CN115948605A - 一种基于dna链置换反应与per扩增的病毒检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于DNA链置换反应与PER扩增的病毒检测试剂盒，包括以下组分：可识别病毒靶标序列的DNA纳米器件；催化发夹；分子信标探针；镁离子；Bst链置换聚合酶；dNTPs；1×PBS缓冲液。本发明将DNA链置换反应和催化发夹结构有机相结合，通过引物与催化发夹结合触发级联引物交换反应的信号放大策略，利用现有的可视化信号识别系统包括荧光信号或核酸试纸条层析显色等，以实现样品中的病毒核酸的可视化检测，具有特异性好，灵敏度高，方法简单，耗时短，能快速检测病毒的基于DNA链置换反应与PER扩增的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体讲是一种基于DNA链置换反应与PER扩增的病毒检测试剂盒。
背景技术
病毒是一类严重威胁着人类健康的细胞内寄生微生物，且绝大多数的人类传染病都是由病毒引起。因而，快速、有效和灵敏的病毒检测，是目前预防、控制甚至消灭病毒的前提与基础。
传统的病毒检测技术包括直接血凝技术、聚合酶链反应(PCR)技术、基因探针技术、酶联免疫技术以及电子显微镜技术等，但这些检测方法耗时，结果不易重复，且需要有经验的技术人员。基于抗原-抗体的酶联免疫吸附试验技术，由于免疫学的方法灵敏度低，不能在发病早期就检测出病毒，这样就会导致误诊，并增加了病人的负担；虽然PCR技术灵敏度高，可从痕量样品中检测出目标分子，但其开展条件要求严格，需要精密昂贵的检测仪器、实验室环境及专业操作人员，并且耗时长。因此，要实现病毒的感染监控，亟待研制一种特异性好，灵敏度高，方法简单，耗时短，能快速检测病毒的检测试剂盒。
发明内容
本发明旨在至少部分地克服现有技术中存在的上述和/或其他潜在的问题：提供一种特异性好，灵敏度高，方法简单，耗时短，能快速检测病毒的基于DNA 链置换反应与PER扩增的试剂盒。
本发明将DNA链置换反应和催化发夹结构有机相结合，通过引物与催化发夹结合触发级联引物交换反应(Primer Exchange Reaction，PER)的信号放大策略，利用现有的可视化信号识别系统包括荧光信号或核酸试纸条层析显色等，以实现样品中的病毒核酸的可视化检测，本发明PER反应原理如图1所示。
本发明提供一种基于DNA链置换反应与PER扩增的病毒检测试剂盒，包括以下组分：可识别病毒靶标序列的DNA纳米器件；催化发夹；分子信标探针；镁离子；Bst链置换聚合酶；dNTPs；1×PBS缓冲液。
所述可识别病毒靶标序列的DNA纳米器件如图2所示，由病毒特异性引物寡核苷酸序列(p)与其互补寡核苷酸序列(t*+p*)通过退火处理制备而成，其中t*作用在于提供一段用于启动链置换反应的支点链，碱基数量可为5bp至20bp 其中之一，p*作用在于提供引物结合的一段互补寡核苷酸序列，碱基数量可为 7bp至12bp其中之一，用于引物与催化发夹结合触发原位级联引物交换反应。
所述可识别病毒靶标序列的DNA纳米器件上含有一段被封闭的病毒特异性引物寡核苷酸序列(p)，碱基数量可为7bp至12bp其中之一，其中引物(p) 的5‘端碱基可采用生物素修饰，待测病毒靶标寡核苷酸序列与引物互补寡核苷酸序列(t*+p*)结合，通过DNA链置换反应将引物(p)从DNA纳米器件中释放出来。
所述催化发夹具有如图3所示的结构，包括茎、环和一个引物结合位点的垂悬部分(p*)，其中茎部分含有一段可结合分子信标探针序列(M)及其寡核苷酸特异性互补的序列(M*)，碱基数量可为5bp至20bp其中之一，用于分子信标探针识别PER扩增的单链DNA分子产物并产生荧光信号，同时靠近环部分即茎的3’端含有引物寡核苷酸序列(p)，碱基数量可为7bp至12bp其中之一，用于下一轮与催化发夹结合触发原位级联引物交换反应。
上述催化发夹与引物寡核苷酸结合可触发原位级联引物交换反应，以生成含有“靶标核酸特异性引物序列+分子信标探针的互补序列”的多联体产物，当反应体系中含有分子信标荧光探针时，即可与多联产物结合产生荧光信号，实现靶标核酸信号放大检测。
所述催化发夹3’端碱基采用Inverted dT或“-TTTTTTT-”修饰，防止聚合酶驱动靶标核苷酸链的延伸。
所述催化发夹茎-环交接区的2个碱基进行甲基化修饰，主要作用是稳定环结构以形成发夹结构，同时其引入修饰可防止聚合酶介导的链置换反应破坏发夹结构。
本发明病毒检测试剂盒检测时，在50μL的1×PBS缓冲液中加入可识别病毒靶标序列的DNA纳米器件、催化发夹、分子信标探针、镁离子、Bst置换聚合酶、dNTPs；并加入待测靶标核酸单链DNA或RNA链后，放置恒温条件，工作温度可为25℃至37℃中任何一个温度；反应维持时间为5-15分钟，采用荧光信号检测仪或核酸试纸条层析采集信号。
本发明的有益效果是：引物交换反应(Primer Exchange Reaction，PER)是一种恒温核酸扩增方法，通过一个短的引物序列(与催化发夹的短悬垂结构序列互补)，在DNA置换酶的作用下，引物被拓展了一段催化发夹序列，随后被置换出去，而重获自由的催化发夹再进入下一轮级联进程，或是捕获新引物，或是捕获已被延长过的引物。通过一系列的延伸和置换反应，PER可恒温、可编程的形式原位自主合成具有重复序列的长单链DNA，仅需要催化发夹和引物即可执行特异性且快速的信号扩增。因此，本发明基于PER可编程的联级反应特性，构建了一种基于DNA链置换与PER恒温扩增结合的检测试剂盒，该试剂盒灵敏度高、特异性好，成本低，常温条件下就能够用于样品中痕量病毒核酸的检测。
附图说明
图1为PER反应原理示意图。
图2为实施例中DNA纳米器件结构示意图。
图3为实施例中催化发夹的结构示意图。
图4为实施例中链置换反应原理示意图。
图5为实施例中检测结果曲线图。
图6为实施例中核酸试纸条层析结果示意图。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。
实施例1
1、识别病毒靶标序列的DNA纳米器件制备
设计并化学合成所述的病毒靶标特异性引物核苷酸序列与携带Toehold的引物互补核苷酸序列，所述序列具有如图2所示的结构特征。所述的核苷酸序列溶解于杂交缓冲液(10mM Tris-Hcl,50mM NaCl,10mM MgCl2,pH＝7.4)制备成 10μM的溶液后，再将10μM引物核苷酸与10μM携带Toehold的引物互补核苷酸等体积混合，并置于95℃水浴箱中变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，使其充分杂交形成DNA纳米器件。
2、DNA催化发夹制备
设计并化学合成所述的催化发夹核苷酸序列，催化发夹具有如图3所示的结构特征。所述的催化发夹核苷酸溶解于退火缓冲液(10mM Tris-Hcl,50mM NaCl,1mM EDTA,pH＝7.5)制备成10μM的溶液，并置于95℃水浴箱中变性5 分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，使其形成稳定的发夹结构。
目标序列的检测步骤
按表1所述组分比例配置反应体系，将反应体系混合液置于恒温条件下，优选温度为30℃，反应优选时间为15分钟，采用荧光信号检测仪或核酸试纸条层析采集信号。
各组分配比如下表1所示：
实施例2
本发明以A组轮状病毒为例制备检测试剂盒：
1、利用NCBI BLAST对NCBI数据库中记录的A组轮状病毒VP6基因的序列进行比对分析，找出不同亚型内同源保守序列作为病毒特异性靶标。
(1)依据A组轮状病毒VP6基因序列设计本实施例中可选用的轮状病毒特异引物寡核苷酸序列，其序列特征如SEQ ID NO1：5’-TGCATGATAATTTAATGGGA-3’；该序列可用于荧光信号检测；
(2)依据A组轮状病毒VP6基因序列设计本实施例中可选用的轮状病毒特异引物的互补寡核苷酸序列特征如SEQ ID NO3： 5’-TCCCATTAAATTATCATGCATTGGTTGA-3’，所述引物互补寡核苷酸序列5’端含有一段未杂交结构域(Toehold，一般含有5-8个碱基)作为链置换反应的支点链，优选8个碱基。
(3)依据A组轮状病毒VP6基因序列设计本实施例中可选用的催化发夹序列，其序列特征如SEQ ID NO 4：
5’-CACCTTGTTTCCTGAGTTAATGGGA/i2OMeG//i2OMeG/CCGTTTTCG G/i2OMeC//i2OMeC/TCCCATTAACTCAGGAAACAAGGTGTCCCATTAA/InvdT /-3’
本实施例中选用的分子信标探针寡核苷酸序列如编号为SEQ ID NO5： 5’-FAM-CCAAGCAACTCAGGAAACARGGTGTCGCTTGG-BHQ1-3’。
上述分子信标探针在其寡核苷酸单链DNA分子的5’端标记荧光报告基团 FAM，3’端标记荧光淬灭基团BHQ1；5’端和3’端的6个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的碱基序列与催化发夹茎部分的 M寡核苷酸序列特异性互补，碱基数量可为14bp至20bp其中之一。
本发明所述实例中的A组轮状病毒VP6基因靶标核酸单链DNA分子与 DNA纳米器件结合，通过支点链介导的链置换反应(TSDR)将引物从适体置换出来，从而暴露引物序列。所述引物与催化发夹结合触发原位级联引物交换反应，所生成含有分子信标互补序列(M*)的多联体产物，当反应体系中含有信标分子荧光探针时，即可与多联产物结合产生荧光信号，实现病毒核酸信号放大检测。
以上所述的设计寡核苷酸序列均由化学合成而制备。
2、可识别病毒靶标序列的DNA纳米器件制备
将上述的病毒靶标特异性引物核苷酸序列与携带Toehold的引物互补核苷酸序列溶解于杂交缓冲液(10mM Tris-Hcl,50mM NaCl,10mM MgCl2,pH＝7.4)，分别制备成10μM的溶液后，再将10μM引物核苷酸与10μM携带Toehold的引物互补核苷酸等体积混合，并置于95℃水浴箱中变性5分钟，然后以每秒下降 0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，使其充分杂交形成DNA纳米器件。
3、DNA催化发夹制备
将上述催化发夹核苷酸溶解于退火缓冲液(10mM Tris-Hcl,50mM NaCl, 1mMEDTA,pH＝7.5)制备成10μM的溶液，并置于95℃水浴箱中变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，使其形成稳定的发夹结构。
4、目标序列的检测步骤
按本发明各组分的配比表1所述比例，配置反应体系，将反应体系混合液置于恒温条件下，优选温度为30℃，每个10秒采用荧光信号检测仪采集一次PER 产物荧光信号，反应持续15分钟，之后在80℃下加热10min，终止反应，结果如图5所示。
实施例3
本发明以A组轮状病毒为例描述该方法的操作步骤：
1、利用NCBI BLAST对NCBI数据库中记录的A组轮状病毒VP6基因的序列进行比对分析，找出不同亚型内同源保守序列作为病毒特异性靶标。
(1)依据A组轮状病毒VP6基因序列设计本实施例中可选用的轮状病毒特异引物寡核苷酸序列，其序列特征如SEQ ID NO 2： 5’-Biotin-TGCATGATAATTTAATGGGA-3’；该序列可用于核酸试纸条层析显色检测。
(2)依据A组轮状病毒VP6基因序列设计本实施例中可选用的轮状病毒特异引物的互补寡核苷酸序列特征如SEQ ID NO 3： 5’-TCCCATTAAATTATCATGCATTGGTTGA-3’，所述引物互补寡核苷酸序列3’端含有一段未杂交结构域(Toehold，一般含有5-8个碱基)作为链置换反应的支点链，优选8个碱基。当所述实例中的轮状病毒特异性靶序列存在时，Toehold激发一个快速的链置换反应，最终靶标和Toehold链形成完全互补的双链，并且释放出引物链，反应过程如图4所示。
(3)依据A组轮状病毒VP6基因序列设计本实施例中可选用的催化发夹序列，其序列特征如SEQ ID NO 4：
5’-CACCTTGTTTCCTGAGTTAATGGGA/i2OMeG//i2OMeG/CCGTTTTCG G/i2OMeC//i2OMeC/TCCCATTAACTCAGGAAACAAGGTGTCCCATTAA/InvdT /-3’
本实施例中选用的分子信标探针寡核苷酸序列如编号为SEQ ID NO5： 5’-FAM-CCAAGCAACTCAGGAAACARGGTGTCGCTTGG-BHQ1-3’。
以上所述的设计寡核苷酸序列均由化学合成而制备。
2、可识别病毒靶标序列的DNA纳米器件制备
将上述的病毒靶标特异性引物核苷酸序列与携带Toehold的引物互补核苷酸序列溶解于杂交缓冲液(10mM Tris-Hcl,50mM NaCl,10mM MgCl2,pH＝7.4)，分别制备成10μM的溶液后，再将10μM引物核苷酸与10μM携带Toehold的引物互补核苷酸等体积混合，并置于95℃水浴箱中变性5分钟，然后以每秒下降 0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，使其充分杂交形成DNA纳米器件。
3、DNA催化发夹制备
将上述催化发夹核苷酸溶解于退火缓冲液(10mM Tris-Hcl,50mM NaCl, 1mMEDTA,pH＝7.5)制备成10μM的溶液，并置于95℃水浴箱中变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，使其形成稳定的发夹结构。
4、目标序列的检测步骤
按本发明各组分的配比表1所述比例，配置反应体系，将反应体系混合液置于恒温条件下，优选温度为30℃，反应持续15分钟，之后在80℃下加热10min，终止反应，PER产物加入50μL样本稀释液，于室温下层析2min，肉眼进行结果判读，如图6所示，NTC为阴性，PC为阳性，阳性在T线显色，阴性样本在检测线处不显色。
以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。
Claims (6)
1.一种基于DNA链置换反应与PER扩增的病毒检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
可识别病毒靶标序列的DNA纳米器件；
催化发夹；
分子信标探针；
镁离子；
Bst链置换聚合酶；
dNTPs；
1×PBS缓冲液。
2.根据权利要求1所述的基于DNA链置换反应与PER扩增的病毒检测试剂盒，其特征在于，所述可识别病毒靶标序列的DNA纳米器件由病毒特异性引物寡核苷酸序列（p）与其互补寡核苷酸序列（t*+p*）通过退火处理制备而成，其中t*作用在于提供一段用于启动链置换反应的支点链，碱基数量为5bp-20bp，p*作用在于提供引物结合的一段互补寡核苷酸序列，碱基数量为7bp-12bp，用于引物与催化发夹结合触发原位级联引物交换反应。
3.根据权利要求1所述的基于DNA链置换反应与PER扩增的病毒检测试剂盒，其特征在于，所述可识别病毒靶标序列的DNA纳米器件上含有一段被封闭的病毒特异性引物寡核苷酸序列（p），碱基数量为7bp-12bp，待测病毒靶标寡核苷酸序列与引物互补寡核苷酸序列（t*+p*）结合，通过DNA链置换反应将引物（p）从DNA纳米器件中释放出来。
4.根据权利要求1所述的基于DNA链置换反应与PER扩增的病毒检测试剂盒，其特征在于，所述催化发夹包括茎、环和一个引物结合位点的垂悬部分（p*），其中茎部分含有一段可结合分子信标探针序列（M）及其寡核苷酸特异性互补的序列（M*)，碱基数量为5bp-20bp，用于分子信标探针识别PER扩增的单链DNA分子产物并产生荧光信号，同时靠近环部分即茎的3’端含有引物寡核苷酸序列（p），碱基数量为7bp-12bp，用于下一轮与催化发夹结合触发原位级联引物交换反应。
5. 根据权利要求1所述的基于DNA链置换反应与PER扩增的病毒检测试剂盒，其特征在于，所述催化发夹3’端碱基采用Inverted dT或“-TTTTTTT-”修饰，防止聚合酶驱动靶标核苷酸链的延伸。
6.根据权利要求1所述的基于DNA链置换反应与PER扩增的病毒检测试剂盒，其特征在于，所述催化发夹茎-环交接区的2个碱基进行甲基化修饰，主要作用是稳定环结构以形成发夹结构，同时其引入修饰可防止聚合酶介导的链置换反应破坏发夹结构。
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