KR102658797B1 - 메틸화된 dna에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 폴리디아세틸렌 리포좀 및 이를 이용한 dna 메틸화의 형광 검출 방법 - Google Patents
메틸화된 dna에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 폴리디아세틸렌 리포좀 및 이를 이용한 dna 메틸화의 형광 검출 방법 Download PDFInfo
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본 발명은 메틸화된 DNA에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 폴리디아세틸렌 리포좀 및 이를 이용한 DNA 메틸화의 형광 검출 방법에 관한 것으로, 폴리디아세틸렌 리포좀의 광학적 특성으로 인해 색 변화를 육안 또는 장비로 확인할 수 있고, 다양한 메틸화 DNA 서열에 적용함으로써 여러 유형의 암의 진단 검사에 응용이 가능한 효과가 있다.
Description
본 발명은 메틸화된 DNA에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 폴리디아세틸렌 리포좀 및 이를 이용한 DNA 메틸화의 형광 검출 방법에 관한 것이다.
DNA 메틸화(methylation)는 사이토신-구아닌 디뉴클레오타이드(CpG)의 사이토신의 5'-위치에 메틸기가 추가되는 것을 뜻하며, 정상적인 유전자의 발현에 영향을 미치는 후성유전학적 변화로 염기서열의 변화 없이 DNA 상에서 일어나는 화학적 변화이다. 특정 유전자의 프로모터 또는 5'비번역 부위 (untranslated region)를 포함하는 전사조절 부위 (transcriptional regulatory region)에 CpG 섬(island) 이라고 하는 CG 디뉴클레오타이드가 고밀도로 모여있는 염기군(cluster)이 존재하고, CpG섬의 사이토신(C)은 DNA 합성 이후에 DNA 메틸화 효소(DNA methyltransferase)에 의해 5번 탄소 위치에서 메틸화되어 5-메틸사이토신으로 변환된다.
이러한 메틸화 현상은 암을 포함한 다양한 질병의 원인으로 알려져 있으며, CpG 섬의 메틸화에 의해 해당하는 유전자의 발현이 억제된다고 알려져 있다. 특히, 종양 억제 유전자 (tumor suppressor genes)의 기능이 소실되어 암이 발생하는 것으로 알려져 있다(Jones et al., Nat. Rev. Genet., 3, 415-428, 2002).
DNA 메틸화 현상은 암 발생의 가장 초기에 일어나는 대표적인 현상이기 때문에 암 조기진단을 위한 최적의 도구로 인식되고 있으며, 최근에는 DNA 메틸화 측정을 통하여 암을 진단하는 방법들이 제시되고 있다. 종래의 메틸화 DNA 검출 기술은 HPLC (high performance liquid chromatography, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 등과 같은 기술로 고가의 분석 장비 및 숙련된 기술자가 필요하며 많은 시간 소요와 같은 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 메틸화된 DNA에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 폴리디아세틸렌 리포좀을 제조하고, 상기 폴리디아세틸렌 리포좀의 광학적 특성에 의해 메틸화 DNA의 형광 검출을 할 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 메틸화된 DNA에 특이적으로 결합하는 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 폴리디아세틸렌 리포좀의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 DNA 메틸화의 형광 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 메틸화된 DNA에 특이적으로 결합하는 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀을 제공한다.
또한, 본 발명은 디아세틸렌 단량체 및 인지질을 자가-조립하여 디아세틸렌 리포좀을 형성하는 단계(단계 1);
상기 디아세틸렌 리포좀을 메틸화 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 리간드와 결합하는 단계(단계 2); 및
상기 단계 2의 메틸화 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 리간드가 결합된 디아세틸렌 리포좀을 중합하는 단계(단계 3); 를 포함하는, 폴리디아세틸렌 리포좀의 제조방법을 제공한다.
나아가 본 발명은 제1항의 폴리디아세틸렌 리포좀을 메틸화된 DNA와 접촉시키는 단계(단계 1); 및
상기 단계 1의 폴리디아세틸렌 리포좀의 색변화를 관찰하는 단계(단계 2); 를 포함하는, DNA 메틸화의 형광 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 메틸화된 DNA에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 폴리디아세틸렌 리포좀은 폴리디아세틸렌 리포좀의 광학적 특성으로 인해 색 변화를 육안 또는 장비로 확인할 수 있고, 다양한 메틸화 DNA 서열에 적용함으로써 여러 유형의 암의 진단 검사에 응용이 가능한 효과가 있다.
도 1a는 본 발명의 메틸화된 DNA에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 폴리디아세틸렌 리포좀의 제조방법에 관한 개략도를 나타낸 것이다.
도 1b는 발명의 메틸화된 DNA에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 폴리디아세틸렌 리포좀을 이용한 메틸화 DNA의 형광 검출에 관한 개략도를 나타낸 것이다.
도 2는 메틸화 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀의 합성결과를 나타낸 것이다.
도 3은 폴리디아세틸렌 리포좀의 표면에 항-5-Methylcytosine 항체 (5-mC Ab)가 결합된 것을 보여주는 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1의 형태학적 분석을 위한 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 5는 메틸화 DNA 추출 및 증폭결과를 나타낸 것이다.
도 6은 분석대상을 검출한 결과를 촬영한 사진이다.
도 1b는 발명의 메틸화된 DNA에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 폴리디아세틸렌 리포좀을 이용한 메틸화 DNA의 형광 검출에 관한 개략도를 나타낸 것이다.
도 2는 메틸화 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀의 합성결과를 나타낸 것이다.
도 3은 폴리디아세틸렌 리포좀의 표면에 항-5-Methylcytosine 항체 (5-mC Ab)가 결합된 것을 보여주는 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1의 형태학적 분석을 위한 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 5는 메틸화 DNA 추출 및 증폭결과를 나타낸 것이다.
도 6은 분석대상을 검출한 결과를 촬영한 사진이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
메틸화된 DNA에 특이적으로 결합하는 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀
본 발명은 메틸화된 DNA에 특이적으로 결합하는 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리디아세틸렌은 디아세틸렌의 중합 반응에 의해 형성되는 공액고분자로서 별도의 표지 없이 광학적 특성이 변화할 수 있는 소재이며, 폴리디아세틸렌은 수용액 상태에서 지질층 막에 의하여 격리된 내부공간을 갖는 구조를 형성할 수 있으며, 이를 "폴리디아세틸렌 리포좀"이라 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 메틸화된 DNA에 특이적으로 결합하는 리간드는 5-메틸사이토신이다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 메틸화된 DNA에 특이적으로 결합하는 리간드의 예로는 항-5-메틸사이토신 항체(anti-5-methylcytosine antibody), 항-5-하이드록시메틸사이토신 항체(anti-5-hydroxymethylcytosine antibody), 항-5-포르밀사이토신 항체(anti-5-formylcytosine antibody), 항-5-카르복실사이토신 항체(anti-5-carboxylcytosine antibody) 또는 항-5-N6-메틸아데닌 항체(anti-N6-methyladenine antibody)일 수 있고, 바람직하게는 항-5-메틸사이토신 항체(anti-5-methylcytosine antibody)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리디아세틸렌 리포좀은 메틸화된 DNA에 특이적으로 결합하는 리간드로 인해 청색에서 적색으로의 색 전이를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리디아세틸렌 리포좀은 280 내지 360nm의 크기일 수 있으며, 바람직하게 300 내지 340nm의 크기일 수 있다.
폴리디아세틸렌 리포좀의 제조방법
본 발명은 디아세틸렌 단량체 및 인지질을 자가-조립하여 디아세틸렌 리포좀을 형성하는 단계(단계 1);
상기 디아세틸렌 리포좀을 메틸화 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 리간드와 결합하는 단계(단계 2); 및
상기 단계 2의 메틸화 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 리간드가 결합된 디아세틸렌 리포좀을 중합하는 단계(단계 3);
를 포함하는, 폴리디아세틸렌 리포좀의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 도 1a를 참조하면, 말단에 친수성 기능기를 갖는 디아세틸렌 단량체와 함께 인지질을 클로로포름, 테트라하이드로퓨란 등과 같은 유기용매에 용해시키고, 퍼지 가스를 사용하여, 유기용매를 제거하면, 디아세틸렌 단량체 박막이 형성되며, 그 후 물 또는 완충 용액을 넣으면, 디아세틸렌 단량체들이 알킬 체인(alkyl chain)간의 소수성 상호작용에 의해 모이게 되면서, 리포좀이 형성된다.
또한, 상기 폴리디아세틸렌 합성에 사용되는 디아세틸렌 단량체는 수용액 상에서 비극성 결합에 의하여 가까운 거리를 유지하는데, 이때 254nm의 자외선 조사 하에서 삼중 결합이 이중 결합으로 전환되며 다른 단량체와 고분자 주쇄(backbone)의 특정 부위가 결합하는 방식으로 중합된다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 디아세틸렌 단량체의 예로는 펜타코사다이이노익산 (PCDA: pentacosadiynoic acid), 펜타코사다이이노익산-에틸렌다이아민(PCDA-EDA: pentacosadiynoic acid-ethylenediamine), 트리코사다이이노익산 (TCDA: tricosadiynoic acid), 헤네이코사다이이노익산 (HCDA: heneicosadiynoic acid), 헵타데카다이이노익산(HDDA: heptadecadiynoic acid) 또는 에이코사다이이노익산(eicosadiynoic acid)를 하나이상 사용할 수 있으며, 바람직하게 디아세틸렌 단량체는 펜타코사다이이노익산 (PCDA: pentacosadiynoic acid) 또는 펜타코사다이이노익산-에틸렌다이아민(PCDA-EDA: pentacosadiynoic acid-ethylenediamine)를 하나 이상 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 인지질의 예로는 디미리스토일포스파티딜콜린 (Dimirystoyl phosphatidylcholine, DMPC), 디미리스토일포스파티딜에탄올아민 (Dimyristoyl phosphatidylethanolamine, DMPE), 디미리스토일포스파티딜에탄올아민 (Dimyristoyl phosphatidylethanolamine, DMPE), 디미리스토일포스파티딜글리세롤 (Dimirystoyl phosphatidylglycerol, DMPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (Dipalmitoyl phosphatidylglycerol, DPPG), 디스테아로일포스파티딜콜린 (Distearoyl phosphatidylcholine, DSPC), 디스테아로일포스파티딜글리세롤 (Distearoyl phosphatidylglycerol, DSPG), 디올레일포스파티딜에탄올아민 (Dioleoyl phatidylethanolamine, DOPE), 팔미토일스테아로일포스파티딜콜린 (Palmitoyl stearoylphosphatidylcholine, PSPC), 팔미토일스테아로일포스파티딜 글리세롤 (Palmitoyl stearoylphosphatidyl glycerol, PSPG), 모노-올레오일-포스파티딜에탄올아민 (mono-oleoyl-phosphatidyl ethanolamine, MOPE), 디라우로일 에틸포스포콜린 (Dilauroyl ethylphosphocholine, DLEP), 디미리스토일 에틸포스포콜린 (Dimirystoyl ethylphosphocholine, DMEP), 디팔미토일 에틸포스포콜린 (Dipalmitoyl ethylphosphocholine, DPEP) 또는 디스테아로일 에틸포스포콜린 (Distearoyl ethylphosphocholine, DSEP)를 하나 이상 사용할 수 있다.
DNA 메틸화의 형광 검출 방법
본 발명은 메틸화된 DNA에 특이적으로 결합하는 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀을 메틸화된 DNA와 접촉시키는 단계(단계 1); 및
상기 단계 1의 폴리디아세틸렌 리포좀의 색변화를 관찰하는 단계(단계 2); 를 포함하는, DNA 메틸화의 형광 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 도 1b를 참조하면, 메틸화된 DNA에 특이적으로 결합하는 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀은 최대 흡수 파장이 640nm인 청색을 발현한다. 이후, 폴리디아세틸렌 리포좀에 결합된 메틸화된 DNA에 특이적으로 결합하는 리간드가 메틸화된 DNA와 특이적으로 반응함에 따라 흡광스펙트럼이 변화하여 최대 흡수 파장이 540nm인 적색으로 색 전이가 일어날 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 2의 색변화는 육안으로 측정되거나, 정량적으로 측정될 수 있으며, 정량적인 측정방법의 예로는 분광광도계, 형광광도계 또는 색도계를 사용하여 측정할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<준비예>
10,12-펜타코사다이이노익산(10,12-pentacosadiynoic acid, PCDA)은 Sigma-Aldrich (USA)로부터 구입하였다.
10,12-펜타코사다이이노익산-에틸렌다이아민(10,12-pentacosadiynoic acid-ethylenediamine, PCDA-EDA)은 PCDA로부터 합성되었다.
디미리스토일포스파티딜콜린(dimirystoylphosphatidylcholine, DMPC)은 Avanti® Polar Lipids 로부터 구입하였다.
5-Methylcytosine (5-mC) 항체는 EpiGentek (USA)로부터 구입하였다.
<실시예 1> 메틸화 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀의 제조
<1-1> 디아세틸렌 리포좀의 제조
디아세틸렌 리포좀은 지질 박막 수화법을 이용하여 제조되었다. 0.9 mg의 10,12-펜타코사다이이노익산(10,12-pentacosadiynoic acid, PCDA), 0.75 mg의 10,12-펜타코사다이이노익산-에틸렌다이아민(10,12-pentacosadiynoic acid-ethylenediamine, PCDA-EDA) 및 1.3 mg의 디미리스토일포스파티딜콜린(dimirystoylphosphatidylcholine, DMPC)를 1 ㎖ 클로로포름에 용해시킨다. 그 다음, 용액을 질소(N2)를 포함하는 퍼지 가스를 사용하여 클로로포름을 제거하여, 지질 박막을 생성하였다. 그 후, 상기 생성된 지질 박막에 3 ㎖ 탈이온수 첨가하고, 90 ℃ 온도에서 초음파 처리한 뒤, 시린지 필터(0.8 μm)로 여과하였다. 그 후 밤새 4 ℃에 저장하여 2 mM의 디아세틸렌 리포좀을 얻었다.
<1-2> 메틸화 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌의 제조
메틸화 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌의 제조을 제조하기 위해, 상기 실시예 1-1에서 제조한 디아세틸렌 리포좀과 5-Methylcytosine (5-mC) 항체와의 EDC/NHS 커플링으로 결합하였다.
우선, 1 ㎍/㎖의 5-Methylcytosine (5-mC) 항체에 10 ㎎/㎖의 1-에틸-3-(디메틸-아미노프로필 카보디아미드) (1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl) carbodimide, EDC) 및 10 ㎎/㎖의 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)를 첨가하고 30분 동안 교반하였다. 그 후, 상기 실시예 1-1에서 제조한 디아세틸렌 리포좀 2 mM을 첨가하고 1시간 동안 교반한다. 교반된 용액은 100 kDa 원심분리 필터를 통해 과량의 시약과 항체들을 제거하여 복합체를 얻는다. 그 다음, 254nm 파장의 UV램프를 사용하여, 1,4-addition 중합하여, 메틸화 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀을 제조(5-mC Ab-PDA)하였다.
<비교예 1> 폴리디아세틸렌 리포좀의 제조
상기 실시예 1-1에서 제조한 디아세틸렌 리포좀을 254nm 파장의 UV램프를 사용하여, 1,4-addition 중합한 뒤, 폴리디아세틸렌 리포좀을 수득하였다(PDA).
<실험예 1> 메틸화 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀의 합성결과 확인
상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 폴리디아세틸렌 리포좀의 합성결과를 확인하기 위해, BioSpec-nano (Shimadzu, Japan)를 통해 흡수 피크를 확인하였다.
흡수 피크를 확인한 결과, 도 2에 나상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 폴리디아세틸렌 리포좀의 합성결과를 확인하기 위해, BioSpec-nano (Shimadzu, Japan)를 통해 흡수 피크를 확인하였다.
흡수 피크를 확인한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 비교예 1은 254nm UV 조사에 의한 광중합 후 640nm에서 청색 흡수 피크를 나타내었다. 또한, 실시예 1의 메틸화 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀은 640 nm에서 청색 흡수 피크를 나타낼 뿐만 아니라, 메틸화 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 리간드인 5-Methylcytosine (5-mC) 항체로 인해 280 nm의 단백질 흡수 피크를 나타내어 성공적으로 합성된 것을 확인하였다.
또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, Nano-ZS (Malvern, UK)를 사용하여 비교예 1은 -12.5 ± 2.7 mV의 음전하 값을 나타낸 것을 확인하였으며, 5-Methylcytosine 항체 (5-mC Ab)는 -3.1 ± 1.2 mV의 음전하 값을 갖는 것을 확인하였고, 실시예 1은 -44.2 ± 5.6 mV로 음전하 값이 크게 증가하여, 폴리디아세틸렌 리포좀의 표면에 5-Methylcytosine 항체 (5-mC Ab)가 결합된 것을 보여준다.
<실험예 2> 형태학적 분석
비교예 1의 폴리디아세틸렌 리포좀 및 실시예 1의 메틸화 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀의 형태학적 분석을 위해 SEM 이미지를 확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군인 비교예 1의 폴리디아세틸렌 리포좀 (PDA)의 입자 크기는 약 240 nm인 반면, 실시예 1의 메틸화 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 리간드인 5-mC 항체(5-mC Ab)가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀 (5-mC Ab-PDA)은 약 320 nm로 입자 크기의 증가뿐만 아니라 거친 입자 표면을 보여주어 5-mC 항체(5-mC Ab)가 결합된 것을 형태학적으로 확인하였다.
<실험예 3> 메틸화 DNA 추출 및 증폭 결과
결장암 세포주인 HT-29 세포는 한국세포주은행에서 구입하였으며, 상기 HT-29 세포에서 추출된 지노믹 DNA (gDNA) (Lane 1)는 바이설파이트(bisulfite) 전환 (Lane 2) 및 PCR 증폭 (Lane 3) 후 아가로스 겔 전기영동 (1% 아가로스 겔, 1X TBE 버퍼 사용)을 통해 확인되었다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 결장암 세포에서 추출된 gDNA는 겔에서 10 kbp 이상 크기의 강한 DNA 밴드로 확인되었다. 메틸화 DNA에 바이설파이트(Bisulfite) 처리시 (EpiJET Bisulfite Conversion Kit, Thermo Scientific™) 메틸화되지 않은 사이토신(C)은 우라실(U)로 변경되는 반면, 메틸화된 사이토신은 변경되지 않으며, 이러한 바이설파이트 전환 과정은 메틸화 특이적 PCR 과정의 기반이 된다. 이 과정에서 DNA 단편화가 일어나 겔에서 끌리는 형태의 밴드를 나타내었으며, 바이설파이트 전환된 DNA는 메틸화 특이적 프라이머(F: 5'-TGAGTTGGTTTAGGTAGTAGTTTTG-3', R: 5'-CTTTCAAAAATCAACTAATTATTCG-3')로 PCR 증폭되어 그 결과 750 bp의 DNA 증폭물(amplified product)을 밴드로 확인하였다.
<실험예 4> 메틸화 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀을 이용한 DNA 메틸화 검출
실시예 1에서 제조한 메틸화 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀의 메틸화된 DNA의 탐지 여부를 확인하기 위해, 대조군으로 비교예 1의 폴리디아세틸렌 리포좀 (PDA) 또는 실시예 1의 5-mC 항체가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀 (5-mC Ab-PDA)을 완충 용액인 PBS 버퍼와 증폭된 메틸화 DNA (Methylated DNA)를 첨가하여 반응시켰다. 이 후 glass에 고정시켜 Genepix 4000B Microarray (Molecular Devices, USA)로 형광 이미지를 촬영하였다. 그 결과, 대조군 폴리디아세틸렌 리포좀 (PDA)은 PBS 및 메틸화 DNA와 반응 시 적색 형광을 거의 나타내지 않았다. 반면에 실시예 1의 5-mC 항체 기능화 된 폴리디아세틸렌 리포좀 (5-mC Ab-PDA)은 PBS에 비해 메틸화 DNA 반응으로 더 강한 적색 형광을 나타내었다. 이는 5-mC Ab-PDA의 표면에 기능화 된 5-Methylcytosine (5-mC) 항체가 메틸화 DNA와 특이적으로 결합되었으며, PDA의 형광 전이 특성에 의해 메틸화 DNA가 검출되었음을 보여준다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (14)
- 펜타코사다이이노익산 (PCDA: pentacosadiynoic acid), 펜타코사다이이노익산-에틸렌다이아민(PCDA-EDA: pentacosadiynoic acid-ethylenediamine) 및 디미리스토일포스파티딜콜린 (Dimirystoyl phosphatidylcholine, DMPC)을 자가-조립하여 형성된 디아세틸렌 리포좀에, 메틸화된 DNA에 특이적으로 결합하는 리간드가 결합된, 메틸화된 DNA 형광 검출용 폴리디아세틸렌 리포좀으로서,
상기 메틸화된 DNA에 특이적으로 결합하는 리간드는 항-5-메틸사이토신 항체(anti-5-methylcytosine antibody), 항-5-하이드록시메틸사이토신 항체(anti-5-hydroxymethylcytosine antibody), 항-5-포르밀사이토신 항체(anti-5-formylcytosine antibody), 항-5-카르복실사이토신 항체(anti-5-carboxylcytosine antibody) 및 항-5-N6-메틸아데닌 항체(anti-N6-methyladenine antibody)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 리포좀.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 메틸화된 DNA에 특이적으로 결합하는 리간드는 항-5-메틸사이토신 항체(anti-5-methylcytosine antibody)인 것을 특징으로 하는, 폴리디아세틸렌 리포좀.
- 제1항에 있어서,
상기 폴리디아세틸렌 리포좀은 메틸화된 DNA에 특이적으로 결합하는 리간드로 인해 청색에서 적색으로의 색 전이를 나타내는 것을 특징으로 하는, 폴리디아세틸렌 리포좀.
- 제1항에 있어서,
상기 폴리디아세틸렌 리포좀은 280 내지 360nm의 크기인 것을 특징으로 하는, 폴리디아세틸렌 리포좀.
- 펜타코사다이이노익산 (PCDA: pentacosadiynoic acid), 펜타코사다이이노익산-에틸렌다이아민(PCDA-EDA: pentacosadiynoic acid-ethylenediamine) 및 디미리스토일포스파티딜콜린 (Dimirystoyl phosphatidylcholine, DMPC)을 자가-조립하여 디아세틸렌 리포좀을 형성하는 단계(단계 1);
상기 디아세틸렌 리포좀을 메틸화 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 리간드와 결합하는 단계(단계 2)로서,
상기 메틸화된 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 리간드는 항-5-메틸사이토신 항체(anti-5-methylcytosine antibody), 항-5-하이드록시메틸사이토신 항체(anti-5-hydroxymethylcytosine antibody), 항-5-포르밀사이토신 항체(anti-5-formylcytosine antibody), 항-5-카르복실사이토신 항체(anti-5-carboxylcytosine antibody) 및 항-5-N6-메틸아데닌 항체(anti-N6-methyladenine antibody)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 단계; 및
상기 단계 2의 메틸화 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 리간드가 결합된 디아세틸렌 리포좀을 중합하는 단계(단계 3);
를 포함하는, 메틸화된 DNA 형광 검출용 폴리디아세틸렌 리포좀의 제조방법.
- 제7항에 있어서,
상기 PCDA, PCDA-EDA 및 DMPC의 중량비는 90:75:130인 것을 특징으로 하는, 폴리디아세틸렌 리포좀의 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항의 폴리디아세틸렌 리포좀을 메틸화된 DNA와 접촉시키는 단계(단계 1); 및
상기 단계 1의 폴리디아세틸렌 리포좀의 색변화를 관찰하는 단계(단계 2);
를 포함하는, DNA 메틸화의 형광 검출 방법.
- 제12항에 있어서,
상기 단계 2의 색변화는 육안으로 측정되거나, 정량적으로 측정되는 것을 특징으로 하는, DNA 메틸화의 형광 검출 방법.
- 제13항에 있어서,
상기 정량적으로 측정되는 것은 분광광도계, 형광광도계 또는 색도계로 측정되는 것을 특징으로 하는, DNA 메틸화의 형광 검출 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20200156558 | 2020-11-20 | ||
| KR1020200156558 | 2020-11-20 |
Publications (2)
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| Changheon Kim et al., Biomacromolecules, 2019, Vol. 20, pp 3392-3398. 1부.* |
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