CN111830006B

CN111830006B - 一种光谱分析方法和装置

Info

Publication number: CN111830006B
Application number: CN201910320361.7A
Authority: CN
Inventors: 马丽; 李久彤; 周雪雷; 郭畅
Original assignee: Shanghai Xinpu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Xinpu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-04-19
Filing date: 2019-04-19
Publication date: 2024-03-15
Anticipated expiration: 2039-04-19
Also published as: CN111830006A

Abstract

本发明提供了一种光谱分析方法。具体地，包括步骤：(a)提供一待测样品；(b)在一容器内，将所述待测样品与捕获颗粒和拉曼检测试剂进行混合，形成含“捕获颗粒‑测试物‑拉曼检测试剂”的复合物的第一混合物；(c)通过磁场，将所述复合物富集于所述容器的底部的检测区；(d)将激发光从所述容器的底部射入，并照射于所述复合物，测量所述复合物经照射后产生的第一拉曼光谱信号L1，以及所述容器的底部产生的第二拉曼光谱信号L2；和(e)将第二拉曼光谱信号L2作为校正参考值，对所述第一拉曼光谱信号L1进行校正，从而获得经校正的第一拉曼光谱信号L1'。本发明提供的检测方法不仅灵敏度高、定量准确，而且操作简便、快捷。

Description

一种光谱分析方法和装置

技术领域

本发明属于体外检测技术领域，具体地涉及一种基于表面增强拉曼技术的分析方法和装置。

背景技术

在免疫检测领域中，常常需要对各类抗原或抗体进行定性或定量检测。现有技术中，以“竞争抑制和双抗夹心”为基础衍生出多种免疫反应分析方法，如：放射免疫法、酶联免疫法、化学发光法、时间分辨荧光法、荧光免疫法和表面增强拉曼(SERS)免疫分析法等，可用于确定病原微生物，对人体的特异性蛋白定量检测，从而对疾病进行辅助诊断或监测等等，用途非常广泛。其中SERS方法因其超高的灵敏度、多指标同时检测和光信号稳定的特点而备受研究者的瞩目。

SERS免疫分析的基本原理是：将针对目标分析物的捕获抗体(Ab1)固定于固相拉曼增强基底(一般为金、银薄膜或金、银纳米微粒或金、银与无机材料组成的复合纳米微粒)，针对目标分析物的信号抗体(Ab2)也固定在另一类似材料的纳米微粒上，同时该纳米微粒表面还固定有拉曼报告分子(Ranman Report，RR)。当阳性样本与Ab1和Ab2形成“三元夹心复合物”时，纳米微粒的近表面(一般小于5nm)和彼此聚集靠近的纳米微粒间的狭缝形成了“热点结构”，使RR的信号得到极大增强，目标分析物越多，形成的“三元夹心复合物”越多，相应地，“热点结构”和RR越多，拉曼信号越强，从而对目标分析物进行定量定性分析。

由于纳米微粒表面的RR极易受到“热点结构”的影响，而每次免疫反应所形成的“热点结构”数量和状态很难做到一致，所以最终测到的拉曼信号波动较大，从而严重影响了SERS的定量检测性能。为解决SERS定量免疫检测的难题，人们做了很多努力和尝试，并取得了一定进展。其中核壳结构的纳米微粒较为有效，大致的做法是：合成金核银壳(Au@Ag)纳米微粒，并将RR分子固定于核壳之间，使其处于稳定的“热点结构”中(Au-RR@Ag)，通过控制壳Ag的厚度，可使RR的拉曼信号免受纳米微粒聚集状态的影响，从而在特定波数呈现很强的且稳定的特征拉曼信号，之后再将信号抗体(Ab2)固定于Au-RR@Ag的表面，形成Au-RR@Ag-Ab2；同时，将Ab1固定于磁微粒(M)表面(M-Ab1)，与样本(S)构建SERS磁免疫均相反应体系。若为阳性样本则形成“M-Ab1·S·Au-RR@Ag-Ab2”复合物，施加磁场后，所有的M-Ab1包括“M-Ab1·S·Au-RR@Ag-Ab2”都被富集，反复洗涤后，检测复合物上RR的拉曼信号。

SERS在其他检测领域的应用，如小分子化合物的检测，现有技术公开了一种嵌入式内标方法，取得良好效果。它是根据待测小分子的特征峰与内标特征峰的相对强度值和小分子标准溶液浓度之间的关系曲线对样品中小分子进行SERS定量分析。内标的存在可以校正由于拉曼激光强度波动、基底活性不均、测量环境改变等不稳定因素引起的全光谱强度变化，使定量结果更为可靠准确。

为进一步提升SERS磁免疫分析定量检测的性能，内标法值得借鉴，参照此思路，前述M-Ab1必须同时具备以下几个功能：①免疫反应功能，这是前提，否则无法捕获S而形成要检测的复合物，②磁性微粒中必须含有不同于Au-RR@Ag-Ab2中RR的其他RR作为内标，此RR应当稳定，③磁性微粒必须有金或银增强基底，以使RR的信号得到增强而呈现稳定的内标RR特征峰。如是，合成步骤较多，稳定一致的内标RR特征峰及良好的免疫反应功能较难控制，自身不稳定，很难用于校正拉曼激光强度波动、基底活性不均、测量环境改变等不稳定因素引起的全光谱强度变化。

另外，现有SERS磁免疫分析技术，反应终了，需对富集的所有M-Ab1包括“M-Ab1·S·Au-RR@Ag-Ab2”反复洗涤，以去除游离未结合的Au-RR@Ag-Ab2，若是人工操作，很麻烦，若是仪器自动化完成，则仪器复杂成本高，总之，有洗涤过程将导致工作效率低而成本上升。

因此，本领域需要对SERS磁免疫分析技术进行持续改进，引入稳定的内标，但合成过程简单而可控，同时又免去洗涤过程，以降本增效。

发明内容

本发明的目的就是提供一种SERS磁免疫均相免疫分析方法，在含有稳定内标的同时，无需任何洗涤步骤以去除反应体系中游离未结合的Au-RR@Ag-Ab2即可定量检测血清、血浆、全血或缓冲液样品中的待测物。

本发明的另一个目的是提供了一种定量检测待测物的检测装置。

在本发明的第一方面，提供了一种光谱分析方法，包括步骤：

(a)提供一待测样品，所述待测样品含有待检测的测试物；

(b)在一容器内，将所述待测样品与捕获颗粒和拉曼检测试剂进行混合，从而形成含“捕获颗粒-测试物-拉曼检测试剂”的复合物的第一混合物；

其中，所述的捕获颗粒为负载有第一捕获剂的磁性颗粒；而所述的拉曼检测试剂为负载有第二捕获剂且标记有拉曼信号分子的固相载体；

其中，所述的第一捕获剂和第二捕获剂均特异性针对所述测试物，并与所述测试物结合形成“第一捕获剂-测试物-第二捕获剂”的三元复合物；

(c)通过磁场，将所述“捕获颗粒-测试物-拉曼检测试剂”的复合物富集于所述容器的底部的检测区；

(d)将激发光从所述容器的底部射入，并照射于所述的“捕获颗粒-测试物-拉曼检测试剂”的复合物，并测量所述“捕获颗粒-测试物-拉曼检测试剂”的复合物经照射后产生的第一拉曼光谱信号L1，以及所述容器的底部产生的第二拉曼光谱信号L2；和

(e)将第二拉曼光谱信号L2作为校正参考值，对所述第一拉曼光谱信号L1进行校正，从而获得经校正的第一拉曼光谱信号L1'。

在另一优选例中，所述的容器的材料选自下组：塑料、玻璃、陶瓷、或其组合。

在另一优选例中，所述的容器的底部材料选自下组：塑料、玻璃、陶瓷、或其组合。

在另一优选例中，所述的底部材料选自下组：聚合物、树脂、或其组合。

在另一优选例中，所述的聚合物包括均聚物或共聚物。

在另一优选例中，所述的底部材料选自下组：聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯、聚丙烯、密胺、或其组合。

在另一优选例中，所述容器的底部是透明的或半透明的。

在另一优选例中，所述容器的底部的厚度为0.2-1.0mm。

在另一优选例中，所述的激发光从所述容器的底部的检测区的下方射入。

在另一优选例中，所述的激发光相对于容器的底部平面的法线的入射角α为0－70度，较佳地0－60度，更佳地0－45度。(即入射角α为0°时，所述激发光是垂直入射于容器的底部)。

在另一优选例中，所述的激发光为激光。

在另一优选例中，所述的激发光的波长为300-600，较佳地600-900nm,更佳地900-1200nm。

在另一优选例中，所述的捕获颗粒是具有式I结构的负载有捕获剂磁性颗粒：

Z1-Z2-Z3 (I)

式中，

Z1为磁性颗粒；

Z2为第一连接元件；和

Z3为第一捕获剂。

在另一优选例中，所述的第一连接元件选自下组：含有巯基、羟基、醛基和/或羧基的连接分子、多肽连接元件、或其组合。

在另一优选例中，所述的多肽连接元件包括“亲和素-生物素”连接臂。

在另一优选例中，所述的第一捕获剂为第一抗体。

在另一优选例中，所述的拉曼检测试剂是具有式II结构的微粒：

Y1-Y2-Y3-Y4-Y5(II)

式中，

Y1为贵金属微粒；

Y2为拉曼信号分子；和

Y3为包裹涂层；

Y4为第二连接元件；

Y5为第二捕获剂。

在另一优选例中，所述的贵金属微粒选自下组：Au微粒、Ag微粒、或其组合。

在另一优选例中，所述的拉曼信号分子选自下组：4-巯基苯甲酸、4-巯基苯硫酚、硝基苯硫酚、氨基苯硫酚、苯并咪唑、苯并噻唑、巯基吡啶、异硫氰酸醋、5，5二巯基双(硝基苯甲酸)、4-乙酰氨基苯硫酸、2-硫脲嘧啶或其组合。

在另一优选例中，所述的包裹涂层为Ag涂层、Au涂层、或其组合。

在另一优选例中，所述的第二捕获剂为第二抗体。

在另一优选例中，所述的经校正的第一拉曼光谱信号L1'用公式Q1获得：

L1'＝L1/L2 (Q1)。

在另一优选例中，所述的第一拉曼光谱信号L1为第一拉曼光谱中特征峰的峰值F1。

在另一优选例中，所述的第二拉曼光谱信号L2为第二拉曼光谱中特征峰的峰值F2。

在另一优选例中，所述的拉曼信号分子为4-巯基苯甲酸。

在另一优选例中，所述的第一拉曼光谱信号L1为第一拉曼光谱中1074±5cm^-1(较佳地1074±2cm^-1)处特征峰的峰值F1。

在另一优选例中，所述的容器底部材料为聚苯乙烯。

在另一优选例中，所述的第二拉曼光谱信号L2为第2拉曼光谱中1004±5cm^-1(较佳地1004±2cm^-1)处特征峰的峰值F2。

在另一优选例中，所述的经校正的第一拉曼光谱信号L1'用公式Q2获得的F1'：

F1'＝F1/F2 (Q2)。

在另一优选例中，所述方法还包括：

(f)将所述的经校正的第一拉曼光谱信号L1'与标准值或标准曲线进行比较，从而获得所述待测样品中测试物存在与否和/或数量的测量结果。

在另一优选例中，所述方法是离体方法。

在另一优选例中，所述方法是非诊断性的和非治疗性的。

在本发明的第二方面，提供了一种光谱分析系统，所述系统包括：

(i)激发光发射源，所述的激发光发射源发射激发光，所述的激发光从一容器的底部的检测区的下方射入，所述的容器的检测区中富集有“捕获颗粒-测试物-拉曼检测试剂”的复合物；

(ii)拉曼光谱信号采集单元，所述的拉曼光谱信号采集单元用于采集所述“捕获颗粒-测试物-拉曼检测试剂”的复合物经照射后产生的第一拉曼光谱信号L1，以及所述容器的底部产生的第二拉曼光谱信号L2；

(iii)拉曼光谱信号处理单元，所述的拉曼光谱信号处理单元用于将第二拉曼光谱信号L2作为校正参考值，对所述第一拉曼光谱信号L1进行校正，从而获得经校正的第一拉曼光谱信号L1'；和

(iv)输出单元。

在另一优选例中，所述的光谱分析系统还包括：

(v)富集单元，所述富集单元用于通过磁场，将所述容器中的所述“捕获颗粒-测试物-拉曼检测试剂”的复合物富集于所述容器的底部的检测区。

在另一优选例中，所述的富集单元包括永磁铁、电磁铁、或其组合。

在另一优选例中，所述的光谱分析系统还包括一检测容器，所述检测容器用于盛装待测样品和/或所述的第一混合物。

在另一优选例中，所述的待测样品和/或所述的第一混合物为液态。

在另一优选例中，所述的光谱分析系统是用于本发明第一方面中所述方法的光谱分析系统。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明的测量方法。

图2显示了仪器将磁珠富集在反应容器底部中心位置的工作状态。

图3显示了仪器处于测量时的状态。

图4显示了系列浓度的血清FABP溶液与本发明所用试剂在反应容器反应后用图2、3方式测得的拉曼图谱。

图5显示了以浓度C对4MBA的拉曼信号P做的标准曲线(血清基质)。

图6显示了以浓度C对4MBA的拉曼信号与聚苯乙烯信号的比值做标准曲线。

图7显示了系列浓度的全血FABP溶液与本发明所用试剂在反应容器反应后的拉曼图谱。

图8显示了以浓度C对4MBA的拉曼信号P做标准曲线(全血基质)。

图9显示了以浓度C对4MBA的拉曼信号与聚苯乙烯信号的比值做标准曲线。

具体实施方式

本发明人通过深入研究，建立了一种含有稳定内标的SERS磁免疫分析方法，所述方法中的内标由盛装各反应物的反应容器担当，反应容器的材质在特定波数有较强且稳定的拉曼信号，可做内标使用。利用反应容器材料的拉曼信号作为内标，免去了前述同时含有磁响应功能、信号抗体、内标RR和金银增强基底复合物的繁琐合成步骤，且反应容器都是商业化的产品，性质稳定，拉曼信号也十分稳定。反应容器的材质通常是高分子材料，如：聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯等。

和现时较流行的其他方法学磁免疫分析试剂体系一样(如：化学发光磁免疫分析技术)，本发明也采用链霉亲合素(Streptavdin，SA)标记的磁珠(SA-M)作为固相载体。本发明的Ab2是标记在内嵌RR的Au/Ag核壳型纳米材料上，即：“Au-RR@Ag-Ab2”。当样本、生物素标记的捕获抗体biotin-Ab1和“Au-RR@Ag-Ab2”以适当的比例加入高分子材料(如：聚苯乙烯)反应容器反应适当时间后，再向反应容器中加适量的SA-M，最后于反应容器外的底部中心位置施加磁场，使所有SA-M富集，其中包括免疫反应生成的复合物，撤去磁场后，使拉曼仪器的光源穿过反应容器的底部后聚焦于SA-M(图1)，可同时得到反应容器聚苯乙烯在1004cm^-1的拉曼峰和“RR”的拉曼峰，2峰高之比与样本中目标物的浓度有对应关系。

也可将“Ab1-M”、“Au-RR@Ag-Ab2”和样本按适当比例混合于聚苯乙烯材质的反应容器中，反应适当时间后于反应容器外的底部中心位置施加磁场，使磁珠富集，其中包括免疫反应生成的复合物，然后使拉曼仪器的光源由反应容器的正下方穿过其底部后聚焦于Ab1-M(附图1)，可同时得到反应容器聚苯乙烯材料的拉曼峰和“RR”的拉曼峰，2峰高之比与样本中目标物的浓度有对应关系。

采用如附图1所示的测量方法，既可非常方便地得到反应容器材料稳定的拉曼信号(内标)，又可避开样本及试剂混合液中未发生反应的游离的“Au·RR@Ag-Ab2”对测量的干扰，因为激光被富集的磁珠所阻挡，无法照射到溶液中的“Au·RR@Ag-Ab2”；如果激光由反应容器的正上方照射富集的磁珠，必须首先将容器内的样本及试剂混合液移除，否则将会有很强的由“Au·RR@Ag-Ab2”产生的背景信号，使测量无效，同时也无法得到反应容器材料稳定的拉曼信号(内标)，因激光被富集的磁珠阻挡，无法照射到反应容器。

依据附图1的测量方法，本发明还设计开发了适配的测量仪器，见图2、图3，其中图2是仪器将磁珠富集在反应容器底部中心位置的工作状态，可以通过反应容器和磁铁相对位置的变化富集1～8不同反应容器内的磁珠于底部中心位置；图3仪器处于测量状态，此时，磁铁从激光光源的上方位置移开，让开光路通道，使激发光和激发出的散射光顺利通过。

标准曲线

在本发明中，可以直接通过测定图1中磁珠处“RR”的拉曼信号强度，从而确定所述待测物的数量，也可以通过反应容器材料拉曼信号的强度与“RR”信号强度的比值确定所述待测物的量。

在优选例中，可通过与标准曲线进行比较，从而获得定量结果。

标准曲线可用以下方法获得：

将已知的不同浓度(C)的待测物标准样品与前述“biotin-Ab1”、“Au·RR@Ag-Ab2”在聚苯乙烯材质的反应容器内反应后，再加入适量SA-M，反应后磁富集，采用图1所示的方法测量，同时得到聚苯乙烯和“RR”的拉曼信号，以“RR”的拉曼信号与浓度C作图，得到标准曲线，或者取二者的比值与浓度C作图，得到标准曲线。

本发明的主要优点包括：

1)本发明所述的方法通过改变测量方式，巧妙地提供了稳定的内标，不仅具有灵敏度高，定量准确的优点，而且操作十分简便、快捷，无需任何洗涤步骤，无需去除反应体系中的游离“Au·RR@Ag-Ab2”即可定量检测血清、血浆、全血或缓冲液样品中的待测物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

试剂：

1.FABP单克隆抗体(抗体2302，以下以Ab1代替，5.1mg/mL,批号：0040011；抗体2304,以下以Ab2代替，5.2mg/mL,批号：0038392；Medix公司)；

2.牛血清白蛋白(68KD，批号：Y161201，Genview公司)；

3.氯金酸(分析纯，批号：20180423，国药集团化学试剂有限公司)；

4.磷酸氢二钠(分析纯，批号：20141015，国药集团化学试剂有限公司)；

5.磷酸二氢钠(分析纯，批号：20140922，国药集团化学试剂有限公司)；

6.氯化钠(分析纯，批号：20180223，国药集团化学试剂有限公司)；

7.SH-PEG-COOH(分析纯，批号：D06112，芃圣生物)；4-巯基苯甲酸(分析纯，批号：20160617，国药集团化学试剂有限公司)；

8.乙醇(分析纯，批号：20170918，国药集团化学试剂有限公司)，

9.硝酸银(分析纯，批号：20161001，上海试剂一厂)；

10.柠檬酸三钠(分析纯，批号：20161209，国药集团化学试剂有限公司)，

11.EDC(分析纯，批号：20160817，国药集团化学试剂有限公司)。

以上实验用水均为二次离子水。

12.链霉亲合素(Streptavdin，SA)标记的磁珠(SA-M),上海英芮诚生物科

技有限公司

设备：

1.L6S型紫外-可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)；

2.CT14RD型台式高速冷冻离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司)；

3.FA1004型电子天平(上海舜宇衡平科学仪器有限公司)；

4.雷磁GB-3A型恒温定时搅拌器(上海雷磁创益仪器仪表有限公司)；

5.R10拉曼光谱仪(Ocean optics公司)；

6.Orbital Shaker TS-1(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。

实施例1拉曼检测试剂的制备

1.1 Au-4MBA@Ag的制备

1.1.1胶体金的制备：100mL 0.01％的氯金酸水溶液煮沸后，快速加入1％的柠檬酸三钠溶液1.75mL，继续煮沸5min。其UV-Vis值大约在518nm左右。

1.1.2 Au-4MBA@Ag的制备：取1mL胶体金溶液加入1mM的4-巯基苯甲酸(4-MBA)溶液后反应一段时间后离心，获得Au-4MBA。

将Au-4MBA复溶于纯水中加热煮沸，先后逐滴加入适量硝酸银溶液和适量柠檬酸三钠溶液后继续煮沸十分钟后室温冷却，4℃保存备用。

1.1.3 Au-4MBA@Ag-Ab2的制备：将1mL合成好的Au-4MBA@Ag离心弃上清复溶于超纯水中，加入适量SH-PEG-COOH 4℃保存过夜,离心去除多余SH-PEG-COOH后，加入5μg抗FABP的信号抗体Ab2偶联30min后加入适量EDC固定三次，每30min加一次，最后加入20μL10％的BSA溶液封闭30min后再加入EDC固定一次，最后离心弃上清定溶于100μL超纯水中4℃保存备用。

1.2 Biotin-Ab1的制备

1.2.1 Biotin标记Ab1：将100μL 1.5mg/mL的抗FABP的捕获抗体(Ab1)加入10μLBiotin，4℃震荡反应2h，再加入10％的甘氨酸溶液100μL反应30min后放入透析袋中避光4℃透析三天，每8h换一次PBS透析液。

实施例2血清中FABP的检测

在本实施例中，基于SERS对FABP进行检测。

2.1样本的配制：利用血清作为基质分别配制0，1，2.5，5，10，25，50ng/mL的FABP样本进行测量。

2.2 FABP的检测：取50μL样本于聚苯乙烯微孔中，分别加入2μL Au-4MBA@Ag-Ab2和3μL Biotin-Ab1室温反应10min后，加入6μL链霉亲合素(Streptavdin，SA)标记的磁珠(SA-M)，作为固相载体，继续反应5min后，用磁板使磁珠富集后按照图1方式检测拉曼信号。

所得数据如图4、5、6和表1、2所示。

表1：浓度与4-MBA信号强度P(扣除本底)数据

C(ng/mL)	0	1	2.5	5	10	25	50
								F1	2124	3052	4886	7469	17894	38688	49105

表2：浓度与4-MBA信号强度和聚苯乙烯信号强度(P₁)比值数据

如图所示：图6比值与浓度的直线相关性(R²＝0.9982)明显好于图5 4MBA绝对信号与浓度的直线相关性(R²＝0.9327)。

再用血清配制5、20、和45ng/ml的样本，按照上述制作标准曲线的方法同样操作，将得到的4MBA信号与聚苯乙烯信号的比值带入图4标准曲线，考察重复性和回收率，结果显示CV均小于8％，回收在92.2～107.6％之间。

实施例3.全血中FABP的检测

对于Au-4MBA@Ag-Ab2以及Biotin-Ab1的制备步骤与血清中FABP检测中的制备方法一致。

3.1基于SERS的FABP的检测

3.1.1样本的配制：现场抽取人血液加入抗凝剂后，以含抗凝剂的血液作为基质分别配制0，1，2.5，5，10，25，50ng/mL的样本梯度进行测量。

3.1.2 FABP的检测：取60μL样本加入聚苯乙烯微孔后再加入120μLPBS溶液稀释，分别加入2μL Au-4MBA@Ag-Ab2和3μL Biotin-Ab1反应10min，加入6μL SA磁珠，继续反应5min后，用磁板使磁珠富集后按照图1方式检测拉曼信号。

所得数据如图7、8、9和表3、4所示：

表3：浓度与4MBA信号强度P(扣除本底)数据

C(ng/mL)	0	1	2.5	5	10	25	50
								F1	260	750	1360	1523	2597	12356	16511

表4：浓度与4MBA信号强度和聚苯乙烯信号强度(P₁)比值数据

如图所示：图7比值与浓度的直线相关性好于图6 4MBA绝对信号与浓度的直线相关性。

再用含抗凝剂的血液配制8、15、和40ng/ml的样本，按照上述制作标准曲线的方法同样操作，将得到的4MBA信号与聚苯乙烯信号的比值带入图4标准曲线，考察重复性和回收率，结果显示CV均小于8％，回收在88.2～108.6％之间。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种光谱分析方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供一待测样品，所述待测样品含有待检测的测试物；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述容器包括选自下组的一个或多个特征：

(1)所述的容器的材料选自下组：塑料、玻璃、陶瓷、或其组合；

(2)所述容器的底部的厚度为0.2-1.0mm。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的容器的底部材料选自下组：塑料、玻璃、陶瓷、或其组合。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的底部材料选自下组：聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯、聚丙烯、密胺、或其组合。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的捕获颗粒是具有式I结构的负载有捕获剂磁性颗粒：

Z1-Z2-Z3 (I)

式中，

Z1为磁性颗粒；

Z2为第一连接元件；和

Z3为第一捕获剂。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的第一连接元件选自下组：含有巯基、羟基、醛基和/或羧基的连接分子、多肽连接元件、或其组合；其中，所述的多肽连接元件包括“亲和素-生物素”连接臂。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的拉曼检测试剂是具有式II结构的微粒：

Y1-Y2-Y3-Y4-Y5 (II)

式中，

Y1为贵金属微粒；

Y2为拉曼信号分子；和

Y3为包裹涂层；

Y4为第二连接元件；

Y5为第二捕获剂。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的贵金属微粒选自下组：Au微粒、Ag微粒、或其组合。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的拉曼信号分子选自下组：4-巯基苯甲酸、4-巯基苯硫酚、硝基苯硫酚、氨基苯硫酚、苯并咪唑、苯并噻唑、巯基吡啶、异硫氰酸醋、5，5二巯基双(硝基苯甲酸)、4-乙酰氨基苯硫酸、2-硫脲嘧啶或其组合。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的包裹涂层为Ag涂层、Au涂层、或其组合。

11.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的第一连接元件选自下组：含有巯基、羟基、醛基和/或羧基的连接分子、多肽连接元件、或其组合；其中，所述的多肽连接元件包括“亲和素-生物素”连接臂。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的容器底部材料为聚苯乙烯。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述容器的底部是透明的或半透明的。

14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的经校正的第一拉曼光谱信号L1'用公式Q1获得：

L1'＝L1/L2 (Q1)。

15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一拉曼光谱信号L1为第一拉曼光谱中特征峰的峰值F1。

16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第二拉曼光谱信号L2为第二拉曼光谱中特征峰的峰值F2。

17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的经校正的第一拉曼光谱信号L1'用公式Q2获得的F1'：

F1'＝F1/F2 (Q2)。

18.一种光谱分析系统，其特征在于，所述系统包括：

(iv)输出单元。

19.如权利要求18所述的光谱分析系统，其特征在于，所述的光谱分析系统还包括：