CN110358842A

CN110358842A - 牦牛亲子鉴定和个体识别的ssr分型检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN110358842A
Application number: CN201910608699.2A
Authority: CN
Inventors: 裴杰; 阎萍; 郭宪; 包鹏甲; 褚敏; 梁春年; 丁学智; 吴晓云; 熊琳
Original assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Current assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Priority date: 2019-07-08
Filing date: 2019-07-08
Publication date: 2019-10-22

Abstract

本发明提供牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测试剂盒及检测方法，针对牦牛牛群的遗传结构特点，筛选出一组适用于检测牦牛亲子关系的SSR标记，共包括15个SSR标记，这些标记多态信息含量高、标记位点间不连锁、相同荧光素的扩增片段大小间隔适当。本发明利用多重荧光PCR和毛细管电泳技术，通过优化实验体系，建立了基于上述15个SSR标记，准确、高效的基因分型方法。本发明的SSR标记组合可用于牦牛的个体识别和亲权鉴定，进而用于牦牛完整、准确的系谱鉴定，可提高牦牛育种准确性，加快其育种进程，具有良好的应用前景和经济效益。

Description

牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及动物核酸体外检测技术领域，具体涉及牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测试剂盒和检测方法。

背景技术

家畜的系谱信息在育种过程中起着重要的作用，错误的系谱会大大降低遗传评定的准确性，影响选种、选配的效果，降低群体的遗传进展，给动物生产带来巨大的经济损失。

牦牛主要生长于以青藏高原为中心海拔三千米以上的高山、亚高山高寒地区。牦牛的系谱记录错误受精液标号、配种记录、产犊记录、系谱录入、耳号脱落等过程中产生错误的影响，另外，以放牧为主的生产方式使牦牛的系谱准确性受到了很大的影响。因此，在牦牛群体中开展亲子鉴定和个体识别工作显得十分必要，该工作的实施可以纠正系谱中的错误信息，加快牦牛的育种进程。

简单序列重复(Simple Sequence Repeat,SSR)广泛存在于生物基因组中，是一类具有高度多态性的遗传标记位点。由于SSR具有片段小、多态性高、信息含量大、遗传共显性、整个基因组分布等特点，因此，将SSR复合扩增技术应用于生物的亲子鉴定和个体识别具有极大的优越性。

将SSR位点标记应用于普通牛的亲子鉴定的报道较多，而尚未见将其应用于牦牛亲子鉴定的相关报道。关于牦牛SSR标记的研究仅限于群体结构和进化分析，并且绝大多数引物都直接取自文献报道中普通牛的引物序列。虽然直接利用部分普通牛的SSR标记引物可以对牦牛的相应位点进行扩增，但是毕竟牦牛与普通牛在基因序列上存在一定的差异，直接利用普通牛的引物往往达不到对牦牛SSR位点检测的最佳效果。

发明内容

本发明的目的是针对牦牛育种过程中对亲子鉴定和个体识别的需求，提供用于牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR标记基因分型的复合PCR扩增检测方法和检测试剂盒。

本发明牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测试剂盒的技术方案为，所述SSR分型检测试剂盒包括以下15个SSR位点，所述SSR位点为BM2113、D25GT、DXTG、YAK11、HEL6、INRA023、TGLA126、YAK07、HAUT24、INRA037、INRA063、SPS115、CSSM036、ILSTS028和YAK08。

进一步的，牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测试剂盒，对所述SSR分型检测试剂盒上15个SSR位点进行基因分型的复合PCR扩增系统，按照所述15个SSR位点分为四组，其组合方式与相应的PCR扩增引物如下：

第一组的4个位点为BM2113、D25GT、DXTG和YAK11，相应的PCR扩增引物核苷酸序列为，

位点BM2113，SEQ ID No.1S：CTTCCTGAGAGAAGCAACACC，SEQ ID No.2U：GCTGCCTTCTACCAAATACCC，产物长度为115～133bp，重复序列为TG，重复次数为8～17，染色体位置为2；

位点D25GT，SEQ ID No.3S：CACCAATAAAAGTAAAAACACCG，SEQ ID No.4U：AAGATCCCTTGGAGGAGGAA，产物长度为199～213bp，重复序列为GT，重复次数为12～19，染色体位置为25；

位点DXTG，SEQ ID No.5S：GTCATCGTGGGGGTTCTTATAG，SEQ ID No.6U：ATTGCCTCACCAGCAAAAAT，产物长度为250～272bp，重复序列为TG，重复次数为11～22，染色体位置为X；

位点YAK11，SEQ ID No.7S：TCCCCTCACTCCTCATTGGT，SEQ ID No.8U：TGCAGGCAGTTTCTTACCAGT，产物长度为306～314bp，重复序列为GT，重复次数为13～17，染色体位置为1；

所述第一组采用FAM荧光素进行标记；

第二组的4个位点为HEL6、INRA023、TGLA126和YAK07，相应的PCR扩增引物核苷酸序列为，

位点HEL6，SEQ ID No.9S：GGACACGACTGAGCAAGTAACA，SEQ ID No.10U：GCTTTGGCAGGCAGATACAT，产物长度为247～265bp，重复序列为GT，重复次数为9～18，染色体位置为1；

位点INRA023，SEQ ID No.11S：ATTTCCCTTCTGACTGGTACTTC，SEQ ID No.12U：GTGTCCCTCCTCTAATCCCTAA，产物长度为184～204bp，重复序列为TG，重复次数为9～19，染色体位置为3；

位点TGLA126G，SEQ ID No.13S：AGCACAAAGTAAACCTGCAATAA，SEQ ID No.14U：CTTCACCATTGGACCACGAG产，物长度为372～386bp，重复序列为TG，重复次数为6～13，染色体位置为20；

位点YAK07，SEQ ID No.15S：TAACAAAGCTGCTGGGAACAT，SEQ ID No.16U：CGGAGTCACTTTCCTCACCTAT，产物长度为323～339bp，重复序列为TG，重复次数为13～21，染色体位置为1；

所述第二组采用HEX荧光素进行标记；

第三组的4个位点为HAUT24、INRA037、INRA063和SPS115，相应的PCR扩增引物核苷酸序列为，

位点HAUT24，SEQ ID No.17S：GGAGTCGCTGAGGGTTGG，SEQ ID No.18U：CCAAACCCCCTACCCACA，产物长度为439～455bp，重复序列为AC，重复次数为12～20，染色体位置为22；

位点INRA037，SEQ ID No.19S：GCTACAATCCAGACTGAGCACG，SEQ ID No.20U：GACACGGCTTAGCGACTGAA，产物长度为296～314bp，重复序列为CA，重复次数为11～20，染色体位置为10；

位点INRA063，SEQ ID No.21S：AAACCACAGAAATGCTTGGAAG，SEQ ID No.22U：ATTTGCACAAGCTAAATCTAACAA，产物长度为175～187bp，重复序列为TG，重复次数为12～18，染色体位置为18；

位点SPS115，SEQ ID No.23S：AAAGTGACACAACAGCTTCACCC，SEQ ID No.24U：ACCGAGTGTCCTAGTTTGG，产物长度为231～261bp，重复序列为CA，重复次数为14～29，染色体位置为15；

所述第三组采用TAMRA荧光素进行标记；

第四组的3个位点为CSSM036、ILSTS028和YAK08，相应的PCR扩增引物核苷酸序列为，

位点CSSM036，SEQ ID No.25S：GATGACTCAACCGCACGTCT，SEQ ID No.26U：AAGAAGTACTGGTTGCCAATCG，产物长度为157～179bp，重复序列为TG，重复次数为10～21，染色体位置为27；

位点ILSTS028，SEQ ID No.27S：AGAAGAGTGTACCTCCTCCCA，SEQ ID No.28U：TCCAGATTTTGTACCAGACCAT，产物长度为261～293bp，重复序列为GT，重复次数为8～24，染色体位置为11；

位点YAK08，SEQ ID No.29S：ACTGGAGTAGGTTGCCCTGC，SEQ ID No.30U：CCTGGCTTGGTCCTGTCTCT，产物长度为321～343bp，重复序列为CA，重复次数为6～17，染色体位置为6；

所述第4组采用ROX荧光素进行标记；

其中“U”代表上游引物，“S”代表下游引物。

进一步的，牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测试剂盒，所述第一组SSR位点BM2113、D25GT、DXTG和YAK11的PCR扩增引物组成第一组引物混合液，其各自的浓度依次为4.0μmol/L、5.5μmol/L、25.0μmol/L和1.3μmol/L；

所述第二组SSR位点HEL6、INRA023、TGLA126和YAK07的PCR扩增引物组成第二组引物混合液，其各自的浓度依次为7.5μmol/L、2.5μmol/L、5.0μmol/L和5.0μmol/L；

所述第三组SSR位点HAUT24、INRA037、INRA063和SPS115的PCR扩增引物组成第三组引物混合液，其各自的浓度依次为15.0μmol/L、10.0μmol/L、10.0μmol/L和7.5μmol/L；

所述第四组SSR位点CSSM036、ILSTS028和YAK08的PCR扩增引物组成第四组引物混合液，其各自的浓度依次为7.5μmol/L、3.3μmol/L和3.3μmol/L。

进一步的，牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测试剂盒，所述试剂盒进行检测时，牦牛基因组DNA样本选自牦牛血液、组织样品或精液样品中的一种或多种。

进一步的，牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测试剂盒，所述试剂盒检测时的试剂包括100ng/μL的SSR标准品50μL，10×PCR反应缓冲液200μL，所述四组引物混合液各50μL，ddH₂O 1000μL×2管；所述四组引物混合液分别包括引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.8、引物SEQ ID No.9～SEQ ID No.16、引物SEQ ID No.17～SEQ ID No.24和引物SEQ ID No.25～SEQ ID No.30的组合物；10×PCR反应缓冲液包含HS Taq DNA聚合酶0.5U/μL，Tris 150mmol/L，MgCl₂25mmol/L，KCl 200mmol/L，dNTP 2.5mmol/L和BSA 650mg/L，25℃的pH值为8.4。

本发明还提供牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测方法，包括以下步骤：

1)提取牦牛基因组DNA；

2)多重荧光PCR扩增：对SSR位点分组进行分别扩增，每组反应体系相同，均为20μL，反应体系组成如下：模板DNA 0.5μL，10×PCR反应缓冲液2.0μL，引物混合液2.0μL，ddH₂O 15.5μL；

3)PCR反应条件如下：95℃预变性5分钟，95℃30秒、56.3℃25秒、72℃25秒，共35个循环，72℃保温5分钟，15℃保存；

4)将得到的每组PCR产物加入样品板，再将样品板装入遗传分析仪进行毛细管电泳；

5)利用GeneMapper^TM 4.0软件分析电泳数据，得到实际样品的基因分型数据。

进一步的，牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测方法，所述基因组DNA浓度为50～500ng/μL。

进一步的，牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测方法，所述SSR位点分为4组，第一组的4个位点为BM2113、D25GT、DXTG和YAK11，相应的PCR扩增引物核苷酸序列依次如序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.8所示，该组采用FAM荧光素进行标记；

第二组的4个位点为HEL6、INRA023、TGLA126和YAK07，相应的PCR扩增引物核苷酸序列依次如序列表中SEQ ID No.9至SEQ ID No.16所示，该组采用HEX荧光素进行标记；

第三组的4个位点为HAUT24、INRA037、INRA063和SPS115，相应的PCR扩增引物核苷酸序列依次如序列表中SEQ ID No.17至SEQ ID No.24所示，该组采用TAMRA荧光素进行标记；

第四组的3个位点为CSSM036、ILSTS028和YAK08，相应的PCR扩增引物核苷酸序列依次如序列表中SEQ ID No.25至SEQ ID No.30所示，该组采用ROX荧光素进行标记。

进一步的，牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测方法，所述第一组SSR位点BM2113、D25GT、DXTG和YAK11的PCR扩增引物组成第一组引物混合液，其各自的浓度依次为4.0μmol/L、5.5μmol/L、25.0μmol/L和1.3μmol/L；

进一步地，牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测方法，所述牦牛基因组DNA样本选自牦牛血液、组织样品或精液样品中的一种或多种。

本发明的有益效果为，本发明针对牦牛的遗传结构特点，筛选出一组适用于检测牦牛亲子关系的SSR标记，共包括15个SSR标记，这些标记多态信息含量高、标记位点间不连锁、相同荧光素的扩增片段大小间隔适当。本发明利用多重荧光PCR和毛细管电泳技术，通过优化实验体系，建立了基于上述15个SSR标记，准确、高效的基因分型方法。在三种不同情况下，利用此SSR标记组合鉴定牦牛亲子关系，累积排除概率CPE1、CPE2、CPE3分别达0.99680161、0.99996200和0.99999997；当标记组合应用于牦牛的个体识别时，TDP更是大于0.99999999，说明本发明的检测效率极高。本发明的SSR标记组合可用于牦牛的个体识别和亲权鉴定，进而用于牦牛完整、准确的系谱鉴定，可提高牦牛育种准确性，加快其育种进程，具有良好的应用前景和经济效益。

附图说明

图1本发明第一组SSR位点基因检测典型图；

图2本发明第二组SSR位点基因检测典型图；

图3本发明第三组SSR位点基因检测典型图；

图4本发明第四组SSR位点基因检测典型图。

具体实施方式

下面进一步描述本发明的技术方案：

1、发明中SSR位点的选择

本发明方案中使用的这些位点是申请人针对牦牛基因组的特性和群体基因频率的不同，通过对牦牛群体的基因特征分析和SSR基因频率的综合分析，在已有研究的基础上经过文献调研、生物信息学分析和大量实验检测，筛选出的不连锁、好判型、多态信息含量丰富、二碱基重复的15个SSR位点(表1、表6)。

表1牦牛15个SSR位点的荧光引物信息

注：1.“U”代表上游引物，“S”代表下游引物；2.由于牦牛的染色体目前还没有得到拼装，此处的“染色体位置”是以普通牛染色体的相应位置作为参考。

2、发明中的SSR位点的引物分组和荧光标记

为实现SSR位点分型的目的，本发明提供了一种SSR位点复合检测的方法，可以准确获得待检测个体的15个SSR位点的分型结果，通过该方法能根据分型结果进行牦牛的亲子鉴定和个体识别。考虑引物的荧光颜色、自身长度、退火温度、扩增产物长度、扩增效率，各个引物间相互作用，带相同荧光素的引物扩增产生不重叠和引物的组合选配等方面因素，申请人通过大量反复的反应体系优化和扩增条件摸索实验，对上述位点采用表1中所述的方式进行分组和荧光标记。具体优化步骤如下：

(1)采用梯度PCR对引物的可用退火温度进行实验确定，对退火温度小于组内温度的引物末端添加少数碱基，对退火温度大于组内温度的引物末端删除少数碱基，使每组引物的退火温度保持一致。当添加少数碱基仍不能达到理想效果时，重新设计相应SSR位点引物。

(2)根据引物序列，推测可能发生相互作用的引物，将可能互作的引物分配到不同的扩增体系，并对同组引物进行PCR复合扩增。当扩增结果不理想时，重新对引物进行分组和长度调整，甚至针对相应SSR位点重新设计引物。经大量的引物组合设计和复合扩增实验，最终确定引物的最佳扩增组合。

(4)根据扩增产物长度的不同，将引物分别用四种荧光素(FAM、HEX、TAMRA和ROX)进行标记，使带有相同荧光素的引物扩增产物长度不重叠。

(5)调整引物的浓度，使带有相同荧光信号的引物所对应扩增产物的荧光信号强度尽量保持一致。

(6)对反应体系的Taq DNA聚合酶、Tris、MgCl2、KCl、dNTP、BSA和pH值进行梯度摸索，使体系的扩增效率达到最佳。

在本发明的实施方案中，通过所述遗传分析仪，将实际扩增出的产物长度和颜色与表1中记载的预期的产物长度和颜色进行对比。实际扩增出的产物长度只要在表1的产物长度范围即可，或者通过测序确认是所要扩增的目的片段。

3、发明中用于SSR检测的试剂盒及使用方法

本发明通过优化扩增条件和调整反应体系中各组分的浓度，筛选出最佳检测体系组成和扩增条件，提供了用于牦牛亲子鉴定和个体识别的检测试剂盒。所述试剂盒含有用于扩增所述SSR标记的PCR荧光引物，以待测牦牛的基因组DNA为模板，利用多重荧光PCR和毛细管电泳技术相结合进行基因型检测，试剂盒组成如表2。

表2牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测试剂盒的组成

注：该试剂盒的试剂量可用于100次20μL体系的SSR检测实验，25个个体的基因分型。

由于每个引物的扩增效率和所带荧光标记的不同，他们的扩增产物的荧光信号强度往往不同，为了使各个引物的扩增产物的荧光强度尽量保持相近，便于同时扩增后的基因分型，发明对各引物进行了浓度调节，具体见表3。

表3试剂盒中各组荧光引物的浓度和退火温度

注：1.各位点的上、下游引物浓度相同，并且在各组中成对出现；2.退火温度为复合PCR扩增实验中各组效果最佳的温度。

本试剂盒的具体操作过程如下：

(1)按照常规方法进行牦牛血液、组织样或精液样品的基因组DNA提取，可以选择商业化的试剂盒或自己配制的实验溶液。

(2)利用试剂盒中各组分扩增所述15个SSR标记的特异性引物，获得SSR位点的扩增产物。根据提取出的待测DNA样品的数量，将待测DNA样品和试剂盒中的溶液按照表4中说明的用量进行混合。

表4试剂盒的多重荧光PCR反应体系

组成成份	用量(μL)
		模板DNA(建议浓度50～500ng/μL)	0.5
10×PCR反应缓冲液	2.0
		引物混合液	2.0
ddH<sub>2</sub>O	15.5

把混合好的反应液加入PCR反应管/板中，再将其放入PCR仪中，设定好PCR的反应程序，对待测样品进行PCR扩增，PCR反应条件见表5。

表5试剂盒的多重PCR反应条件

(3)荧光标记毛细管电泳技术分析所述标记的基因型。

将上一步的每组PCR产物样品装入遗传分析仪进行电泳。由于PCR产物根据不同荧光颜色进行了标记，因而通过毛细管电泳即可获得不同SSR标记的基因型。在本申请的分型结果中，下面标注有方框的峰为有效峰，方框中数字代表扩增产物的片段长度，峰的高度代表产物的丰度，峰的颜色为荧光经激发后产生的颜色，其中，蓝色的峰代表经FAM染料标记的扩增产物，绿色的峰代表经HEX染料标记的扩增产物，黑色的峰代表经TAMRA染料标记的扩增产物，红色的峰代表经ROX染料标记的扩增产物(图1～4)。在不同的分析仪中，荧光染料经激发后产生的光可能与其本身带有的颜色不同，这对本领域技术人员来说是可以理解的。

利用GeneMapper^TM 4.0软件，设定分子量标准条带后，根据遗传分析仪所收集电泳荧光信号的颜色和位置，自动计算各标记座位的基因型，得到实际样品的基因分型数据。最后，人为校对电泳结果与基因型结果是否匹配。

(4)本发明中排除率的计算

亲子鉴定基于孟德尔遗传的分离和自由组合规律。通过基因型的匹配分析，如果符合孟德尔遗传定律，则不能排除具有亲子关系，否则可排除其亲子关系。非亲排除概率(Probability of Parentage Exclusion，PE)是评价遗传标记在亲子鉴定中实用价值大小的一个重要指标；是利用各位点的等位基因频率来计算候选亲本某标记的等位基因不是来自亲生亲本的排除概率。非亲排除概率的计算一般分以下三种情况：(1)已知候选亲本信息，另一亲本信息未知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的排除概率为PE1；(2)已知候选亲本信息，另一亲本信息已知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的排除概率为PE2；(3)排除子代与假设父母对是亲子关系的排除概率为PE3。在实际的鉴定中，需要纳入多个标记位点以提高判定的准确性。当使用m个标记时，系统的累积排除概率(Combined ExclusionProbabilities，CPE)计算公式：

其中，m代表涉入的标记数量，PE_j代表第j个标记的排除率。

在上述三种不同情况下，根据以上计算公式分别得出相应的CPE。通过计算每个候选亲本在所有检测位点的累积排除概率，即可知候选亲本为子代真实亲本的可能性大小。

根据各SSR位点的等位基因频率，计算各位点的非亲排除概率和个体排除率。通过计算它们的排除概率和累积排除概率，由表6可知，这15个SSR标记在三种不同情况下，累积排除概率三种CPE值分别高达0.99680161、0.99996200和0.99999997，而累积个体识别率更是大于0.99999999(表6)，说明这15个SSR标记组合的亲子鉴定和个体识别的效力极高。

表6牦牛15个SSR位点的多态性和排除率

注：非亲排除概率1：当另一亲本信息未知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的排除概率；非亲排除概率2：当另一亲本信息已知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的排除概率；非亲排除概率3：排除子代与假设父母对是亲子关系的排除概率；个体识别率：排除一个体与无关个体亲缘关系的排除概率。

(5)本发明中亲权指数和亲子概率的计算

亲权指数(Parentage Index，PI)是判断亲子关系的似然比，即具有假设亲本遗传表型的个体是孩子生物学亲本的概率(P_a)与随机个体是孩子生物学亲本的概率(P_r)的比值，其计算公式如下：

当应用多个基因位点进行亲子鉴定时，累积亲权指数(Combined ParentageIndex，CPI)的计算公式如下：n为检测基因位点的数目。

多个基因位点的累积亲子概率计算如下：

根据本发明中SSR基因位点的基因频率、待测牦牛的基因型和以上公式，可以计算出待测牦牛的CPI和RCP值。当CPI大于10000或者亲子概率大于99.99％时，可认定待测个体之间存在亲子关系。

(6)本发明中个体识别率的计算

个体识别率(Power of discrimination,DP)是指在生物群体中随机抽取两个个体，二者的遗传标记表型不相同的概率。采用一个标记位点的个体识别率的表达式如下：

采用多个遗传标记的累积个体识别概率计算公式：其中，n代表每个遗传标记的基因型数，p_i代表第i个基因型的频率。

实施例1：

一例牦牛三联体亲子关系鉴定：

从牦牛群体中选择一对母子关系明确的母牦牛和子代牦牛，该子代牦牛存在两个可疑父本。分别抽取母牦牛、子代牦牛和两个可疑父本(候选父本牦牛1和候选父本牦牛2)的血液，用本发明的试剂盒进行亲子关系检验。

1.样本：

(1)子代牦牛的编号为B3916091，血样管号为Y72372159；

(2)母本牦牛的编号为C1105192，血样管号为Y72372328；

(3)候选父本牦牛1的编号为C2010013，血样管号为Y72372192；

(4)候选父本牦牛2的编号为C2010073，血样管号为Y72372147。

2.提取4个牦牛血液样品的基因组DNA，使用本发明中的试剂盒对各个样品进行荧光引物扩增和毛细管电泳检测。

3.检验及结果

根据以上毛细管电泳中各扩增产物荧光信号的不同，对15个SSR位点的扩增产物长度进行读取，并将产物长度转变为SSR位点的重复数，结果见表7。

表7牦牛三联体亲子关系鉴定的基因分型

注：方框内的基因型为不符合亲缘关系的基因型。

4.鉴定结论

在被检测的15个SSR标记中，子代牦牛和候选父本牦牛1的所有SSR基因位点都符合孟德尔遗传方式(亲权系数大于0.9999)，而子代牦牛和候选父本牦牛2有6个位点不符合孟德尔遗传方式(表11)，故排除候选父本牦牛2为子代牦牛的生物学父亲，而选择候选父本牦牛1为子代牦牛的生物学父亲。

实施例2：

一例牦牛精液个体识别鉴定：

两批冷冻精液可疑为采自同一个牦牛种公牛，取牦牛种公牛的血液样品和两批冷冻精液样品，用本发明的试剂盒进行个体识别检验。

1.样本：

(1)牦牛种公牛的编号为C0610155，

(2)冷冻精液1的标号为229518；

(3)冷冻精液2的标号为229519。

2.提取牦牛种公牛血液样品和两批牦牛精液样品的基因组DNA，使用本发明中的试剂盒对各个样品进行荧光引物扩增和毛细管电泳检测。

3.检验及结果

根据以上毛细管电泳中各扩增产物荧光信号的不同，对15个SSR位点的扩增产物长度进行读取，并将产物长度转变为SSR位点的重复数，结果见表8。

表8两个牦牛个体识别鉴定的基因分型

注：方框内的基因型为不符合同一个体的基因型。

4.鉴定结论：

在被检测的15个SSR标记中，牦牛种公牛和冷冻精液2有13个位点的基因型不相同，而牦牛种公牛和冷冻精液1的15个SSR基因位点的基因型都相同(表12)，它们遗传一致性的几率大于99.9999％，说明冷冻精液1为牦牛种公牛的精液，而冷冻精液2不是。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所

<120> 牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测试剂盒及检测方法

<130> 1

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 1

cttcctgaga gaagcaacac c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 2

gctgccttct accaaatacc c 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 3

caccaataaa agtaaaaaca ccg 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 4

aagatccctt ggaggaggaa 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 5

gtcatcgtgg gggttcttat ag 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 6

attgcctcac cagcaaaaat 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 7

tcccctcact cctcattggt 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 8

tgcaggcagt ttcttaccag t 21

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 9

ggacacgact gagcaagtaa ca 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 10

gctttggcag gcagatacat 20

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 11

atttcccttc tgactggtac ttc 23

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 12

gtgtccctcc tctaatccct aa 22

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 13

agcacaaagt aaacctgcaa taa 23

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 14

cttcaccatt ggaccacgag 20

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 15

taacaaagct gctgggaaca t 21

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 16

cggagtcact ttcctcacct at 22

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 17

ggagtcgctg agggttgg 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 18

ccaaaccccc tacccaca 18

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 19

gctacaatcc agactgagca cg 22

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 20

gacacggctt agcgactgaa 20

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 21

aaaccacaga aatgcttgga ag 22

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 22

atttgcacaa gctaaatcta acaa 24

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 23

aaagtgacac aacagcttca cc 22

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 24

accgagtgtc ctagtttggc 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 25

gatgactcaa ccgcacgtct 20

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 26

aagaagtact ggttgccaat cg 22

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 27

agaagagtgt acctcctccc a 21

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 28

tccagatttt gtaccagacc at 22

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 29

actggagtag gttgccctgc 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> Bos grunniens

<400> 30

cctggcttgg tcctgtctct 20

Claims

1.牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测试剂盒，其特征在于，所述SSR分型检测试剂盒包括15个SSR位点，所述SSR位点分别为BM2113、D25GT、DXTG、YAK11、HEL6、INRA023、TGLA126、YAK07、HAUT24、INRA037、INRA063、SPS115、CSSM036、ILSTS028和YAK08。

2.根据权利要求1所述的牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测试剂盒，其特征在于，对所述SSR分型检测试剂盒上15个SSR位点进行基因分型的复合PCR扩增系统，按照所述15个SSR位点分为四组，其组合方式与相应的PCR扩增引物如下：

位点BM2113，SEQ ID No.1 S：CTTCCTGAGAGAAGCAACACC，SEQ ID No.2 U：GCTGCCTTCTACCAAATACCC，产物长度为115～133bp，重复序列为TG，重复次数为8～17，染色体位置为2；

位点D25GT，SEQ ID No.3 S：CACCAATAAAAGTAAAAACACCG，SEQ ID No.4 U：AAGATCCCTTGGAGGAGGAA，产物长度为199～213bp，重复序列为GT，重复次数为12～19，染色体位置为25；

位点DXTG，SEQ ID No.5 S：GTCATCGTGGGGGTTCTTATAG，SEQ ID No.6 U：ATTGCCTCACCAGCAAAAAT，产物长度为250～272bp，重复序列为TG，重复次数为11～22，染色体位置为X；

位点YAK11，SEQ ID No.7 S：TCCCCTCACTCCTCATTGGT，SEQ ID No.8 U：TGCAGGCAGTTTCTTACCAGT，产物长度为306～314bp，重复序列为GT，重复次数为13～17，染色体位置为1；

所述第一组采用FAM荧光素进行标记；

位点HEL6，SEQ ID No.9 S：GGACACGACTGAGCAAGTAACA，SEQ ID No.10 U：GCTTTGGCAGGCAGATACAT，产物长度为247～265bp，重复序列为GT，重复次数为9～18，染色体位置为1；

位点INRA023，SEQ ID No.11 S：ATTTCCCTTCTGACTGGTACTTC，SEQ ID No.12 U：GTGTCCCTCCTCTAATCCCTAA，产物长度为184～204bp，重复序列为TG，重复次数为9～19，染色体位置为3；

位点TGLA126G，SEQ ID No.13 S：AGCACAAAGTAAACCTGCAATAA，SEQ ID No.14 U：CTTCACCATTGGACCACGAG，产物长度为372～386bp，重复序列为TG，重复次数为6～13，染色体位置为20；

位点YAK07，SEQ ID No.15 S：TAACAAAGCTGCTGGGAACAT，SEQ ID No.16 U：CGGAGTCACTTTCCTCACCTAT，产物长度为323～339bp，重复序列为TG，重复次数为13～21，染色体位置为1；

所述第二组采用HEX荧光素进行标记；

位点HAUT24，SEQ ID No.17 S：GGAGTCGCTGAGGGTTGG，SEQ ID No.18 U：CCAAACCCCCTACCCACA，产物长度为439～455bp，重复序列为AC，重复次数为12～20，染色体位置为22；

位点INRA037，SEQ ID No.19 S：GCTACAATCCAGACTGAGCACG，SEQ ID No.20 U：GACACGGCTTAGCGACTGAA，产物长度为296～314bp，重复序列为CA，重复次数为11～20，染色体位置为10；

位点INRA063，SEQ ID No.21 S：AAACCACAGAAATGCTTGGAAG，SEQ ID No.22 U：ATTTGCACAAGCTAAATCTAACAA，产物长度为175～187bp，重复序列为TG，重复次数为12～18，染色体位置为18；

位点SPS115，SEQ ID No.23 S：AAAGTGACACAACAGCTTCACCC，SEQ ID No.24 U：ACCGAGTGTCCTAGTTTGG，产物长度为231～261bp，重复序列为CA，重复次数为14～29，染色体位置为15；

所述第三组采用TAMRA荧光素进行标记；

位点CSSM036，SEQ ID No.25 S：GATGACTCAACCGCACGTCT，SEQ ID No.26 U：AAGAAGTACTGGTTGCCAATCG，产物长度为157～179bp，重复序列为TG，重复次数为10～21，染色体位置为27；

位点ILSTS028，SEQ ID No.27 S：AGAAGAGTGTACCTCCTCCCA，SEQ ID No.28 U：TCCAGATTTTGTACCAGACCAT，产物长度为261～293bp，重复序列为GT，重复次数为8～24，染色体位置为11；

位点YAK08，SEQ ID No.29 S：ACTGGAGTAGGTTGCCCTGC，SEQ ID No.30 U：CCTGGCTTGGTCCTGTCTCT，产物长度为321～343bp，重复序列为CA，重复次数为6～17，染色体位置为6；

所述第4组采用ROX荧光素进行标记；

其中“U”代表上游引物，“S”代表下游引物。

3.根据权利要求2所述的牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测试剂盒，其特征在于，所述第一组SSR位点BM2113、D25GT、DXTG和YAK11的PCR扩增引物组成第一组引物混合液，其各自的浓度依次为4.0μmol/L、5.5μmol/L、25.0μmol/L和1.3μmol/L；

4.根据权利要求1所述的牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进行检测时，牦牛基因组DNA样本选自牦牛血液、组织样品或精液样品中的一种或多种。

5.根据权利要求1～4任一所述的牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测时的试剂包括100ng/μL的SSR标准品50μL，10×PCR反应缓冲液200μL，所述四组引物混合液各50μL，ddH₂O 1000μL×2管；所述四组引物混合液分别包括引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.8、引物SEQ ID No.9～SEQ ID No.16、引物SEQ ID No.17～SEQ ID No.24和引物SEQ ID No.25～SEQ ID No.30的组合物；

10×PCR反应缓冲液包含HS Taq DNA聚合酶0.5 U/μL，Tris 150mmol/L，MgCl₂ 25mmol/L，KCl 200mmol/L，dNTP 2.5mmol/L和BSA 650mg/L，25℃的pH值为8.4。

6.牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取牦牛基因组DNA；

2)多重荧光PCR扩增：对SSR位点分组进行分别扩增，每组反应体系相同，均为20μL，反应体系组成如下：

模板DNA0.5μL，10×PCR反应缓冲液2.0μL，引物混合液2.0μL，ddH₂O 15.5μL；

5)利用GeneMapper^TM4.0软件分析电泳数据，得到实际样品的基因分型数据。

7.根据权利要求6所述的牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测方法，其特征在于，所述基因组DNA浓度为50～500ng/μL。

8.根据权利要求6所述的牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测方法，其特征在于：所述SSR位点分为4组，第一组的4个位点为BM2113、D25GT、DXTG和YAK11，相应的PCR扩增引物核苷酸序列依次如序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.8所示，该组采用FAM荧光素进行标记；

9.根据权利要求6所述的牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测方法，其特征在于：所述第一组SSR位点BM2113、D25GT、DXTG和YAK11的PCR扩增引物组成第一组引物混合液，其各自的浓度依次为4.0μmol/L、5.5μmol/L、25.0μmol/L和1.3μmol/L；

10.根据权利要求6所述的牦牛亲子鉴定和个体识别的SSR分型检测方法，其特征在于：所述牦牛基因组DNA样本选自牦牛血液、组织样品或精液样品中的一种或多种。