CN106979942A - 一种对固相合成化合物组合库个体定量的拉曼光谱分析方法及其用途 - Google Patents
一种对固相合成化合物组合库个体定量的拉曼光谱分析方法及其用途 Download PDFInfo
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- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/65—Raman scattering
- G01N21/658—Raman scattering enhancement Raman, e.g. surface plasmons
Abstract
本发明公开了一种对固相合成化合物组合库的个体定量的拉曼光谱分析方法及其用途，所述方法使用在2000‑2500cm‑1波数内具有强拉曼信号的分子作为拉曼信号源，此类分子的信号不受其他官能团的影响，有效解决了其它拉曼信号带来的影响。该拉曼信号分子与目标化合物的连接反应效率高，所述分析方法中，得到的目标化合物的固相合成产率与相对拉曼信号强度成正比；此外，通过对组合库中大量单个固相载体的表征，可以得到组合库的化合物产率分布图，其定量数据包括产率的最大峰值和均一性(分布宽度)等指标。所述分析方法可用于对固相合成产物官能团的定量分析、对固相合成组合库中化合物个体的产率分析，以及对固相合成化合物组合库的产率分布分析与质量监测。
Description
技术领域
本发明属于化合物组合库的个体定量分析方法技术领域，具体涉及一种对固相合成化合物组合库个体定量的拉曼光谱分析方法及其用途。
背景技术
固相合成法，通常是指连接在固相载体(如树脂等)上的活性官能团与溶解在有机溶剂中的试剂之间的反应。此方法通常使用过量的液相反应物，反应完毕后可通过快速抽滤、洗涤完成产物的纯化，避免了液相合成中重结晶或色谱分离等步骤，可防止产物在分离纯化时的大量损失。固相合成法通过如上步骤的反复多次运用，广泛用于化合物组合库的合成，尤其是多肽的合成。
然而，随着反应步骤的增加，组合库不断增大，固相载体上化合物的产率(负载)不能被准确了解。对个体载体上的产率进行定量对于组合库合成的质量监控有着重要的影响。
通常固相合成中对反应的监控，使用颜色反应法，或洗脱后用薄层层析(TLC)板监测。但是，颜色反应或洗脱后TLC板监测通常检测的是反应物的消失，不能检测产物的出现。为了对产物进行定量分析，传统的定量方法是收集足够多的固相载体，然后进行滴定检测，通常方法为：以树脂珠上的固相合成为例，从树脂珠上裂解下来足够的产物化合物以供准确滴定使用。此方法需要消耗大量的树脂珠，且无法检测单个树脂珠。
现有的单珠检测技术有红外光谱法、高效液相色谱-质谱联用和荧光共聚焦光谱法。红外光谱法是一种吸收光谱，通常观察某个官能团特征峰的出现或消失，用来定量具有一定难度。高效液相色谱-质谱联用需要预先将反应物洗脱，此方法可以检测产物的分子量，但是不能准确定量树脂珠上产物的产率。荧光共聚焦光谱虽然比较灵敏，但是荧光的强度由于各种因素的影响稳定性不强，无法提供精确的定量检测结果。
拉曼光谱是一种成熟的非损伤性化学物质检测方法。此方法快速，准确，样品制备方法简单。由于它研究的是化合物分子经光照后产生的散射，此散射光反映的是化合物官能团的振动频率和转动频率。当测量的条件(比如样品制备、光学设置、聚焦位置等)不变时，拉曼信号非常稳定，并且检测的过程并不破环样品；但由于拉曼信号通常较弱，检测的灵敏度较低限制了其进一步的应用。
发明内容
发明人研究发现，尽管拉曼信号通常较弱，但是选择具有炔基、氰基等官能团的化合物作为信号分子，运用其较强的振动散射可获得较强的拉曼信号；同时共聚焦光谱运用高功率的激光聚焦于极小的体积，使得拉曼信号大幅度增强，因此微量的样品即可完成检测。
基于上述分析，本发明可以解决现有单珠检测技术的不足，为化合物组合库的固相合成提供了单个固相载体上化合物定量监测的解决方案，采用的方法为一种对固相合成化合物组合库的个体定量的拉曼光谱分析方法。所述拉曼光谱分析方法简单可行，定量准确，时间快速，价格适中，并且可以实现自动化高通量检测。其用途包括对固相合成产物官能团的定量分析、对固相合成组合库中化合物个体的产率分析，以及对固相合成化合物组合库的产率分布分析与质量监测。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
一种对固相合成化合物组合库个体定量的拉曼光谱分析方法，所述方法包括如下步骤：
1)合成与选择拉曼信号分子；
2)将拉曼信号分子与待测化合物组合库的固相个体载体进行化学连接；
3)通过拉曼光谱仪，检测步骤2)得到的化合物组合库的固相个体载体上的拉曼信号。
根据本发明，所述的拉曼信号分子选自在2000-2500cm-1波数内具有强拉曼信号的分子；优选为双芳香环取代的二炔、单芳香环取代的二炔、单芳香环取代的单炔、氰基取代的芳香化合物、二炔的取代化合物中的一种或多种。
根据本发明，所述的化合物组合库选自多肽组合库。优选地，所述多肽为氨基酸多肽或类多肽。
根据本发明，所述的化合物的组合库以树脂珠为固相载体，以氨基酸为原料，用混合-裂分的组合方法，采用酰胺缩合反应制备得到。
根据本发明，所述树脂珠选自自身有强拉曼信号的聚合物树脂，所述聚合物树脂在500-2000cm-1波数具有强拉曼信号。
根据本发明，优选的聚合物树脂在800-1500cm-1波数具有强拉曼信号。更优选地，所述聚合物树脂选自聚苯乙烯树脂，还更优选地，所述聚苯乙烯树脂珠选自末端带有氨基的TentalGel树脂和末端带有氨基的Rink Amide树脂。
本发明中，所述的TentaGel树脂和Rink Amide树脂在1002cm-1波数具有强拉曼信号。
本发明中，所述多肽的拉曼信号在500-2000cm-1范围很复杂，但是在波数范围介于2000-2500cm-1之间时没有干扰信号，只有上述的拉曼信号分子的官能团有较强的拉曼散射峰，所以本发明通过大量的实验确定以2000-2500cm-1为被测拉曼信号区间，此时干扰少，测量精准。
根据本发明，在步骤2)中，所述化学连接为拉曼信号分子与待测的多肽化合物进行连接反应；优选地，所述连接反应为耦合反应；还优选地，所述耦合反应为酰胺缩合反应，更优选地，所述化学连接是拉曼信号分子中的羧基与所述化合物中的氨基发生化学键合反应形成酰胺键连接。
根据本发明，所述聚苯乙烯树脂上的末端氨基通过与氨基酸中羧基的酰胺缩合，制备得到所述多肽的组合物库。
根据本发明，所述缩合反应依次将氨基酸偶联到所述聚合物树脂珠上形成肽链。
根据本发明，所述氨基酸选自能与所述树脂珠发生酰胺缩合反应的任一种氨基酸，例如丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、蛋氨酸(Met)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)中的一种或多种。
本发明中，所述的混合-裂分组合方法是一种基于树脂珠上化合物合成的方法，指的是：一定数量的载体被分成相等的若干部分，然后各部分独自与不同的起始单体原料(如氨基酸)反应；反应后，树脂的各部分又重新合并、混匀，再被分成若干部分，进一步重复上述系列反应。
根据本发明，在步骤3)中，所述拉曼检测仪为现有技术已知的任一种拉曼检测仪，其中优选地，所述拉曼检测仪具有共聚焦功能。
本发明中，因为拉曼信号的绝对强度受每一次具体测量环境(参数如测量温度，激光强度，聚焦位置，树脂珠聚合物的溶胀度等)的影响，重复性不好。但是在同一次测量中，每一个树脂珠载体上待测化合物的拉曼信号与树脂珠聚合物载体本身的拉曼信号之比是确定的，因此所述聚合物树脂珠载体本身的拉曼信号可作为内标，测量两者的相对比值可避免测量环境波动所造成的干扰。
根据本发明，所述拉曼光谱分析方法还包括如下步骤：
4)通过拉曼检测仪，分析拉曼信号分子的信号强度与聚合物树脂珠载体的拉曼信号强度的比值，定量分析所述待测化合物的基团浓度。
本发明中，由于所述组合库的每一个树脂珠载体上待测化合物的拉曼信号相比于树脂珠聚合物载体的拉曼信号是确定的。因此，在同一次测量的图谱中，通过计算可以得出拉曼信号分子的信号强度与聚合物树脂珠载体的拉曼信号强度的比值；此比值与树脂珠载体上被测化合物的基团含量成线性关系，从而可以利用这个比值定量分析所述固相合成化合物组合库中个体载体上产物的浓度及产率。
综上所述，本发明提供了一种对固相合成化合物组合库的检测方法，其特征在于，所述方法包括使用前述的拉曼光谱分析方法。
本发明还提供上述对固相合成化合物组合库中化合物的拉曼光谱分析方法的用途，其特征在于，所述用途包括对固相合成产物官能团的定量分析检测。
根据本发明，所述官能团为氨基，还可以为羟基、羧基、巯基等其它官能团。
本发明还提供一种对固相合成组合库中化合物的产率分析方法，其特征在于，所述方法包括使用前述的拉曼光谱分析方法。
优选地，分析单个树脂珠和平面阵列、微阵列上某个化合物的定量产率。
本发明还提供一种对固相合成化合物组合库的产率分布分析方法，其特征在于，所述方法包括使用前述的拉曼光谱分析方法。
该产率分布分析方法可以用于对固相合成化合物组合库(树脂、平面阵列和微阵列等)进行自动化高通量的质量监测，为后续高通量的药物筛选提供合格的组合库。
本发明的有益效果：
1.本发明提供了一种对固相合成化合物组合库的个体定量的拉曼光谱分析方法及其用途，所述方法使用在2000-2500cm-1波数内具有强拉曼信号的分子作为拉曼信号源，同时此类分子的信号不受其他官能团的影响，位于拉曼安静区域，故而有效解决了其它拉曼信号带来的影响。
2.本发明方法中的拉曼信号分子与目标化合物(组合物库中的个体化合物)的连接反应效率高，可达95％以上；所述分析方法中，得到的目标化合物的固相合成产率与相对拉曼信号强度成正比；此外，通过对组合库中大量单个固相载体的表征，可以得到组合库的化合物产率分布图，其定量数据包括产率的最大峰值和均一性(分布宽度)等指标。
3.本发明的拉曼光谱分析方法与现有技术相比，具有如下优点：
1)由于拉曼散射的信号和荧光信号相比非常微弱(约为荧光信号的10-6)，而且峰比较杂乱，但本发明通过选用在2000-2500cm-1波数内具有强拉曼信号官能团的分子；此类分子的信号强并且信号位于拉曼安静区域，有效解决了其它拉曼散射带来的影响。据此挑选出具有特征峰的拉曼信号分子，信号峰能够避免其他基团杂峰的干扰，得到准确可靠的数据。
2)拉曼光谱用于定量与许多其它的光谱技术不同，它是单光束零背景测量，因此受测量环境的影响，聚焦位置不同，照射激光强度不同，树脂珠的大小不同等外部测量环境会导致拉曼信号的绝对强度不能重复。而本发明鉴于大多数树脂材料中都含有聚苯乙烯，聚苯乙烯在1002cm-1波数处有一个非常强的特征峰；在图谱中，选择树脂中的聚苯乙烯作为内标，只要测量拉曼信号分子的信号与聚苯乙烯信号的比值，就可以避免外部测量环境的干扰。
3)由于键合反应的效率需要很高，必须验证固相反应的拉曼信号分子上羧基与不同氨基酸上氨基固相缩合反应的效率达到测量要求。经过测试发现，本发明所述的拉曼光谱分析方法优选适用范围为测量脂肪伯胺和环状二级脂肪胺，例如脂肪伯胺上的氨基即使有很大的空间位阻(如2-氨基异丁酸)，对测量的影响也很小。
4)经过实验表明，本发明的方法中拉曼分子的信号强度与树脂珠上的氨基浓度具有良好的线性关系。例如在TentaGel树脂上，即使化合物负载只有树脂起始负载的2％，拉曼分子的信号仍然可被准确检测到。
附图说明
图1为实施例1所述化合物的拉曼光谱。
图2为实施例2中将带有羧基的拉曼信号分子，通过酰胺缩合反应，键合到带有氨基的TentaGel树脂珠上后，聚焦在树脂珠中心得到的拉曼光谱。
图3为实施例3中聚焦树脂珠的不同z轴位置、不同x、y位置的显微镜明场成像。
图4为实施例5中带有氨基的TentaGel树脂珠上键合丙氨酸后再键合拉曼信号分子的信号与基团浓度线性关系图。
图5为实施例5中带有氨基的Rink Amide树脂珠上键合丙氨酸后再键合拉曼信号分子的信号与基团浓度线性关系图。
图6为实施例6中基于100个随机树脂珠计算所得的多个合成多肽(有确定氨基酸序列)的百分比负载(产率)的柱状分布图及其比较。
图7为实施例7中基于100个随机树脂珠计算所得的合成多肽组合库的百分比负载(产率)的柱状分布图。
图8为实施例8中多肽化合物库的产率分布及肽链解码。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的保护范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落入本发明的保护范围。
实施例1.拉曼信号分子的选取
将4种具有代表性的拉曼信号分子4-(苯二炔基)苯甲酸甲酯，4-(乙炔基)苯甲酸，4-氰基苯甲酸和2-丁炔酸，溶解在N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)中形成0.1mol/L的溶液，取10微升溶液放到玻璃底的培养皿中。本测试中由于4-(苯二炔基)苯甲酸不溶于DMF，用可溶于DMF的4-(苯二炔基)苯甲酸甲酯代替4-(苯二炔基)苯甲酸说明其拉曼信号的强度。将拉曼光谱仪的激光聚焦在距离玻璃底面上方10微米的地方。每一个样品平行测量5次，每次测量时间2秒。
图1给出了实施例1所述化合物的拉曼光谱图。可以看出，4个化合物对应的拉曼信号强度为：4-(苯二炔基)苯甲酸甲酯(～2232cm-1)>4-(乙炔基)苯甲酸(～2115cm-1)>4-氰基苯甲酸(～2244cm-1)>2-丁炔酸(峰值很小，可忽略)。其分别对应的拉曼信号官能团为二芳香取代二炔基(Ar-C≡C-C≡C-Ar)、乙炔基芳香化合物(Ar-C≡C-H)、芳香腈类化合物(Ar-C≡N)和脂肪族取代的单炔类化合物(Ar-C≡C-COOH)。由此说明，在2000-2500cm-1波数内，二芳香取代二炔化合物的信号峰(～2232cm-1)最强，其强度顺序是二芳香取代二炔>芳香取代单炔化合物>芳香氰基>脂肪族取代的单炔。
从上述分析结果可知，4-(苯二炔基)苯甲酸作为拉曼信号分子是理想的选择。同时4-(苯二炔基)苯甲酸合成的步骤也较简单，原料价格较经济。
实施例2.拉曼信号分子与待测树脂珠的键合及测量
将100毫克市售的末端为氨基的TentaGel树脂(130微米，0.29mmol/g)，浸泡在DMF中4个小时，将3倍当量的4-(苯二炔基)苯甲酸，3倍当量的1-羟基苯并三唑(HOBt)，3.3倍当量的N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)溶解于DMF中，形成0.2mol/L的羧酸活化物溶液，摇荡5分钟后加入到树脂中进行反应，再摇荡2个小时。用茚三酮测试检验，当成阴性时，表示反应已经完全，将反应液过滤除去，树脂分别用DMF洗3次，甲醇洗3次，DMF洗3次。将得到的树脂悬浮在DMF中，取10微升的树脂悬浮液于玻璃底的培养皿中。将拉曼光谱仪的激光聚焦在树脂珠的中心。每一个样品平行测量5次，每次测量时间2秒。
将其它的拉曼信号分子4-(乙炔基)苯甲酸、4-氰基苯甲酸和2-丁炔酸用同样的步骤键合到树脂上即得到含有相对应的拉曼信号分子的树脂。用上述的同样方法进行拉曼光谱测定。
图2给出了实施例2制备所得带有拉曼信号分子的树脂珠的拉曼光谱。从中可知，在树脂上，4-(苯二炔基)苯甲酰胺的信号比4-(乙炔基)苯甲酰胺、4-氰基苯甲酰胺和2-丁炔酰胺明显更强。拉曼信号分子的拉曼信号越强，在被测氨基浓度较低的时候会使定量更加精确，因此4-(苯二炔基)苯甲酸作为拉曼信号分子是较理想的选择。
实施例3.验证本发明方法的稳定性和可靠性
为了验证本发明所述检测方法的可靠性和可重复性，从上述实施例2得到的树脂珠中随机挑选5个，进行以下实验：
a.将激光聚焦在每一个树脂珠的水平平面中心，在z轴上从低到高选取5个不同位置(如图3a)。
图3a为在每一个树脂珠的水平平面中心，在z轴上从低到高选取5个不同位置的明场图像。
表1给出拉曼分子的信号强度2232cm-1和树脂苯乙烯的信号强度1002cm-1的比值。
表1.在z方向上5个不同聚焦位置上测得的相对拉曼强度
由上表可知，聚焦在树脂珠x、y平面上的不同区域测得的拉曼信号强度是一致的。
b.将激光聚焦在每一个树脂珠的z轴中心，在水平平面上选取9个不同位置(如图3b)。
图3b为在每一个树脂珠的z轴中心，在水平平面上从低到高选取9个不同位置的明场图像。
表2为拉曼分子的信号强度2232cm-1和树脂苯乙烯的信号强度1002cm-1的比值。
表2.在x、y平面上9个不同聚焦位置上测得的相对拉曼强度
由上表可知，聚焦在树脂珠x、y平面上的不同位置测得的拉曼信号强度是一致的。结合表1的结果可知，测量位置对信号的影响很小，可以忽略不计。
从上述结果可以看出，在采用了内标-树脂珠本身的聚苯乙烯特征拉曼峰(1002cm-1)后，测量得到的相对拉曼强度比值在不同的测量位置重现性较好，这表明树脂珠的键合非常均匀，拉曼信号分子均匀分布在树脂珠的不同部位，测量时聚焦在树脂珠的不同部位，得到的测量结果稳定性和可靠性都很好。
实施例4.不同氨基酸和拉曼信号分子键合的产率比较
由于键合反应的效率需要很高，必须验证拉曼信号分子上的羧基与不同氨基酸的氨基固相缩合反应的效率是否达到测量要求。为验证此发明对不同种类氨基酸氨基的适用范围，选取11种被9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸，连接到TentaGel树脂上，将氨基酸脱保护后，用本发明方法进行测量。
表3给出了拉曼信号分子与不同氨基酸键合反应的效率。
表3.连接在TentaGel树脂珠上的不同氨基酸被拉曼信号分子标记后测得的相对拉曼信号强度(与树脂珠氨基直接被标记后对比)
其中，3-Abz:3-氨基苯甲酸；Aib:α-氨基异丁酸；Ala:丙氨酸；Cys(Mbzl):S-(4-甲基苄基)-半胱胺酸；Gln:谷氨酰胺；Leu:亮氨酸；Lys(Ac):Nε-乙酰基-赖氨酸；Ac-Lys:Nα-乙酰基-赖氨酸；Pro:脯氨酸；Tyr(t-Bu):O-t-丁基-酪氨酸；Val:缬氨酸。
以实施例3中的带氨基的TentaGel树脂为基准对照(键合效率100％)，拉曼信号分子的键合效率对Gln、Leu、Val最好(99％)，Ala、Pro、Lys(Nα-氨基和Nε-氨基)比较好(>95％)，Aib由于位阻的原因略微偏低(～94％)，而对3-Abz的效率不高(原因为芳香胺的活性较低)。Cys(Mbzl)和Tyr(t-Bu)的键和效率略微超过100％，额外的信号可能源于起始原料的不纯或反应过程中少量的巯基与羟基的脱保护作用，羧基与其发生了副反应。
这些结果表明，本发明所述的拉曼光谱分析方法适用的测量范围为脂肪伯胺和环状脂肪仲胺，脂肪族的伯胺和环状脂肪仲胺可以得到高产率的拉曼信号分子键合。但是，由于芳香胺的反应活性问题，与酰胺缩合不能完全进行，故而此方法对芳香胺的检测效果较差。由此推广，针对其它固相合成产物的官能团特点(如羟基、羧基、巯基等)，可以相应设计拉曼信号分子上的对应基团，与这些官能团发生高效率的键和反应，以满足本发明中测试方法的需要。
实施例5.拉曼信号与氨基负载的线性关系
为了验证本发明方法可对不同负载的氨基定量，不同比例(摩尔比0:100，2:98，5:95，10:90，20:80，50:50，75:25，100:0)的9-芴甲氧羰基丙氨酸(Fmoc-Ala)和叔丁氧羰基丙氨酸(Boc-Ala)混合后与TentaGel树脂的氨基键合，以此来控制氨基的负载浓度。脱去9-芴甲氧羰基保护后，用前述方法进行测量，得到8个样品的图谱。
图4为树脂珠上丙氨酸键合拉曼信号分子后的定量检测。图4a给出了不同丙氨酸负载下的拉曼光谱，树脂珠_TentaGel是带氨基的TentaGel树脂直接键合拉曼信号分子的谱图，为100％氨基负载的基准参比。图4b为相对拉曼强度与氨基负载的线性曲线。图4c为原始拉曼强度与氨基负载的线性曲线。以相对拉曼强度为纵坐标，氨基的百分比负载为横坐标，数据点为5次平行测量的平均值(含标准偏差)。说明相对拉曼强度比原始拉曼强队对氨基的百分比负载具有更好的线性关系。
本方法也适用于其他含有聚苯乙烯的树脂珠，比如在Rink Amide上重复上述的实验，也可得到良好的线性关系(图5)。
实施例6.树脂珠多肽合成的产率及产率分布
在TentaGel树脂上合成5肽(Tag-QPFSP-TentaGel)、8肽(Tag-RPWQPFSP-TentaGel)、11肽(Tag-WPYRPWQPFSP-TentaGel)、15肽(Tag-PAPTWPYRPWQPFSP-TentaGel)与20肽(Tag-QPFSPPAPTWPYRPWQPFSP-TentaGel)。分别随机抽取100个树脂珠，用本发明方法进行测量。
图6给出了基于100个树脂珠测试所得的合成多肽百分比负载柱状分布图。如图所示，从产率分布图中可以看出，随着肽链的增长，产率逐步下降，分别为85％(5肽)、82％(8肽)、27％(11肽)、19％(15肽)、17％(20肽)。但是，产率的降低幅度与肽链的增长程度并不成正比。在加上第9至第11个氨基酸时，产率明显下降最大。这说明，这3个氨基酸中的一个或多个在树脂珠上的键合效率并不理想，肽链生成的产率远小于90％。
根据此项结果，本发明方法可以准确了解化合物库中每一个树脂珠的产率差异，并且分析分步反应中某一步或某几步的反应效率，用以监测反应的进程和最终的产率分布。
实施例7.树脂珠多肽组合库的合成产率及产率分布
对于多肽化合物组合库，由于每一个树脂珠上氨基酸的起始原料不同，其多肽化合物的产率可能存在差异。为了评价多肽组合库的合成质量，本发明方法可用于测定多肽化合物库在不同树脂珠上的产率分布。
图7给出了基于100个随机树脂珠计算所得的合成肽链化合物库百分比负载的柱状分布图。此化合物库为一个10肽的组合库(Tag-X10X9X8X7X6X5X4X3X2X1-TentaGel)，合成方法为裂分-组合的树脂珠合成技术，用作合成的氨基酸为19个天然氨基酸(不包括半胱氨酸)。
由图可知，将产率分布的最高值(最大负载)和分布宽度作为两个标准参数，最大负载越接近100％说明此多肽组合库的合成效率较高，分布宽度越小说明不同树脂珠上产率的差异越小，产物的均一性越好。此发明方法用于多肽或其他固相合成化合物组合库，能有效了解化合物组合库的合成质量，协助排除药物筛选中由于组合库中某个化合物产率过高而造成的假阳性结果，或者协助保留由于组合库中某个化合物产率过低而造成的假阴性个体。
实施例8.多肽组合库的产率分布及肽链解码
对于化合物的组合库，在了解其固相合成产率分布后，可以对高产率多肽和低产率多肽的氨基酸序列进行解码。具体实施方法为：在组合库每一个树脂珠末端氨基上连接Nα-Boc-Nε-Fmoc赖氨酸；Fmoc脱保护后，可将拉曼信号分子连接到赖氨酸的ε-氨基上，用本发明方法进行拉曼光谱测定；而赖氨酸的α-氨基脱保护后，可用Edman降解法进行解码。
图8给出了基于100个随机树脂珠计算所得的合成肽链组合库百分比负载的柱状分布图，以及经拉曼光谱测定后挑选出高产率和低产率的树脂珠用Edman降解法解码所得的氨基酸序列。此化合物库为一个8肽的组合库H2N-K(-Tag)-X7X6X5X4X3X2X1-TentaGel。合成方法为裂分-组合的树脂珠合成技术，用作合成的氨基酸为19个天然氨基酸(不包括半胱氨酸)。
对高产率和低产率的多肽进行氨基酸解码，可以有效了解多肽固相合成中特定氨基酸序列的产率规律。此方法也适用于其它固相合成化合物组合库的解码与分析。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种对固相合成化合物组合库个体定量的拉曼光谱分析方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)合成与选择拉曼信号分子；
2)将拉曼信号分子与待测化合物组合库的固相个体载体进行化学连接；
3)通过拉曼光谱仪，检测步骤2)得到的化合物组合库的固相个体载体上的拉曼信号。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的拉曼信号分子选自在2000-2500cm-1波数内具有强拉曼信号的分子；优选为双芳香环取代的二炔、单芳香环取代的二炔、单芳香环取代的单炔、氰基取代的芳香化合物、二炔的取代化合物中的一种或多种；
优选地，所述的化合物组合库选自多肽组合库；
优选地，所述多肽为氨基酸多肽或类多肽；
优选地，所述的化合物的组合库以树脂珠为固相载体，以氨基酸为原料，用混合-裂分的组合方法，采用酰胺缩合反应制备得到。
3.根据权利要求1或2所述的分析方法，其特征在于，所述树脂珠选自自身有强拉曼信号的聚合物树脂，所述聚合物树脂在500-2000cm-1波数具有强拉曼信号；
优选地，所述聚合物树脂在800-1500cm-1波数具有强拉曼信号；
优选地，所述聚合物树脂选自聚苯乙烯树脂；
优选地，所述聚苯乙烯树脂珠选自末端带有氨基的TentalGel树脂和末端带有氨基的Rink Amide树脂。
4.根据权利要求1-3所述的分析方法，其特征在于，在步骤2)中，所述化学连接为拉曼信号分子与待测的多肽化合物进行连接反应；
优选地，所述连接反应为耦合反应；
优选地，所述耦合反应为酰胺缩合反应；
优选地，所述化学连接是拉曼信号分子中的羧基与所述化合物中的氨基发生化学键合反应形成酰胺键连接；
优选地，所述聚苯乙烯树脂上的末端氨基通过与氨基酸中羧基的酰胺缩合，制备得到所述多肽的组合物库；
优选地，所述缩合反应依次将氨基酸偶联到所述聚合物树脂珠上形成肽链。
5.根据权利要求1-4所述的分析方法，其特征在于，在步骤3)中，所述拉曼检测仪选自具有共聚焦功能的。
6.根据权利要求1-5所述的分析方法，其特征在于，所述拉曼光谱分析方法还包括如下步骤：
4)通过拉曼检测仪，分析拉曼信号分子的信号强度与聚合物树脂珠载体的拉曼信号强度的比值，定量分析所述待测化合物的基团浓度。
7.一种对固相合成化合物组合库的检测方法，其特征在于，所述方法包括权利要求1-6所述的拉曼光谱分析方法。
8.权利要求1-6所述的对固相合成化合物组合库中化合物的拉曼光谱分析方法的用途，其特征在于，所述用途包括对固相合成产物官能团的定量分析检测；
优选地，所述官能团为氨基、羟基、羧基、巯基。
9.一种对固相合成组合库中化合物的产率分析方法，其特征在于，所述方法包括权利要求1-6所述的拉曼光谱分析方法；
优选地，所述产率分析方法能够分析单个树脂珠和平面阵列、微阵列上某个化合物的定量产率。
10.一种对固相合成化合物组合库的产率分布分析方法，其用于对固相合成化合物组合库(如树脂、平面阵列和微阵列等)进行自动化高通量的质量监测，为后续高通量的药物筛选提供合格的组合库。
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