschichtet auf eine nanoporöse Membran.
Nachweis von Campylobacter mit Polydiacetylen mit Antikörpern für Campylobacter inkorporiert und mit oder ohne Fluorophoren beschichtet auf eine nanoporöse Membran.
Nachweis von Glucose mit Poly(N-hydroxysuccinimid PDA-PDA) mit Hexokinase inkorporiert auf die Oberfläche und mit oder ohne Fluorophoren, beschichtet auf eine nanoporöse Membran.
Nachweis von Antigenen mit Polydiacetylen mit Antikörpern oder Antikörperfragmenten inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren, beschichtet auf eine nanoporöse Membran.
Nachweis von Proteasen einschließlich HIV-Protease mit Polydiacetylen mit Proteasesubstrat inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren beschichtet auf eine nanoporöse Membran.
Nachweis von Kinasen einschließlich MAP-Kinase mit Polydiacetylen mit Kinasesubstrat inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren beschichtet auf eine nanoporöse Membran.
Nachweis von Antikörpern oder Antikörperfragmenten mit Polydiacetylenarrays mit dem geeigneten Antigen oder Epitop inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren inkorporiert.
Nachweis von Antikörpern oder Antikörperfragmenten mit Polydiacetylenliposomen mit dem geeigneten Antigen oder Epitop inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren inkorporiert.
Nachweis von Antikörpern oder Antikörperfragmenten mit Polydiacetylenfilmen mit dem geeigneten Antigen oder Epitop inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren inkorporiert.
Nachweis von Antikörpern oder Antikörperfragmenten mit Polydiacetylenarrays mit dem geeigneten Antigen oder Epitop inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren inkorporiert, beschichtet auf eine nanoporöse Membran.
Nachweis von Antikörpern oder Antikörperfragmenten mit Polydiacetylenliposomen mit dem geeigneten Antigen oder Epitop inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren inkorporiert, beschichtet auf eine nanoporöse Membran.
Nachweis von Antikörpern oder Antikörperfragmenten mit Polydiacetylenfilmen mit dem geeigneten Antigen oder Epitop inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren inkorporiert, beschichtet auf eine nanoporöse Membran.
Nachweis von Nucleinsäuren mit Polydiacetylenarrays mit Nukleinsäuren inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren inkorporiert.
Nachweis von Nucleinsäuren mit Polydiacetylenliposomen mit Nukleinsäuren inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren inkorporiert.
Nachweis von Nucleinsäuren mit Polydiacetylenfilmen mit Nukleinsäuren inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren inkorporiert.
Nachweis von Nucleinsäuren mit Polydiacetylenfilmen mit Nukleinsäuren inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren inkorporiert.
Nachweis von Nucleinsäuren mit Polydiacetylenfilmen mit Nukleinsäuren inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren inkorporiert beschichtet auf eine nanoporöse Membran.
Nachweis von Proteinen mit Polydiacetylenarrays mit Nukleinsäuren inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren inkorporiert.
Nachweis von Proteinen mit Polydiacetylenliposomen mit Nukleinsäuren inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren inkorporiert.
Nachweis von Proteinen mit Polydiacetylenfilmen mit Nukleinsäuren inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren inkorporiert.
Nachweis von Proteinen mit Polydiacetylen mit Nukleinsäuren inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren inkorporiert beschichtet auf eine nanoporöse Membran.
Nachweis von Nucleinsäuren mit Polydiacetylenarrays mit Proteinen inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren inkorporiert.
Nachweis von Nucleinsäuren mit Polydiacetylenliposomen mit Proteinen inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren inkorporiert.
Nachweis von Nucleinsäuren mit Polydiacetylenfilmen mit Proteinen inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren inkorporiert.
Nachweis von Nucleinsäuren mit Polydiacetylen mit Proteinen inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren inkorporiert beschichtet auf eine nanoporöse Membran.
Nachweis von Proteinen mit Polydiacetylenarrays mit Proteinen inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren inkorporiert.
Nachweis von Proteinen mit Polydiacetylenliposomen mit Proteinen inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren inkorporiert.
Nachweis von Proteinen mit Polydiacetylenfilmen mit Proteinen inkorporiert mit oder ohne Fluorophoren inkorporiert.
Nachweis von Proteinen mit Polydiacetylen, mit Proteinen inkorporiert, mit oder ohne Fluorophoren inkorporiert, beschichtet auf eine nanoporöse Membran.

Claims

Nachweisverfahren für einen Analyten in einer Probe, das das Kontaktieren der zu testenden Probe mit einem dreidimensionalen Array eines Polydiacetylen-Grundgerüsts mit einem in dem Array inkorporierten Substrat umfaßt, wobei das Substrat eine direkte Affinität für den Analyten aufweist oder als Bindemittel an den Analyten wirken kann oder mit dem Analyten reagieren kann; und Nachweis der Veränderung der Fluoreszenz, um die Gegenwart des Analyten anzuzeigen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Array in Form einer Lösung von Liposomen oder Röhrchen vorliegt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Analyt ein Enzym ist und das Substrat ein reaktives Substrat des Enzyms ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Analyt ein Antigen und das Substrat der Antikörper des Antigens ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Analyt ein Antigen und das Substrat ein Fragment des Antikörpers des Antigens ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Analyt ein Antikörper oder Antikörperfragment und das Substrat das Antigen des Antikörpers ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Analyt ein Antikörper oder Antikörperfragment und das Substrat das Epitop des Antikörpers ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Analyt ein Enzym und das Substrat ein für das Enzym reaktives Substrat ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Polydiacetylen des Arrays in nichtfluoreszierender Form vorliegt und ein fluoreszierendes Signal ausgibt, das ungefähr 1-3-fach höher ist als dasjenige des Hintergrunds und geringer als dasjenige der korrespondierenden fluoreszierenden Form.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Substrat einen Liganden beinhaltet.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Array in Form einer Lösung von Liposomen oder Röhrchen vorliegt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Substrat ein reaktives Substrat beinhaltet.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei der Array in Form einer Lösung von Liposomen oder Röhrchen vorliegt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der dreidimensionale Array weiterhin ein Fluorophor umfaßt und wobei die Veränderung der Fluoreszenz des Polydiacetylen-Arrays überwacht wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der dreidimensionale Array weiterhin ein Fluorophor umfaßt und wobei die Veränderung der Fluoreszenz des Fluorophors überwacht wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Array kein weiteres Fluorophor enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Veränderung der Fluoreszenz durch Aussetzung gegenüber Licht mit Wellenlängen unterhalb von 550 nm und Messung der Emission nachgewiesen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Veränderung der Fluoreszenz durch Aussetzung gegenüber Licht mit Wellenlängen zwischen 450 und 500 nm und Messung der Emission nachgewiesen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Polydiacetylen des Arrays eine Fluoreszenz ausgibt und wobei die Fluoreszenz als Anzeige der Gegenwart des Analyten steigt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Array auf einen festen Träger geschichtet ist.
Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei der feste Träger eine poröse Membran ist.
Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei der feste Träger eine nanoporöse Membran ist.
Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei der feste Träger eine mikroporöse Membran ist.
Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, das das Kontaktieren der zu testenden Probe mit dreidimensionalen Arrays mit einem Polydiacetylen-Grundgerüst umfaßt, mit in die Arrays inkorporiertem Substrat, wobei das Substrat eine direkte Affinität für den Analyten aufweist oder als Bindemittel für den Analyten wirkt oder mit dem Analyten reagieren kann und wobei die Arrays in Lösung suspendiert sind, und Nachweis der Veränderung der Polarisation der Fluoreszenz der Polydiacetylen-Arrays bei Anregung mit polarisiertem Licht, um die Gegenwart des Analyten anzuzeigen.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei die dreidimensionalen Arrays Liposomen sind.
Verfahren gemäß Anspruch 24 oder 25, wobei das Substrat ein Antikörper und der Analyt ein Antigen für den Antikörper ist.
Verfahren gemäß Anspruch 24 oder 25, wobei das Substrat ein Antikörperfragment und der Analyt ein Antigen gegen das Antikörperfragment ist.
Verfahren gemäß Anspruch 24 oder 25, wobei der Analyt auf einer Oberfläche immobilisiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 24 oder 25, wobei der Analyt auf einem Mikrokügelchen angehaftet ist.
Verfahren gemäß Anspruch 24 oder 25, wobei der Analyt auf einem Makrokügelchen angehaftet ist.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei die dreidimensionalen Arrays auch Fluorophore enthalten und die Veränderung der Polarisation der Fluorophoremission bei Anregung des Polydiacetylen-Arrays mit polarisiertem Licht nachgewiesen wird, um die Gegenwart des Analyten anzuzeigen.
Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei die dreidimensionalen Arrays Liposomen sind.