CN113358882A - 一种光谱分析方法和装置 - Google Patents

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关明
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Abstract

本发明涉及一种光谱分析方法和装置。具体地，本发明提供一种光谱分析方法，所述的方法包括步骤：(a)提供一待测样品，所述待测样品含有待检测的测试物；(b)在一容器内，将所述待测样品与捕获颗粒和检测颗粒进行混合，从而形成含“捕获颗粒‑测试物‑检测颗粒”的复合物的第一混合物；(c)对所述“捕获颗粒‑测试物‑检测颗粒”的复合物进行清洗后，将“捕获颗粒‑测试物‑检测颗粒”的复合物分散成混悬液后，使混悬液处于持续运动状态下进行光谱信号的测定。本发明所述的光谱分析方法能够提高分析的重复性和稳定性，从而提高测定的准确性。

Description

一种光谱分析方法和装置
技术领域
本发明属于体外检测技术领域，具体地涉及一种光谱分析方法和装置。
背景技术
在免疫检测领域中，常常需要对各类抗原或抗体进行定性或定量检测。现有技术中，以“竞争抑制和双抗夹心”为基础衍生出多种免疫反应分析方法，如：放射免疫法、酶联免疫法、化学发光法、时间分辨荧光法、荧光免疫法和表面增强拉曼(SERS)免疫分析法等，可用于确定病原微生物，对人体的特异性蛋白定量检测，从而对疾病进行辅助诊断或监测等等，用途非常广泛。其中SERS方法因其超高的灵敏度、多指标同时检测和光信号稳定的特点而备受研究者的瞩目。
SERS免疫分析的基本原理是：将针对目标分析物的捕获抗体(Ab1)固定于固相拉曼增强基底(一般为金、银薄膜或金、银纳米微粒或金、银与无机材料组成的复合纳米微粒)，针对目标分析物的信号抗体(Ab2)也固定在另一类似材料的纳米微粒上，同时该纳米微粒表面还固定有拉曼报告分子(Ranman Report，RR)。当阳性样本与Ab1和Ab2形成“三元夹心复合物”时，纳米微粒的近表面(一般小于5nm)和彼此聚集靠近的纳米微粒间的狭缝形成了“热点结构”，使RR的信号得到极大增强，目标分析物越多，形成的“三元夹心复合物”越多，相应地，“热点结构”和RR越多，拉曼信号越强，从而对目标分析物进行定量定性分析。
由于纳米微粒表面的RR极易受到“热点结构”的影响，而每次免疫反应所形成的“热点结构”数量和状态很难做到一致，所以最终测到的拉曼信号波动较大，从而严重影响了SERS的定量检测性能。
因此，本领域需要对SERS磁免疫分析技术进行持续改进，降低拉曼信号波动性，提高SERS磁免疫分析的重复性和稳定性。。
发明内容
本发明的目的在于提供一种SERS磁免疫分析方法，提高SERS磁免疫分析的重复性和稳定性，从而能够准确测定血清、血浆、全血或缓冲液样品中的待测物质。
本发明的另一个目的在于提供了一种检测待测物的光谱分析系统。
本发明的第一方面提供一种光谱分析方法，包括步骤：
(a)提供一待测样品，所述待测样品含有待检测的测试物；
(b)在一容器内，将所述待测样品与捕获颗粒和检测颗粒进行混合，从而形成含“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物的第一混合物；
其中，所述的捕获颗粒为负载有第一捕获剂的磁性颗粒；而所述的检测颗粒为负载有第二捕获剂且标记有信号分子的固相载体；
其中，所述的第一捕获剂和第二捕获剂均特异性针对所述测试物，并与所述测试物结合形成“第一捕获剂-测试物-第二捕获剂”的三元复合物；
(c)对所述“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物进行清洗后，将“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物分散成混悬液后，使混悬液处于持续运动状态下进行光谱信号的测定。
在另一优选例中，所述的光谱信号的测定包括：
将激发光从所述容器的底部射入，并测量处于持续运动状态下的“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物经照射后产生的光谱信号。
在另一优选例中，所述待检测的测试物选自下组：降钙素原、白细胞介素6，或其组合。
在另一优选例中，所述的光谱分析方法为表面增强拉曼光谱分析方法。
在另一优选例中，所述的检测颗粒为拉曼检测颗粒。
在另一优选例中，所述的光谱信号为拉曼光谱信号。
在另一优选例中，所述的信号分子为拉曼信号分子。
在另一优选例中，所述的混悬液中降钙素原的浓度为0.001-1000ng/ml，较佳地0.01-1000ng/ml，更佳地0.01-500ng/ml，更佳地0.05-100ng/ml，更佳地0.05-50ng/ml，更佳地0.1-30ng/ml，更佳地0.1-10ng/ml，最佳地0.5-1ng/mL。
在另一优选例中，所述的混悬液中白细胞介素6的浓度为0.001-1000ng/ml，较佳地0.01-500ng/ml，更佳地0.01-100ng/ml，更佳地0.01-50ng/ml，更佳地0.01-30ng/ml，更佳地0.01-10ng/ml，最佳地0.01-1ng/mL。
在另一优选例中，所述待测样品为血清、血浆、全血或缓冲液。
在另一优选例中，所述的步骤(c)中，所述清洗使用的清洗液为PBS缓冲液。
在另一优选例中，所述的运动包括流动。
在另一优选例中，所述的流动包括涡流。
在另一选例中，所述的运动包括涡流。
在另一优选例中，所述清洗包括以下步骤：
将所述“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物聚集在容器的侧壁上，然后用清洗液对所述“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物进行清洗。
在另一优选例中，在磁场作用下将所述“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物聚集在容器的侧壁上。
在另一优选例中，所述的磁场是由磁性物质产生。
另一优选例中，所述的磁性物质为磁铁。
在另一优选例中，所述的清洗液为PBS缓冲液。
在另一优选例中，所述的清洗的次数为1-6次。
在另一优选例中，所述的清洗为1、2、3、4、5或6次。
在另一优选例中，在清洗结束后后，将容器中清洗后的清洗液除去。
另一优选例中，所述的清洗结束后，移除磁性物质。
另一优选例中，所述的清洗结束后，移除磁性物质，使清洗后的“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物位于容器的底部。
在另一优选例中，用缓冲液(如PBS缓冲液)将“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物分散成混悬液。
在另一优选例中，所述的缓冲液包括PBS缓冲液。
在另一优选例中，所述的使混悬液处于持续运动状态包括以下步骤：
对混悬液进行振荡，从而混悬液处于持续运动状态。
在另一优选例中，所述的使混悬液处于持续运动状态包括以下步骤：
吸取容器中的适量混悬液后，将吸取的适量混悬液打回容器中，再吸取容器中的适量混悬液后，再将吸取的适量混悬液打回容器中，反复进行如上操作，使混悬液处于持续运动状态。
在另一优选例中，所述的适量混悬液为混悬液量(如体积量)的5-50％，较佳的5-50％，更佳地5-50％，更佳地5-40％，更佳地10-30％，更佳地15-25％。
在另一优选例中，吸取是用移液枪进行吸取。
在另一优选例中，所述的容器的材料选自下组：塑料、玻璃、陶瓷，或其组合。
在另一优选例中，所述的容器的底部材料选自下组：塑料、玻璃、陶瓷，或其组合。
在另一优选例中，所述的底部材料选自下组：聚合物、树脂，或其组合。
在另一优选例中，所述的聚合物包括均聚物或共聚物。
在另一优选例中，所述的底部材料选自下组：聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯、聚丙烯、密胺，或其组合。
在另一优选例中，所述容器是透明的或半透明的。
在另一优选例中，所述容器的底部是透明的或半透明的。
在另一优选例中，所述容器的底部的厚度为0.2-1.0mm。
在另一优选例中，所述的激发光从所述容器的底部的下方射入。
在另一优选例中，所述的激发光从所述容器的底部中央的正下方射入。
在另一优选例中，所述的激发光相对于容器的底部平面的法线的入射角α为0－70度，较佳地0－60度，更佳地0－45度。(即入射角α为0°时，所述激发光是垂直入射于容器的底部)。
在另一优选例中，α为0度。
在另一优选例中，所述的激发光为激光。
在另一优选例中，所述的激发光的波长为300-600，较佳地600-900nm,更佳地900-1200nm。
在另一优选例中，所述的拉曼光谱信号为拉曼光谱中1074±5cm-1(较佳地1074±2cm-110)处特征峰的峰值。
在另一优选例中，所述的捕获颗粒是具有式I结构的负载有捕获剂磁性颗粒：
Z1-Z2-Z3(I)
式中，
Z1为磁性颗粒；
Z2为第一连接元件；和
Z3为第一捕获剂。
在另一优选例中，所述的第一连接元件选自下组：含有巯基、羟基、醛基和/或羧基的连接分子、多肽连接元件、或其组合。
在另一优选例中，所述的多肽连接元件包括“亲和素-生物素”连接臂。
在另一优选例中，所述的亲和素为链霉亲合素。
在另一优选例中，所述的第一捕获剂为第一抗体。
在另一优选例中，所述的检测颗粒是具有式II结构的微粒：
Y1-Y2-Y3-Y4-Y5(II)
式中，
Y1为贵金属微粒；
Y2为拉曼信号分子；和
Y3为包裹涂层；
Y4为第二连接元件；
Y5为第二捕获剂。
在另一优选例中，所述的贵金属微粒选自下组：Au微粒、Ag微粒，或其组合。
在另一优选例中，所述的贵金属微粒选自下组：胶体金、胶体银、或其组合。
在另一优选例中，所述的拉曼信号分子选自下组：4-巯基苯甲酸、4-巯基苯硫酚、硝基苯硫酚、氨基苯硫酚、苯并咪唑、苯并噻唑、巯基吡啶、异硫氰酸醋、5，5二巯基双(硝基苯甲酸)、4-乙酰氨基苯硫酸、2-硫脲嘧啶，或其组合。
在另一优选例中，所述的包裹涂层为Ag涂层、Au涂层、或其组合。
在另一优选例中，所述的第二连接元件选自下组：含有巯基、羟基、醛基和/或羧基的连接分子、多肽连接元件、或其组合。
在另一优选例中，所述的多肽连接元件包括“亲和素-生物素”连接臂。
在另一优选例中，所述的第二捕获剂为第二抗体。
在另一优选例中，所述的拉曼光谱信号为拉曼光谱中特征峰的峰值。
在另一优选例中，所述的拉曼信号分子为4-巯基苯甲酸。
在另一优选例中，所述的容器底部材料为聚苯乙烯。
在另一优选例中，所述方法是离体方法。
在另一优选例中，所述方法是非诊断性的和非治疗性的。
本发明第二方面，提供一种光谱分析系统，所述系统包括：
(i)激发光发射源，所述的激发光发射源发射激发光，所述的激发光从一容器的底部的下方射入，所述的容器中含有持续运动的“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物；
(ii)光谱信号采集单元，所述的光谱信号采集单元用于采集所述“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物经照射后产生的光谱信号；
(iii)输出单元。
在另一优选例中，所述的光谱分析系统还包括：
(iv)分散单元，所述的分散单元用于将所述容器中的所述“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物进行持续运动。
在另一优选例中，所述的分散单元包括搅拌器、振荡器，或其组合。
在另一优选例中，所述的搅拌器包括搅拌头(如搅拌刀)。
在另一优选例中，所述的搅拌头(如搅拌刀)对容器进行搅拌，使得所述容器中含有的“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物进行持续运动。
在另一优选例中，所述的振荡器包括摇床。
在另一优选例中，所述的摇床对容器进行振荡，使得所述容器中含有的“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物进行持续运动。
在另一优选例中，所述的光谱分析系统还包括一检测容器，所述检测容器用于盛装待测样品和/或所述的“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物。
在另一优选例中，所述的待测样品和/或所述的“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物为液态。
在另一优选例中，所述的光谱分析系统是用于本发明第一方面中所述方法的光谱分析方法。
在另一优选例中，所述的光谱分析系统为表面增强拉曼光谱分析系统。
在另一优选例中，所述的检测颗粒为拉曼检测颗粒。
在另一优选例中，所述的光谱信号为拉曼光谱信号。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图
图1显示了本发明一个优选例中的光谱分析系统。
具体实施方式
本发明人通过大量的试验比较研究，建立了一种SERS磁免疫分析方法，在所述的方法中，意外的发现当待测物质的SA-M复合物在持续运动状态下，测定的拉曼信号强度波动最小，CV％小于5％，表明SA-M复合物在持续运动状态下SERS测定的重复性和稳定性最强，从而能够准确测定待测物质的含量，满足定量免疫检测的要求
在本发明的实验中，采用链霉亲合素(Streptavdin，SA)标记的磁微粒(SA-M)作为固相载体。本发明的Ab2是标记在Au-RR@Ag核壳型纳米材料上，即：“Au-RR@Ag-Ab2”。当样本、生物素标记的捕获抗体biotin-Ab1和“Au-RR@Ag-Ab2”以适当的比例加入反应容器反应一定时间后，再向反应容器中加适量的SA-M，于反应容器外的侧壁上施加磁场，使所有SA-M聚集，其中包括免疫反应生成的SA-M复合物，多次洗涤聚集的SA-M及SA-M复合物后撤去磁场，向反应容器加入适量缓冲液，以适当的方式将SA-M及SA-M复合物分散后形成混悬液，在保持反应容器中的混悬液处于持续运动状态时，用拉曼光谱仪测量信号强度。
本发明的实验表明，测量时“SA-M复合物”的分散状态对测值的重复性和稳定性具有重要影响，检测静置的SA-M复合物混悬液和反复聚集的SA-M复合物的拉曼信号波动大，重复性和稳定性差，无法满足定量免疫检测的要求；而“SA-M复合物”混悬液处于持续运动时检测，拉曼信号波动最小，重复性和稳定性最强，能够完全满足定量免疫检测的要求。
术语
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如本文所用，“拉曼”、“表面增强拉曼”和“SERS”可互换使用。
光谱分析方法
本发明提供一种光谱分析方法，所述的光谱分析方法对处于持续运动状态下待测物质的磁微粒复合物的SERS测定的重复性和稳定性最强。
典型地，本发明所述的光谱分析方法包括步骤：
(a)提供一待测样品，所述待测样品含有待检测的测试物；
(b)在一容器内，将所述待测样品与捕获颗粒和检测颗粒进行混合，从而形成含“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物的第一混合物；
其中，所述的捕获颗粒为负载有第一捕获剂的磁性颗粒；而所述的检测颗粒为负载有第二捕获剂且标记有信号分子的固相载体；
其中，所述的第一捕获剂和第二捕获剂均特异性针对所述测试物，并与所述测试物结合形成“第一捕获剂-测试物-第二捕获剂”的三元复合物；
(c)对所述“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物进行清洗后，将“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物分散成混悬液后，使混悬液处于持续运动状态下进行光谱信号的测定。
在本发明的一个优选例中，所述方法是离体方法。
在另一优选例中，所述方法是非诊断性的和非治疗性的。
在本发明的一个优选例中，所述的光谱分析方法为表面增强拉曼光谱分析方法。
在另一优选例中，所述的检测颗粒为拉曼检测颗粒。
在另一优选例中，所述的光谱信号为拉曼光谱信号。
在另一优选例中，所述的信号分子为拉曼信号分子。
如本文所述，“混悬液处于持续运动状态”指混悬液是一种非静止且处于一种流体运动状态，是一种流动性的状态，流体运动可以包括涡流的流动。
代表性地，所述的运动包括流动。
典型地，所述的流动包括(但不限于)涡流。
本发明所述的光谱分析方法能够用于待检测的测试物的定量测定，优选地，所述待检测的测试物包括(但不限于)：降钙素原、白细胞介素6，或其组合。
在另一优选例中，所述待测样品包括(但不限于)血清、血浆、全血或缓冲液。
在本发明的另一优选例中，所述清洗包括以下步骤：
将所述“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物聚集在容器的侧壁上，然后用清洗液对所述“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物进行清洗。
在本发明中，使混悬液处于持续运动状态下的方式并没有特别的限定，只要满足本发明的目的即可。
在一个优选例中，所述的使混悬液处于持续运动状态包括以下步骤：
对混悬液进行振荡，从而混悬液处于持续运动状态。
在另一优选例中，所述的使混悬液处于持续运动状态包括以下步骤：
吸取容器中的适量混悬液后，将吸取的适量混悬液打回容器中，再吸取容器中的适量混悬液后，再将吸取的适量混悬液打回容器中，反复进行如上操作，使混悬液处于持续运动状态。
在本发明的一个优选例中，所述的捕获颗粒是具有式I结构的负载有捕获剂磁性颗粒：
Z1-Z2-Z3(I)
式中，
Z1为磁性颗粒；
Z2为第一连接元件；和
Z3为第一捕获剂。
在另一优选例中，所述的第一连接元件选自下组：含有巯基、羟基、醛基和/或羧基的连接分子、多肽连接元件、或其组合。
在另一优选例中，所述的多肽连接元件包括“亲和素-生物素”连接臂。
在另一优选例中，所述的亲和素为链霉亲合素。
在另一优选例中，所述的第一捕获剂为第一抗体。
在本发明的另一优选例中，所述的检测颗粒是具有式II结构的微粒：
Y1-Y2-Y3-Y4-Y5(II)
式中，
Y1为贵金属微粒；
Y2为拉曼信号分子；和
Y3为包裹涂层；
Y4为第二连接元件；
Y5为第二捕获剂。
在另一优选例中，所述的贵金属微粒选自下组：Au微粒、Ag微粒，或其组合。
在另一优选例中，所述的贵金属微粒选自下组：胶体金、胶体银、或其组合。
在另一优选例中，所述的拉曼信号分子选自下组：4-巯基苯甲酸、4-巯基苯硫酚、硝基苯硫酚、氨基苯硫酚、苯并咪唑、苯并噻唑、巯基吡啶、异硫氰酸醋、5，5二巯基双(硝基苯甲酸)、4-乙酰氨基苯硫酸、2-硫脲嘧啶，或其组合。
在另一优选例中，所述的包裹涂层为Ag涂层、Au涂层、或其组合。
在另一优选例中，所述的第二连接元件选自下组：含有巯基、羟基、醛基和/或羧基的连接分子、多肽连接元件、或其组合。
在另一优选例中，所述的多肽连接元件包括“亲和素-生物素”连接臂。
在另一优选例中，所述的第二捕获剂为第二抗体。
在另一优选例中，所述的拉曼光谱信号为拉曼光谱中特征峰的峰值。
在另一优选例中，所述的拉曼信号分子为4-巯基苯甲酸。
在另一优选例中，所述的容器底部材料为聚苯乙烯。
光谱分析系统
本发明还提供一种光谱分析系统，所述的光谱分析系统可以用于本发明所述的光谱分析方法。
为了便于说明，以下结合图1进一步描述本发明的光谱分析系统，应当理解的是，附图并不限定光谱分析系统的的范围。
代表性地，所述光谱分析系统包括：
(i)激发光发射源，所述的激发光发射源发射激发光，所述的激发光从一容器的底部的下方射入，所述的容器中含有持续运动的“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物；
(ii)光谱信号采集单元，所述的光谱信号采集单元用于采集所述“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物经照射后产生的光谱信号；
(iii)输出单元。
在本发明的一个优选例中，所述的光谱分析系统还包括：
(iv)分散单元，所述的分散单元用于将所述容器中的所述“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物进行持续运动。
在另一优选例中，所述的光谱分析系统为表面增强拉曼光谱分析系统。
在另一优选例中，所述的检测颗粒为拉曼检测颗粒。
在另一优选例中，所述的光谱信号为拉曼光谱信号。
在另一优选例中，所述的分散单元包括搅拌器、振荡器，或其组合。
在另一优选例中，所述的搅拌器包括搅拌头(如搅拌刀)。
优选地，所述的搅拌头(如搅拌刀)对容器进行搅拌，使得所述容器中含有的“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物进行持续运动。
在另一优选例中，所述的振荡器包括摇床。
优选地，所述的摇床对容器进行振荡，使得所述容器中含有的“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物进行持续运动。
在另一优选例中，所述的光谱分析系统还包括一检测容器，所述检测容器用于盛装待测样品和/或所述的“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物。
在另一优选例中，所述的待测样品和/或所述的“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物为液态。
本发明的主要优点包括：
本发明提供一种光谱分析方法，在所述的方法中，意外的发现当待测物质的磁微粒复合物在持续运动状态下，测定的拉曼信号强度波动最小，表明待测物质的磁微粒复合物在持续运动状态下测定的重复性和稳定性最强，从而能够准确测定待测物质的含量，满足定量免疫检测的要求。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例
试剂：
降钙素原(PCT)、白细胞介素6(IL-6)配对单克隆抗体(捕获抗体以Ab1代替，检测抗体以Ab2代替，市售)；
牛血清白蛋白(68KD，批号：Y161201，Genview公司)；
氯金酸(分析纯，批号：20180423，国药集团化学试剂有限公司)；
磷酸氢二钠(分析纯，批号：20141015，国药集团化学试剂有限公司)；
磷酸二氢钠(分析纯，批号：20140922，国药集团化学试剂有限公司)；
氯化钠(分析纯，批号：20180223，国药集团化学试剂有限公司)；
SH-PEG-COOH(分析纯，批号：D06112，芃圣生物)；4-巯基苯甲酸(分析纯，批号：20160617，国药集团化学试剂有限公司)；
乙醇(分析纯，批号：20170918，国药集团化学试剂有限公司)，
硝酸银(分析纯，批号：20161001，上海试剂一厂)；
柠檬酸三钠(分析纯，批号：20161209，国药集团化学试剂有限公司)，
EDC(分析纯，批号：20160817，国药集团化学试剂有限公司)。
以上实验用水均为二次离子水。
链霉亲合素(Streptavdin，SA)标记的磁珠(SA-M),上海英芮诚生物科技有限公司
1μm链霉亲和素磁珠(SA-M)。
设备：
L6S型紫外-可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)；
CT14RD型台式高速冷冻离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司)；
FA1004型电子天平(上海舜宇衡平科学仪器有限公司)；
雷磁GB-3A型恒温定时搅拌器(上海雷磁创益仪器仪表有限公司)；
Seed3000拉曼光谱仪(上海如海公司)；
Orbital Shaker TS-1(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。
透明的聚苯乙烯微孔。
实施例1：SA-M复合物不同分散状态下降钙素原(PCT)和白细胞介素6(IL-6)测量数据稳定性的比较试验
1.Au-4MBA@Ag-Ab2的制备
1.1胶体金的制备：100mL 0.01％的氯金酸水溶液煮沸后，快速加入1％的柠檬酸三钠溶液1.75mL，继续煮沸5min。其UV-Vis值大约在518nm左右。
1.2Au-4MBA@Ag的制备：取1mL胶体金溶液加入1mM的4-巯基苯甲酸(4-MBA)溶液后反应一段时间后离心复溶于27μM的柠檬酸三钠溶液中加热煮沸，先后逐滴加入60μL 20mM硝酸银溶液和60μL 20mM柠檬酸三钠溶液后继续煮沸十分钟后室温冷却，4℃保存备用。
1.3Au-4MBA@Ag-Ab2的制备：将1mL合成好的Au-4MBA@Ag溶液离心弃上清复溶于超纯水中，加入2μL 0.1mM SH-PEG-COOH 4℃保存过夜,离心去除多余SH-PEG-COOH后，加入5μg抗PCT的检测抗体Ab2偶联30min后加入适量1μM EDC固定三次，每30min加一次，最后加入20μL 10％的BSA溶液封闭30min后再加入EDC固定一次，最后离心弃上清定溶于100μL超纯水中4℃保存备用，得到Au-4MBA@Ag-Ab2液。
2Biotin-Ab1的制备
2.1Biotin标记Ab1：将100μL 1.5mg/mL的抗PCT的捕获抗体(Ab1)加入10μLBiotin，4℃震荡反应2h，再加入10％的甘氨酸溶液100μL反应30min后放入透析袋中避光4℃透析三天，每8h换一次PBS透析液，得到Biotin-Ab1液。
3.检测的稳定性比较试验
3.1样本的配制：
利用小牛血清作为基质分别配制0.5、1ng/mL的降钙素原(PCT)待测样本。
利用小牛血清作为基质配制0.1ng/mL的白细胞介素6(IL-6)样本。
3.2不同分散状态下的拉曼检测方法
Seed3000拉曼光谱仪的激发光从聚苯乙烯微孔底部中央的下方射入，且激发光垂直入射于聚苯乙烯微孔底部。
降钙素原(PCT)的拉曼信号强度为拉曼光谱中1074cm-1处特征峰的峰值的强度。
白细胞介素6(IL-6)的拉曼信号强度为拉曼光谱中1074cm-1处特征峰的峰值的强度。
3.2.1混悬液处于持续流动状态下的拉曼检测
取50μLPCT待测样本加入一只透明的聚苯乙烯微孔中，分别加入2μL Au-4MBA@Ag-Ab2和3μL Biotin-Ab1室温反应10min后，加入50μL SA-M，继续反应5min后，用磁铁的磁场作用将SA-M及SA-M复合物聚集在聚苯乙烯微孔的侧壁上，去除反应容器聚苯乙烯微孔中的液体，加入200μl PBS缓冲液洗涤，再去除PBS缓冲液，如是重复3次，最后移除磁铁，并向聚苯乙烯微孔中加50μL PBS缓冲液，使SA-M及SA-M复合物分散成混悬液，用移液枪吸取聚苯乙烯微孔中的10μL混悬液并即刻将吸取的混悬液打回聚苯乙烯微孔中，持续不断进行“吸取、打回”操作，使混悬液处于持续涡流流动状态，在混悬液处于持续涡流流动状态过程中，平行测量10次处于持续涡流流动状态的SA-M复合物的拉曼信号强度。
3.2.2混悬液处于静置状态下拉曼检测
取50μLPCT待测样本加入一只透明的聚苯乙烯微孔中，分别加入2μL Au-4MBA@Ag-Ab2和3μL Biotin-Ab1室温反应10min后，加入50μL SA-M，继续反应5min后，用磁铁的磁场作用将SA-M及SA-M复合物聚集在聚苯乙烯微孔的侧壁上，去除反应容器聚苯乙烯微孔中的液体，加入200μl PBS缓冲液洗涤，再去除PBS缓冲液，如是重复3次，最后移除磁铁，并向聚苯乙烯微孔中加50μL PBS缓冲液，使SA-M及SA-M复合物分散成混悬液，平行测量10次处于静置状态的混悬液的拉曼信号强度。
3.2.3反复聚集状态下拉曼检测
取50μLPCT待测样本加入一只透明的聚苯乙烯微孔中，分别加入2μL Au-4MBA@Ag-Ab2和3μL Biotin-Ab1室温反应10min后，加入50μL SA-M，继续反应5min后，用磁铁的磁场作用将SA-M及SA-M复合物聚集在聚苯乙烯微孔的侧壁上，去除反应容器聚苯乙烯微孔中的液体，加入200μl PBS缓冲液洗涤，再去除PBS缓冲液，如是重复3次，接着，移除磁铁，并向聚苯乙烯微孔中加50μL PBS缓冲液，使SA-M及SA-M复合物分散成混悬液，然后利用磁铁将SA-M及SA-M复合物聚集在聚苯乙烯微孔的底部检测区，测定第一次聚集的SA-M复合物的拉信号强度，第一次测定结束后，移除磁铁，用移液枪吹打聚苯乙烯微孔中的液体，使得SA-M及SA-M复合物在聚苯乙烯微孔中再次形成混悬液，然后再利用磁铁将SA-M及SA-M复合物聚集在聚苯乙烯微孔的底部检测区，测定第二次聚集的SA-M复合物的拉信号强度，如此重复10次，测量10次重复聚集的SA-M复合物的拉曼信号强度。
3.3不同条件下的拉曼检测结果
0.5、1ng/mL的降钙素原(PCT)和0.1ng/mL的白细胞介素6(IL-6)待测样本的SA-M复合物在不同分散状态下(持续流动状态下、静置状态下和反复聚集状态下)的拉曼信号强度检测结果如表1、表2和表3所示：
表1 0.5ng/mL PCT待测样本的SA-M复合物在不同分散状态下的拉曼信号强度
Figure BDA0002400039650000141
表2 1ng/mL PCT待测样本的SA-M复合物在不同分散状态下的拉曼信号强度
Figure BDA0002400039650000142
Figure BDA0002400039650000151
表3 0.1ng/mL IL-6待测样本的SA-M复合物在不同分散状态下的拉曼信号强度
Figure BDA0002400039650000152
从表1、表2和表3可以看出，在静置状态下和反复聚集状态下，待测物质降钙素原(PCT)和白细胞介素6(IL-6)的SA-M复合物测定的拉曼信号强度波动大，不能满足定量免疫检测的要求，而待测物质降钙素原(PCT)和白细胞介素6(IL-6)的SA-M复合物的混悬液在持续流动状态下，测定的拉曼信号强度波动最小，CV％均小于5％，表明SA-M复合物在持续流动状态下SERS测定的重复性和稳定性最强，从而能够准确测定待测物质的含量，满足定量免疫检测的要求。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种光谱分析方法，包括步骤：
(a)提供一待测样品，所述待测样品含有待检测的测试物；
(b)在一容器内，将所述待测样品与捕获颗粒和检测颗粒进行混合，从而形成含“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物的第一混合物；
其中，所述的捕获颗粒为负载有第一捕获剂的磁性颗粒；而所述的检测颗粒为负载有第二捕获剂且标记有信号分子的固相载体；
其中，所述的第一捕获剂和第二捕获剂均特异性针对所述测试物，并与所述测试物结合形成“第一捕获剂-测试物-第二捕获剂”的三元复合物；
(c)对所述“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物进行清洗后，将“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物分散成混悬液后，使混悬液处于持续运动状态下进行光谱信号的测定。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待检测的测试物选自下组：降钙素原、白细胞介素6，或其组合。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的检测颗粒为拉曼检测颗粒。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的运动包括流动。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的流动包括涡流。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的使混悬液处于持续运动状态包括以下步骤：
吸取容器中的适量混悬液后，将吸取的适量混悬液打回容器中，再吸取容器中的适量混悬液后，再将吸取的适量混悬液打回容器中，反复进行如上操作，使混悬液处于持续运动状态。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的捕获颗粒是具有式I结构的负载有捕获剂磁性颗粒：
Z1-Z2-Z3 (I)
式中，
Z1为磁性颗粒；
Z2为第一连接元件；和
Z3为第一捕获剂。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的检测颗粒是具有式II结构的微粒：
Y1-Y2-Y3-Y4-Y5 (II)
式中，
Y1为贵金属微粒；
Y2为拉曼信号分子；和
Y3为包裹涂层；
Y4为第二连接元件；
Y5为第二捕获剂。
9.一种光谱分析系统，其特征在于，所述系统包括：
(i)激发光发射源，所述的激发光发射源发射激发光，所述的激发光从一容器的底部的下方射入，所述的容器中含有持续运动的“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物；
(ii)光谱信号采集单元，所述的光谱信号采集单元用于采集所述“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物经照射后产生的光谱信号；
(iii)输出单元。
10.如权利要求9所述的光谱分析系统，其特征在于，所述的光谱分析系统还包括：
(iv)分散单元，所述的分散单元用于将所述容器中的所述“捕获颗粒-测试物-检测颗粒”的复合物进行持续运动。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN115219428A (zh) * 2022-08-15 2022-10-21 新疆师范大学 一种无干扰sers探针及其制备方法和应用

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