CN117701778A

CN117701778A - 一种用于快速检测眼内病毒核酸的外置燃料型纳米耀斑探针及其应用

Info

Publication number: CN117701778A
Application number: CN202410138445.XA
Authority: CN
Inventors: 曹丹; 刘锦斌; 张良; 王子诚; 聂文艳; 余洪华
Original assignee: Guangdong General Hospital
Current assignee: Guangdong General Hospital
Priority date: 2024-02-01
Filing date: 2024-02-01
Publication date: 2024-03-15
Anticipated expiration: 2044-02-01
Also published as: CN117701778B

Abstract

本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种用于快速检测眼内病毒核酸的外置燃料型纳米耀斑探针及其应用。本发明所述外置燃料型纳米耀斑探针通过引入外置Fuel链以进行链驱动的链置换反应，使得纳米耀斑探针能够“多对一”地响应同一段目标核酸序列，从而产生放大效应，以获得较高的灵敏度和更低的检测限。同时在具体实施例中结果表明：该外置燃料型纳米耀斑探针在低值和中值的定量结果比多重PCR定量检测结果更可靠。

Description

一种用于快速检测眼内病毒核酸的外置燃料型纳米耀斑探针及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种用于快速检测眼内病毒核酸的外置燃料型纳米耀斑探针及其应用。

背景技术

眼内液的病毒需要采用高敏感度的方法对其进行分子生物学检测。而在病原学检测中，传统的病毒培养因其耗时较长（3-30天）、且灵敏度和分型都受限的问题，所以在临床上应用并不广泛；而血清学常见的抗体检测也因为在机体出现较晚、不能用于早期检测，且对于样本需求量相对较大的问题，也在应用方面受到了一定限制。而核酸检测，因其具有相对快速、高灵敏度、高特异性的特点，现在眼科已成为检测病毒的主流方法。PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是检测微生物引起眼内感染的最常用方法之一，作为一项通过人为设计探针和引物，以选择性地模拟DNA复制过程的生物学技术，其中模板DNA通常为病毒的特征DNA序列，而该序列参与一次PCR的循环需要经历三个步骤，分别是变性、结合和扩增；也正是通过反复地对模板链进行扩增来达到对病毒核酸的放大效应，通常经过20-40个循环后可得到大量的且易于检测的特定PCR片段，从而达到检测其核酸序列的目的。对病毒感染性眼病的检测中，检测的时间损耗和客观需求是现在最亟待攻克的两大困难。PCR及其衍生技术因耗时及存在仪器依赖而无法满足当前的临床需求。其耗时的原因首先是根据病毒的类型及载量不同，PCR的操作过程通常需要耗时4-6h；再者，当前的医疗机构对于眼内液的病原学检查多以批量送检为主，在这之中从发出标本到取回报告所耽误的时间也需要被考虑进诊疗耗时中；还有目前的核酸检测技术对仪器的依赖性仍然较强，由于检测仪器、配套设备和实验环境的必要投入使得这些检测技术难以推广；最后，其检测操作存在技术门槛，对于技术人员的培养成本更使其难以在科室内或者基层医疗机构中发展。因此，一种快速、低成本、可靠及采样现场即时检测的方法研究亟待展开。

发明内容

本发明提供一种用于快速检测眼内病毒核酸的外置燃料型纳米耀斑探针及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明所述外置燃料型纳米耀斑探针与眼内病毒特性序列反应20-30min即可进行结果检测，而且具有成本低（单个探针合成成本小于10元）、快速以及设备依赖性低的优势。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种用于快速检测眼内病毒核酸的外置燃料型纳米耀斑探针，包括检测HSV-1病毒的外置燃料型纳米耀斑探针、检测HSV-2病毒的外置燃料型纳米耀斑探针、检测CMV病毒的外置燃料型纳米耀斑探针、检测EBV病毒的外置燃料型纳米耀斑探针和检测VZV病毒的外置燃料型纳米耀斑探针中的一种或几种；

所述检测HSV-1病毒的外置燃料型纳米耀斑探针包括HSV-1纳米耀斑探针和外置HSV-1-Fuel链；所述HSV-1纳米耀斑探针中的HSV-1反应链、HSV-1连接链和HSV-1信号链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-4所示，外置HSV-1-Fuel链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述检测HSV-2病毒的外置燃料型纳米耀斑探针包括HSV-2纳米耀斑探针和外置HSV-2-Fuel链；所述HSV-2纳米耀斑探针中的HSV-2反应链、HSV-2连接链和HSV-2信号链的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-9所示，外置HSV-2-Fuel链的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述检测CMV病毒的外置燃料型纳米耀斑探针包括CMV纳米耀斑探针和外置CMV-Fuel链；所述CMV纳米耀斑探针中的CMV反应链、CMV连接链和CMV信号链的核苷酸序列如SEQID NO.12-14所示，外置CMV-Fuel链的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

所述检测EBV病毒的外置燃料型纳米耀斑探针包括EBV纳米耀斑探针和外置EBV-Fuel链；所述EBV纳米耀斑探针中的EBV反应链、EBV连接链和EBV信号链的核苷酸序列如SEQID NO.17-19所示，外置EBV-Fuel链的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

所述检测VZV病毒的外置燃料型纳米耀斑探针包括VZV纳米耀斑探针和外置VZV-Fuel链；所述VZV纳米耀斑探针中的VZV反应链、VZV连接链和VZV信号链的核苷酸序列如SEQID NO.22-24所示，外置VZV-Fuel链的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。

本发明所述反应链的5’-端连接巯基，并包含数个用于修饰GNP核心的重复碱基，长度选定范围为10个，碱基类型为腺嘌呤；连接链其3’-端应与反应链当中的5’-端中重复碱基后的序列互补，3’-端则应依次与信号链的前端、特征序列分别互补；此外，与上述结构形成反应链-连接链-信号链后还应预留数个碱基的翘除位点方便其后续与特征序列、燃料链分别结合，为控制变量，其翘除位点长度设计为3个碱基；信号链的3’-端中包含数个用于修饰荧光组分的重复碱基，长度选定范围为10个，碱基类型应与连接链保持一致；外置Fuel链其3’-端应与连接链的5’-端完全互补，且能够形成相对稳定的寡核苷酸双链。

优选的，所述HSV-1信号链、HSV-2信号链、CMV信号链、EBV信号链和VZV信号链的荧光基团均为FAM。

优选的，所述HSV-1反应链、HSV-2反应链、CMV反应链、EBV反应链和VZV反应链的5’端均修饰有巯基。

优选的，所述金纳米颗粒的粒径为13nm。

优选的，所述纳米耀斑探针的制备方法包括以下步骤：

将金纳米颗粒溶液与反应链混合后孵育，得到GNP-DNA；所述反应链包括HSV-1反应链、HSV-2反应链、CMV反应链、EBV反应链或VZV反应链；

在氯化镁溶液中添加GNP-DNA和连接链，进行孵育和离心，得GNP-Linker；所述GNP-DNA和连接链的摩尔比为1:60；所述连接链包括HSV-1连接链、HSV-2连接链、CMV连接链、EBV连接链或VZV连接链；

在氯化镁溶液中添加GNP-Linker和信号链，进行孵育和离心，得纳米耀斑探针；所述GNP-Linker和信号链的摩尔比为1:40；所述信号链包括HSV-1信号链、HSV-2信号链、CMV信号链、EBV信号链或VZV信号链。

本发明提供了上述外置燃料型纳米耀斑探针在制备检测眼内病毒核酸产品中的应用，所述产品包括试剂、芯片、试剂盒或生物传感器。

优选的，所述眼内病毒包括HSV-1病毒、HSV-2病毒、CMV病毒、EBV病毒和VZV病毒中的一种或几种。

本发明提供了一种检测眼内病毒核酸的试剂盒，所述试剂盒包括上述的外置燃料型纳米耀斑探针。

优选的，所述试剂盒的待检测样本为前房水或玻璃体液。

优选的，所述眼内病毒包括HSV-1病毒、HSV-2病毒、CMV病毒、EBV病毒和VZV病毒中的一种或几种

本发明公开了以下技术效果：

本发明所述外置燃料型纳米耀斑探针与眼内病毒特性序列反应20-30min即可进行结果检测，而且具有成本低（单个探针合成成本小于10元）、可现场检测以及检测结果可靠的优势。本发明所述外置燃料型纳米耀斑探针通过引入外置Fuel链以进行链驱动的链置换反应，使得纳米耀斑探针能够“多对一”地响应同一段目标核酸序列，从而产生放大效应，以获得较高的灵敏度和更低的检测限。具体原理为：在具体的响应过程中，纳米耀斑会先识别特征的核酸序列，使信号链脱离探针、产生荧光，随之与外置Fuel链进行第二次链置换反应，从而使得特征序列脱离探针，并响应下一个核酸探针。同时在具体实施例中结果表明：该外置燃料型纳米耀斑探针在低值和中值的定量结果比多重PCR定量检测结果更可靠。而且利用本发明所述外置燃料型纳米耀斑探针能够建立用于眼内液即时检测的生物传感分析系统。由此可见，本发明所述外置燃料型纳米耀斑探针为病毒感染性眼病检测提供了新的道路。

而且本发明所述外置燃料型纳米耀斑探针与眼内病毒特性序列反应20-30min即可进行结果检测，相较于现有技术（4-6h），大大缩短了检测时间，同时本发明所述外置燃料型纳米耀斑探针仅需与便携式荧光仪配合实用，而且具有成本低（单个探针合成成本小于10元）、快速以及设备依赖性低的优势。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为外置燃料型纳米耀斑探针信号放大机制图，其中a为静止态的纳米耀斑探针探针，b为纳米耀斑探针探针响应开始，c为纳米耀斑探针探针响应特征序列，d为纳米耀斑探针探针响应燃料链，e为纳米耀斑探针探针释放特征序列，f为纳米耀斑探针探针响应结束；

图2为基于HSV-1的外置燃料型纳米耀斑探针的设计原理图；

图3为外置燃料型纳米耀斑探针的局部图，其中1为金纳米颗粒，2为反应链，21为巯基基团，22为反应链的寡核苷酸序列，3为连接链，31为连接链的寡核苷酸序列，4为信号链，41为荧光染料FAM，42为信号链的寡核苷酸序列；

图4为外置燃料型纳米耀斑探针的整体图；

图5为HSV-1病毒的外置燃料型纳米耀斑探针中各寡核苷酸片段的链置换及分布情况图；

图6为HSV-2病毒的外置燃料型纳米耀斑探针中各寡核苷酸片段的链置换及分布情况图；

图7为CMV病毒的外置燃料型纳米耀斑探针中各寡核苷酸片段的链置换及分布情况图；

图8为EBV病毒的外置燃料型纳米耀斑探针中各寡核苷酸片段的链置换及分布情况图；

图9为VZV病毒的外置燃料型纳米耀斑探针中各寡核苷酸片段的链置换及分布情况图；

图10为病毒特征序列/外置Fuel链浓度比例响应曲线；

图11为外置燃料型纳米耀斑探针响应水平与病毒浓度的关系对比图；

图12为目标病毒的外置燃料型纳米耀斑探针与多重PCR的定量检测结果对比图，其中，样本01-03的浓度为100copies/mL，样本04-06的浓度为1000copies/mL，样本07-09的浓度为1000copies/mL，纳米耀斑探针为外置燃料型纳米耀斑探针；

图13为琼脂糖凝胶电泳图，其中①为GNP-DNA1，②为GNP-DNA1-Linker，③为探针(GNP-DNA1-LINKER-FAM)，④为探针+目标DNA（特征序列），⑤为探针+燃料，⑥为响应探针(探针+目标DNA+燃料)；

图14为实施例7中HSV-1的外置燃料型纳米耀斑探针对非目标序列的响应水平考察；

图15为实施例7中HSV-2的外置燃料型纳米耀斑探针对非目标序列的响应水平考察；

图16为实施例7中CMV的外置燃料型纳米耀斑探针对非目标序列的响应水平考察；

图17为实施例7中EBV的外置燃料型纳米耀斑探针对非目标序列的响应水平考察；

图18为实施例7中VZV的外置燃料型纳米耀斑探针对非目标序列的响应水平考察；

图19为实施例8中外置燃料型纳米耀斑探针对目标序列的响应水平考察结果图，左侧为各项处理的描述图，右侧为荧光强度图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1 根据5种常见眼内感染病毒（HSV-1、HSV-2、CMV、EBV和VZV）的特征片段设计配套的外置燃料型纳米耀斑探针（反应链、连接链、信号链和外置Fuel链），具体的序列信息详见表1。

表1 序列信息

设计原理为：以HSV-1型探针为例（图2），在寡核苷酸链的配置上，发明人首先在连接链中选取了6个碱基长度的循环翘除位点（-GTAGGG-）；其次，为了使得寡核苷酸链与纳米金粒子有足够的修饰空间，在反应链的5’端（GNP结合端）设置了10个腺嘌呤碱基长度的重复核苷酸序列，并在该片段的5’端以巯基修饰；同理在信号链5’端（FAM结合端）设置了5个腺嘌呤碱基长度的重复序列；而且，我们在设计过程中还将特征序列、外置Fuel与Linker链的结合位点分别延长，便于与支架产生更强的结合力。

工作原理为：在具体的响应过程中，纳米耀斑会先识别特征的核酸序列（图1中的a），使信号链脱离探针、产生荧光（图1中的c），随之与外置Fuel链进行第二次链置换反应（图1中的d和图1中的e），从而使得特征序列脱离探针，并响应下一个核酸探针（图1中的f和图1中的b）。

实施例2 纳米耀斑探针的合成

若无特殊要求，“%”均代表质量百分含量。

一、制备金纳米颗粒（GNPs）：

①13nm的GNPs：

试剂：王水、氯金酸溶液（0.01%）、柠檬酸三钠（1%）和去离子水；

仪器：烧杯、棕色试剂瓶（氯金酸）、移液管和过滤器；

制备的步骤：

1.所有玻璃器皿浸泡王水8h以上，烧杯、移液管和棕瓶用前用去离子水冲洗；

2.烧杯中加入100mL氯金酸（0.01%），搅拌加热至完全沸腾；

3.在步骤“2.”中加入0.1g柠檬酸三钠和9.9mL水，溶解为柠檬酸三钠（1%）溶液；

4.在步骤“3.”中加入3.5mL柠檬酸三钠溶液，搅拌加热至溶液变为稳定的酒红色，并保持微沸10-15min；

5.继续搅拌、停止加热，冷却到室温后过滤摇匀；

6.保存至4℃备用。

②30nm/40nm的GNPs：

与13nm的GNPs的制备方法相同，区别为在步骤“3.”加入2.1mL或1.75mL柠檬酸三钠（1%）溶液，搅拌加热至溶液变为稳定的酒红色，并保持微沸10-15min；

二、修饰GNP-DNA1

试剂：表1中各个病毒对应的DNA1链、磷酸三氯乙酯（TCEP，3mM）、步骤“一”制备得到不同粒径的GNP、磷酸缓冲液（PB，0.2M，pH7.4）、氯化钠（4M）和磷酸缓冲生理盐水（PBS，10mM）；

仪器：离心管和离心机；

制备步骤：

1.粉状DNA1链根据的粉状DNA1的光密度（OD）加入适当比例的TE缓冲液（说明书中记载的）溶解；

2.在5μL TCEP（15mM）中加入100μM DNA1链（10μL），处理DNA1链的二硫键1h；之后将所得的DNA在95℃下变性5min；

3.在步骤“2.”中加入过量GNP（10nM 300μL），在-20℃冰箱下孵育过夜；

4.计算配置的13nm GNP、30nm GNP以及40nm GNP摩尔浓度后保存至4℃环境，根据朗伯比尔定律（A=εbc），其中A=吸光度=1.24257；13nm GNP的ε=摩尔吸光系数=2.7×10⁸L/mol×cm^-1，b=吸收层厚度=1cm，得出c=吸光物质浓度=0.46×10^-8M=4.6nM，同理计算出30nmGNP的浓度为4.2nM，40nm GNP的浓度为6.1nM。

三、纳米耀斑探针（修饰GNP-FAM或GNP-DNA1-LINKER-FAM）

试剂：巯基乙醇（MCH，100μM）、步骤“二”制备得到不同的修饰GNP-DNA、表1中各个病毒对应的Linker、表1中各个病毒对应的FAM、PBS、NaCl（50mM）和MgCl₂（2.5mM）；

仪器：离心管和离心机；

制备步骤：

1.加入45μL MCH（100μM）处理GNP-DNA（10nM 300μL），其作用是封闭金粒子空位以及舒展DNA，MCH和GNP-DNA的摩尔比为1500:1，静置1h；

2.在1.3wrpm转速下，离心30min，洗涤后取沉淀GNP-DNA用300μL PBS回收；

3.在33μL氯化镁溶液（MgCl₂溶液）中（MgCl₂溶液中MgCl₂的终浓度为20mM）中加入沉淀GNP-DNA和Linker（7.5μL），沉淀GNP-DNA和Linker的摩尔比为1:60；将溶液在90℃下加热10min，冷却至室温并4℃保存6h以上；

4.在1.3wrpm转速下，离心30min，洗涤后取沉淀GNP-Linker用300μL PBS回收；

5.在33μL MgCl₂溶液中（MgCl₂溶液中MgCl₂的终浓度为20mM）中加入沉淀GNP-Linker和FAM（5μL），沉淀GNP-Linker和FAM的摩尔比为1:40；将溶液在37℃下孵育过夜，冷却至室温并4℃保存12h以上；

6.在1.3wrpm转速下，离心30min，洗涤后取沉淀GNP-FAM用300μL PBS回收，得到3种不同粒径的纳米耀斑探针；纳米耀斑探针的整体结构和局部结构如图3和图4所示。

实施例3 金纳米颗粒的粒径变化对探针合成的影响

为了深入探究三种粒径的病毒探针在不同浓度序列下达成的响应强度，我们将5种病毒的特征序列分别稀释为10μM、10nM、10pM以及10fM，分别加入至三种不同粒径纳米耀斑探针（实施例2制备得到）中充分反应后，其中纳米耀斑探针的浓度为10nM，纳米耀斑探针的荧光水平变化如表2所示，结果显示当目标序列浓度为10fM时，30nm和40nm的探针荧光强度均无明显变化，仅有13nm粒径探针能完成明显响应，表明13nm探针更适合作为目标病毒的纳米耀斑探针核心。

表2 三种不同粒径纳米耀斑探针在不同浓度目标序列下的荧光强度量化指标

实施例4 外置燃料型纳米耀斑探针之间的杂交配对能力评估

使用NUPACK算法评估表1中每一组外置燃料型纳米耀斑探针之间的杂交方式和稳定性，计算出各组分间各自游离或是相互结合的吉布斯自由能和反应熵，且自由能其负值大小应满足三个条件：①特征序列＞信号链；②外置Fuel链（燃料链）＞特征序列；③外置Fuel链（燃料链）＞反应链，计算结果显示表1提供的外置燃料型纳米耀斑探针之间能够稳定生成“反应链-连接链-信号链”三段式的纳米耀斑探针；检测不同病毒的外置燃料型纳米耀斑探针第一次反应中目标病毒的特征序列能够置换信号链、第二次反应中外置Fuel链（燃料链）置换特征序列；由此可见，在两次纳米耀斑循环置换的过程中，均能生成正确的置换组分。

同时对实施例2制备得到的GNPs粒径为13nm的5种外置燃料型纳米耀斑探针对5种目标病毒（HSV-1病毒、HSV-2病毒、CMV病毒、EBV病毒和VZV病毒）特征序列的循环效率进行计算，图5-图9中展示了计算结果。5种外置燃料型纳米耀斑探针对于特征序列的循环利用率均已达到较高水平，分别为96%（图5）、96%（图6）、97%（图7）、99%（图8）和94%（图9）。

实施例5 最佳外置Fuel链添加浓度比例的探究

为了探究最佳外置Fuel链添加浓度比例，该实施例检测了表1中每种病毒的特征序列与实施例2制备得到的GNPs粒径为13nm的纳米耀斑探针和外置Fuel链在室温下避光反应30min后，其中纳米耀斑探针的浓度为10nM，测定并记录其与实施例2制备得到的GNPs粒径为13nm的纳米耀斑探针和表1中外置Fuel链响应后的荧光强度并描绘出该特征序列/外置Fuel链浓度比例（S:F）响应曲线。结果如图10所示，在S:F为0至120时，荧光强度能迅速上升，并在约为120至150时达到平台期，表示在添加浓度≥150倍特征序列浓度的外置Fuel链时，特征序列的纳米耀斑循环几乎不再进行，也就是特征序列的循环放大效应已达到极限。

为了保证特征序列在检测中能够最大程度地放大荧光信号，以达到最大响应水平，我们在后续实验中在外置燃料型纳米耀斑探针体系中将会添加终浓度至少为特征序列浓度的200倍外置Fuel链。

实施例6 一般探针和循环探针的电泳结果和荧光强度结果

针对HSV-1病毒进行的如下实验：

取制备好的GNP-DNA1、GNP-DNA1-LINKER和GNP-DNA1-LINKER-FAM，将GNP-DNA1-LINKER-FAM分别分为四份，之后分别加入2μL灭菌水、2μL目标DNA（特征序列）、燃料链及目标DNA（特征序列）+燃料链。在2%的琼脂糖凝胶中以0.5×TBE为缓冲体系，观察电泳电压为70V、时间为45min，45min后的各条带的移动距离。

对上述组分共同进行琼脂糖凝胶电泳共同进行了琼脂糖凝胶电泳，其结果如图13所示：不难发现在1-3号孔中，随着探针组分的修饰，条带逐渐变重，表明探针重量随之增大；而在4-5号孔中，探针未能完全/未能响应，因此条带重量未发生明显改变；在6号孔中，燃料和序列的共同作用使得纳米耀斑循环充分进行，使得条带明显减轻，表明探针重量大大减少。以上合成与响应过程表明探针在结合过程中能够按照设计层层组装，并且在响应时能够在结构上符合纳米耀斑循环的理论预期。

实施例6

一、试剂来源：DNA恒温快速扩增试剂盒购买于安普未来（常州）生物科技有限公司、病毒核酸质控品（HSV-1病毒、HSV-2病毒、CMV病毒、EBV病毒和VZV病毒）购买于上海朝瑞生物科技有限公司以及眼内液样本收集于广东省人民医院眼科眼内病液标本库。

二、检测过程：

A.取样：在既往建立的眼内液标本库中获取45份已明确排除病毒感染性眼病的标本（每一份含前房水100-200μL或玻璃体液200-300μL）。使用标准添加法，加入已定量标准株病毒（HSV-1病毒、HSV-2病毒、CMV病毒、EBV病毒或VZV病毒），其添加浓度分别为1×10²copies/μL、2×10²copies/μL、5×10²copies/μL、1×10³copies/μL、2×10³copies/μL、5×10³copies/μL、1×10⁴copies/μL、2×10⁴copies/μL、5×10⁴copies/μL，均收集在无菌Eppendorf管中；

B.按照DNA恒温快速扩增试剂盒内的说明提取并扩增眼内液样本的DNA，得到模板DNA（特征序列）；

C.外置燃料型纳米耀斑探针的检测方法为：将实施例2制备得到的GNPs粒径为13nm的纳米耀斑探针稀释为10nM并取200μL，得到探针体系，在探针体系中添加过量的外置Fuel链（终浓度为模板DNA浓度的200×），之后添加20μL的模板DNA，在室温下避光反应20min后，记录下其荧光峰值强度。结果如图11所示，不难发现大多数病毒外置燃料型纳米耀斑探针的响应强度均随着目标病毒浓度的增加而稳定上升，表示这些病毒有着相对良好的半定量作用；而HSV-2在病毒浓度达到5000 copies/μL后则迅速上升，使得其响应曲线呈现明显的非线性趋势，与其余四种相比较差，这中情况会使得前半段的结果偏大一些，提示当HSV-2在病毒浓度达到5000 copies/μL后,该外置燃料型纳米耀斑探针的定量能力会较差。

实施例7

试剂与仪器：DNA引物序列购买于生工生物工程（上海）股份有限公司；石英半微量荧光四通光比色皿购买于笛柏生物科技（上海）有限公司；低吸附透明离心管购买于高教研（北京）科技有限公司；96孔黑色酶标板不透光荧光盘购买于金典生化器材（青岛）有限公司；超敏多功能成像系统：美国ImageQuant 800；荧光光度计：美国PerkinElmer（LS-55）。

具体步骤如下：

A.对照组的设计：以表1中的特征序列为参考，分别设计5种病毒特征序列中随机错配碱基数目为1、2、3或4个的错配目标碱基，具体序列详见表3。

表3 序列信息

注：加粗部分为错配碱基。

B.分别取5种病毒纳米耀斑病毒探针（10nM，各40μL共200μL），分别加入对应病毒错配碱基链（100fM，20μ）和特征序列（100fM，20μ）；随后在室温、过量外置Fuel（200×）的条件下使得探针充分反应。

C.测定并记录其探针响应后的荧光强度。

其结果如图14-图18所示，不难发现随机错配碱基数目为0时，探针都能明显响应目标序列；当随机错配碱基数目为1时，探针的响应强度明显下降；而随机错配碱基数目为≥3时，所有的病毒探针都几乎不响应错配序列。表明该病毒探针具有极高的特异性，能相对准确地识别特异序列。

实施例8

具体步骤如下：

A.准备探针体系，包含探针5种病毒纳米耀斑病毒探针（10nM，40μL）、目标DNA（100fM，20μ）和足量燃料序列（200×）；

B.在96孔板中依次加入HSV-1、HSV-2、CMV、EBV、VZV和5种探针的混合体系并重复6组；在6组重复样中依次滴入HSV-1、HSV-2、CMV、EBV、VZV和5种病毒的混合特征序列的溶液，并按照加入特征序列的浓度添加过量燃料；

C.使用超敏多功能成像系统记录96孔板中各孔内的荧光强度变化。

其结果如图19所示，图中①至⑤分别代表HSV-1、HSV-2、CMV、EBV、VZV共5种病毒探针、⑥则为5种探针的混合体系，1至5代表HSV-1、HSV-2、CMV、EBV、VZV共5种目标病毒的核酸序列，6则为5种序列的混合体系，其中不难发现有且仅有探针组分能和核酸组分对应的时候，体系中才会呈现强荧光，表明探针在多重检测中仍然能顺利识别目标序列，而不受其他病毒序列的干扰。

实施例9

二、检测过程：

A.取样：在既往建立的眼内液标本库中获取45份已明确排除病毒感染性眼病的标本（每一份含前房水100-200μL或玻璃体液200-300μL）。使用标准添加法，加入已定量标准株病毒（HSV-1病毒、HSV-2病毒、CMV病毒、EBV病毒和VZV病毒，购自上海朝瑞生物科技有限公司），其添加浓度分别为10²copies/μL、10³copies/μL、10⁴copies/μL，将同一标本分为两组，均收集在无菌Eppendorf管中，其中1份使用外置燃料型纳米耀斑探针，另一份使用常见眼内感染病毒多重实时荧光PCR检测试剂盒中的引物和探针进行多重PCR的定量检测（该试剂盒公开于申请号为“CN 106834548 A”的专利中）进行对照检测；

B.多重PCR定量检测具体如下：

试剂/仪器来源：PCR扩增反应标准品样本（PCR-Mix、ROX）购买自基迪奥生物科技（广州）有限公司，荧光定量PCR系统为新加坡赛默飞ABI StepOnePlus；超纯水系统为美国PALL LIFE SCIENCE Cascada；

方法：添加待测样本（2μL）至反应体系PCR-Mix（厂家：基迪奥生物科技（广州）有限公司）、ROX后放入PCR仪中并启动运行，设置其周期分为四个阶段，其中阶段1：在95℃条件下反应5min；阶段2：在95℃条件下反应10s；阶段3：在60℃条件下反应30s；阶段4：在60℃条件下反应30s；其中阶段2和阶段3共持续40周期，阶段1和阶段4分别持续1周期；

C.外置燃料型纳米耀斑探针的检测方法：

按照DNA恒温快速扩增试剂盒内的说明提取并扩增眼内液样本的DNA，得到模板DNA（特征序列）；

将实施例2制备得到的GNPs粒径为13nm的纳米耀斑探针稀释为10nM并取200μL，得到探针体系，在探针体系中添加过量的外置Fuel链（终浓度为模板DNA浓度的200×），之后添加20μL的模板DNA，在室温下避光反应20min后，记录下其荧光峰值强度，每个样本进行3个重复。

三、检测结果：

该实施例共使用了45份已明确排除病毒感染性眼病的人源性眼内液标本，在添加5种不同浓度的病毒标准株并充分反应后外置燃料型纳米耀斑探针的响应情况如图12，不难发现大多数病毒探针的响应强度均随着目标病毒浓度的增加而稳定上升，表示这些病毒有着相对良好的半定量作用。由此可见，所有的目标病毒的外置燃料型纳米耀斑探针均能在该病毒浓度区间内完成响应；但在添加浓度为低值和中值的标本中，HSV-1和HSV-2外置燃料型纳米耀斑探针的定量结果比起多重PCR的定量检测的结果存在较大差异，而在高值的标本中，定量结果的差异进一步变大，比如，HSV-2在病毒浓度达到5000 copies/μL后则迅速上升，使得其响应曲线呈现明显的非线性趋势，提示该病毒的外置燃料型纳米耀斑探针定量能力会较差。同时与多重PCR的定量检测的相比，该外置燃料型纳米耀斑探针在低值和中值的定量结果更可靠。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种用于快速检测眼内病毒核酸的外置燃料型纳米耀斑探针，其特征在于，包括检测HSV-1病毒的外置燃料型纳米耀斑探针、检测HSV-2病毒的外置燃料型纳米耀斑探针、检测CMV病毒的外置燃料型纳米耀斑探针、检测EBV病毒的外置燃料型纳米耀斑探针和检测VZV病毒的外置燃料型纳米耀斑探针中的一种或几种；

所述检测CMV病毒的外置燃料型纳米耀斑探针包括CMV纳米耀斑探针和外置CMV-Fuel链；所述CMV纳米耀斑探针中的CMV反应链、CMV连接链和CMV信号链的核苷酸序列如SEQ IDNO.12-14所示，外置CMV-Fuel链的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

所述检测EBV病毒的外置燃料型纳米耀斑探针包括EBV纳米耀斑探针和外置EBV-Fuel链；所述EBV纳米耀斑探针中的EBV反应链、EBV连接链和EBV信号链的核苷酸序列如SEQ IDNO.17-19所示，外置EBV-Fuel链的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

所述检测VZV病毒的外置燃料型纳米耀斑探针包括VZV纳米耀斑探针和外置VZV-Fuel链；所述VZV纳米耀斑探针中的VZV反应链、VZV连接链和VZV信号链的核苷酸序列如SEQ IDNO.22-24所示，外置VZV-Fuel链的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。

2.根据权利要求1所述的外置燃料型纳米耀斑探针，其特征在于，所述HSV-1信号链、HSV-2信号链、CMV信号链、EBV信号链和VZV信号链的荧光基团均为FAM。

3.根据权利要求1所述的外置燃料型纳米耀斑探针，其特征在于，所述HSV-1反应链、HSV-2反应链、CMV反应链、EBV反应链和VZV反应链的5’端均修饰有巯基。

4.根据权利要求1所述的外置燃料型纳米耀斑探针，其特征在于，所述纳米耀斑探针中的金纳米颗粒的粒径为13mm。

5.根据权利要求1所述的外置燃料型纳米耀斑探针，其特征在于，所述纳米耀斑探针的制备方法包括以下步骤：

6.权利要求1-5任一项所述外置燃料型纳米耀斑探针在制备检测眼内病毒核酸产品中的应用，其特征在于，所述产品包括试剂、芯片、试剂盒或生物传感器。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述眼内病毒包括HSV-1病毒、HSV-2病毒、CMV病毒、EBV病毒和VZV病毒中的一种或几种。

8.一种检测眼内病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-5任一项所述的外置燃料型纳米耀斑探针。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的待检测样本为前房水或玻璃体液。

10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述眼内病毒包括HSV-1病毒、HSV-2病毒、CMV病毒、EBV病毒和VZV病毒中的一种或几种。