CN102735677A - 一种具有普适性的表面增强拉曼光谱定量分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有普适性的表面增强拉曼光谱定量分析方法，其主要内容包括：1)通过在SERS基底上标记适量的巯基化合物制备出具有准确定量功能的SERS基底；2)利用定量SERS基底对待测物质进行SERS分析检测，并建立新型SERS光谱定量分析模型，即乘子效应模型；3)采用独特的SERS定量分析新策略，即先将校正样本中SERS光谱信号的乘子效应估计出来，待测样本中SERS光谱信号的乘子效应则通过‘双校正’策略予以消除，从而实现对待测样本中待测物质浓度的准确预测。本发明很好地解决了复杂化学生物体系的SERS光谱准确定量分析问题。

Description

一种具有普适性的表面增强拉曼光谱定量分析方法

技术领域

本发明涉及化工、食品、环境、生物等行业的拉曼光谱仪器分析和检测领域，特别是一种具有普适性的表面增强拉曼光谱定量分析方法。

背景技术

拉曼光谱属于分子振动光谱，反映分子的特征结构，可以用于包括固体、液体、气体等的样品的分析和检测。然而拉曼散射效应是一个非常弱的过程(一般仅为入射光强的10^-10)，使其应用受到很大的局限。Fleischman等人于1974年首次获得吸附在粗糙的银电极表面上的单分子层吡啶分子的高质量拉曼光谱，从而发现了表面增强拉曼光谱效应。近三十多年来，利用了金或者银材料的纳米增强技术的表面增强拉曼光谱(Surface Enhanced Raman Spectroscopy,SERS)技术的发明将拉曼光谱检测灵敏度提高了百万倍，使传统的拉曼光谱技术具备了超高的灵敏度，因而其应用领域得到了一定的拓展。作为一种分析检测技术，SERS具有很多优点，例如：1)拉曼光谱的谱峰窄、具有高度的分子特征性；2)很少受光漂白的影响；3)检测灵敏度高。因此，尽管目前SERS增强机理的解释尚未达成完全共识，SERS技术在细胞、生物大分子的组成鉴定与结构表征、生物分子之间的相互作用、以及生物组织的体外和活体检测中已有诸多应用。SERS技术的核心就是拉曼增强基底。拉曼增强基底目前主要有表面粗糙的金、银、铜等少数金属电极、各类金属纳米粒子组成的溶胶、金属沉积岛膜等。其中，由金、银纳米粒子组成的溶胶型拉曼增强试剂因其制备相对较简单、增强效果好、以及适用于细胞内生物分子的检测等优点而广泛用于生物分析领域中SERS检测的基底。

但是SERS技术所存在的缺点如其优点一样突出。由于SERS信号的获得依赖于纳米级粗糙的金属基底(如纳米银或金胶体)，因此SERS光谱的绝对强度不但取决于待测物质的浓度，而且与SERS基底的物理性质(如：纳米银或金胶体的粒径大小、形状以及聚集度等)以及激光光源功率和聚焦位置有关。而作为SERS基底主要组成的银(金)纳米粒子的可重现性和稳定性均较差，严重影响SERS信号的可靠性和重现性，导致SERS定量分析结果的准确度远远达不到实际分析的要求。虽然已有一些将SERS技术用于定量分析的尝试，但目前SERS技术仅属于定性或半定量分析技术，尚未成为一项成熟的定量分析检测技术。SERS技术的这一缺陷大大削弱了其高检测灵敏度所带来的技术优势，从而严重限制了SERS技术的推广应用和相关仪器的市场开发。因此在现阶段，如何提高SERS定量分析结果的精确度及其成熟的应用技术，将成为SERS技术开发与应用的核心内容。

在文献中，目前主要采用以下三种途径来提高SERS定量分析结果的准确度：1)提高SERS基底的制作技术和工艺，尽量减小SERS基底之间的差异。国际上在提高SERS定量分析结果精确度的工作主要集中在这一方面。然而制作各项物理性质指标高度一致、且性质稳定的SERS基底(特别是银或金纳米溶胶)是一项十分艰巨的任务。目前尚没有一项制作技术能保证制备出的SERS基底物理性质完全一致。因此依靠制作完全一致的SERS基底来达到实现SERS准确定量分析的目的至少在目前是不太现实的。2)采用内标法结合微流控技术可在一定程度上消除SERS基底物理性质以及激光光源功率和聚焦位置的不同对SERS定量分析结果精确度的影响。采用内标法时，要求内标必须具有与待测样本中所有组分的SERS光谱峰均不重叠的峰，而且所测得的SERS光谱中不能有显著的背景干扰。显然，采用SERS技术对不同的体系进行定量分析时，需要采用不同的内标。对于复杂的体系(如：细胞内蛋白质的定量分析)来说，通常很难找到合适的内标。这在很大程度上限制了内标法的广泛应用。3)另外，采用多元数据分析方法如偏最小二乘回归法(Partial Least Squares，PLS)等取代传统的建立在峰高或峰面积基础上的单变量数据分析法，在一定程度上也能提高SERS定量分析结果的精确度。但是由于PLS等模型并没有明确地阐明SERS基底物理性质变化与待测物质SERS信号强度变化之间的定量关系，因而不能有效地消除SERS基底之间的差异对SERS定量分析结果的影响，所获得的定量结果通常也达不到实际分析的要求。

如上所述，现有用于提高SERS定量分析结果精确度的方法和途径有着各种局限性和不足，致使SERS技术很少用于复杂体系的准确定量分析。既然目前不太可能获得各项物理性质指标高度一致且性质稳定的SERS基底，那么为了实现应用SERS技术对复杂体系进行准确的定量分析，必须发展新型的方法来将待测物质浓度变化所引起SERS信号贡献与SERS基底物理性质变化所带来的SERS信号贡献分离开来，从而消除SERS基底物理性质变化对SERS定量分析结果的影响，实现复杂体系的SERS准确定量分析。迄今为止国内外尚未出现能有效解决这一问题的理论和方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提供一种具有普适性的表面增强拉曼光谱定量分析方法，将待测物质浓度变化所引起SERS信号贡献与SERS基底物理性质变化对样本SERS信号的乘子效应影响进行有效分离，以解决复杂化学生物体系的SERS光谱准确定量分析问题。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种具有普适性的表面增强拉曼光谱定量分析方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)在纳米粒子上标记适量的内标物质，得到具有准确定量功能的表面增强拉曼光谱基底，其中内标物质在纳米粒子上的覆盖率小于100％；

(2)采用上述定量表面增强拉曼光谱基底对校正样本集中待测物质进行表面增强拉曼光谱分析检测，获得所有校正样本集的表面增强拉曼光谱数据，并建立新型表面增强拉曼光谱定量分析模型，即乘子效应模型；

(3)利用校正样本集表面增强拉曼光谱数据X_cal和校正样本集中待测化学组分的浓度矢量c来估计校正样本集的表面增强拉曼光谱信号中由于表面增强拉曼光谱基底物理性质以及激光光源功率和聚焦位置的变化而导致的乘子效应矢量b；

(4)测得未知待测样本的表面增强拉曼光谱信号X_un，然后采用‘双校正’策略消除未知待测样本中表面增强拉曼光谱信号的乘子效应，并实现对未知

待测样本中待测物质浓度的准确预测。

(1)样本SERS光谱信号的新型分解模型

当使用银(金)纳米溶胶作为SERS基底对待测物质进行SERS定量分析时，银(金)纳米粒子的粒径大小、形状、以及聚集度等物理性质的变化均对待测物质的SERS信号强度有十分显著的影响(见图2)。另外，激光光源的功率和聚焦位置的变化也会显著地影响待测物质的SERS信号强度。而在使用SERS技术对待测物质进行定量分析时，很难(甚至是不可能)保证每次检测所用的SERS基底的物理性质和激光光源的聚焦位置完全一样。因此所获得的SERS光谱信号不但包含了待测物质浓度变化的SERS信号强度贡献，而且还包含有SERS基底物理性质和激光光源聚焦位置变化的SERS信号强度贡献：

I_k(v)=c_k·r_chem(v)·g_phys，k·g_instrum,k·I_0,k+d_k(v)            (1)

其中，I_k(v)代表第k个样本(或第k次测量)在拉曼位移v处的SERS信号强度；c_k代表第k个样本中待测物质的浓度；r_chem(v)代表第j个化学组分在单位浓度下的表面增强拉曼光谱信号强度，取决于待测物质分子在拉曼位移v处的散射性质；g_phys,k代表SERS基底物理性质变化对第k个样本SERS信号强度的乘子效应影响部分；g_instrum,k代表光谱仪器的整体响应特性以及激光光源聚焦位置对第k个样本SERS信号的乘子效应影响；I_o,k为第k次测量时入射激光强度；d_k(v)代表在拉曼位移v处的背景干扰以及SERS基底物理性质变化对第k个样本SERS信号的非乘子效应影响部分。式(1)中只有r_chem(v)在分析测量中保持相对不变，其他各项则随着SERS基底物理性质和激光光源聚焦位置和功率的变化而变化。当只有一个物质(即：待测物质)在SERS基底表面有增强效应、产生SERS信号时，显然无法将g_phys,k、g_instrum,k和I_0,k的变化对样本SERS信号总强度的贡献与待测物质浓度c_k的变化所带来的SERS信号强度贡献区分开来。这正是SERS技术难以用于准确定量分析的根本原因。目前，人们主要采用内标法来提高SERS定量分析结果的精确度。内标法的原理很简单：首先选择具有与待测物质SERS光谱峰不重叠的光谱峰的物质做内标，将其加入待测溶液或修饰在SERS基底上，然后将待测物质的SERS光谱峰的峰高(或峰面积)除以内标所独有光谱峰的峰高(或峰面积)来消除g_phys,k、g_instrum,k和I_0,k的变化对SERS定量分析结果的影响。显然，采用内标法对不同的待测物质进行SERS定量分析时，通常需选用不同的内标，以满足内标具有与待测物质SERS光谱峰不重叠的光谱峰这一严苛要求；此外，普通内标法的使用还要求样本SERS信号中不存在显著的背景干扰。在很多情况下，要找到一个合适的内标是一件很不容易的事。因此普通内标法难以作为一个普适性的SERS定量分析方法而加以推广。

(2)新型SERS光谱定量分析模型

设现有K个校正样本，这些校正样本中有J(J≥2)个化学组分能在SERS基底表面上产生SERS信号(任意假定校正样本中第1个组分是人工加入到样本中的内标组分；在所有样本中，该组分的浓度是已知的)；且SERS基底物理性质以及激光光源聚焦位置的变化对各个化学组分SERS信号的乘子效应基本相同，则第k个样本在拉曼位移v处的SERS光谱强度I_k(v)可分解为：

$I_k\left(v\right)=\{c_{k,1}\·r_{\mathrm{chem},1}\left(v\right)+\underset{j=2}{\overset{J}{\mathrm{\Σ}}}{c}_{k,j}\·r_{\mathrm{chem},j}\left(v\right)\}\·g_{\mathrm{phys}.k}\·g_{\mathrm{instrum},k}\·I_{o,k}+d_k\left(v\right)---\left(2\right)$

其中，c_k,j代表第k个样本中第j个化学组分的浓度；r_chem,j(v)代表第j个化学组分分子在拉曼位移v处的散射性质。设现已获得K个校正样本的SERS光谱。假定在所考察的相对较窄的拉曼位移范围内(ν₁～v_n)，g_phys,k和g_instrum,k均不随拉曼位移ν变化而变化，则第k个校正样本在拉曼位移ν₁～v_n范围内的拉曼光谱x_k=[I_k(v_l),...,I_k(v_n)]可表示为：

$x_k=b_k\·c_{k,1}\·r_{\mathrm{chem},1}+\underset{j=2}{\overset{J}{\mathrm{\Σ}}}{b}_k\·c_{k,j}\·r_{\mathrm{chem},j}+d_k;(k=\mathrm{1,2},...,K)---\left(3\right)$

其中，b_k=g_phys,k·g_instrum,k·I_0,k；r_chem,j=[r_chem,j(v₁),...,r_chem,j(v_n)]；d_k=[d_k(v₁),...,d_k(v_n)]，

由式(3)可知，由于SERS基底物理性质以及激光光源功率和聚焦位置的变化对样本SERS光谱信号产生乘子效应(b_k)，使得样本SERS光谱信号x_k与待测组分浓度C_k，j之间的关系不再服从简单的线性关系。这正是多元线性回归方法(如PLS)不能有效地消除SERS基底物理性质以及激光光源功率和聚焦位置的变化对SERS定量分析结果的影响的根本原因。另外，式(3)揭示：样本SERS光谱信号x_k与b_k·c_k，j成线性关系。因此要实现SERS准确定量分析，首先必须将SERS基底物理性质以及激光光源功率和聚焦位置变化对校正样本SERS光谱信号的乘子效应(b_k，k=1,2...,K)估计出来。

(3)SERS定量分析新策略

首先本发明对光程估计与纠正方法(Optical Path Length Estimation andCorrection，OPLEC)稍加推广，以解决SERS基底物理性质以及激光光源功率和聚焦位置变化对校正样本SERS信号的乘子效应(b_k，k=1,2...,K)的估计问题。其工作原理简述如下：

设X_cal=[x_l；...；x_k；...；x_K]为由K个校正样本SERS光谱数据构成的矩阵，其奇异值分解为X_cal=USV^T(上标“T”代表矩阵转置)；定义U_J为由U的前J列组成的矩阵；任意假定第1个化学组分和第j个化学组分分别为内标组分和待测组分，c₁=[c_l,l；...；c_k,l；...；c_K,l]和c_j=[c_l,j；...；c_k,j；...；C_K,j]分别为K个校正样本中内标组分和待测化学组分的浓度矢量；b=[b₁；...；b_k；...；b_K]为SERS基底物理性质以及激光光源功率和聚焦位置变化对K个校正样本SERS光谱信号的乘子效应矢量。则由式(3)可知，diag(b)c₁ ^[注1]和diag(b)c_j均属于U_J的列空间，满足式(4)和式(5)。

$U_J{U}_J^T\mathrm{diag}\left(b\right)c_1=\mathrm{diag}\left(b\right)c_1---\left(4\right)$

$U_J{U}_J^T\mathrm{diag}\left(b\right)c_j=\mathrm{diag}\left(b\right)c_j---\left(5\right)$

由于在SERS光谱校正过程中只需获得乘子矢量b中各元素的相对大小，而无需知道其绝对值，因此可以假定b中各元素均不小于1(即b≥1)。那么满足式(4)和式(5)且各元素均大于1的乘子矢量b可以通过求解如下约束最小化问题得到：

$\underset{b}{\min }\frac{1}{2}(\frac{1}{w_1^2}{\left|\right|U_J{U}_J^T\mathrm{diag}\left(c_1\right)b-\mathrm{diag}\left(c_1\right)b\left|\right|}_2^2+\frac{1}{w_j^2}{\left|\right|U_J{U}_J^T\mathrm{diag}\left(c_j\right)b-\mathrm{diag}\left(c_j\right)b\left|\right|}_2^2)---\left(6\right)$

s.t.b≥1

 其中，‖‖²代表l²范数，w₁，w_j为平衡式(6)中目标函数两部分的权重参数，可简单地将其值分别设置为浓度矢量c₁、c_j的最大元素之值，s.t.表示约束条件。上式等价于如下二次规划问题^[注2]：

$\underset{b}{\min }f\left(b\right)=\frac{1}{2}{b}^T(\mathrm{diag}(c_1/w_1)(I-U_s{U}_s^T)\mathrm{diag}(c_1/w_1)+\mathrm{diag}(c_j/w_j)(I-U_s{U}_s^T)\mathrm{diag}(c_j/w_j))b---\left(7\right)$

s.t.-b≤-1

获得K个校正样本的乘子效应矢量b后，待测样本SERS信号中的乘子效应可通过如下‘双校正’策略来消除。第一个校正模型是建立在X_cal与diag(b)c₁之间的线性模型：diag(b)c₁=α₁1+X_calβ_l；第二个校正模型是建立在X_cal与diag(b)c_j之间的线性模型：diag(b)c_j=α₂1+X_calβ₂。这两个校正模型中的参数α₁、β₁、α₂和β₂可用主成分回归(PCR)或偏最小二乘回归(PLS)等常用多元回归方法估计出来。获得未知待测样本的SERS光谱信号x_un后，则SERS基底物理性质以及激光光源功率和聚焦位置变化对未知待测样本SERS信号的乘子效应可以通过两个校正模型预测值的比值来消除，从而准确预测出未知待测样本中待测组分的浓度，即

其中c_un,1为未知待测样本中内标组分的浓度。

[注1]：diag(b)为对角矩阵，其对角元素为矢量b的相应元素。

[注2]：式(7)中的二次规划问题可用MATLAB中的quadprog函数来求解。

(4)定量SERS基底

上述SERS定量分析策略是建立在样本中含有一个浓度已知或固定的内标组分这一假设基础上。对于一般待测体系，可以通过向校正样本和待测样本中加入已知浓度的内标组分(要求该内标组分与待测物质的化学性质要尽可能相似，且最好为待测物质的同位素(氘)标记物)来满足这一前提条件(见图3(a))。但是，这一方法不太适合于某些比较复杂体系中的待测物质(如细胞内生物活性物质)的SERS定量分析。令人感兴趣的是，本发明提出的新型SERS光谱定量分析模型和SERS定量分析新策略表明：通过在SERS基底上标记适量的内标物质(如巯基化合物：对甲苯硫酚、HS-FAM等)制备具有准确定量功能的SERS基底(见图3(b))，可使本发明提出的SERS定量分析策略具有更广泛的适用性以及使用的简便性。值得特别指出的是：本发明提出的SERS定量分析新策略不要求标记在SERS基底上的内标具有与待测物质SERS光谱峰不重叠的SERS光谱峰。因此标记了某种内标的SERS基底可适用于很多物质的定量检测。(注：本发明仅以对甲苯硫酚标记在银纳米颗粒上来说明制备出具有准确定量功能的SERS基底的可行性)。

下面对本发明做进一步的解释和说明：

本发明从研究SERS基底的物理性质(如：纳米银或金溶胶的粒径大小、形状以及聚集度等)以及激光光源功率和聚焦位置对待测物质SERS信号的影响出发，提出新型SERS光谱定量分析模型，即SERS光谱乘子效应模型。其中乘子参数代表SERS基底的物理性质以及激光光源功率和聚焦位置的变化对样本SERS信号的乘子效应影响。

本发明利用光谱分析领域中使用的最基本的线性空间投影理论，巧妙的找到了用于求解校正样本集SERS光谱的乘子效应矢量的两个基本关系式，然后通过严格的数学推导，最终将校正样本SERS光谱信号的乘子效应矢量的求解转化为工程领域常用的二次规划问题来求解。

本发明采用SERS定量分析新策略(即：‘双校正’策略)来消除SERS基底的物理性质以及激光光源功率和聚焦位置的变化对待测样本SERS光谱产生的乘子效应。该策略的利用是建立在样本中含有一个浓度已知或固定的内标组分这一假设基础之上。对于一般待测体系，可以通过向校正样本和待测样本中加入浓度已知或固定的内标组分来满足这一要求。值得特别指出的是，该SERS定量分析新策略不要求内标具有与待测样本中所有组分的SERS光谱峰均不重叠的峰，并且该策略在一定的背景干扰下仍然有效。

本发明提出通过在SERS基底上标记适量的内标物质制备具有准确定量功能的SERS基底。由于本发明提出的SERS定量分析新策略不要求标记在SERS基底上的内标具有与待测物质SERS光谱峰不重叠的SERS光谱峰。因此标记了某种内标的SERS基底可适用于很多物质的定量检测，使得本发明提出的SERS定量分析技术方案具有更广泛的实用性以及使用的简便性。

由以上描述可知，本发明为一种能有效分离样本中待测组分浓度变化所引起的SERS光谱贡献与SERS基底物理性质变化对样本SERS信号的乘子效应影响的新方法，它克服了现有用于提高SERS定量分析精确度的方法的诸多不足(如：普通内标法要求内标必须具有与待测样本中所有组分的SERS光谱峰均不重叠的峰)。

与现有技术相比，本发明的优势如下：

1)本发明是建立在合理的、且已经验证的假设上，所有公式均是通过严格的数学推导获得的。因此本发明具有理论基础完善的特点。

2)本发明同普通内标法相比，不要求内标必须具有与待测样本中所有组分的SERS光谱峰均不重叠的峰，因此本发明设计的SERS定量基底(即：在SERS基底上标记适量的内标物质)能够适用很多物质的定量检测，极大的扩增了本发明的适用范围。

本发明所涉及的较高级的数学知识仅包括工程领域常用的二次规划问题、奇异值分解(SVD)和主成份回归(PCR)或偏最小二乘回归(PLSR)等多元回归方法。而这些方法的原理已十分成熟、计算过程比较简单。因此本发明又具有使用简单的优点，适合非专业人员使用。

附图说明

图1是本发明所述具有普适性的表面增强拉曼光谱定量分析方法的流程图；

图2是Lee-Meisel方法所合成的银纳米颗粒的透射电镜图(见图2(a))以及在该银纳米溶胶基底上进行三次测量所得的同一罗丹明6G(浓度：5×10^-7mol/L)水溶液样本的SERS光谱(见图2(b))；

图3是通过加入内标组分的定量分析检测方式示意图(见图3(a))以及利用定量SERS基底的定量分析检测方式示意图(见图3(b))，其中

代表待测物质，

代表内标组分，

代表巯基化合物；

图4是纯罗丹明6G和纯丁基罗丹明B在银溶胶基底上的SERS光谱(见图4(a))以及所有水溶液混合样本的SERS光谱(见图4(b))；

图5是当以丁基罗丹明B为内标组分时本发明采用的SERS定量分析新策略对校正样本集SERS信号的乘子效应参数的估计图示(见图5(a))以及采用PLS回归方法估计得到的双校正模型参数β₁、β₂图示(见图5(b))；

图6是当以丁基罗丹明B为内标组分时本发明同PLS方法对罗丹明6G浓度的预测效果图示，图6(a)是PLS方法对罗丹明6G浓度的预测效果图示，预测均方误差(RMSEP)为1.6×10^-7mol/L，平均相对预测误差(ARPE)为35.3％，决定系数(R)为0.906；图6(b)是本发明对罗丹明6G浓度的预测效果图示，预测均方误差(RMSEP)为3.8×10^-8mol/L，平均相对预测误差(ARPE)为9.0％，决定系数(R)为0.994；

图7是标记有对甲苯硫酚的银纳米粒子溶胶的SERS光谱(见图7(a))以及采用该定量SERS基底对罗丹明6G(浓度：8×10^-8mol/L)的水溶液样本进行其中三次测量得到的SERS光谱(见图7(b))；

图8是当以标记对甲苯硫酚的银纳米粒子溶胶为定量SERS基底时本发明采用的SERS定量分析新策略对校正样本集SERS信号的乘子效应参数的估计图示；

图9是当以标记对甲苯硫酚的银纳米粒子溶胶为定量SERS基底时采用PLS回归方法估计得到的校正模型I的回归参数β₁图示(见图9(a))以及校正模型II的回归参数β₂图示(见图9(b))；

图10是当以标记对甲苯硫酚的银纳米粒子溶胶为定量SERS基底时本发明同PLS方法对罗丹明6G浓度的预测效果图示，图10(a)是PLS方法对罗丹明6G浓度的预测效果图示，预测均方误差(RMSEP)为1.2×10^-7mol/L，平均相对预测误差(ARPE)为39.4％，决定系数(R)为0.919；图10(b)是本发明对罗丹明6G浓度的预测效果图示，预测均方误差(RMSEP)为4.0×10^-8mol/L，平均相对预测误差(ARPE)为13.7％，决定系数(R)为0.994。

具体实施方式

实施例1：以丁基罗丹明B为内标组分实现对水溶液中罗丹明6G浓度的SERS光谱定量分析

本实施例以向校正样本和待测样本中加入浓度已知的丁基罗丹明B作为内标组分的方式(见图3(a))来实现对水溶液中罗丹明6G浓度的SERS光谱准确定量分析，以验证本发明提出的新型SERS光谱定量分析模型以及SERS定量分析新策略的有效性。

试剂与仪器：硝酸银、柠檬酸钠、氯化钾从上海国药集团化学试剂有限公司购得，罗丹明6G、丁基罗丹明B从阿拉丁试剂(上海)有限公司购买。实验中用的所有试剂均为分析纯，所有水溶液都是用艾科浦Aquapro超低有机型超纯水机ACD-2001-U提供的去离子水(18.25MΩ·cm)配置。拉曼光谱仪为法国HORIBA Jobin Yvon公司的Labram-010激光共聚焦拉曼光谱仪。该系统集成了Olympus BX40显微镜，配有放大倍率为10、50倍的两种物镜；陷波滤光片(notchfilter)滤掉瑞利散射；1800g/mm全息光栅，光谱的分辨率设置为1cm^-1，检测器为空气冷却型1024×256像素的电荷耦合装置(CCD)。共轭孔和狭缝分别设置为1000μm和100μm；激发光波长为632.8nm，功率为17mW，加率光片D0.3。曝光时间设置为5秒，累积3次。实验采用10倍物镜对毛细管聚焦，50倍长焦物镜进行检测。银纳米颗粒的透射电子显微镜(TEM)图在300KV的加速电压下用带Digitalgraph软件的JEM-3010型号的电子显微镜仪(JEOL，日本)上获得。

本实验的主要步骤如下：

1)参考Lee-Meisel方法制备出银溶胶：在剧烈搅拌下，将250mL含45mg硝酸银的溶液加热至沸腾，然后快速加入1％的柠檬酸钠5ml，保持微沸腾状态持续反应一个小时，然后自然冷却，将制得的银溶胶在4℃避光保存。取上述新合成的银溶胶滴加到镀有碳支持膜的铜网上并在红外灯下烘干，用透射电子显微镜(TEM)表征所合成银纳米颗粒的粒径大小、形状。另外，在该银溶胶基底上进行三次测量同一罗丹明6G(浓度：5×10^-7mol/L)水溶液样本的SERS光谱，用以考察银溶胶中银纳米颗粒的不均一性对待测物质的SERS光谱信号强度的影响。

2)制备浓度为1×10^-5mol/L的罗丹明6G与丁基罗丹明B的标准溶液。校正样与待测样本的配置由1.5ml银溶胶、一定体积的罗丹明6G与丁基罗丹明B的标准溶液、适量的水以及100ul浓度为0.5mol/L的KCl溶液混合成最终体积为2ml的水溶液样本。所配置的9个样本中罗丹明6G的最终浓度依次为：1×10^-7、2×10^-7、3×10^-7、4×10^-7、5×10^-7、6×10^-7、7×10^-7、8×10^-7、9×10^-7mol/L；丁基罗丹明B的最终浓度依次为：2×10^-7、2×10^-7、6×10^-7、6×10^-7、6×10^-7、6×10^-7、10×10^-7、10×10^-7、10×10^-7mol/L。

3)每个样本配制好后大约2分钟在Labram-010激光共聚焦拉曼光谱仪采集200～2000cm^-1范围内的SERS光谱，每个样本平行测量6次，所有样本累计共54(9×6)条光谱。

4)在进行数据分析之前，将所有采集的SERS光谱向M=[1；λ；λ²]的行矢量所张成的空间的正交补空间做投影预处理，扣除可能存在的荧光背景干扰；接着将经投影预处理后的SERS光谱数据划分为5个校正集样本、4个测试集样本，并选取1061cm^-1～1680cm^-1光谱区间作为分析区间。然后采用本发明对罗丹明6G的浓度进行定量分析。其中，在采用PLS回归方法估计双校正模型参数时，对所有采集的SERS光谱作均值中心化处理，使得校正模型参数α₁，α₂的值为0。此外，为了考察本发明在消除SERS基底物理性质变化对SERS定量分析结果的影响的能力，将本发明的定量分结果同PLS方法比较。

图2显示的是Lee-Meisel方法所合成的银纳米颗粒的透射电镜图(见图2(a))以及在该银纳米溶胶基底上进行三次测量所得的同一罗丹明6G水溶液样本的SERS光谱(见图2(b))。由图2(a)中可以看出所合成的银纳米颗粒存在球状、棒状和米粒状，且尺寸大小不一，因此该银溶胶的单分散性非常差；图2(b)比较了在该银纳米溶胶基底上进行三次测量所得的同一罗丹明6G(浓度：5×10^-7mol/L)水溶液样本的SERS光谱，从图可以看出即使罗丹明6G的浓度一样，但由于银溶胶中银纳米颗粒及其聚集体的不均一性导致三次测量的SERS光谱强度存在明显的差异。

图4显示的是纯罗丹明6G和纯丁基罗丹明B在银溶胶基底上的SERS光谱(见图4(a))以及所有水溶液混合样本的SERS光谱(见图4(b))。由于罗丹明6G和丁基罗丹明B同属于罗丹明系列染料，且分子结构非常相似，故二者在银溶胶基底上的SERS光谱重叠非常严重，普通内标法无法应用该种情况。因此需借助本发明提出的SERS定量分析新策略来对罗丹明6G浓度进行定量分析。

图5显示的是本发明采用的SERS定量分析新策略对校正样本集SERS信号的乘子效应参数的估计情况(见图5(a))以及采用PLS回归方法估计得到的双校正模型参数β₁、β₂(见图5(b))。由图5(a)可知，乘子效应参数在1～2.28范围内变化，这充分说明了SERS基底物理性质以及激光光源功率和聚焦位置变化对校正样本SERS光谱信号的乘子效应非常明显，故未知待测样本中的乘子效应必须借助模型II和模型I的预测值的比值予以消除。

图6显示的是本发明同PLS方法对罗丹明6G浓度的预测效果。图6(a)是PLS方法对罗丹明6G浓度的预测效果图示，预测均方误差(RMSEP)为1.6×10^-7mol/L，平均相对预测误差(ARPE)为35.3％，决定系数(R)为0.906；图6(b)是本发明对罗丹明6G浓度的预测效果图示，预测均方误差(RMSEP)为3.8×10^-8mol/L，平均相对预测误差(ARPE)为9.0％，决定系数(R)为0.994。比较二者可知，由于PLS方法不能区分待测物质浓度变化所引起的SERS信号贡献与SERS基底物理性质变化所带来的SERS信号贡献，因而对罗丹明6G浓度的定量分析结果不能令人满意；本发明能够有效地将待测物质浓度变化引起SERS信号贡献与SERS基底物理性质变化对样本SERS信号的乘子效应影响分离开，因此本发明的定量分析结果要远远优于PLS方法。

实施例2：以标记适量对甲苯硫酚的纳米银溶胶为SERS定量基底实现对水溶液中罗丹明6G浓度的定量检测

本实施例以标记对甲苯硫酚的纳米银溶胶为定量SERS基底的方式(见图3(b))实现对水溶液中罗丹明6G浓度的SERS光谱定量检测，以进一步说明结合定量SERS基底，本发明提出的新型SERS光谱定量分析模型以及SERS定量分析新策略的具有更广泛的实用性以及使用的简便性。

试剂与仪器：对甲苯硫酚从阿拉丁试剂(上海)有限公司购得，其余试剂与仪器参数设置同实施例1。

本实验的主要步骤如下：

1)SERS定量基底的合成：取26ml银溶胶加入650ul浓度为1×10^-4mol/L对甲苯硫酚溶液(充分混合后对甲苯硫酚浓度约为2.4×10^-6mol/L)。然后在200～2000cm^-1范围内采集标记有适量的对甲苯硫酚的纳米银溶胶的SERS光谱，并结合纯罗丹明6G在银溶胶的SERS光谱确定后续数据分析区间为1000cm^-1～1751cm^-1。

2)校正样与待测样本的配置由1.8ml标记有适量的对甲苯硫酚的上述纳米银溶胶、一定体积的浓度为1×10^-5mol/L的罗丹明6G标准溶液、适量的水以及20ul浓度为0.5mol/L的KCl溶液混合成最终体积为2ml的水溶液样本。

所配置的11个水溶液混合样本中罗丹明6G的最终浓度依次为：5×10^-8、8×10^-8、1×10^-7、2×10^-7、3×10^-7、4×10^-7、5×10^-7、6×10^-7、7×10^-7、8×10^-7、9×10^-7mol/L。

3)每个样本配制好后大约2分钟在Labram-010激光共聚焦拉曼光谱仪采集200～2000cm^-1范围内的SERS光谱，每个样本平行测量6次，所有样本累计共66(11×6)条光谱。

4)在进行数据分析之前，将所有采集的每条SERS光谱进行标准正态变换(SNV)预处理；接着将经SNV预处理后的SERS光谱数据划分为6个校正集样本、5个测试集样本，并选取1000cm^-1~1751cm^-1光谱区间作为分析区间。然后采用本发明对水溶液混合样本中罗丹明6G的浓度进行定量分析。其中，双校正模型参数的估计采用PLS回归方法；并对所有采集的SERS光谱作均值中心化处理，使得校正模型参数α₁，α₂的值为0。此外，为了考察本发明的在消除SERS基底物理性质变化对SERS定量分析结果的影响的能力，将本发明的定量分结果同PLS方法比较。

图7显示的是标记适量对甲苯硫酚的银纳米粒子溶胶的SERS光谱(见图7(a))以及采用该定量SERS基底对罗丹明6G(浓度：8×10^-8mol/L)的水溶液样本进行其中三次测量得到的SERS光谱(见图7(b))。从图7(b)可以看出三次测量得到的SERS光谱信号强度存在明显的差异以及它们之间的所有SERS光谱峰(含对甲苯硫酚和罗丹明6G的SERS光谱峰)的信号强度变化呈现近似一致的比例关系，说明了以标记适量对甲苯硫酚的银纳米粒子溶胶作为SERS定量基底的可行性。

图8显示的是本发明采用的SERS定量分析新策略对校正样本集SERS信号的乘子效应参数的估计情况。由图8可知，乘子效应参数在1～2.95范围内变化，并且乘子效应参数的估计值随着1#～36#校正样本中待测组分浓度的逐渐增大而呈现递减趋势，这说明了待测组分的浓度变化可能会导致标记有对甲苯硫酚的银纳米粒子的聚集程度不一样，从而对校正样本SERS光谱信号产生不同程度的乘子效应，此外激光光源功率和聚焦位置变化对校正样本SERS光谱信号的乘子效应也有一定的影响。

图9显示的采用PLS回归方法估计得到的校正模型I的回归参数β₁(见图9(a))以及校正模型II的回归参数β₂(见图9(b))。获得未知待测样本的SERS光谱信号后，利用模型I和模型II求得其相应的预测值；未知待测样本中待测组分的浓度则通过模型II和模型I的预测值的比值获得。

图10显示的是本发明同PLS方法对罗丹明6G浓度的预测效果。图10(a)是PLS方法对罗丹明6G浓度的预测效果图示，预测均方误差(RMSEP)为1.2×10^-7mol/L，平均相对预测误差(ARPE)为39.4％，决定系数(R)为0.919；图10(b)是本发明对罗丹明6G浓度的预测效果图示，预测均方误差(RMSEP)为4.0×10^-8mol/L，平均相对预测误差(ARPE)为13.7％，决定系数(R)为0.994。由此可以得知，当采取以标记对甲苯硫酚的银纳米粒子溶胶为定量SERS基底对水溶液中的罗丹明6G的浓度进行定量检测的方式，本发明对罗丹明6G浓度的预测结果同样非常令人满意的结果，且远远优于PLS方法。

Claims (5)

1.一种具有普适性的表面增强拉曼光谱定量分析方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)在纳米粒子上标记适量的内标物质，得到具有准确定量功能的表面增强拉曼光谱基底，其中内标物质在纳米粒子上的覆盖率小于100%；

(2)采用上述定量表面增强拉曼光谱基底对校正样本集中待测物质进行表面增强拉曼光谱分析检测，获得所有校正样本集的表面增强拉曼光谱数据，并建立新型表面增强拉曼光谱定量分析模型，即乘子效应模型；

(3)利用校正样本集表面增强拉曼光谱数据X_cal和校正样本集中待测化学组分的浓度矢量c来估计校正样本集的表面增强拉曼光谱信号中由于表面增强拉曼光谱基底物理性质以及激光光源功率和聚焦位置的变化而导致的乘子效应矢量b；

(4)测得未知待测样本的表面增强拉曼光谱信号x_un，然后采用‘双校正’策略消除未知待测样本中表面增强拉曼光谱信号的乘子效应，并实现对未知待测样本中待测物质浓度的准确预测。

2.根据权利要求1所述的具有普适性的表面增强拉曼光谱定量分析方法，其特征在于，所述步骤（1）中，纳米粒子为银或者金纳米粒子；内标物质为对甲苯硫酚。

3.根据权利要求1所述的具有普适性的表面增强拉曼光谱定量分析方法，其特征在于，所述步骤（2）中，乘子效应模型为：

$x_k=b_k\·c_{k,1}\·r_{\mathrm{chem},1}+\underset{j=2}{\overset{J}{\mathrm{\Σ}}}{b}_k\·c_{k,j}\·r_{\mathrm{chem},j}+d_k,(k=\mathrm{1,2},...,K),$

其中：x_k代表第k个样本的表面增强拉曼光谱；c_k,1代表第k个样本中内标组分的浓度；c_k,j代表第k个样本中第j个化学组分的浓度；r_chem,j代表第j个化学组分在单位浓度下的表面增强拉曼光谱信号强度，取决于第j个化学组分分子的散射性质；b_k代表表面增强拉曼光谱基底物理性质、光谱仪器的整体响应特性以及激光光源功率和聚焦位置的变化对第k个样本表面增强拉曼光谱信号强度的乘子效应影响部分；d_k代表背景干扰以及表面增强拉曼光谱基底物理性质变化对第k个样本表面增强拉曼光谱信号的非乘子效应影响部分。

4.根据权利要求1所述的具有普适性的表面增强拉曼光谱定量分析方法，其特征在于，所述步骤（3）中，估计乘子效应矢量b的过程如下：

1)对校正样本集的表面增强拉曼光谱数据X_cal进行奇异值分解即：

X_cal=USV^T，其中U、S、V为对X_cal进行奇异值分解后得到的三个矩阵，上标‘T’代表矩阵转置操作；定义U_J为由U的前J列组成的矩阵，其中J为校正样本中能够在表面增强拉曼光谱基底表面上产生表面增强拉曼光谱信号的化学组分数；

2)校正样本中表面增强拉曼光谱信号的乘子效应矢量b通过求解如下二次规划问题获得：

$\underset{b}{\min }f\left(b\right)=\frac{1}{2}{b}^T(\mathrm{diag}(c_1/w_1)(I-U_s{U}_s^T)\mathrm{diag}(c_1/w_1)+\mathrm{diag}(c_j/w_j)(I-U_s{U}_s^T)\mathrm{diag}(c_j/w_j))b$

s.t.-b≤-1

其中w₁，w_j为平衡上式两部分的权重参数，c₁=[c_1,1;...;c_k,1;...;c_K,1]为内标组分在校正样本中的浓度矢量,c_j=[c_1,j;...;c_k,j;...;c_K,j]为目标化学组分在校正样本中的浓度矢量，s.t.表示约束条件。

5.根据权利要求1所述的具有普适性的表面增强拉曼光谱定量分析方法，其特征在于，所述步骤（4）中，采用‘双校正’策略消除未知待测样本中表面增强拉曼光谱信号的乘子效应的步骤如下：

1)在校正样本集的表面增强拉曼光谱数据X_cal与diag(b)c₁、以及X_cal与diag(b)c_j之间建立双校正模型，即：模型I：diag(b)c₁=α₁1+X_calβ₁；模型II：diag(b)c_j=α₂1+X_calβ₂；其中，diag(b)为一对角矩阵，其对角元素为矢量b的相应元素；α₁，β₁，α₂，β₂为校正模型参数；

2)测得未知待测样本的表面增强拉曼光谱数据x_un，通过模型II和模型I的预测值的比值乘以未知待测样本中内标化学组分的浓度C_un,1求出未知待测样本中待测化学组分的浓度：即

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