KR101775968B1 - 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 이용한 바이오 센서 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 이용한 바이오 센서 및 이의 제조방법이 개시되어 있다. 시료를 수용하기 위한 시료 패드, 상기 시료 중에서 목적 물질과 결합가능한 적색의 폴리디아세틸렌 형광체가 포함된 멤브레인, 상기 목적 물질과 결합된 상기 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 검출하기 위한 검출부 및 상기 시료 패드, 상기 멤브레인 및 상기 검출부를 지지하기 위한 지지체를 포함한다. 적색의 폴리디아세틸렌 형광체와 특정 목적 물질을 특이적으로 결합시키고 형광량을 측정하는 것에 의해 목적 물질을 검출할 수 있다.

Description

적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 이용한 바이오 센서 및 이의 제조방법{Biosensor using red polydiacetylene phosphor and method of manufacturing the same}

본 발명은 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 이용한 바이오 센서 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 적색의 폴리디아세틸렌 형광체의 형광 특성을 이용한 바이오 센서 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

항체를 이용한 정량분석 방법에는 효소면역측정법(Enzyme Immunoassay, EI), ELISA 법(Enzyme-linked immunosorbent assay) 및 방사면역측정법(radioimmunoassay, RIA) 등이 있다. ELISA 법은 항체에 효소를 결합시켜 항원-항체 반응을 확인하는 방법으로서 비교적 간단하고 비용이 많이 들지 않으며 다량 분석이 가능하다는 장점을 가지고 있어서 널리 이용되는 방법 중 하나이다. 그러나 ELISA 법은 분석에 많은 양의 시료를 요구하며, 시간이 오래 걸리고 여러 단계의 과정을 거쳐야 한다는 단점이 있다. 민감도가 높은 방사면역측정법은 방사능 물질에 의한 위험성이 수반된다는 문제가 된다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여 동위 원소, 효소 반응, 형광 등을 이용하고 신호 변환이 가능한 분석 방법이 제안된 바 있다. 그런데 이러한 방법들 중에서, 동위원소 측정법은 안전성에 문제가 있고, 효소반응측정법은 분석 범위가 좁아 다양한 농도로 존재하는 시료를 분석하기에 적합하지 않으며 형광측정법은 고가의 형광물질을 검출 단백질에 다시 결합시켜 사용해야 하는 어려움이 있다.

한편, 폴리디아세틸렌(polydiacetylene; PDA)을 이용하는 것과 같은 비표지(label-free) 검출 방식이 제안되었다.

폴리디아세틸렌 소포(vesicle)는 독특한 발색 성질을 갖고 있기 때문에 화학적 또는 생물학적 센서에 이용하기 위한 많은 연구가 이루어지고 있다. 10,12-펜타코사디이노익 애시드(10,12-pentacosadiynoic acid, PCDA)와 같은 디아세틸렌 단량체는 자외선 조사하에서 1,4-첨가반응을 통해 중합이 이루어지며 엔-인(ene-yne) 결합이 교대로 나타나는 중합사슬 구조를 갖는데, 리포좀(liposome) 형태의 소포를 형성한다.

분자 인식에 의해 청색에서 적색으로 색이 전이되는 현상을 이용한 다양한 종류의 폴리디아세틸렌계 바이오 센서가 연구되어 왔다.

한국공개특허 2009-0121669호에서는 생체물질의 검출방법이 개시되어 있는데, 이 방법은 폴리디아세틸렌 리포좀을 기판에 고정시킨 후 검출 대상 물질을 반응시켜 반응에 의한 색전이를 통해 형광 신호를 측정하는 원리를 이용한다. 이 방법에 의하면, 디아민 등의 인터링커를 통해 폴리디아세틸렌 리포좀 간의 연결을 강화하여 센서 칩 내에서 폴리디아세틸렌 리포좀이 적층된 형태가 되도록 함으로써 형광 신호를 증폭하여 낮은 농도의 생체 물질을 검출하게 된다.

이와 같이 폴리디아세틸렌을 이용한 센서의 응용은 주로 청색에서 적색으로의 색전이 현상을 이용한 것에 국한되어 왔다. 그런데 청색의 폴리디아세틸렌을 이용한 센서를 사용하여 임상시료 등을 분석할 때 시료 내에 목적 물질 이외의 물질이 다량 함유되어 있기 때문에 목적 물질 이외 물질과의 반응에 따른 색전이가 심하게 나타난다는 문제점이 있다. 이에 더하여, 목적 물질에 대한 정성적인 분석은 가능하나 정량적인 분석이 어렵고 청색의 폴리디아세틸렌은 장시간 동안의 보관이 용이하지 않다는 단점이 있다.

따라서 본 발명을 통해 해결하려는 과제는 색전이를 이용한 센서가 아닌 안정적인 적색의 폴리디아세틸렌 형광체의 형광 특성을 이용하여 목적 물질을 높은 감도로 검출할 수 있으며 정량적 분석이 가능한 바이오 센서를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 적용함으로써 목적 물질에 대한 선택적인 검출 기능을 갖게 되는 바이오 센서의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 달성하기 위하여 본 발명에서는 시료를 수용하기 위한 시료 패드, 상기 시료 중에서 목적 물질과 결합가능한 적색의 폴리디아세틸렌 형광체가 포함된 멤브레인, 상기 목적 물질과 결합된 상기 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 검출하기 위한 검출부 및 상기 시료 패드, 상기 멤브레인 및 상기 검출부를 지지하기 위한 지지체를 포함하는 바이오 센서를 제공한다.

일실시예에 있어서, 상기 적색의 폴리디아세틸렌 형광체는 보론산(boronic acid)기, DNA, RNA, 단백질, 바이러스, 펩타이드, 압타머, 항체 및 탄수화물 중에서 선택된 하나의 인터링커가 결합된 폴리디아세틸렌의 리포좀이다.

일실시예에 있어서, 상기 목적 물질은 당화 단백질, DNA, RNA, 단백질, 항체, 바이러스, 펩타이드, 압타머, PNA, 항원, 대장균 및 콜레라 독성을 포함하여 이루어진다.

일실시예에 있어서, 상기 바이오 센서는 상기 목적 물질 외의 생체 물질을 포획하기 위한 제어부 및 과량의 상기 시료를 흡수하기 위한 흡수 패드를 더 포함한다.

일실시예에 있어서, 상기 검출부에는 상기 목적 물질의 항체가 포함된다.

상술한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위한 바이오 센서의 제조방법은, 시료를 수용하기 위한 시료 패드를 마련하는 단계, 상기 시료 패드의 하부에 배치되며, 상기 시료 중 목적 물질과 결합 가능한 적색의 폴리디아세틸렌 형광체가 포함된 멤브레인을 마련하는 단계, 상기 멤브레인의 하부에 배치되며, 상기 목적 물질과 결합된 상기 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 검출하기 위한 검출부를 마련하는 단계 및 상기 시료 패드, 상기 멤브레인 및 상기 검출부를 지지하기 위한 지지체를 마련하는 단계를 포함한다.

일실시예에 있어서, 상기 적색의 폴리디아세틸렌 형광체는, 디아세틸렌 리포좀을 제조하는 단계, 제조된 디아세틸렌 리포좀을 자외선에 노출시켜 청색 폴리디아세틸렌 리포좀으로 변화시키는 단계 및 상기 청색 폴리디아세틸렌 리포좀을 적색의 폴리디아세틸렌 형광체로 색전이 시키는 단계에 의해 제조된다.

일실시예에 있어서, 상기 청색 폴리디아세틸렌 리포좀을 상기 적색의 폴리디아세틸렌 형광체로 색전이 시키는 단계는 상기 청색 폴리디아세틸렌 리포좀의 흡광도가 청색 영역에서 적색 영역으로 변화될 때까지 열처리를 수행하여 색전이 시킨다.

일실시예에 있어서, 상기 열처리는 상기 청색 폴리디아세틸렌 리포좀을 50 ~ 100℃ 의 온도에서 30초 ~ 120초 동안 노출시켜 수행된다.

일실시예에 있어서, 상기 디아세틸렌 리포좀을 제조하는 단계는 디아세틸렌 단량체와 보론산기, DNA, RNA, 단백질, 바이러스, 펩타이드, 압타머, 항체 및 탄수화물 중에서 선택된 하나의 인터링커를 결합시키는 단계 및 상기 인터링커가 결합된 디아세틸렌 단량체를 제조하는 단계를 포함한다.

일실시예에 있어서, 상기 디아세틸렌 단량체와 상기 보론산기를 결합시키는 단계는 EDC/NHS (1-ethyl-3-[3-dimethylamino-propyl] carbodiimide hydrochloride/N-hydroxysuccinimide) 반응을 통하여 수행된다.

일실시예에 있어서, 상기 디아세틸렌 단량체는 카르복실기, 아민기, 티올기, 에폭사이드기 및 말레이미드기 중에서 적어도 하나의 작용기를 포함한다.

일실시예에 있어서, 상기 디아세틸렌 리포좀은, 상기 작용기가 포함된 디아세틸렌 단량체와 상기 작용기가 포함되지 않은 디아세틸렌 단량체의 혼합비를 1:9 ~ 10:0 범위로 혼합하여 얻어지는 혼합물을 사용하여 제조된다.

일실시예에 있어서, 상기 디아세틸렌 리포좀은 보론산기, DNA, RNA, 단백질, 바이러스, 펩타이드, 압타머, 항체 및 탄수화물 중에서 하나의 인터링커를 결합시킨 것이다.

일실시예에 있어서, 상기 디아세틸렌 리포좀과 상기 보론산기와의 결합은 EDC/NHS 반응을 통하여 수행된다.

일실시예에 있어서, 상기 청색 폴리디아세틸렌 리포좀은 보론산기, DNA, RNA, 단백질, 바이러스, 펩타이드, 압타머, 항체 및 탄수화물 중에서 선택되는 하나의 인터링커를 결합시킨 것이다.

일실시예에 있어서, 상기 청색 폴리디아세틸렌 리포좀과 상기 보론산기와의 결합은 EDC/NHS 반응을 통하여 수행된다.

일실시예에 있어서, 상기 적색의 폴리디아세틸렌 형광체는 보론산기, DNA, RNA, 단백질, 바이러스, 펩타이드, 압타머, 항체 및 탄수화물 중에서 선택되는 하나의 인터링커를 결합시킨 것이다.

일실시예에 있어서, 상기 적색의 폴리디아세틸렌 형광체와 상기 보론산기와의 결합은 EDC/NHS 반응을 통하여 수행된다.

일실시예에 있어서, 상기 목적 물질은 당화 단백질, DNA, RNA, 단백질, 항체, 바이러스, 펩타이드, 압타머, PNA, 항원, 대장균 및 콜레라 독성 물질 중에서 어느 하나인 것을 특징으로 하는 제조방법.

이와 같이 구성되는 본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서에 따르면, 특이적인 인터링커를 포함하는 적색의 폴리디아세틸렌 형광체에 분자 또는 생체 물질이 특이적으로 결합되기 때문에 이러한 목적 물질에 대한 선택적 식별이 가능하게 되고, 적색의 폴리디아세틸렌 형광체가 방출하는 형광을 이용하여 목적 물질을 고감도로 검출할 수 있다. 또한 목적 물질에 대한 정량분석이 매우 용이하며 적색의 폴리디아세틸렌 형광체는 장기간 동안 보관이 용이하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 센서를 설명하기 위하여 나타낸 개략적인 분해 사시도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 센서에 포함되는 적색의 폴리디아세틸렌 형광체의 제조방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 3a 및 3b는 열처리 조건에 따른 적색의 폴리디아세틸렌 형광체의 형성 정도를 그래프로 나타내었다.
도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 바이오 센서에 포함되는 적색의 폴리디아세틸렌 형광체의 제조방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 바이오 센서에 포함되는 적색의 폴리디아세틸렌 형광체의 제조방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 6은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 바이오 센서에 포함되는 적색의 폴리디아세틸렌 형광체의 제조방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 7는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 센서에 포함되는 적색의 폴리디아세틸렌 형광체의 흡수 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 8A 및 도 8B는 시료를 본 발명의 일실시예에 따른 바이오 센서에 적용하는 방식과 검출하는 방식을 개략적으로 나타내는 도면이다.

이하, 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명의 실시예에 따른 바이오 센서에 대하여 설명하기로 한다.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다. 첨부된 도면에 있어서, 구조물들의 치수는 발명의 명확성을 기하기 위해 실제보다 확대하거나, 개략적인 구성을 설명하기 위하여 실제보다 축소하여 도시한 것이다. 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

한편, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

이하, 본 발명을 첨부된 도면을 참고로 하여 상세하게 설명하기로 한다.

바이오 센서는 생체 인지 물질과의 결합에 의한 반응을 신호로 변환시키며, 특정한 물질에 대해 빠른 검사가 가능한 센서를 가리킨다. 이는 생물학적 개념의 효소-기질 복합체와 같은 원리로 하나의 리간드는 이에 대한 특이 성분을 가지는 한 가지 물질에 대해서만 반응성을 보인다는 원리를 이용한 것으로서, 반응성 유무 및 반응성 정도를 측정하여 특이 성분을 정성 및 정량적으로 검출하는 것이다. 적색의 폴리디아세틸렌 형광체는 독특한 발색 특성 때문에 화학적 또는 생물학적 센서로서 많은 연구가 이루어지고 있다. 본 발명에서는 이러한 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 적용한 바이오 센서를 제공하는 것이다.

일 실시예에 있어서, 바이오 센서는 시료를 수용하기 위한 시료 패드, 상기 시료 중에서 목적 물질과 결합가능한 적색의 폴리디아세틸렌 형광체가 포함된 멤브레인, 상기 목적 물질과 결합된 상기 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 검출하기 위한 검출부 및 상기 시료 패드, 상기 멤브레인 및 상기 검출부를 지지하기 위한 지지체를 포함하여 이루어진다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 센서를 설명하기 위하여 나타낸 개략적인 분해 사시도이다.

도 1을 참고하면, 바이오 센서(10)에는 먼저 시료를 수용하기 위한 시료 패드(1)가 제공되고, 시료 패드(1)의 우측 하단으로 상기 시료 패드(1)와 일부가 겹치도록 멤브레인(2)이 구비된다. 멤브레인(2)에는 적색의 폴리디아세틸렌 형광체가 포함되어 있는데 이는 시료 성분 중에서 검출 대상인 목적 물질과 결합가능하다. 멤브레인(2)의 우측 하단으로 상기 멤브레인(2)과 일부가 겹치도록 검출부(3)가 제공된다. 검출부(3)에는 적색의 폴리디아세틸렌 형광체와 결합되는 목적 물질의 항체가 포함되어 있다.

일 실시예에 따른 바이오 센서는 검출부(3)의 우측 상단에 검출부(3)와 일부가 겹치도록 제어부(4)를 더 포함할 수 있다. 이는 시료 중에 포함된 목적 물질 외의 다른 단백질을 포함하는 성분을 포획하기 위하여 구비되는 부분이다. 이 외에도 흐르는 시료가 센서를 넘치지 않도록 여분의 시료를 모두 흡수하기 위한 흡수 패드(5)를 제어부(4)의 우측 상단에 제어부(4)와 겹치도록 더 포함할 수 있다.

바이오 센서에는 상기 시료 패드(1), 상기 멤브레인(2), 상기 검출부(3), 상기 제어부(4) 및 상기 흡수 패드(5)를 지지하기 위한 지지체(6)가 더 구비될 수 있다.

도 1에 나타난 각 부분은 지지체(6) 상에 고정될 수 있는데 시료 패드(1)의 우측 하단과 멤브레인(2)의 좌측 상단이 서로 연결되고, 멤브레인(2)의 우측 하단과 검출부(3)의 좌측 상단이 연결되고, 검출부(3)의 우측 상단과 제어부(4)의 좌측 하단이 연결되고, 제어부(4)의 우측 상단과 흡수 패드(5)의 좌측 하단이 서로 연결된다. 이에 따라 시료 패드(1)로 시료가 주입되면 시료가 옆으로 흐르는 (lateral flow) 형태로 시료의 이동이 이루어진다.

바이오 센서를 이루는 각 구성 요소는 단부가 조금씩 겹치도록 계단식으로 연결되어 시료가 옆으로 흐르게 되는 스트립(lateral flow strip) 형태를 이루게 된다. 각 구성 요소의 고정을 위하여 지지체(6)가 구비되는데 이는 각 구성 요소를 지지해 줄 수 있는 얇은 필름 형태로 이루어진다. 예컨대 PET(polyethylene terephthalate) 필름, PC(polycarbonate) 필름, PTFE(polytetrafluoroethylene) 필름 등이 바람직하게 사용될 수 있다.

도 1에 나타난 구성을 갖는 바이오 센서(10)를 이용하여 시료에 포함된 목적 물질을 검출하는 메카니즘은 다음과 같다. 먼저, 혈액과 같은 생체 물질 시료를 시료 패드(1)에 주입하도록 한다. 주입된 시료는 시료 패드(1)와 연결된 멤브레인(2)으로 이동하게 되며, 멤브레인(2)에 포함된 적색의 폴리디아세틸렌 형광체와 만나게 된다. 적색의 폴리디아세틸렌 형광체와 결합가능한 시료 내의 목적 물질은 적색의 폴리디아세틸렌 형광체와 특이적으로 결합하게 된다. 일 예로, 적색의 폴리디아세틸렌 형광체는 예컨대, 보론산기를 포함하며 이 때 목적 물질인 당화 단백질과 결합하게 된다.

다르게는, 적색의 폴리디아세틸렌 형광체는 DNA를 포함하며 이 때 목적 물질인 DNA 또는 RNA와 결합하게 된다. 그 외에도 적색의 폴리디아세틸렌 형광체가 포함하는 물질 및 이와 결합하는 목적 물질의 예로서는 RNA-RNA, 단백질-단백질, 단백질-항체, 바이러스-바이러스, 바이러스-항체, 펩타이드-펩타이드, 펩타이드-항체, 압타머-압타머, 압타머-PNA, 항체-항원, 탄수화물-항체, 탄수화물-단백질, 항체-대장균 등과 같은 다양한 종류를 예시할 수 있다.

결국 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 사용하는 상기 바이오 센서를 이용하면 당화 단백질 외에도 DNA, RNA, 단백질, 펩타이드, 압타머, PNA, 바이러스, 대장균, 항원, 항체, 콜레라 독성 물질 등 다양한 성분의 검출이 가능한 것이다.

주입된 시료는 화살표 방향으로 시료가 흐르므로 멤브레인(2)에서 목적 물질은 적색의 폴리디아세틸렌 형광체와 결합된 상태로 검출부(3)로 이동하게 된다. 검출부(3)에는 목적 물질의 항체가 포함되어 있어서, 당화 단백질과 같은 목적 물질은 항체와 결합되므로 검출부에서 포집된다. 이 단계에 검출부에서 형광을 발하는 물질을 검출하여 정성적, 정량적 분석이 이루어지는 것이다.

계속해서 시료는 흐르고 제어부(4)로 이동하게 된다. 제어부(4)에서는 목적 물질 외의 나머지 다른 단백질을 포획하게 된다. 포획되고 남은 시료는 흡수 패드(5)에 의해 모두 흡수되고 시료는 센서를 넘치지 않게 된다.

상술한 바이오 센서를 제조하는 방법은 다음과 같다.

먼저, 시료를 수용하기 위한 시료 패드를 마련하도록 한다. 다음에, 상기 시료 중에서 목적 물질과 결합가능한 적색의 폴리디아세틸렌 형광체가 포함된 멤브레인을 마련하도록 한다. 이후 상기 목적 물질과 결합된 상기 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 검출하기 위한 검출부를 마련하도록 한다. 상기 시료 패드, 상기 멤브레인 및 상기 검출부를 지지하기 위한 지지체를 마련한다.

이하, 상기 멤브레인에 포함되는 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 제조하는 방법을 상세히 설명하기로 한다.

적색의 폴리디아세틸렌 형광체는 적색의 폴리디아세틸렌 리포좀일 수 있다. 폴리디아세틸렌은 디아세틸렌 단량체가 중합되어 제조된 고분자로서 3중 결합과 2중 결합이 번갈아 있는 구조이다. 디아세틸렌 단량체는 친수성기와 소수성기를 동시에 갖는 양쪽성으로서 수용액 상에서 리포좀과 같은 초분자체를 형성하는 것으로 알려져 있다.

디아세틸렌 단량체를 클로로포름과 같이 끓는점이 낮은 용매에 용해시킨 후 질소 가스를 이용하거나 회전 증발로 용매를 증발시키면 불용성 필름 형태의 단량체막이 형성된다. 여기에 물을 넣고 끓이면서 초음파 처리(sonication) 하면 물에 의하여 축구공 모양으로 구형상의 구조체가 형성되는데 이것이 리포좀이다. 이 때 리포좀은 물속에 있으므로 소수성기는 내부를 향하고 구형상의 리포좀 표면으로 친수성기인 카르복실기가 바깥으로 노출되어 물을 향하는 구조를 이루게 된다. 제작된 리포좀을 약 4시간 동안 냉장 보관하여 구조체가 더 타이트해지면 다음 단계에 사용할 수 있게 된다. 이렇게 리포좀이 타이트해져서 디아세틸렌 단량체들 사이의 거리가 충분히 가까워지면 자외선에 의해 고분자화될 수 있는데, 고분자 결합에 의해 중합체인 폴리디아세틸렌이 형성되면 청색을 띠게 된다.

예를 들면, 디아세틸렌 단량체 약 3 ㎖를 사용하여 제조된 리포좀에 약 220 내지 300nm의 자외선, 바람직하게는 약 254nm 의 자외선을 약 10초 내지 20분 동안 조사하면 단량체간에 교차 결합(cross linking)을 이루면서 중합이 이루어진다. 노출 시간이 10초 보다 짧으면 리포좀이 충분히 중합되지 않아서 청색으로 변하지 않은 부분이 있을 수 있고, 20분을 초과하면 더 이상의 향상 효과를 얻기 어렵기 때문에 조사 시간은 상기한 범위가 되도록 한다. 얻어지는 폴리디아세틸렌 리포좀은 약 640nm 부근에서 최대 흡수파장을 가지며 청색을 띤다.

청색의 폴리디아세틸렌 리포좀은 온도, pH, 용매, 물리적 자극, 화학적 자극 등과 같은 외부 환경의 변화에 의해 약 540nm에서 최대 흡수 파장을 지니는 붉은색으로 전이가 일어나면서 적색의 폴리디아세틸렌 형광체가 된다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서는 외부 환경의 변화 요인 중에서 가장 안정적으로 변화시킬 수 있도록 온도의 변화를 적용하여 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 제조하게 된다. 특히, 온도의 변화를 적용하여 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 제조하면 예컨대, 이를 냉장고에 보관시 적색의 폴리디아세틸렌 형광체 자체의 안정성도 증가할 뿐만 아니라 이후 단백질 등과 결합시켰을 때 목적 물질에 영향을 주지 않기 때문에 안정성이 유효하게 유지되는 효과도 얻을 수 있다. 특히 단백질은 외부 환경에 의해 쉽게 깨지는 성질이 있으므로 적색의 폴리디아세틸렌 형광체로 색전이 하기 위하여 온도의 변화 요인을 적용하는 것이 바람직하다.

pH로 인한 색전이도 가능하나 색전이 후 적색의 폴리디아세틸렌 형광체에 다른 목적 물질을 결합시키고자 할 때 목적 물질마다 안정성을 가지고 있는 pH 범위가 있는데, pH가 바뀌면 단백질 등의 목적 물질의 안정성이 저하될 수 있다. 용매로 인한 색전이를 유도하면 pH로 인한 색전이 유도의 경우와 마찬가지로 목적 물질, 예컨대 단백질에 물이 아닌 에탄올, 메탄올 등과 같은 다른 용매의 사용으로 인하여 안정성이 떨어질 수 있다. 물리적 자극 또는 화학적 자극에 의한 색전이를 유도하는 경우에는 목적 물질의 구조적인 결함을 가져올 수 있기 때문에 안정성이 떨어질 수 있다.

따라서, 다양한 외부 환경의 변화 요인이 적용가능하나 필요에 따라 적절한 요인을 선택하여 적용하도록 하며 가장 바람직하게는 온도의 변화 요인을 적용하도록 한다.

얻어지는 적색의 폴리디아세틸렌 형광체에 보론산기 등과 같은 인터링커를 결합시키면 당화 단백질과 같이 상기 보론산기와 특이적으로 결합되는 분자 또는 생체 분자에 대한 분석이 가능하게 된다. 즉, 목적 물질을 선택적으로 식별할 수 있는 형광체로서 활용할 수가 있는 것이다. 또한 형광의 세기는 형광체와 결합하는 목적 물질의 양과 비례하여 증가할 것이므로 형광의 세기를 측정하는 것에 의해 형광체와 결합되는 분자에 대한 정량 분석도 가능하게 된다.

이하, 본 발명에 적용가능한 적색의 폴리디아세틸렌 형광체에 대하여 좀 더 상세히 설명하기로 한다.

기본적인 구조는 상술한 바와 같이 디아세틸렌 단량체를 중합시켜 제조되는 폴리디아세틸렌을 리포좀 형태로 제조하고, 이를 자외선에 노광하여 청색 폴리디아세틸렌 리포좀으로 제조한 후, 열을 가하는 등 특정 조건에 노출시킴으로써 형광을 띠는 적색의 폴리디아세틸렌 형광체로 색전이를 시켜 얻어지는 것이다.

즉, 본 발명에 따른 바이오 센서용 적색의 폴리디아세틸렌 형광체는 디아세틸렌 리포좀을 제조하는 단계, 제조된 리포좀에 자외선을 조사하여 청색 폴리디아세틸렌 리포좀으로 변화시키는 단계 및 청색 폴리디아세틸렌 리포좀을 적색의 폴리디아세틸렌 형광체로 색전이 시키는 단계를 통하여 제조된다.

디아세틸렌 단량체는 카르복실기, 아민기, 티올기, 에폭사이드기 및 말레이미드기 중 적어도 하나의 작용기를 포함할 수 있다.

적색의 폴리디아세틸렌 형광체의 표면에 특정 단백질, 분자 등과의 결합을 유도하기 위하여 보론산기, DNA, RNA, 단백질, 바이러스, 펩타이드, 압타머, 항체 및 탄수화물 중에서 하나의 인터링커를 도입하도록 한다. 이들은 당화 단백질, DNA, RNA, 단백질, 항체, 바이러스, 펩타이드, 압타머, PNA, 항원, 대장균, 콜레라 독성 물질 등의 생체 분자와 결합 가능하다. 보론산기는 당화단백질과 특이적으로 결합하지만, DNA, RNA등 당화단백질을 제외한 나머지 생체 분자들은 말단에 캡쳐(capture) DNA, RNA등 서로 상호 작용할 수 있는 인터링커들을 만들어 주면 결합 가능하다.

즉, 적색의 폴리디아세틸렌 형광체의 표면 인터링커를 변경시키는 것에 의해 다양한 목적 물질과의 결합을 유도할 수 있으므로, 이에 대한 특이적이고 정량적인 분석이 가능하다.

적색의 폴리디아세틸렌 리포좀에 인터링커로서 보론산기를 결합시키기 위하여 말단이 카르복실기인 디아세틸렌 리포좀을 사용하도록 한다. 그러나 상술한 바와 같이 다양한 목적 물질과의 결합을 유도하기 위하여 카르복실기 외에도 아민기, 티올기, 말레이미드기, 에폭사이드기 등을 갖는 디아세틸렌 단량체도 사용가능하다.

카르복실기를 포함하는 디아세틸렌 단량체와 인터링커를 결합할 때는 EDC/NHS 화학 반응을 이용하도록 한다. 아민기를 포함하는 디아세틸렌 단량체와 인터링커를 결합할 때는 인터링커가 카르복실기를 포함하는 경우에는 EDC/NHS 반응을 이용할 수 있고, 인터링커가 아민기를 포함하는 경우에는 글루타르알데하이드를 이용하여 반응을 수행할 수 있고 인터링커가 에폭사이드기를 포함하는 경우에는 이들을 혼합하는 것으로 반응을 수행할 수 있다. 에폭사이드기를 포함하는 디아세틸렌 단량체는 아민기를 갖는 인터링커와 혼합하는 것으로 반응을 수행할 수 있다. 티올기를 포함하는 디아세틸렌 단량체는 말레이미드기를 갖는 인터링커와, 말레이미드기를 포함하는 디아세틸렌 단량체는 티올기를 갖는 인터링커와 혼합하는 것으로 반응을 수행할 수 있다.

상술한 바와 같이 다양한 작용기를 갖는 디아세틸렌 단량체와 다양한 작용기를 갖는 인터링커를 결합시킬 수 있는데 이들은 결합시 공통적으로 공유 결합을 형성한다는 특징이 있다. 예시된 결합쌍 외에도 다양한 변경이 가능하며 본 발명이 상술한 예로만 한정되지 않음이 이해되어야 한다.

일 실시예에서는 얻어지는 적색의 폴리디아세틸렌 형광체가 목적 물질로서 당화 단백질과 결합하도록 하기 위하여 보론산기를 결합시키도록 한다. 보론산기는 적색의 폴리디아세틸렌 형광체의 형성을 위한 다수의 단계중 특별한 제한 없이 어느 단계에서나 도입하는 것이 가능하다. 예컨대, 디아세틸렌 단량체 단계에서 도입할 수도 있고, 디아세틸렌 리포좀 단계에서 도입할 수도 있고, 청색 폴리디아세틸렌 리포좀으로 형성된 단계에서 도입할 수도 있고, 적색의 폴리디아세틸렌 형광체 단계에서 도입할 수도 있다.

먼저, 디아세틸렌 단량체 단계에서 보론산기를 도입하는 경우에 대하여 설명하기로 한다. 디아세틸렌 단량체와 보론산을 결합하는 단계 및 보론산기가 결합된 디아세틸렌 단량체를 디아세틸렌 리포좀으로 제조하는 단계를 통하여 도입될 수 있다. 이를 포함하는 적색의 폴리디아세틸렌 형광체의 제조 과정을 첨부된 도면을 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 센서에 포함되는 적색의 폴리디아세틸렌 형광체의 제조방법을 설명하기 위한 도면이다. 디아세틸렌 단량체로서는 카르복실기를 포함하는 PCDA 단량체를 사용하고, 인터링커로서는 보론산을 사용한 경우를 예로 하여 설명하기로 하는데, 본 발명이 이로만 한정되지 않음은 물론이다.

먼저, 보론산기가 결합된 PCDA 단량체와 보론산기가 결합되지 않은 PCDA 단량체를 혼합하여 보론산기를 결합시킨 PCDA 단량체(A)를 제조하도록 한다. 보론산기가 결합된 PCDA 단량체(A)에 초음파 처리하여 보론산기가 결합된 PCDA 리포좀(B)을 제조하도록 한다.

이 경우, 상기 보론산기가 결합된 디아세틸렌 단량체와 보론산기가 결합되지 않은 디아세틸렌 단량체를 약 1:9 ~ 10:0 범위로 혼합하여 사용할 수 있다. 이는 리포좀의 제조 효율을 높이고 이후 바이오 센서에 적용시 검출하고자 하는 목적 물질과의 결합력을 고려하여 얻어진 범위이다. 쉽게 말해서, 보론산기가 결합된 디아세틸렌 단량체가 구형의 리포좀을 이룰 때, 보론산기는 친수성 작용기이므로 구형 리포좀의 표면상에 존재하게 된다. 그런데 보론산기가 결합되지 않은 디아세틸렌 단량체를 혼합하면 디아세틸렌 단량체의 일부분만 보론산기가 결합된 상태이므로 보론산기가 구형의 표면상에 빽빽하게 존재하지 않고 보론산기가 결합되지 않은 부분에는 빈공간이 만들어져서 리포좀의 표면에 어느 정도의 여유 공간이 제공된다. 이 경우, 리포좀의 형성이 용이하게 되고, 이후 단계에서 리포좀의 보론산기와 당화 단백질이 결합할 때 결합도가 향상되는 것이다.

여기서, 보론산기가 결합된 PCDA 단량체는 보론산기가 결합되지 않은 PCDA 단량체와 보론산기를 EDC/NHS 반응을 통하여 결합될 수 있다.

다시 도 2를 참고하면, 제조된 보론산기가 결합된 PCDA 리포좀(B)에 자외선(UV)을 조사하면 1,4-첨가반응을 통해 중합이 이루어져 엔-인(ene-yne) 결합이 교대로 나타나는 중합사슬이 제조된다. 그러면 보론산기가 결합된 청색 폴리디아세틸렌 리포좀(C)이 얻어진다.

보론산기가 결합된 청색 폴리디아세틸렌 리포좀(C)에 외부 환경의 변화, 예컨대 열처리 등을 적용하여 보론산기가 결합된 적색의 폴리디아세틸렌 형광체(P)를 제조하도록 한다. 바람직하게 상기 청색 폴리디아세틸렌 리포좀(C)을 상기 적색의 폴리디아세틸렌 형광체(P)로 색전이 시키는 단계는 약 50 ~ 200℃ 의 온도에서 약 10초 ~ 20분 동안 열처리하는 것으로 수행되며, 더욱 바람직하게는 약 50 ~ 100℃ 의 온도에서 약 30초 ~ 120초 동안 열처리하는 것으로 수행된다. 이러한 열처리 조건은 청색 폴리디아세틸렌 리포좀(C)의 양에 따라 변동될 수 있으며 온도가 높으면 짧은 시간 동안 수행되고 온도가 낮으면 긴 시간 동안 수행될 수 있다. 가장 바람직하게는 약 100℃ 에서 약 120초 동안 열처리 하는 것이다.

청색 폴리디아세틸렌 리포좀(C)을 열처리하여 적색의 폴리디아세틸렌 형광체(P)를 제조할 때 적절한 조건을 알아보기 위하여 열처리 온도와 열처리 시간을 변경하면서 몇 가지 경우에 대하여 실험을 수행하였다.

도 3a 및 도 3b에 열처리 조건에 따른 적색의 폴리디아세틸렌 형광체의 형성 정도를 그래프로 나타내었다.

도 3a는 50℃ 온도 조건으로 열처리한 경우에 대한 결과를 나타내는데, 열처리 시간에 따라 흡수 파장이 변경되는 것을 확인할 수 있다. 각 그래프에서, 열처리 시간이 그래프 a는 10초, 그래프 b는 1분, 그래프 c는 5분, 그래프 d는 10분, 그래프 e는 20분인 경우에 해당된다. 참고로, 청색 폴리디아세틸렌 리포좀의 경우 약 640 nm에서 최대흡수파장을 나타내고, 적색의 폴리디아세틸렌 형광체의 경우 약 540 nm에서 최대흡수파장을 나타내게 된다.

도 3a를 참고하면, 열처리 시간이 증가함에 따라 폴리디아세틸렌 형광체는 청색에서 적색으로 전이되는 양이 증가하는 것을 알 수 있다. 그러나 약 20분이 경과하여도 완전히 적색으로 전이되지는 않음을 확인할 수 있다. 이는 청색 폴리디아세틸렌 리포좀이 완전히 적색의 폴리디아세틸렌 형광체로 전환되지 않았음을 의미한다.

도 3b는 100℃ 온도에서 열처리한 경우에 대한 것이다. 각 그래프는 열처리 시간이 그래프 a는 10초, 그래프 b는 1분, 그래프 c는 5분인 경우에 해당된다. 도 3a와 비교할 때, 열처리 온도가 높으면 열처리 시간이 짧아도 청색에서 적색으로의 전이가 빠르게 이루어짐을 확인할 수 있다. 특히 열처리 온도 100℃ 에서는 1분 내에 거의 적색으로 전이되는 것을 확인할 수 있다.

상술한 바와 같은 열처리 과정을 통하여 제조된 적색의 폴리디아세틸렌 형광체(P)는 형광을 발하는 특징이 있다. 제조된 적색의 폴리디아세틸렌 형광체(P)는 바이오 센서의 멤브레인에 도포 등의 방법으로 포함되어 당화 단백질과 같은 목적 물질과 결합하는 데 이용되는 것이다.

적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 형성하기 위하여 또 다르게는 보론산기를 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 형성한 이후 단계에서 도입할 수도 있는데 이에 대하여는 첨부된 도면을 참고하여 좀 더 상세하게 설명하기로 한다.

도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 바이오 센서에 포함되는 적색의 폴리디아세틸렌 형광체의 제조방법을 설명하기 위한 도면이다. 본 실시예에서도 디아세틸렌 단량체로서 PCDA 단량체를 사용하고 인터링커로서 보론산기를 사용한 경우를 예시하고 있다.

먼저, PCDA 리포좀(E)에 자외선(UV)을 조사하여 1,4-첨가반응을 통해 중합이 이루어지고 엔-인(ene-yne) 결합이 교대로 나타나는 중합사슬을 제조하도록 한다. 그러면 청색 폴리디아세틸렌 리포좀(F)이 얻어진다. 청색 폴리디아세틸렌 리포좀(F)에 외부 환경의 변화, 예컨대 열을 적용하여 보론산이 결합되지 않은 예비 적색의 폴리디아세틸렌 형광체(G)를 제조하도록 한다.

제조된 예비 적색의 폴리디아세틸렌 리포좀(G)은 형광을 발하게 된다. 보론산이 결합되지 않은 예비 적색의 폴리디아세틸렌 형광체(G)에 보론산을 결합시켜 보론산이 결합된 적색의 폴리디아세틸렌 형광체(P)를 제조하도록 한다. 예비 적색의 폴리디아세틸렌 리포좀(G)과 보론산을 결합하는 경우에는 이들간의 혼합량을 몰비로 약 1:1 ~ 10:1의 범위가 되도록 하는 것이 좋다. 이는 예비 적색의 폴리디아세틸렌 리포좀(G) 구체의 표면에 보론산기가 결합되지 않은 여유 공간이 존재하도록 하기 위해서이다. 예비 적색의 폴리디아세틸렌 리포좀(G)에 상기 보론산을 결합시키는 단계는 통상적인 EDC/NHS 반응을 통하여 수행될 수 있다. 예비 적색의 폴리디아세틸렌 리포좀(G)에 대한 EDC/NHS 반응은 하기 화학식 1 및 화학식 2에 나타난 바와 같은 두 가지 중 어느 한 가지 메카니즘으로 진행될 수 있다.

<화학식 1>

<화학식 2>

보론산기가 결합된 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 제조하는 세 번째 방법으로서, 먼저 디아세틸렌 단량체를 사용하여 디아세틸렌 리포좀을 형성하고 여기에 인터링커를 결합시키는 방법이 있다. 이를 첨부된 도면을 참고로 하여 설명하도록 하되 상술한 첫 번째 및 두 번째 실시예와 유사한 부분에 대하여는 간략히 설명하기로 한다.

도 5는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 바이오 센서에 포함되는 적색의 폴리디아세틸렌 형광체의 제조방법을 설명하기 위한 도면이다. 본 실시예에서도 디아세틸렌 단량체로서는 PCDA 단량체를 사용하고 인터링커로서는 보론산기를 사용하였다.

먼저, PCDA 단량체를 초음파 처리하여 물에 분산시키고, 물을 끓이면서 초음파 처리를 거친 PCDA 분산액을 여과한 후 저온에서 안정화 시켜 PCDA 리포좀(E)을 형성한다. 이후 EDC/NHS 반응을 통하여 PCDA 리포좀(E)과 보론산기를 반응시켜 보론산이 결합된 PCDA 리포좀(B)을 제조할 수 있다.

이후, 도 2를 참고로 하여 설명한 것과 동일한 방법으로 수행하도록 한다. 즉, 보론산기가 결합된 PCDA 리포좀(B)에 자외선(UV)을 조사하면 1,4-첨가반응을 통해 중합이 이루어져 엔-인(ene-yne) 결합이 교대로 나타나는 중합사슬이 제조된다. 그러면 보론산기가 결합된 청색 폴리디아세틸렌 리포좀(C)이 얻어진다.

보론산기가 결합된 청색 폴리디아세틸렌 리포좀(C)에 외부 환경의 변화, 예컨대 열처리 등을 적용하여 보론산이 결합된 적색의 폴리디아세틸렌 형광체(P)를 제조하도록 한다.

적색의 폴리디아세틸렌 형광체에 인터링커를 결합시키는 네 번째 방법으로서, 먼저 디아세틸렌 단량체를 사용하여 디아세틸렌 리포좀을 형성하고 UV를 조사하여 보론산기가 결합되지 않은 청색 폴리디아세틸렌 리포좀을 제조한 후, 제조된 청색 폴리디아세틸렌 리포좀과 보론산기를 결합시키는 단계를 수행하도록 한다. 이를 첨부된 도면을 참고로 하여 설명하도록 한다.

도 6은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 바이오 센서에 포함되는 적색의 폴리디아세틸렌 형광체의 제조방법을 설명하기 위한 도면이다. 상술한 실시예들과 유사한 부분에 대하여는 간략히 설명하기로 한다. 본 실시예에서도 디아세틸렌 단량체로서는 PCDA 단량체를 사용하고 인터링커로서는 보론산기를 사용하였다.

PCDA 단량체를 초음파 처리하여 물에 분산시키고, 물을 끓이면서 초음파 처리를 수행한 후 PCDA 분산액을 여과하고 저온에서 안정화 시켜 PCDA 리포좀(E)을 형성한다. 보론산기가 결합되지 않은 PCDA 리포좀(E)에 자외선(UV)을 조사하면 1,4-첨가반응을 통해 중합이 이루어져 엔-인(ene-yne) 결합이 교대로 나타나는 중합사슬이 제조된다. 그러면 보론산기가 결합되지 않은 청색 폴리디아세틸렌 리포좀(F)이 얻어진다. 이후 EDC/NHS 반응을 통하여 청색 폴리디아세틸렌 리포좀(F)과 보론산을 반응시켜 보론산이 결합된 청색 폴리디아세틸렌 리포좀(C)를 제조할 수 있다. 보론산기가 결합된 청색 폴리디아세틸렌 리포좀(C)에 외부 환경의 변화, 예컨대 열처리 등을 적용하여 보론산기가 결합된 적색의 폴리디아세틸렌 형광체(P)를 제조하도록 한다.

이상과 같이, 다양한 방법을 통하여 제조되는 인터링커가 결합된 적색의 폴리디아세틸렌 형광체(P)와 목적 물질이 만나면 상기 목적 물질은 인터링커와 결합하게 된다. 인터링커를 매개로 하여 목적 물질과 결합된 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 항체와 접촉시키면, 목적 물질은 항체와 결합되므로 결국 적색의 폴리디아세틸렌 형광체(P)는 목적 물질 및 항체와 결합된 구조를 갖게 된다. 결합체는 형광을 발하는 특성이 있으므로 분리하고 특정 파장을 조사함으로써 목적 물질에 대한 정성적, 정량적 분석이 가능하게 된다. 이러한 원리는 스트립이나 용액상에서 모두 적용가능하다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예를 통하여 상세히 설명하기로 한다. 실시예는 도 4에 나타난 과정에 따라 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 제조하는 경우에 대하여 설명한 것이지만 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 용이한 수준에서 변형이 가능함이 이해되어야만 한다.

PCDA - 리포좀의 제조

먼저, 클로로포름 10㎖에 PCDA(Fluka >97%, HPLC grade, Mw 374.61) 0.0374g을 녹여서 10mM 의 모액(stock solution)을 제조하였다. 제조된 용액을 0.22㎛ 의 필터를 사용하여 여과하고 투명한 용액을 얻었다. 여과된 용액 3㎖를 바이알에 넣고 질소 가스로 바이알의 벽면을 쏘아 주면서 클로로포름 용매를 날려서 제거하고 바이알 벽면에 필름을 형성하였다. 바이알에 증류수 10㎖를 넣고 80℃에서 20분 동안 초음파 처리(sonication) 하였다. 이 때, 필름이 형성된 높이와 초음파 분쇄기 내의 물의 높이를 맞춰 주고 바이알이 정중앙에 위치하도록 하였다. 초음파 처리가 끝난 후 즉시 0.8㎛ 의 필터를 사용하여 여과하였다. 이후 빛을 차단하고 4℃에서 4∼24 시간 동안 보관하여 PCDA-리포좀을 형성하였다.

청색 폴리디아세틸렌 리포좀의 제조

제조된 PCDA-리포좀을 뚜껑이 없는 페트리 접시에 옮기고 마그네틱 바를 넣어 주었다. 254nm 의 자외선을 20분 동안 조사하여 청색 폴리디아세틸렌 리포좀을 제조하였다.

적색의 폴리디아세틸렌 형광체의 제조

청색 폴리디아세틸렌 리포좀을 고온으로 단시간 동안 가열하였다. 즉, 약 100℃의 핫플레이트에서 약 2분 동안 가열하였다. 이 때, 증발로 인한 손실이 발생되지 않도록 덮개를 사용하여 윗부분을 차단한 상태로 가열하였다. 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 제조하였다.

적색의 폴리디아세틸렌 형광체와 보론산기의 결합

44.96mg/㎖의 EDC (1-ethyl-3-[3-dimethylamino-propyl] carbodiimide) 10㎕ 및 123.6mg/㎖의 NHS (N-hydroxy succinimide) 10㎕를 상기 실험에 의해 제조된 3mM의 적색의 폴리디아세틸렌 형광체 1㎖와 혼합하고 실온에서 교반하였다. 실온에서 약 30분 동안 보르텍싱(vortexing) 하였다. 여기에 3-아미노페닐보로닉 애시드-헤미설페이트(3-aminophenylboronic acid-hemisulfate) 0.557mg/㎖을 첨가하고 실온에서 약 1시간 동안 보르텍싱 하였다. 보론산이 결합된 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 제조하였다.

도 7에는 제조된 적색의 폴리디아세틸렌 형광체의 흡수 스펙트럼을 나타내었다. 도 7로부터 형성된 적색의 폴리디아세틸렌 형광체가 약 470~560 nm의 적색 파장 영역에서 높은 흡수도를 나타내는 것을 확인할 수 있다.

PCDA 단량체와 보론산기의 결합

PCDA 단량체와 EDC/NHS를 1:1.2의 당량비로 반응시켰다. 증류수로 세정한 후 용매를 증발시켰다. 파우더 형태의 PCDA 단량체 중간 생성물을 DMF(dimethylformamide)에 용해시켰다. 보론산을 PCDA와 1:1의 몰비로 혼합하고 하룻밤 동안 교반하였다. 컬럼 크로마토그래피로 보론산이 결합된 PCDA를 분리하였다.

보론산기가 결합된 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 적용한 바이오 센서의 제조

도 1에 나타난 구성을 갖는 바이오 센서를 제작하였다. 멤브레인에는 제조된 보론산이 결합된 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 멤브레인에 분주 방식으로 적용하였다. 검출부에는 당화단백질을 포획하기 위하여 이의 항체를 포함시켰다.

바이오 센서를 이용한 당화 단백질의 검출

혈액 시료 약 10㎕ 를 채취하여 제조된 바이오 센서의 시료 패드에 주입하였다. 시료는 정맥혈, 모세혈을 채취하여 계면활성제를 이용하여 적혈구를 용혈 시킨 다음 헤모글로빈을 추출하는 전처리 과정을 거쳐서 얻었다.

도 8A 및 도 8B에는 시료를 바이오 센서에 적용하는 방식과 검출하는 방식을 개략적으로 나타내었다.

도 8A를 참고하면, 전처리 과정을 거친 시료를 시료 패드에 주입한다. 혈액 내에는 혈색소(Hb) 및 당화혈색소(HbA1c)가 포함되어 있다. 멤브레인은 염료 존(dye zone)으로서 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 포함한다. 검출부에는 당화혈색소(HbA1c)의 항체가 포함된 HbA1c 존(HbA1c zone)이 포함된다. 이러한 구성을 갖는 바이오 센서에 시료가 주입되면, 도 8B에 나타난 바와 같이 당화혈색소(HbA1c)는 검출부에 포획되고 혈색소(Hb)는 제어부에 포획된다.

도 8B를 참고하면, 주입된 시료는 멤브레인에 포함된 염료인 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 만나게 된다. 이 때, 시료에 포함된 혈색소는 적색의 폴리디아세틸렌 형광체와 결합하지 않지만 당화혈색소(HbA1c)는 적색의 폴리디아세틸렌 형광체와 결합하게 된다. 적색의 폴리디아세틸렌 형광체와 결합된 당화혈색소(HbA1c)는 검출부의 HbA1c 존을 지나면서 항체와 결합하게 된다. 혈색소(Hb)를 포함하여 시료중 항체와 결합되지 않은 부분은 시료의 흐름 방향을 따라 계속 진행하여 제어부와 흡수 패드에 남게 된다. 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 포함하는 검출부에 광원(light source)을 조사하면 적색은 흡수되고 청색이 반사되며, 혈색소(Hb)가 포함된 제어부에 광원을 조사하면 청색은 흡수되고 적색이 반사된다. 반사되는 광을 측정하여 당화혈색소(HbA1c)의 양을 측정할 수 있다.

이상과 같은 본 발명에 의하면 적색의 폴리디아세틸렌 형광체와 특정 목적 물질을 결합시키고 형광량을 측정하는 것에 의해 목적 물질의 검출을 수행하도록 한 것으로서, 고감도를 나타내면서도 휴대가 간편한 바이오 센서의 제작이 가능하다. 각종 생체 물질에 대하여 짧은 시간 내에 정확하게 정성적, 정량적 분석이 가능하여 진단 분야 등에서도 이용가능하다.

특히, 청색 폴리디아세틸렌 형광체 보다 적색의 폴리디아세틸렌 형광체는 안정성이 더 우수하기 때문에 장기간 보관에도 유리하다. 일반적인 형광체는 시간이 지남에 따라 형광의 세기가 감소하지만 적색의 폴리디아세틸렌 형광체는 형광의 세기가 장시간 동안 유지된다는 장점이 있다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

1: 시료 패드 2: 멤브레인
3: 검출부 4: 제어부
5: 흡수 패드 6: 지지체
10: 바이오 센서

Claims (20)

1. 시료를 수용하기 위한 시료 패드;
   상기 시료 중에서 목적 물질과 결합가능한 적색의 폴리디아세틸렌 형광체가 포함된 멤브레인;
   상기 목적 물질과 결합된 상기 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 검출하기 위한 검출부; 및
   상기 시료 패드, 상기 멤브레인 및 상기 검출부를 지지하기 위한 지지체를 포함하는 바이오 센서.
2. 제1항에 있어서, 상기 적색의 폴리디아세틸렌 형광체는 보론산(boronic acid)기, DNA, RNA, 단백질, 바이러스, 펩타이드, 압타머, 항체 및 탄수화물 중에서 선택된 하나의 인터링커가 결합된 폴리디아세틸렌의 리포좀인 것을 특징으로 하는 바이오 센서.
3. 제1항에 있어서, 상기 목적 물질이 당화 단백질, DNA, RNA, 단백질, 항체, 바이러스, 펩타이드, 압타머, PNA, 항원, 대장균 및 콜레라 독성을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서.
4. 제1항에 있어서, 상기 목적 물질 외의 생체 물질을 포획하기 위한 제어부 및 과량의 상기 시료를 흡수하기 위한 흡수 패드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서.
5. 제1항에 있어서, 상기 검출부에는 상기 목적 물질의 항체가 포함되는 것을 특징으로 하는 바이오 센서.
6. 시료를 수용하기 위한 시료 패드를 마련하는 단계;
   상기 시료 패드의 하부에 배치되며, 상기 시료 중 목적 물질과 결합 가능한 적색의 폴리디아세틸렌 형광체가 포함된 멤브레인을 마련하는 단계;
   상기 멤브레인의 하부에 배치되며, 상기 목적 물질과 결합된 상기 적색의 폴리디아세틸렌 형광체를 검출하기 위한 검출부를 마련하는 단계; 및
   상기 시료 패드, 상기 멤브레인 및 상기 검출부를 지지하기 위한 지지체를 마련하는 단계를 포함하는 바이오 센서의 제조방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 적색의 폴리디아세틸렌 형광체는,
   디아세틸렌 리포좀을 제조하는 단계;
   제조된 디아세틸렌 리포좀을 자외선에 노출시켜 청색 폴리디아세틸렌 리포좀으로 변화시키는 단계; 및
   상기 청색 폴리디아세틸렌 리포좀을 적색의 폴리디아세틸렌 형광체로 색전이 시키는 단계에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 청색 폴리디아세틸렌 리포좀을 상기 적색의 폴리디아세틸렌 형광체로 색전이 시키는 단계는 상기 청색 폴리디아세틸렌 리포좀의 흡광도가 청색 영역에서 적색 영역으로 변화될 때까지 열처리를 수행하여 색전이 시키는 것임을 특징으로 하는 제조방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 열처리는 상기 청색 폴리디아세틸렌 리포좀을 50 ~ 100℃ 의 온도에서 30초 ~ 120초 동안 노출시켜 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
10. 제7항에 있어서, 상기 디아세틸렌 리포좀을 제조하는 단계는:
    디아세틸렌 단량체와 보론산(boronic acid)기, DNA, RNA, 단백질, 바이러스, 펩타이드, 압타머, 항체 및 탄수화물 중에서 선택된 하나의 인터링커를 결합시키는 단계; 및
    상기 인터링커가 결합된 디아세틸렌 단량체를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 디아세틸렌 단량체와 상기 보론산기를 결합시키는 단계는 EDC/NHS (1-ethyl-3-[3-dimethylamino-propyl] carbodiimide hydrochloride/N-hydroxysuccinimide) 반응을 통하여 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
12. 제10항에 있어서, 상기 디아세틸렌 단량체는 카르복실기, 아민기, 티올기, 에폭사이드기 및 말레이미드기로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 디아세틸렌 리포좀은, 상기 작용기가 포함된 디아세틸렌 단량체와 상기 작용기가 포함되지 않은 디아세틸렌 단량체의 혼합비를 1:9 ~ 10:0 범위로 혼합하여 얻어지는 혼합물을 사용하여 제조되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
14. 제7항에 있어서, 상기 디아세틸렌 리포좀은 보론산기, DNA, RNA, 단백질, 바이러스, 펩타이드, 압타머, 항체 및 탄수화물 중에서 선택되는 하나의 인터링커를 결합시킨 것을 특징으로 하는 제조방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 디아세틸렌 리포좀과 상기 보론산기와의 결합은 EDC/NHS 반응을 통하여 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
16. 제7항에 있어서, 상기 청색 폴리디아세틸렌 리포좀은 보론산기, DNA, RNA, 단백질, 바이러스, 펩타이드, 압타머, 항체 및 탄수화물 중에서 선택되는 하나의 인터링커를 결합시킨 것을 특징으로 하는 제조방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 청색 폴리디아세틸렌 리포좀과 상기 보론산기와의 결합은 EDC/NHS 반응을 통하여 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
18. 제7항에 있어서, 상기 적색의 폴리디아세틸렌 형광체는 보론산기, DNA, RNA, 단백질, 바이러스, 펩타이드, 압타머, 항체 및 탄수화물 중에서 선택되는 하나의 인터링커를 결합시킨 것을 특징으로 하는 제조방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 적색의 폴리디아세틸렌 형광체와 상기 보론산기와의 결합은 EDC/NHS 반응을 통하여 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
20. 제6항에 있어서, 상기 목적 물질은 당화 단백질, DNA, RNA, 단백질, 항체, 바이러스, 펩타이드, 압타머, PNA, 항원, 대장균 및 콜레라 독성 물질 중에서 어느 하나인 것을 특징으로 하는 제조방법.

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