KR101039629B1 - 생체물질의 검출방법, 생체물질 검출용 칩의 제조방법 및생물질 검출용 칩 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생체물질의 검출방법, 생체물질 검출용 칩의 제조방법 및 생체물질 검출용 칩에 관한 것이다. 본 발명의 생체물질 검출방법은 (S1) 기판에 폴리디아세틸렌 리포좀을 고정화시키는 단계; (S2) 상기 폴리디아세틸렌 리포좀을 상호 간에 결합시켜 상기 기판 위에 적층하는 단계; (S3) 상기 폴리디아세틸렌 리포좀에 검출 대상 생체물질과 상보적 결합을 하는 물질을 고정화시키는 단계; (S4) 상기 폴리디아세틸렌 리포좀을 자외선에 노출시켜 생체물질 검출용 칩을 제조하는 단계; (S5) 상기 생체물질 검출용 칩에 상기 검출 대상 생체물질을 반응시키는 단계; 및 (S6) 상기 생체물질 검출용 칩의 형광 신호를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 디아민 등의 인터링커를 통해 폴리디아세틸렌 리포좀 간의 연결(interlink)을 강화하여 센서 칩 내의 폴리디아세틸 리포좀이 적층된 형태가 되도록 함으로써 형광 신호를 증폭하여 낮은 농도의 생체물질을 효과적으로 검출할 수 있다.
생체물질, 검출, 폴리디아세틸렌, 리포좀, 적층

Description

생체물질의 검출방법, 생체물질 검출용 칩의 제조방법 및 생물질 검출용 칩{DETECTION METHOD OF BIO MATERIAL, FABRICATION METHOD OF CHIP FOR DETECTION OF BIO MATERIAL, AND CHIP FOR DETECTION OF BIO MATERIAL}
본 발명은 생체물질의 검출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 외부 자극에 대해 색 전이가 가능한 폴리디아세틸렌(PDA)을 나노프로브로 제작하여 색 전이 현상으로 항원을 빠르고 간편하게 탐지할 수 있는 생체물질 검출방법에 관한 것이다.
폴리디아세틸렌 바이오센서의 대부분이 합성 리셉터를 이용하는 형태로 현재까지 항체를 선택적으로 고정화한 센서의 예는 극히 일부에 지나지 않는다. 2003년에 미국 연구팀이 폴리디아세틸렌으로 면역 검출법을 개발하여 발표한 바 있으나, 제작 방식이 복잡하여 대안이 될 수 있는 새로운 형태의 면역 검출법이 필요할 것으로 판단된다.
현재 해외 여러 곳에서 폴리디아세틸렌 관련 연구들이 진행되고 있으나 아직 까지는 폴리디아세틸렌 분자체의 물리적, 화학적 특성을 기초로 한 실험 위주로 연구가 행해지고 있으며, 바이오센서로 활용할 수 있다는 이론적인 바탕만을 제공하고 있다. 국내 폴리디아세틸렌 센서 연구 수준은 세계적인 수준을 보이고 있으며, 특히 폴리디아세틸렌으로 센서 칩을 제작하는 기술은 가장 앞서고 있다고 판단된다.
일반적으로, 항체를 이용한 정량분석 방법은 효소면역측정법 (Enzyme Immunoassay, EI), ELISA 법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 및 방사면역측정법 (Radioimmunoassay, RIA) 등이 있다. ELISA 법은 항체에 효소를 결합시켜 항원-항체 반응을 확인하는 방법으로서, 방사능면역시험법 (RIA, Radio ImmunoAssay)에 필적하는 수준의 민감도 (sensitivity)를 가지면서도 방사능을 사용하지 않는다는 점에서 커다란 장점을 가지고 있어 그 이용이 증가되고 있다. 그러나, ELISA 법은 분석에 많은 양의 시료를 요구하며, 시간이 오래 걸리고, 여러 단계의 과정을 거쳐야 한다는 단점이 있다. 또한, 가장 민감도가 높은 방법인 방사면역측정법은 방사능 물질에 의한 위험이 문제가 된다.
최근 이러한 종래기술의 문제점을 해결하기 위해, 동위원소, 형광, 효소 반응을 이용하고 신호 변환이 가능한 분석 방법이 제안된 바 있다. 그러나 이들 방법 중, 동위원소측정법은 안전성에 문제가 있고, 효소반응측정법은 분석 범위가 좁아 다양한 농도로 존재하는 시료를 분석하기에 적합하지 않으며, 형광측정법은 고가의 형광물질을 검출 단백질에 다시 결합시켜 사용해야 한다는 문제점이 있다.
이러한 문제점들을 해결하기 위해, 폴리디아세틸렌을 이용하는 것과 같은 비 표지(Label-free) 검출 방식이 제안되었다. 폴리디아세틸렌은 3중 결합이 번갈아 있는 디아세틸렌(diacetylene) 단량체의 고분자를 의미한다. 디아세틸렌은 양쪽성 성질로 인하여 수용액 상에서 리포좀, Langmuir-Blodgett(LB) 또는 Langmuir-Schaeffer(LS) 단분자막과 같은 초분자체를 형성하는 것으로 알려졌다. 초분자체를 이룬 디아세틸렌은 자외선에 노출되는 경우, 인접 디아세틸렌 간에 고분자화 반응이 일어나면서 파란색을 띠게 된다. 또한, 고분자화된 폴리디아세틸렌 초분자체는 온도, pH, 마찰, 계면활성제 또는 용매 등의 자극을 받으면 빨간색으로 색전이되는 특성을 갖는다. 폴리디아세틸렌 색전이는 고분자 결합의 π-결합 (conjugation)의 길이와 이에 따라 분자들이 취하는 구조에 따른다. 따라서 폴리디아세틸렌 고분자 결합의 변화를 이용한 다양한 형태의 센서 제조가 가능하다. 그러나 이러한 폴리디아세틸렌 바이오센서는 폴리디아세틸렌의 고정화의 불안정으로 인해 검출 물질에 대한 신호가 약하다는 문제점이 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는, 디아민 등의 인터링커를 통해 폴리디아세틸렌 리포좀 간의 연결(interlink)을 강화하여 센서 칩 내의 폴리디아세틸렌 리포좀이 적층된 형태가 되도록 함으로써 형광 신호를 증폭하여 낮은 농도의 생체물질을 효과적으로 검출할 수 있는 생체물질의 검출방법을 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여 예의 연구를 거듭하던 본 발명자들은, 폴리디아세틸렌 리포좀을 단단하게 결합시켜 기판 위에 폴리디아세틸렌 리포좀을 적층된 형태로 고정화시킴으로써 칩을 제조하고, 이를 생체물질과 반응시켜 색 전이를 통해 신호의 증폭을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은, (S1) 기판에 폴리디아세틸렌 리포좀을 고정화시키는 단계; (S2) 상기 폴리디아세틸렌 리포좀을 상호 간에 결합시켜 상기 기판 위에 적층하는 단계; (S3) 상기 폴리디아세틸렌 리포좀에 검출 대상 생체물질과 상보적 결합을 하는 물질을 고정화시키는 단계; (S4) 상기 폴리디아세틸렌 리포좀을 자외선에 노출시켜 생체물질 검출용 칩을 제조하는 단계; (S5) 상기 생체물질 검출용 칩에 상기 검출 대상 생체물질을 반응시키는 단계; 및 (S6) 상기 생체물질 검출용 칩의 형광 신호를 측정하는 단계를 포함하는 생체물질의 검출방법을 제공한다.
상기 폴리디아세틸렌 리포좀은 예를 들어 PCDA(10,12-Pentacosadiynoic-acid) 및 DMPC(1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-phosphocholine)의 혼합물로부터 제조될 수 있다. 여기서, 리포좀의 제조 효율 및 공정의 용이성을 고려할 때, 상기 PCDA 및 DMPC의 혼합비는 9:1 ~ 6:4으로, 상기 PCDA와 DMPC의 혼합 시 온도는 4 ~ 100 ℃으로 하는 것이 바람직하다.
한편, 상기 PCDA는 술폰기, 아민기 및 카르복실기로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 작용기를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 (S2) 단계에서 상기 폴리디아세틸렌 리포좀은 인터링커를 이용하여 상 호 간에 결합될 수 있다. 여기서, 상기 인터링커는 동일 또는 서로 다른 두 개 이상의 작용기를 포함하며, 예를 들어 술폰기, 아민기 또는 카르복실기 등의 작용기를 포함할 수 있다. 이와 같은 인터링커의 예로는 디아민, 디티올, 디카르복시산, 디올 등이 있다. 한편, 상기 인터링커의 농도는 0 mM을 초과하고 20 mM 이하인 것이 바람직하다. 인터링커의 농도가 20mM을 초과하는 경우 너무 넓은 범위의 리포좀 표면을 아민기로 치환 시키는 문제가 있어 바람직하지 못하다.
상기 (S1) 단계는 예를 들어 상기 기판과 상기 폴리디아세틸렌 리포좀에 각각 아민기와 카르복실기를 치환하여, 아민기와 카르복실기 사이의 NHS(N-Hydroxysuccinimide)/EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylamino-propyl]carbodiimide hydrochloride) 화학반응을 이용하여 이루어질 수 있다. 이때, NHS/EDC 화학반응은 0 ℃에서 37 ℃범위에서 이루어지는 것이 바람직하다. 아민기와 카르복실기 이외에도 상호 간에 반응할 수 있는 작용기를 기판 및 폴리디아세틸렌 리포좀에 치환하여 상호 반응시킴으로써 (S1) 단계를 진행할 수 있다. 예를 들어, PCDA에 말레이미드(maleimide)가 결합되는 PCDA-MI의 경우 티올기(-SH 기)로 치환된 기판을 사용하여 기판에 폴리디아세틸렌 리포좀을 고정화시킬 수 있다.
상기 (S3) 단계에서 상기 검출대상 생체물질과 상보적 결합을 하는 물질은 항체이고, 상기 항체의 고정화는 NHS/EDC의 화학반응을 이용하여 이루어질 수 있다.
상기 (S4) 단계에서 상기 폴리디아세틸렌 리포좀은 10 초 내지 10 분 동안 자외선에 노출시키는 것이 바람직하다. 노출 시간이 10초에 미달하면 노출시간이 너무 짧아 리포좀이 푸른색으로 변하는데 한계가 있고, 10분을 초과하면 이미 푸른 색으로 변한 리포좀에 스트레스가 가해져 붉은색으로 변하는 문제가 있다.
상기 (S5) 단계에서 상기 생체물질 검출용 칩에 상기 생체물질을 반응시키는 것은 0 내지 50 ℃에서 이루어지는 것이 바람직하다. 반응 온도가 0℃ 미만이나 50℃를 초과하는 경우 생체물질에 손상이 생기는 문제가 있다.
본 발명의 생체물질 검출방법은 항원-항체, 효소-기질 등 상보적 결합 또는 면역 반응을 하는 물질들의 검출에 널리 활용될 수 있으며, 예를 들어 C.parvum, DNA, RNA, 단백질 및 세포 등의 검출에 이용될 수 있다. 본 발명의 생체물질 검출방법은 극소량의 생체물질도 검출할 수 있는데, 예를 들어 C.parvum의 약 102unit/ml의 농도도 검출이 가능하였다.
본 발명은 또한, (S1) 기판에 폴리디아세틸렌 리포좀을 고정화시키는 단계; (S2) 상기 폴리디아세틸렌 리포좀을 상호 간에 결합시켜 상기 기판 위에 적층하는 단계; (S3) 상기 폴리디아세틸렌 리포좀에 검출 대상 생체물질과 상보적 결합을 하는 물질을 고정화시키는 단계; 및 (S4) 상기 폴리디아세틸렌 리포좀을 자외선에 노출시키는 단계를 포함하는 생체물질 검출용 칩의 제조방법을 제공한다.
상기 폴리디아세틸렌 리포좀은 PCDA 및 DMPC의 혼합물로부터 제조될 수 있다. 여기서, 상기 PCDA는 술폰기, 아민기 및 카르복실기로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 작용기를 포함할 수 있다.
상기 (S2) 단계에서 상기 폴리디아세틸렌 리포좀은 인터링커를 이용하여 상호 간에 결합될 수 있다. 여기서, 상기 인터링커는 동일 또는 서로 다른 두 개 이 상의 작용기를 포함하며, 예를 들어 술폰기, 아민기 및 카르복실기 등의 작용기를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 기판 위에 고정화된 다층의 폴리디아세틸렌 리포좀을 포함하고, 상기 폴리디아세틸렌 리포좀은 검출 대상 생체물질과 상보적 결합을 하는 물질이 고정화되고, 자외선 처리되어 푸른색을 띄는 것을 특징으로 하는 생체물질 검출용 칩을 제공한다.
상기 폴리디아세틸렌 리포좀은 PCDA 및 DMPC의 혼합물로부터 제조될 수 있다. 여기서, 상기 PCDA는 술폰기, 아민기 및 카르복실기로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 작용기를 포함할 수 있다.
상기 폴리디아세틸렌 리포좀은 인터링커를 통해 상호 간에 결합될 수 있다. 여기서, 상기 인터링커는 동일 또는 서로 다른 두 개 이상의 작용기를 포함하며, 예를 들어 술폰기, 아민기 및 카르복실기 등의 작용기를 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 디아민 등의 인터링커를 통해 폴리디아세틸렌 리포좀 간의 연결(interlink)을 강화하여 센서 칩 내의 폴리디아세틸렌 리포좀이 적층된 형태가 되도록 함으로써 형광 신호를 증폭하여 낮은 농도의 생체물질을 효과적으로 검출할 수 있다. 본 발명은 생체물질을 검출하는 바이오센서 칩 등에 적용되어 널리 활용될 수 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명에 따르면, 생체물질 검출을 위한 폴리디아세틸렌 리포좀 칩 제조 시에 에틸렌디아민(Ethylenediamine)과 같은 인터링커를 이용하여 리포좀 간의 결합을 강화하여 리포좀이 기판 위에 적층되도록 함으로써 항원-항체 면역반응으로 인한 색전이 신호를 크게 증폭시켜 생체물질을 효과적으로 검출할 수 있다.
디아세틸렌은 양쪽성 성질에 의해 수용액과 계면을 형성하므로, 리포좀, 마이셀, Langmuir Blodgett 또는 Langmuir Schaeffer 필름과 같은 초분자체로 자기 조립의 유도가 가능하다. 초분자체를 형성할 때, 디아세틸렌 단량체들 사이의 거리가 충분히 좁으면 자외선에 의해 고분자화될 수 있는데, 이때 새로 형성된 고분자 결합에 의해 파란색을 띠게 된다. 여기서 고분자 결합의 색은 결합에 참여하는 π-결합(conjugation)과 밀접한 관련이 있으며, 외부 자극에 의해 고분자의 단량체들의 재배열이 일어나 π-결합 길이가 짧아지면서 자극의 정도에 따라 점차 붉은 색으로의 색전이 현상을 보인다. 색 전이를 일으킬 수 있는 일반적인 자극은 온도, pH, 표면 마찰, 유기 용매 또는 계면 활성제와의 상호 작용이 있으며, 그 외 초분자체의 단량체들을 화학적으로 변형하여 리셉터가 초분자체 계면에 도출되도록 설계할 경우 리셉터가 리간드와 반응하여 색전이가 유도되는 바이오센서, 또는 생화학적 분석 기술로 이용될 수 있다.
도 1a 내지 도 1c는 본 발명에 따라 생체물질 검출용 칩이 제조되는 과정을 개략적으로 나타낸 도면이다. 도 1a 내지 도 1c를 참조하면, 먼저 기판(110)에 폴리디아세틸렌 리포좀(120)이 고정화된다(도 1a). 기판에는 아민기(111) 등이 치환되어 폴리디아세틸렌 리포좀(120)의 카르복실기 등과 반응함으로써 폴리디아세틸렌 리포좀(120)을 고정화시킨다. 다음으로, 상기 폴리디아세틸렌 리포좀(120)을 상호 간에 결합시켜 상기 기판(110) 위에 상기 폴리디아세틸렌 리포좀(120)을 적층한다(도 1b). 본 단계를 거치기 전에는 폴리디아세틸렌 리포좀(120) 간의 결합력이 약하여 폴리디아세틸렌 리포좀(120)이 쉽게 씻겨지므로 적층 구조를 형성할 수 없으나, 본 단계를 거치면서 결합력이 강화되어 적층 구조를 형성하게 된다. 다음으로, 폴리디아세틸렌 리포좀(120)에 생체물질과 상보적 결합을 하는 물질(140)을 고정화시킨다(도 1c). 마지막으로, 폴리디아세틸렌 리포좀을 자외선에 노출시킨다. 본 단계를 통해 폴리디아세틸렌 리포좀은 푸른색을 띄게 된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예> 다층 폴리디아세틸렌 리포좀을 포함하는 센서 칩을 이용한 C. parvum 의 검출
1) PCDA와 DMPC를 이용하여 폴리디아세틸렌 리포좀 제조
첫 번째 단계로 리포좀의 제조와 유리 기판으로의 고정화는 PCDA와 DMPC의 혼합과 NHS/EDC의 화학작용으로 수행되었다. PCDA와 DMPC를 각각 클로로포름에 일 정한 농도(10 mM)로 용해시켜 바이알에 단단히 밀봉하여 -20 ℃에서 보관하였다. 두 용액을 일정한 몰 비율로 혼합하여 최종 지질 농도가 1 mM이 되도록 했다. PCDA와 DMPC를 8:2의 몰 비율로 혼합한 후, 질소 가스를 이용하여 클로로포름을 증발시키고 바이알 바닥에 리피드 필름을 형성시켰다. 형성된 리피드 필름에 PBS 버퍼를 첨가해 주고 80 ℃에서 15 분간 가열하여 지질 필름을 버퍼 내로 재 분산시켰다. 이렇게 재 분산된 용액을 익스트루더(Extruder) 시스템을 통해 투과 크기 100 nm의 막으로 수차례 통과시켰다. 이 때, 익스트루더 시스템은 PCDA 지질 구조체의 용이한 형성을 위해 75 ℃를 유지했다. 최종적으로 막을 통과한 용액은 PCDA와 DMPC를 포함하는 100 nm 크기의 리포좀으로 구성되어졌다. 제조된 리포좀 용액은 실온 (25 ℃)에서 20 분간 식힌 후 아민으로 치환된 유리 기판에 고정화시킬 준비를 하였다.
2) 폴리디아세틸렌 리포좀의 고정화와 폴리디아세틸렌 리포좀의 적층
화학적 방법을 이용하여 폴리디아세틸렌 리포좀을 아민 치환된 유리 기판에 고정화시켰다. NHS와 EDC를 PBS 버퍼에 각각 200 mM 의 농도가 되도록 용해시켰다. 그 후 준비된 폴리디아세틸렌 리포좀 용액을 NHS/EDC 용액 및 에틸렌디아민과 동일한 양으로 혼합시켰다. 이때 에틸렌디아민의 최적 농도를 결정하기 위해 에틸렌디아민의 농도를 0 mM에서부터 20 mM까지 다양하게 변화시키면서 실험을 하였다. 에틸렌디아민의 농도 범위는 에틸렌디아민의 농도가 너무 높으면 폴리디아세틸렌 리포좀의 겉표면이 모두 아민기로 치환이 되어 유리 기판에 고정화가 되지 않을 것이고, 또 너무 낮으면 신호 증폭의 효과가 없다는 것을 고려한 것이다. 혼합된 리포 좀 용액은 마이크로-어레이어(micro-arrayer)를 사용하여 아민 치환된 유리 기판에 스팟팅했다. 이렇게 폴리디아세틸렌 리포좀이 스팟팅 된 유리 기판은 리포좀 용액의 증발을 막기 위해 저온(4 ℃)의 습한 용기에서 두 시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 폴리디아세틸렌 리포좀 기판을 증류수와 0.1 % Tween-20 용액을 이용하여 신속히 세척하고 질소 가스를 이용하여 가볍게 건조시켰다.
3) C. parvum 에 대한 항체를 폴리디아세틸렌 리포좀 위에 고정화
항체 고정화도 NHS/EDC 화학반응을 이용하였다. PBS 버퍼에 용해시킨 200 mM의 NHS/EDC용액에 항체를 혼합하여 폴리디아세틸렌 리포좀을 고정화시킨 기판과 3시간 동안 반응시켰다. 본 과정 역시 항체 용액의 증발을 막기 위해 저온(4 ℃)의 습한 용기에서 반응시켰다. 반응 종료 후, 이전 단계에서와 같이 세척 및 건조하여 폴리디아세틸렌 리포좀 센서 칩 제작을 완성하였다.
4) C. parvum 의 검출
앞서 제조된 센서 칩을 254 nm의 자외선에 약 5 분간 노출시켰다. 자외선에 노출된 폴리디아세틸렌 리포좀 센서 칩은 파란색을 띄게 되고, 그 후 상기에 준비한 0 mM에서 20 mM 농도의 디아민 처리를 한 센서 칩에 C. parvum(10^7 unit/ml)을 면역반응의 최적온도(37 ℃)에서 흘려줬다. 이때 면역반응의 스트레스로 인하여 파란색의 폴리디아세틸렌 리포좀 센서 칩은 붉은색을 띄게 되고, 그 색전이 정도를 광학현미경으로 측정했다. 도 2a 내지 도 2c는 본 실험을 통해 얻어진 것으로, 도 2a는 인터링커의 농도에 따른 C.parvum의 검출 신호를 나타낸 그래프이고, 도 2b는 인터링커를 이용하지 않고 폴리디아세틸렌 리포좀을 단층으로 고정화한 경우와 인터링커를 이용하여 폴리디아세틸렌 리포좀을 다층으로 고정화한 경우의 검출 신호 비교 그래프이며, 도 2c는 인터링커의 농도별 C.parvum 검출 색전이 이미지이다.
도 2a 내지 도 2c의 분석 결과를 통해, 0 mM에서 1 mM까지 디아민의 농도가 높아질수록 신호도 증가했지만, 1 mM 이후로는 농도가 높아질수록 신호가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 디아민의 농도가 1 mM일 때 신호가 약 205정도로 가장 높았으며, 이미지를 보아도 확연히 알 수가 있었다. 그리고, 기존의 방법(0 mM)과 1 mM의 디아민으로 처리한 그래프를 보면 약 20배 정도 신호가 증폭되었음을 확인할 수 있었다.
5) C. parvum 의 농도에 따른 검출 신호 변화
상기와 같은 방법으로 디아민 처리를 하면 기존의 방법보다 신호가 상당히 증폭된다는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 이러한 방법으로 센서 칩의 기능을 할 수 있는지를 증명하려면 검출 대상 생체물질의 농도별로 정확한 신호가 감지된다는 것을 보여줘야 했다. 또한 실제 하천수의 병원성 미생물을 검출하기 위해서는, 기존의 방법의 검출 한계인 105 unit/ml로는 실용화하기 어렵기 때문에 더 낮은 검출 한계를 얻어야 했다. 따라서 센서 칩의 기능을 제대로 수행할 수 있는지를 증명하기 위해, C. parvum을 농도별로 검출하는 실험을 실시하였다.
상기의 방법대로 최적 농도인 1 mM의 디아민 처리된 폴리디아세틸렌 리포좀 센서 칩을 254 nm의 자외선에 약 5 분간 노출시킨 후 102unit/ml(control)에서 107 unit/ml까지의 C. parvum을 37 ℃에서 흘려주었다. 그리고 광학현미경으로 형광신호를 측정했다. 도 3a 및 도 3b는 위 실험을 통해 얻어진 것으로, 도 3a는 C.parvum의 농도에 따른 검출 신호 변화를 나타낸 그래프이고, 도 3b는 검출 신호 값과 C.parvum의 농도의 지수적 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 3a 및 도 3b의 결과를 통해, 세포의 농도가 증가함에 따라 신호도 일정하게 증가하여 세포 농도에 따른 검정곡선이 직선 형태를 보이는 것을 확인하였고, 최고 102unit/ml의 농도부터 최대 107unit/ml까지 검출이 가능함을 알 수 있었다. 그리고 BSA(Bovine Serum Albumin)에 대한 신호가 제어 신호와 비슷한 것으로 보아 센서 칩은 표적 물질이 아닌 것에는 반응하지 않고 C. parvum에 대해 특이적으로 반응한다는 것을 알 수 있었다.
도 1a 내지 도 1c는 본 발명에 따라 생체물질 검출용 칩이 제조되는 과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 2a는 인터링커의 농도에 따른 C.parvum의 검출 신호를 나타낸 그래프이고, 도 2b는 인터링커를 이용하지 않고 폴리디아세틸렌 리포좀을 단층으로 고정화한 경우와 인터링커를 이용하여 폴리디아세틸렌 리포좀을 다층으로 고정화한 경우의 검출 신호 비교 그래프이며, 도 2c는 인터링커의 농도별 C.parvum 검출 색전이 이미지이다.
도 3a는 C.parvum의 농도에 따른 검출 신호 변화를 나타낸 그래프이고, 도 3b는 검출 신호 값과 C.parvum의 농도의 지수적 상관관계를 나타낸 그래프이다.

Claims (26)

  1. (S1) 기판에 폴리디아세틸렌 리포좀을 고정화시키는 단계;
    (S2) 상기 기판에 폴리디아세틸렌 리포좀을 고정화시킨 이후에, 폴리디아세틸렌 리포좀과 폴리디아세틸렌 리포좀 사이를 인터링커를 이용하여 연결하여 폴리디아세틸렌 리폼좀을 상호 간에 결합시켜서 상기 기판 위에 폴리디아세틸렌 리포좀을 적층하여, 다층의 폴리디아세틸렌 리포좀을 형성하는 단계;
    (S3) 상기 폴리디아세틸렌 리포좀에 검출 대상 생체물질과 상보적 결합을 하는 물질을 고정화시키는 단계;
    (S4) 상기 폴리디아세틸렌 리포좀을 자외선에 노출시켜 생체물질 검출용 칩을 제조하는 단계;
    (S5) 상기 생체물질 검출용 칩에 상기 검출 대상 생체물질을 반응시키는 단계; 및
    (S6) 상기 생체물질 검출용 칩의 형광 신호를 측정하는 단계
    를 포함하는 생체물질의 검출방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 폴리디아세틸렌 리포좀은 PCDA 및 DMPC의 혼합물로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 생체물질의 검출방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 PCDA는 술폰기, 아민기 및 카르복실기로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체물질의 검출방법.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 인터링커는 술폰기, 아민기 및 카르복실기로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체물질의 검출방법.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 PCDA 및 DMPC의 혼합비는 9:1 ~ 6:4것을 특징으로 하는 생체물질의 검출방법.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 PCDA와 DMPC의 혼합 시 온도는 4 ~ 100℃인 것을 특징으로 하는 생체물질의 검출방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 (S1) 단계는 상기 기판에 치환된 아민기와 상기 폴리디아세틸렌 리포좀의 카르복실기의 NHS/EDC 화학반응을 이용한 것을 특징으로 하는 생체물질의 검출방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 (S1) 단계에서 상기 NHS/EDC 화학반응은 0 ℃에서 37 ℃ 범위에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 생체물질의 검출방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 인터링커의 농도는 0 mM을 초과하고 20 mM 이하인 것을 특징으로 하는 생체물질의 검출방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 (S3) 단계에서 상기 검출대상 생체물질과 상보적 결합을 하는 물질은 항체이고, 상기 항체의 고정화는 NHS/EDC 화학반응을 이용한 것을 특징으로 하는 생체물질의 검출방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 (S4) 단계에서 상기 폴리디아세틸렌 리포좀을 10 초 내지 10분 동안 자외선에 노출시키는 것을 특징으로 하는 생체물질의 검출방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 (S5) 단계에서 상기 생체물질 검출용 칩에 상기 생체물질을 반응시키는 것은 0 내지 50 ℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 생체물질의 검출방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 검출 대상 생체물질은 C.parvum, DNA, RNA, 단백질 및 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생체물질의 검출방법.
  15. (S1) 기판에 폴리디아세틸렌 리포좀을 고정화시키는 단계;
    (S2) 상기 기판에 폴리디아세틸렌 리포좀을 고정화시킨 이후에, 폴리디아세틸렌 리포좀과 폴리디아세틸렌 리포좀 사이를 인터링커를 이용하여 연결하여 폴리디아세틸렌 리포좀을 상호 간에 결합시켜서 상기 기판 위에 폴리디아세틸렌 리포좀을 적층하여, 다층의 폴리디아세틸렌 리포좀을 형성하는 단계;
    (S3) 상기 폴리디아세틸렌 리포좀에 검출 대상 생체물질과 상보적 결합을 하는 물질을 고정화시키는 단계; 및
    (S4) 상기 폴리디아세틸렌 리포좀을 자외선에 노출시키는 단계
    를 포함하는 생체물질 검출용 칩의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 폴리디아세틸렌 리포좀은 PCDA 및 DMPC의 혼합물로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 생체물질 검출용 칩의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 PCDA는 술폰기, 아민기 및 카르복실기로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체물질 검출용 칩의 제조방법.
  18. 삭제
  19. 제15항에 있어서,
    상기 인터링커는 술폰기, 아민기 및 카르복실기로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체물질 검출용 칩의 제조방법.
  20. 제15항에 있어서,
    상기 검출 대상 생체물질은 C.parvum, DNA, RNA, 단백질 및 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생체물질 검출용 칩의 제조방법.
  21. 기판 위에 고정화된, 인터링커를 통해 폴리디아세틸렌 리포좀 상호 간에 결합되어 폴리디아세틸렌 리포좀이 적층된 다층의 폴리디아세틸렌 리포좀을 포함하고,
    상기 폴리디아세틸렌 리포좀은 검출 대상 생체물질과 상보적 결합을 하는 물질이 고정화되고, 자외선 처리되어 푸른색을 띄는 것을 특징으로 하는 생체물질 검출용 칩.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 폴리디아세틸렌 리포좀은 PCDA 및 DMPC의 혼합물로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 생체물질 검출용 칩.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 PCDA는 술폰기, 아민기 및 카르복실기로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체물질 검출용 칩.
  24. 삭제
  25. 제21항에 있어서,
    상기 인터링커는 술폰기, 아민기 및 카르복실기로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체물질 검출용 칩.
  26. 제21항에 있어서,
    상기 검출 대상 생체물질은 C.parvum, DNA, RNA, 단백질 및 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생체물질 검출용 칩.
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