CN104155287A - 一种环境水体样本中镉离子含量的定量分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种环境水体样本中镉离子含量的定量分析方法，其主要过程如下：1)通过在SERS基底上修饰适量的比率型探针三聚硫氰酸制备出具有螯合镉离子功能的SERS基底；2)利用此SERS基底获取含镉离子的标准样本和待测环境水体样本的SERS光谱；3)利用比率型探针SERS光谱定量分析理论在标准样本的镉离子浓度与其SERS光谱之间建立校正模型；4)利用所建立的校正模型从待测环境水体样本的SERS光谱中准确预测出镉离子的浓度。本发明是一种无需使用内标物的比率型探针SERS光谱准确定量分析技术，为环境和食品领域提供了一简单、灵敏且具有低成本效益的镉离子检测方法。

Description

一种环境水体样本中镉离子含量的定量分析方法

技术领域

本发明涉及一种环境水体样本中镉离子含量的定量分析方法。

背景技术

镉(Cd)是一种毒性很强的重金属。镉会对呼吸道产生刺激，长期暴露会造成嗅觉丧失症、牙龈黄斑或渐成黄圈，镉化合物不易被肠道吸收，但可经呼吸被体内吸收，积存于肝或肾脏造成危害，尤以对肾脏损害最为明显。还可导致骨质疏松和软化、增强肿瘤的生长[1-6]。镉不是人体的必需元素。人体内的镉是出生后从环境中吸取的，主要通过食物、水和空气而进入体内积蓄下来，并且镉的排除速度很慢，人肾皮质镉的生物学半衰期是10～30年。因而，被镉污染的食物、水和空气对人体危害很严重。目前镉的主要污染源是电镀、采矿、冶炼、染料、电池和化学工业等排放的废水，所以镉离子对水的污染在世界普遍存在[7,8]。有毒物质和疾病登记机构和美国环境保护署将镉列为前20名危险物质中的第7位[9]。美国环境保护署限制排入湖、河、弃置场和农田的镉量并禁止杀虫剂中含有镉。美国环境保护署允许饮用水含有10ppb的镉，并打算把限制减到5ppb。美国食品和药物管理局规定食用色素的含镉量为不得多于15ppm。美国职业安全卫生署规定工作环境空气中镉含量在烟雾为100微克/立方米，在镉尘为200微克/立方米。美国职业安全卫生署计划将空气中所有镉化合物含量限制在1～5微克/立方米，希望让工人尽量少呼吸到镉以防止肺癌[9,10]。欧盟也将镉列为高危害有毒物质和可致癌物质并予以规管。

综上所述，基于镉离子对人体的种种危害，分析研究工作者已经开发了一系列的检测镉离子的分析方法，包括电热原子吸收光谱[11]、原子荧光光谱法[12]、比率型镉离子荧光探针[13]和电感耦合等离子体质谱法[14]。虽然这些方法可以基本上实现环境样品中镉离子含量的定量分析，但是当镉离子浓度非常低，或者待测环境和生物样品的基质比较复杂时，就需要对样品进行分离和富集等较繁杂的前处[15,16]。这些前处理过程通常比较费时、费力、成本高，并且对环境还会造成污染，不适用于环境水体样本中镉离子含量的日常快速原位分析。因此目前仍然迫切需要发展简单、灵敏且具有低成本效益的镉离子检测方法。

由于其出色的分子特征性、很少受光漂白的影响以及极高的灵敏度，表面增强拉曼光谱(SERS)被分析家们认为是一种潜在的可用于复杂基质中微量成分定量分析的光谱分析技术[17]。目前，SERS技术已经被逐渐应用于生物医学和环境分析等领域[18-20]。虽然SERS技术具有上述独特优点，但其实际应用仍然受到诸多限制。由于SERS光谱信号强度在很大程度上依赖于增强基底的物理性质(如：纳米金或银胶体的粒径大小、形状以及聚集度等)，而目前仍然难以制备出物理性质高度稳定和高重复的SERS增强基底，所以现阶段SERS技术仅属于定性或半定量分析技术。采用内标法在一定程度上可以消除SERS基底物理性质以及激光光源功率和聚焦位置的不同对SERS信号强度的影响[21-24]。但采用内标法时，要求内标物质必须有一个或多个与待测样本中所有组分的SERS光谱峰不重叠的SERS峰；而且待测样本中不能有其他具有SERS光谱活性的共存化合物和荧光背景的干扰。显然，对不同的目标组分进行定量分析时，需要采用不同的内标。对于一些复杂基质样本中待测物质的SERS定量分析(如细胞内蛋白质的SERS定量分析)来说，通常很难找到合适的内标。这在很大程度上限制了内标法的广泛应用。

近年来，一些工作者提出了用于表面增强拉曼光谱的乘子效应模型(MultiplicativeEffects Model for Surface-Enhanced Raman Spectroscopy,MEMSERS)[25，26]，该模型能有效的消除SERS基底物理性质的变化对SERS定量分析结果的影响。不同于传统内标法，MEMSERS模型不需要内标具有与待测物质中所有组分的SERS光谱峰均不重叠的SERS光谱峰，而且不受其他共存SERS活性物质和荧光背景的干扰。MEMSERS成功的弥补了传统内标法上述的不足，能够实现复杂样本中待测物质的准确SERS光谱定量分析。然而，MEMSERS模型的内标检测模式仍然需要使用内标物，这使得SERS定量检测过程仍然比较复杂。

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发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对上述现有技术的不足，提供一种环境水体样本中镉离子含量的定量分析方法。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种环境水体样本中镉离子含量的定量分析方法，包括以下步骤：

1)在金纳米颗粒上标记适量的比率型探针三聚硫氰酸，制备出具有螯合镉离子功能的SERS基底；

2)采用上述SERS基底，在二极管激光器所发出的785nm激光的激发下，获取含镉离子的标准样本的SERS光谱；

3)在标准样本的SERS光谱数据X和标准样本中镉离子的浓度矢量c之间建立校正模型；

4)获取实际待测环境水体样本的SERS光谱x_test，采用上述校正模型预测出实际环境水体样本中镉离子的浓度。

所述步骤1)中，金纳米颗粒粒径为13nm。

所述步骤2)中，含镉离子的标准样本为采用超纯水配置的镉离子标准液，且所述镉离子标准液的浓度梯度为0.000、0.010、0.062、0.083、0.100、0.120、0.170、0.190、0.210；SERS光谱扫描范围为317～1477cm^-1。

所述步骤3)中，校正模型的建立过程如下：

1)确定所述标准样本的SERS光谱与所述标准样本中镉离子浓度之间的关系：

$x_i=b_i\×({\left[\mathrm{TMT}\right]}_i\·r_{\mathrm{TMT}}+{[\mathrm{TMT}-{\mathrm{Cd}}^{2+}]}_i\·r_{\mathrm{TMT}-{\mathrm{Cd}}^2})+d_i,i=\mathrm{1,2},\·\·\·,N;$

其中，x_i代表第i个标准样本的SERS光谱；[TMT]_i和[TMT-Cd²⁺]_i分别代表第i个标准样本中游离三聚硫氰酸的浓度以及三聚硫氰酸与镉离子结合产物TMT-Cd的浓度；r_TMT和分别代表三聚硫氰酸和TMT-Cd的分子散射特性；b_i代表由于所述SERS基底物理性质以及激光光源的功率、聚焦位置的变化对第i个标准样本的SERS光谱信号强度产生的乘子效应；d_i代表由于背景干扰和SERS基底的物理性质变化对第i个标准样本SERS光谱信号产生的非乘子效应；N为标准样本的数量；

2)根据上述标准样本的SERS光谱与所述标准样本中镉离子浓度之间的关系估算所有标准样本的乘子效应矢量b＝[b₁；…；b_N]，建立以下两个校正模型：b_i＝α₁+x_iβ₁；利用多元线性校正方法估计参数α₁、β₁、α₂、和β₂；其中，为第i个标准样本中总的镉离子浓度。

所述步骤4)中，实际环境水体样本中镉离子的浓度计算公式如下：

$c_{\mathrm{test},{\mathrm{Cd}}^{2+}}=({\mathrm{\α}}_2+x_{\mathrm{test}}{\mathrm{\β}}_2)/({\mathrm{\α}}_1+x_{\mathrm{test}}{\mathrm{\β}}_1).$

以下对本发明做出进一步说明。

本发明从研究比率型探针的SERS光谱信号强度的变化出发，将实验室发展的新型SERS光谱定量分析模型(即：SERS光谱乘子效应模型，MEM_SERS)进行推广，提出比率型SERS光谱定量分析模型。

本发明建立的比率型SERS光谱定量分析模型将增强基底的物理性质变化对样本SERS光谱信号产生的乘子效应与由于背景干扰和增强基底的物理性质变化对样本SERS光谱信号产生的非乘子效应进行了分离。

本发明利用OPLEC_m来估计出除目标分析物含量变化以外的其他因素(如金纳米颗粒的大小、形状以及聚集度、仪器部件的光学性质、激光光源的功率和聚焦位置等)变化对样本的SERS信号产生的乘子效应。

本发明采用‘双校正模型’策略来消除SERS基底的物理性质以及激光光源功率和聚焦位置的变化对待测样本SERS光谱产生的乘子效应。本发明除了需要校正样本SERS光谱和校正样本中待测组分(Cd²⁺)浓度的信息外，没有其他苛刻的要求。

本发明利用TMT可以通过其巯基和杂环氮原子与纳米金颗粒结合将TMT固定在金纳米颗粒上。TMT中对称的两个巯基和中间的杂环氮原子可以与纳米金颗粒形成三齿配位的相互作用形式；剩下的一个巯基和两个杂环上的氮原子可用于与镉离子进行螯合(图2)。TMT的SERS峰强度随着镉离子的加入而发生形变(图3)。利用比率型探针TMT结合上述比率型探针SERS光谱定量分析模型，就可以在无需内标物的情况下，实现镉离子的准确定量分析。因此，本发明提出的比率型SERS定量分析技术在环境和食品样本中镉离子含量的快速检测方面具有广泛的应用前景。

由以上描述可知，本发明为一种能有效分离样本中待测组分浓度变化所引起的SERS光谱贡献与SERS基底物理性质变化对样本SERS信号的乘子效应影响的新型技术方法，它克服了现有用于提高SERS定量分析精确度的方法的诸多不足且无需添加任何内标物。

与现有技术相比，本发明所具有的有益效果为：本发明是建立在合理的、且已经验证的假设基础上，所有公式均是通过严格的数学推导获得的，因此本发明具有理论基础完善的优点；本发明无需添加任何内标物，即完全消除了传统内标法的不足，因此本发明具有操作简单、且应用范围广的优势；本发明所涉及的较高级的数学知识仅包括PLS多元线性回归方法，而该方法的原理已经十分成熟、计算过程比较简单，因此本发明具有使用简单的优点，适合非专业人员使用；本发明对镉离子的检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别为2.9和8.7nM，完全满足对实际样本的最低监测量要求。

附图说明

图1为本发明方法流程图；

图2为本发明使用SERS探针三聚硫氰酸检测镉离子的示意图；

图3为本发明AuNP-TMT和AuNP-TMT-Cd²⁺的SERS光谱图；

图4为本发明用超纯水配制的镉离子校正样本在拉曼位移972与875cm^-1处SERS信号强度比值与样本中镉离子浓度的关系图；

图5为本发明用OPLECm估计出的镉离子校正样本SERS光谱的乘子效应参数b_i；

表1为本发明和PLS方法对超纯水配制的镉离子测试样本中镉离子含量的分析结果；

表2为本发明对不同环境水体样本中镉离子浓度的预测结果。

具体实施方式

如图1所示，本发明方法包括以下步骤：

(1)在粒径约为13nm的金纳米颗粒上标记适量的比率型探针三聚硫氰酸制备出具有螯合镉离子功能的SERS基底；

(2)采用上述SERS基底，在二极管激光器所发出的785nm激光的激发下，获取N个超纯水配置的含不同浓度镉离子的标准样本(校正样本)的SERS光谱；三聚硫氰酸与样本中镉离子的结合会使得三聚硫氰酸的SERS光谱会发生形状的变化；

(3)将校正样本的SERS光谱数据按如下比率型探针SERS光谱定量分析模型进行分解：

$x_i=b_i\×({\left[\mathrm{TMT}\right]}_i\·r_{\mathrm{TMT}}+{[\mathrm{TMT}-{\mathrm{Cd}}^{2+}]}_i\·r_{\mathrm{TMT}-{\mathrm{Cd}}^2})+d_i;(i=\mathrm{1,2},\·\·\·,N)$

其中，x_i代表第i个校正样本的SERS光谱；[TMT]_i和[TMT-Cd²⁺]_i分别代表第i个校正样本游离TMT的浓度和TMT与镉离子结合产物TMT-Cd的浓度；r_TMT和分别代表TMT和TMT-Cd的分子散射特性；乘子参数b_i代表由于SERS基底物理性质以及激光光源的功率和聚焦位置的变化而非待测物质浓度变化对第i个校正样本的SERS光谱信号强度产生的乘子效应；d_i代表由于背景干扰和SERS增强基底的物理性质变化对第i个校正样本SERS光谱信号产生的非乘子效应。由于游离TMT的浓度加上TMT-Cd的浓度等于TMT的总浓度(c_TMT)，而TMT的总浓度c_TMT在样本中是固定的，并且相对于第i个校正样本中总的镉离子浓度而言，TMT是过量的。因此，可以认为[TMT-Cd²⁺]_i与大致相等的，因而上式可改写为：

$x_i=b_i\×(c_{\mathrm{TMT}}\·r_{\mathrm{TMT}}+c_{{i,\mathrm{Cd}}^{2+}}\·\mathrm{\Δr})+d_i,\mathrm{\Δr}=r_{{\mathrm{TMT}-\mathrm{Cd}}^{2+}}-r_{\mathrm{TMT}}$

(4)上述比率型探针SERS光谱定量分析模型中N个校正样本的乘子效应参数b_i(i＝1,2,…,N)是未知的，且各不相同的。b_i(i＝1,2,…,N)可用陈增萍及其合作者发明的Modified Optical Path-Length Estimation and Correction，OPLEC_m方法(“用于复杂非均匀混合物的光谱定量分析方法”，中国专利号：ZL201110280639.6)估算出来；

(5)获得b_i(i＝1,2,…,N)后，分别在x_i和b_i(b_i＝α₁+x_iβ₁)之间，以及x_i和 之间用多元线性校正方法(如：Partial Least Squares，PLS)建立两个校正模型；

(6)上述两个校正模型的模型参数α₁、β₁、α₂、和β₂可用通过PLS估计出来；获得待测环境水体样本SERS光谱x_test后，其中镉离子的含量可按式 $c_{\mathrm{test},{\mathrm{Cd}}^{2+}}=({\mathrm{\α}}_2+x_{\mathrm{tes}}{\mathrm{\β}}_2)/({\mathrm{\α}}_1+x_{\mathrm{test}}{\mathrm{\β}}_1)$ 预测出来。

实施例：基于比率型探针的表面增强拉曼光谱定量分析技术对环境水样中镉离子的检测。

本实施例采用三聚硫氰酸(TMT)作为镉离子的比率型探针，且以此建立比率型SERS光谱定量分析模型，来实现对环境水样中镉离子浓度的SERS光谱准确定量分析。

试剂：三聚硫氰酸(TMT，分析标准品，95％)购自阿拉丁试剂有限公司，氯金酸(HAuCl₄4H₂O，分析纯)购于上海国药集团化学试剂有限公司，柠檬酸三钠(C₆H₅Na₃O₇·2H₂O，分析纯)购于天津市风船化学试剂有限公司。实验所用超纯水(18.2MΩcm^-1)是由中国重庆艾科浦的超纯水仪生产的。

本实验的主要步骤如下：

1)采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法制备粒径大约13nm的纳米金溶胶。其简要过程如下：在三口烧瓶中加入50mL 0.01％(m/V)HAuCl₄，快速搅拌并加热至沸腾，然后迅速的加入2mL 1％(m/V)柠檬酸三钠溶液，当溶液变为酒红色后，保持微沸状态持续反应30min，然后移去热源，在继续搅拌下冷却至室温，即得到所需纳米金溶胶；

2)比率型SERS基底的制备：将40μL TMT(340μM)加入到2mL纳米金溶胶中，充分混匀；

3)用超纯水配制了9个浓度梯度的镉离子标准溶液(0.000、0.010、0.062、0.083、0.100、0.120、0.170、0.190、0.210μM)。为了模拟真实环境中被镉离子污染的水体样本，分别用自来水、湘江水(中国，长沙)和土壤水(4.8g土壤加入50mL超纯水后，超声30min，离心去上清液即得土壤水)配制了三个浓度梯度(0.062,0.100and0.170μM)的镉离子溶液样本；

4)将10μL镉离子标准溶液或镉离子溶液样本与50μL TMT-AuNPs和2.5μL 2M的氯化钾充分混匀，然后用点样毛细管吸取样品，进行SERS光谱测定；每个样本平行测量6次。SERS光谱测定所用拉曼光谱仪为英国雷尼绍(Renishaw)公司生产的Invia-Reflex激光共聚焦倒置显微拉曼光谱仪。该拉曼光谱仪配有空气冷却型1024×256像素的电荷耦合装置(CCD)的检测器、德国徕卡(Leica)显微镜、二极管激光器(785nm，300mW)和50倍短焦物镜。SERS光谱扫描范围为317～1477cm^-1，曝光时间为7s，累计次数为4次；

5)根据TMT和TMT-Cd的SERS光谱峰的位置，选择380～1252cm^-1作为数据分析区域，采用比率型SERS光谱定量分析模型进行定量分析：首先使用OPLEC_m方法估算出校正样本SERS光谱的乘子效应参数，然后采用‘双校正模型’策略预待测样本中镉离子的含量；

6)采用预测均方根误差 $(\mathrm{RMSEP}=\sqrt{\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}{(c_{{i,\mathrm{Cd}}^{2+}}-{\hat{c}}_{{i,\mathrm{Cd}}^{2+}})}^2/N},$ 其中，和分别代表了第i个预测样本中镉离子的真实含量和预测结果)和平均相对预测误差 $(\mathrm{ARPE}=\frac{1}{N}\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}|(c_{{i,\mathrm{Cd}}^{2+}}-{\hat{c}}_{{\mathrm{Cd}}^{2+}})/c_{{i,\mathrm{Cd}}^{2+}}|\×100\%)$ 来评估本发明的定量分析性能，以及将本发明的定量分析结果与PLS方法进行了比较。

图4显示金纳米颗粒聚集程度的不均匀性和聚焦位置的不同对样本SERS信号的影响。样本中镉离子的浓度与样本SERS光谱在拉曼位移972和875cm^-1处强度比值(I₉₇₂/I₈₇₅)之间的关系严重偏离线性关系。这表明有必要引入乘子效应参数来描述SERS增强基底的物理性质(如，金纳米颗粒的大小、形状以及聚集度)，以及激光光源的功率和聚焦位置变化对样本SERS光谱信号强度的影响。

图5给出了由OPLEC_m估计出的镉离子校正样本SERS光谱的乘子效应参数b_i(i＝1,2,…,N)，它直观的反映了SERS增强基底的物理性质以及激光光源功率和聚焦位置对样本SERS强度的影响。因此，当使用比率型SERS探针三聚硫氰酸对水样中的镉离子含量进行定量检测时，必须先消除增强基底的物理性质以及激光光源功率和聚焦位置对样本SERS光谱信号强度的影响，才能获得准确的定量分析结果。

表1为本发明和PLS对超纯水配制的镉离子测试样本中镉离子含量的比较分析结果。很显然，本发明的RMSEP和ARPE值分别为0.006μM和5.0％，远低于PLS的相应值，只约为PLS相应值的三分之一。

表1 本发明和PLS方法对超纯水配制的镉离子测试样本中镉离子含量的分析结果

a.括号内的数字为标准偏差

我们同时也测试了AuNP-TMT探针体系对真实环境中镉离子含量的定量检测性能，即利用超纯水配制的镉离子标准溶液作为校正集，并用在其SERS光谱上建立的比率型SERS校正模型来预测自来水、湘江水和土壤水中镉离子的含量。表2列出了本发明对环境水样中的镉离子浓度的定量分析结果。所获得的结果相当令人满意，其加标回收率在91.8～108.1％之间，环境水样中可能存在的其他化学成分基本上不干扰镉离子的测定，表明本发明能够应用于真实环境样本中镉离子含量的定量检测。

表2 本发明对不同环境水体样本中镉离子浓度的预测结果

Claims (6)

1.一种环境水体样本中镉离子含量的定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)在金纳米颗粒上标记适量的比率型探针三聚硫氰酸，制备出具有螯合镉离子功能的SERS基底；

2)采用上述SERS基底，在二极管激光器所发出的785nm激光的激发下，获取N个含镉离子的标准样本的SERS光谱；

3)在标准样本的SERS光谱数据X和标准样本中镉离子的浓度矢量c之间建立校正模型；

4)获取实际待测环境水体样本的SERS光谱x_test，采用上述校正模型预测出实际环境水体样本中镉离子的浓度。

2.根据权利要求1所述的环境水体样本中镉离子含量的定量分析方法，其特征在于，所述步骤1)中，金纳米颗粒粒径为13 nm。

3.根据权利要求1或2所述的环境水体样本中镉离子含量的定量分析方法，其特征在于，所述步骤2)中，含镉离子的标准样本为采用超纯水配置的镉离子标准液，且所述镉离子标准液的浓度梯度为0.000、0.010、0.062、0.083、0.100、0.120、0.170、0.190、0.210中的一种。

4.根据权利要求3所述的环境水体样本中镉离子含量的定量分析方法，其特征在于，所述步骤2)中，SERS光谱扫描范围为317～1477cm^-1。

5.根据权利要求4所述的环境水体样本中镉离子含量的定量分析方法，其特征在于，所述步骤3)中，校正模型的建立过程如下：

1)确定所述标准样本的SERS光谱与所述标准样本中镉离子浓度之间的关系：

$x_i=b_i\×({\left[\mathrm{TMT}\right]}_i\·r_{\mathrm{TMT}}+{[\mathrm{TMT}-{\mathrm{Cd}}^{2+}]}_i\·r_{\mathrm{TMT}-{\mathrm{Cd}}^2})+d_i,i=\mathrm{1,2},\·\·\·,N;$

其中，x_i代表第i个标准样本的SERS光谱；[TMT]_i和[TMT-Cd²⁺]_i分别代表第i个标准样本中游离三聚硫氰酸的浓度以及三聚硫氰酸与镉离子结合产物TMT-Cd的浓度；r_TMT和分别代表三聚硫氰酸和TMT-Cd的分子散射特性；b_i代表由于所述SERS基底物理性质以及激光光源的功率、聚焦位置的变化对第i个标准样本的SERS光谱信号强度产生的乘子效应；d_i代表由于背景干扰和SERS基底的物理性质变化对第i个标准样本SERS光谱信号产生的非乘子效应；

2)根据上述标准样本的SERS光谱与所述标准样本中镉离子浓度之间的关系估算所有标准样本的乘子效应矢量b＝[b₁；…；b_N]，建立以下两个校正模型：b_i＝α₁+x_iβ₁；利用多元线性校正方法估计参数α₁、β₁、α₂、和β₂；其中，为第i个标准样本中总的镉离子浓度。

6.根据权利要求5所述的环境水体样本中镉离子含量的定量分析方法，其特征在于，所述步骤4)中，实际环境水体样本中镉离子的浓度计算公式如下：

$c_{\mathrm{test},{\mathrm{Cd}}^{2+}}=({\mathrm{\α}}_2+x_{\mathrm{test}}{\mathrm{\β}}_2)/({\mathrm{\α}}_1+x_{\mathrm{test}}{\mathrm{\β}}_1).$