CN113358609A - 一种利用多色荧光内标动态校正dna荧光光谱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法，包括如下步骤：确定待检测的STR基因座，并规划STR基因座中各个荧光颜色通道的排布；设计多色荧光内标；在每一次DNA片段检测分析时，识别前期嵌入的多色荧光内标，动态构建相应的光谱校正矩阵，进行DNA荧光光谱的校正。利用本发明，不需要专门配备光谱校正试剂和独立设置的光谱校正环节，DNA检测技术人员无需关注光谱校正矩阵和试剂盒的对应，也不需要关注何时光谱校正失真需要重做等繁琐问题，显著降低了STR检测技术的应用复杂度，也无疑可以降低检测成本，具有良好的潜在经济效益和重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种校正DNA荧光光谱的方法，尤其涉及一种利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法，属于遗传物质检测技术领域。
背景技术
第一代DNA测序技术包括1975年由Frederick Sanger提出的链终止法以及1977年由Walter Gibert所发明的链降解法。其中，链终止法也称为Sanger法，其核心原理是：利用ddNTP的2’和3’基团都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应。在4个DNA合成反应体系中，分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP(分别为：ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP)，通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。该方法的检测结果准确性高达99.999％，在行业内被认为是“金标准”；在司法鉴定、刑侦判定和遗传物质鉴定(基因诊断)等工作中发挥了重要作用。
STR(Short Tandem Repeat，短串联重复序列)是基因组中由2～6个碱基单元组成，重复串联的一类DNA重复序列。由于STR基因座的多态性丰富、突变率低，是DNA分型的金标准。如图1所示，在现有的STR检测操作流程中，通常使用单一颜色的荧光染料进行标记。由十几个已知碱基对(base pair，简写为bp)长度的DNA片段组成检验尺度(即内标DNA片段，简写为内标)，用来标定待测DNA片段长度。在实际电泳过程中，通过检测该颜色的内标特征峰，记录每个内标DNA片段出现的数据帧位置，可以建立数据帧位置和DNA片段长度的映射关系，用于电泳中待测DNA片段(STR基因片段)的长度计算。
在专利号为ZL 201110160549.3的中国发明专利中，公开了一种基于空间校正及光谱校正的毛细管阵列电泳检测方法。该方法将STR检测操作流程分为空间校正、光谱校正和DNA片段分析三个环节，其中在光谱校正环节中，先用n种荧光染料标记物在面阵CCD上成像，获得光谱校正矩阵，然后在DNA片段分析环节中，应用之前光谱校正环节获得的光谱校正矩阵进行内标以及DNA片段光谱数据的处理，获得DNA片段信息。但是，上述检测方法仍然存在以下不足：1)需要光谱校正试剂和独立的光谱校正环节；2)光谱校正矩阵是之前建立的，随时间推移，可能不再适用当前DNA片段检测；3)移动机器、更换毛细管等操作后都需要单独做一遍光谱校正；4)试剂盒种类较多时，各种荧光染料标记的光谱校正选择、应用容易混淆。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法。
为了实现上述目的，本发明采用下述的技术方案：
一种利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法，包括如下步骤：
(1)确定待检测的STR基因座，并规划所述STR基因座中各个荧光颜色通道的排布；
(2)设计多色荧光内标；
(3)在每一次DNA片段检测分析时，识别前期嵌入的所述多色荧光内标，动态构建相应的光谱校正矩阵，进行DNA荧光光谱的校正。
其中较优地，所述步骤(2)中，在预定间距的内标片段序列标记上不同颜色的荧光染料，得到所述多色荧光内标。
其中较优地，所述预定间距为彼此相等的间距。
其中较优地，所述多色荧光内标中，不同颜色标记的内标片段避免和待检测的STR基因座的bp段相近或重叠。
其中较优地，不同颜色标记的内标片段与待检测的STR基因座的bp段相距在10bp以上。
其中较优地，不同颜色标记的内标片段，彼此之间相距2bp以上。
其中较优地，不同颜色标记的内标片段所对应的DNA片段在50～100bp之间。
其中较优地，所述步骤(3)中，实时采集荧光光谱，直至检测到多个相等间距的原始荧光光谱峰，据此判断已采集到所述多色荧光内标；计算多色荧光染料的光谱分布，动态构建相应的光谱校正矩阵。
其中较优地，利用所述光谱校正矩阵对之前的原始荧光光谱进行回溯解谱，并评估实际解谱质量。
其中较优地，如果满足质量要求，继续用所述光谱校正矩阵实时处理后续的DNA片段的荧光光谱数据，以解析获得各个荧光颜色通道的待检DNA片段的谱峰，进而生成预定格式的数据文件，实现STR分型检测。
与现有技术相比较，本发明所提供的方法根据待测DNA片段的情况，选择内标嵌入多色荧光染料片段，形成一种新的多色荧光内标。在随后的每一次DNA片段检测分析环节中，自动识别前期嵌入的多色荧光内标，建立相应的光谱校正矩阵，并进行光谱校正运算，分析待测DNA片段。在本发明中，不需要专门配备光谱校正试剂和独立设置的光谱校正环节，DNA检测技术人员无需关注光谱校正矩阵和试剂盒的对应，也不需要关注何时光谱校正失真需要重做等繁琐问题，显著降低了STR检测技术的应用复杂度，也无疑可以降低检测成本，具有良好的潜在经济效益和重要的应用价值。
附图说明
图1为现有技术中，常用的单色荧光内标示例图；
图2为本发明所提供的多色荧光内标的示例图；
图3为本发明所提供的利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法流程图；
图4为本发明实施例中，待检测的STR基因座的荧光颜色通道排布示例图；
图5为本发明实施例中，设计好的多色荧光内标示例图；
图6为本发明所提供的方法中，动态构建光谱校正矩阵进行DNA荧光光谱解析的流程图；
图7为本发明实施例中，基于多色荧光内标构建的光谱校正矩阵示例图；
图8为本发明实施例中，原始荧光光谱的示例图；
图9为本发明实施例中，实际解谱后的STR基因片段光谱示例图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术内容做进一步的详细说明。
目前，业内广泛使用美国应用生物系统(Applied Biosystems)公司出品的3130/3130xl系列基因测序仪进行DNA测序或者片段分析。该类基因测序仪可以采用多种颜色(通常为四色或五色)的荧光对DNA片段进行标记。由于多色荧光检测的本质是检测多种颜色的荧光素在其中心发射波长处的信号。每一种荧光素发射光谱不是锐线光谱，而是有一定宽度分布的光谱带。一个纯色荧光除了在它自己的光谱中心波长处能采集到信号外，在其他荧光信号光谱的中心波长处也能检测到信号，从而形成信号重叠。为了校准该信号重叠，需要知道该荧光信号在其他荧光信号处产生的重叠系数。然后，在不同长度的DNA片段上分别标记不同颜色的荧光素并计数其系数，得到N×N(N为荧光颜色的种类)的矩阵，以此建立光谱校正矩阵模型，用于解析待测样品。
建立涉及多色荧光光谱的校正矩阵模型，通常根据后续检测样品的相关要求，由有经验的实验操作人员配制光谱校正试剂，经过试剂准备、光谱校正染料集选择、上样电泳、光谱检测等步骤后，建立合适的光谱校正矩阵模型，以便于后续的整体操作。每一种光谱校正矩阵模型仅适用于当时情况的实验操作。一旦出现必要的检测设备移动、毛细管阵列重新安装、复合扩增试剂盒更换等情况，均需要重新进行光谱校正，建立新的光谱校正矩阵模型。
由此可见，独立的光谱校正环节是现有STR检测操作流程的必要关键步骤，对操作人员的专业程度要求高，时效性短，操作繁琐。在实际操作过程中，实验操作人员还可能因为其个人对光谱校正试剂、校正方法等的理解偏差等，造成STR检测的结果出错。
为了解决上述问题，本发明实施例提供一种利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法。该方法首先通过在常规的内标中嵌入多色荧光染料片段，形成一种新的多色荧光内标。例如在图2所示的多色荧光内标示例中，50bp、100bp、150bp、200bp……450bp、500bp等处DNA片段用橙色做标记，60bp处的DNA片段用蓝色做标记，70bp处的DNA片段用绿色做标记，80bp处的DNA片段用黄色做标记，90bp处的DNA片段用红色做标记。这种多色荧光内标除了可以用于标定DNA片段长度之外，还可以用多色荧光染料标记的内标片段动态构建光谱校正矩阵，并用于后续的待测DNA片段解谱和STR分型。
如图3所示，本发明所提供的方法在试剂准备阶段，分别准备嵌入多色荧光染料片段的内标试剂和相应的STR复合扩增产物，不再制备光谱校正板，不进行光谱校正矩阵的预制，而是直接将待测样品选择预定颜色的荧光素进行染色。在每一次DNA片段的检测分析(电泳)环节中，利用基因测序仪自动识别多色荧光内标的DNA片段，动态构建光谱校正矩阵并进行解谱运算，从而完成STR分型检测。本方法将光谱校正融合到DNA片段的分析检测流程中，避免了专门配备光谱校正试剂和独立进行光谱校正的流程，使DNA技术专家不用关注光谱校正矩阵模型和试剂盒之间的对应关系，以及什么时候光谱校正需要重做等繁琐问题，显著降低了STR检测技术的应用复杂度。下面，结合应用示例对此展开具体说明。
在本发明的一个实施例中，使用Applied Biosystems的3130/3130xl系列基因测序仪进行DNA测序或者片段分析。
首先，进行待检测的STR基因座的检测规划，即确定待检测的STR基因座，并规划待检测的STR基因座中各个荧光颜色通道的排布。例如，待检测的STR基因座包括D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、vWA、TPOX、D18S51、AMEL、D5S818、FGA，共计16个，分为4个荧光颜色通道(即4组)，分别用6-FAM(蓝色)、VIC(绿色)、NED(黄色)、PET(红色)共4种不同颜色的荧光染料标记，另外，再安排一个内标颜色通道，用Liz(橙色)进行标记。在本实施例中，内标前端用多色荧光染料标记，具体排布规划如图4所示。其中，
6-FAM(蓝色)组：D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO；
VIC(绿色)组：D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338；
NED(黄色)：D19S433、vWA、TPOX、D18S51；
PET(红色)组：AMEL、D5S818、FGA。
在其它的实施例中，还可以在内标后端或者其他合适的位置用多色荧光染料标记，均可以达到相似的应用效果。
接下来，统筹STR基因座的荧光颜色通道的排布，设计多色荧光内标。在上述实施例中，多色荧光内标的DNA片段共设计16个。其中，50bp、100bp、139bp、150bp、160bp、200bp、250bp、300bp、340bp、350bp、400bp、450bp等共计12个DNA片段用Liz(橙色)荧光染料标记，其他60bp、70bp、80bp、90bp等共计4个DNA片段分别用6-FAM(蓝色)、VIC(绿色)、NED(黄色)、PET(红色)荧光染料标记，这4个非橙色的内标片段均安排在100bp之前，这样可以避免和待检测的STR基因座的bp段相近或重叠。
另外，上述4个非橙色的内标片段均选择对应的DNA片段在50～100bp之间。这是因为高于50bp是现有的第一代基因测序仪，例如上述的3130/3130xl系列基因测序仪自身的可信检测最低值的要求；低于100bp是因为在实际操作中，较小bp的DNA片段能够迅速得到电泳数据，计算分析出检测结果，高效率地完成后续DNA荧光光谱的解析环节。
在上述实施例中，多色荧光内标总共使用了5个荧光染料，包括6-FAM(蓝色)、VIC(绿色)、NED(黄色)、PET(红色)、Liz(橙色)，设计好的多色荧光内标如图5所示。
在上述多色荧光内标中，使用预定间距(优选为彼此相等的间距)的内标片段序列标记上对应的荧光染料。这样，在后续的DNA片段检测分析(电泳)环节中，可以检测到多个预定间距的原始荧光光谱峰。
需要说明的是，本发明实施例中选择上述bp数值的DNA片段进行染色，仅仅是便于演示实验结果，所采用的bp数值等并不是固定的，而是可以根据实际需要灵活调整的。在实际操作中，选择若干个不同bp数值的DNA片段分别染色，需要避免和待检测的STR基因座的bp段相近或重叠，最少相距10bp以上；并且相互之间也需要避免过于相近，最少相距2bp以上。这样，所设计的多色荧光内标进行后续检测的准确性比较有保证。
在本发明的实施例中，由于去掉了现有技术中的光谱校正试剂和光谱校正环节，DNA片段检测分析环节不能像以前一样，用之前建立的光谱校正矩阵进行光谱解析，因为采集到的荧光光谱数据是原始荧光光谱，该原始荧光光谱以混叠光谱存在，特别是当多个荧光染料标记的待检DNA片段同时出现时，各个荧光染料光谱会叠加(即混叠)，导致无法直观上区分各色荧光染料标记的DNA片段，因此，在随后的每一次DNA片段检测分析环节中，需要动态构建光谱校正矩阵，进行DNA荧光光谱解析。即，根据所设计的多色荧光内标，动态构建光谱校正矩阵，进行DNA荧光光谱的校正，生成预定格式的数据文件，实现STR分型检测。
下面，结合图6所示的具体操作对上述步骤进行详细说明。
在本发明的一个实施例中，使用ID Plus试剂盒(美国Thermofisher公司出品)扩增DNA片段。该试剂盒可扩增D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、vWA、TPOX、D18S51、AMEL、D5S818、FGA等16个STR基因座，获得相应的STR复合扩增产物。然后，将多色荧光内标加入上述STR复合扩增产物，开始DNA片段的检测分析(电泳)环节。
在DNA片段的检测分析(电泳)环节中，实时采集荧光光谱，直至检测到多个等间距的原始荧光光谱峰。由此，可以判断已采集到预定的多色荧光内标，并以此计算多色荧光染料的光谱分布，动态构建光谱校正矩阵。在本发明的一个实施例中，每一帧采集的是20个数据，对应500～700nm光谱范围，先识别出50bp、60bp、70bp、80bp、90bp对应的谱峰中心点位置，取这些谱峰中心点对应帧位置的20个数据，共5组，基于多色荧光内标构建光谱校正矩阵如图7所示(横轴单位为nm，纵轴单位为％)。
由于图7所示的光谱校正矩阵是每一次DNA片段的检测分析(电泳)环节实时自动建立的，不存在随时间推移光谱校正矩阵可能不再适用的问题，在移动机器、更换毛细管等操作后不需要考虑光谱校正的问题，更不需要考虑之前建立的光谱校正和当前试剂盒的匹配问题。
接下来，计算光谱校正矩阵的条件数、质量数，用光谱校正矩阵对之前的原始荧光光谱进行回溯解谱并评估解析质量。在本发明的一个实施例中，如果满足条件数小于20，认为光谱校正矩阵的质量合格，进而对之前的原始荧光光谱(如图8所示)进行回溯解谱，并评估实际解谱质量，质量数在0.9以内认为满足质量要求，则继续用该光谱校正矩阵实时处理后续的DNA片段的荧光光谱数据，以解析获得各个荧光颜色通道的待检DNA片段的谱峰(即STR谱峰)，进而生成预定格式的数据文件，实现STR分型检测。如果不能满足质量要求，则直接结束DNA片段的检测分析(电泳)环节。
图8和图9分别是原始荧光光谱示例图和利用本发明实际解谱后的STR基因片段光谱示例图，可以看出利用本发明提供的光谱校正矩阵，实时将混叠的荧光光谱解析成了各个荧光颜色通道的STR基因片段光谱。从图9可以看出，不同荧光颜色通道的光谱不再混叠在一起，而是清晰可辨识。
与现有技术相比较，本发明所提供的方法根据待测DNA片段的情况，选择内标嵌入多色荧光染料片段，形成一种新的多色荧光内标。在随后的每一次DNA片段检测分析环节中，自动识别前期嵌入的多色荧光内标，建立相应的光谱校正矩阵，并进行光谱校正运算，实现STR分型检测。在本发明中，不需要专门配备光谱校正试剂和独立设置的光谱校正环节，DNA检测技术人员无需关注光谱校正矩阵和试剂盒的对应，也不需要关注何时光谱校正失真需要重做等繁琐问题，显著降低了STR检测技术的应用复杂度，也无疑可以降低检测成本，具有良好的潜在经济效益和重要的应用价值。
以上对本发明所提供的利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法进行了详细的说明。对本领域的一般技术人员而言，在不背离本发明实质内容的前提下对它所做的任何显而易见的改动，都将属于本发明专利权的保护范围。
Claims (10)
1.一种利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)确定待检测的STR基因座，并规划所述STR基因座中各个荧光颜色通道的排布；
(2)设计多色荧光内标；
(3)在每一次DNA片段检测分析时，识别前期嵌入的所述多色荧光内标，动态构建相应的光谱校正矩阵，进行DNA荧光光谱的校正。
2.如权利要求1所述利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法，其特征在于：
所述步骤(2)中，在预定间距的内标片段序列标记上不同颜色的荧光染料，得到所述多色荧光内标。
3.如权利要求2所述利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法，其特征在于：
所述预定间距为彼此相等的间距。
4.如权利要求2所述利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法，其特征在于：
所述多色荧光内标中，不同颜色标记的内标片段避免和待检测的STR基因座的bp段相近或重叠。
5.如权利要求4所述利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法，其特征在于：
不同颜色标记的内标片段与待检测的STR基因座的bp段相距在10bp以上。
6.如权利要求5所述利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法，其特征在于：
不同颜色标记的内标片段，彼此之间相距2bp以上。
7.如权利要求4所述利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法，其特征在于：
不同颜色标记的内标片段所对应的DNA片段在50～100bp之间。
8.如权利要求1所述利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法，其特征在于：
所述步骤(3)中，实时采集荧光光谱，直至检测到多个相等间距的原始荧光光谱峰，据此判断已采集到所述多色荧光内标；计算多色荧光染料的光谱分布，动态构建相应的光谱校正矩阵。
9.如权利要求8所述利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法，其特征在于：
利用所述光谱校正矩阵对之前的原始荧光光谱进行回溯解谱，并评估实际解谱质量。
10.如权利要求9所述利用多色荧光内标动态校正DNA荧光光谱的方法，其特征在于：
如果满足质量要求，继续用所述光谱校正矩阵实时处理后续的DNA片段的荧光光谱数据，以解析获得各个荧光颜色通道的待检DNA片段的谱峰，进而生成预定格式的数据文件，实现STR分型检测。
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