CN114395636B

CN114395636B - 一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原体检测系统及其应用

Info

Publication number: CN114395636B
Application number: CN202210128562.9A
Authority: CN
Inventors: 郝文波; 黄颖而; 陈佳灵
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2022-02-11
Filing date: 2022-02-11
Publication date: 2024-04-23
Anticipated expiration: 2042-02-11
Also published as: CN114395636A

Abstract

本发明公开了一种基于RPA‑CRISPR/Cas12a的人型支原体检测系统及其应用，涉及微生物检测领域；所述检测系统包括RPA扩增引物对、探针、crRNA和AsCas12a蛋白；所述RPA扩增引物对为如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列；所述探针的序列为SEQ ID NO:16所示序列；所述crRNA为SEQ ID NO:10‑12任一项所示序列。本发明基于该RPA‑CRISPR/Cas12a检测系统构建的三种快速核酸检测人型支原体的方法增加了检测的灵敏度，并且本发明方法显示出具有极高的特异性，为人型支原体的检测提供了新的技术平台。

Description

一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原体检测系统及其应用

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，特别是涉及一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原体检测系统及其应用。

背景技术

支原体是体积最小，能自我复制的原核生物。其中较多感染包括解脲脲原体和人型支原体。人型支原体(Mycoplasma homini,M.homini)是泌尿生殖道感染的主要病原体之一，主要通过分解精氨酸产生氨，对宿主细胞造成免疫刺激和人体危害，引起泌尿生殖道和外生殖道感染。尤其发生在女性患者中，能够引起女性阴道炎、产道感染等疾病。国内外学者发现，随着人类性意识的开放，抗生素的不规范使用，临床检测技术相对落后等，造成部分患者确诊困难，影响后续治疗效果。

在人型支原体的检测鉴定方法研究方面，从传统的形态学鉴定到分子检测技术均有报道。目前人型支原体检测主要采用液体培养法和金标准固体培养法。而相较于其他生殖道相关的病原体，人型支原体无细胞壁，生长缓慢，对培养鉴定要求及其严格，使得分离培养较为困难，费时费力。qPCR是一种高灵敏高特异性的核酸检测技术，但这种方法需要专业人员操作以及需要复杂的仪器设备，并不是所有的实验室都具备这样的检测条件，且耗时长，成本高，从而阻碍该检测方法的大范围推广。因此，建立一种快速，便捷，灵敏的实验室诊断方法极其必要。

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)规律成簇间隔短回文重复序列以及Cas(CRISPR-associated proteins)CRISPR相关联蛋白构成CRISPR/Cas系统。研究者发现CRISPR/Cas系统不仅具有基因编辑能力，还可用于基因诊断。随着对CRISPR/Cas系统的深入研究，已有多种CRISPR/Cas系统被开发为快速、灵敏的核酸检测技术。其中II类Cas蛋白具有“附带切割”特性，在核酸检测上具有巨大的应用潜能和研究开发价值。以张锋团队发现的II类V型Cas12a蛋白为例，在crRNA引导下，Cas12a蛋白能够特异性识别目标ssDNA并切割，伴随附带切割功能，激活非特异性ssDNA的断裂能力。基于该原理，借助DNA探针这种非特异的ssDNA片段加入，通过荧光信号的释放提示靶标基因存在，从而推断样品中是否含有待检的病原体。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原体检测系统及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明采用CRIAPR/Cas12a系统、RPA(重组酶聚合酶扩增技术)、荧光实时监测、侧流层析技术相结合的方法，实现人型支原体的检测，解决了人型支原体筛查的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原体检测系统，所述检测系统包括RPA扩增引物对、探针、crRNA和AsCas12a蛋白；

所述RPA扩增引物对为如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列；

所述探针的序列为SEQ ID NO:16所示序列；

所述crRNA为SEQ ID NO:10-12任一项所示序列。

进一步地，所述crRNA的制备方法为：先按照SEQ ID NO:7-9任一项所示的DNA单链制备DNA体外转录模板，再根据所述DNA体外转录模板转录制备得到所述crRNA；其中，SEQID NO:10所示crRNA按照SEQ ID NO:7所示的DNA单链制备得到，SEQ ID NO:11所示crRNA按照SEQ ID NO:8所示的DNA单链制备得到，SEQ ID NO:12所示crRNA按照SEQ ID NO:9所示的DNA单链制备得到。

优选地，所述crRNA为SEQ ID NO:12所示序列。

本发明还提供上述的基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原体检测系统在制备检测人型支原体的试剂盒中的应用。

进一步地，所述试剂盒检测人型支原体的方法包括以下步骤：

(1)以待测菌的基因组DNA为模板，采用上述的RPA扩增引物对进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；

(2)配制CRISPR/Cas12a反应液，所述CRISPR/Cas12a反应液包括上述的探针、crRNA和AsCas12a蛋白，以及步骤(1)制备的RPA扩增产物；所述探针一端标记FAM，另一端标记BHQ；

(3)利用步骤(2)制备的CRISPR/Cas12a反应液进行CRISPR/Cas12a反应，之后对荧光强度进行检测。

(2)配制CRISPR/Cas12a反应液，所述CRISPR/Cas12a反应液包括上述的探针、crRNA和AsCas12a蛋白，以及步骤(1)制备的RPA扩增产物；所述探针一端标记FITC，另一端标记Biotin；

(3)利用步骤(2)制备的CRISPR/Cas12a反应液进行CRISPR/Cas12a反应，之后用胶体金侧流层析试纸条进行检测。

(3)利用步骤(2)制备的CRISPR/Cas12a反应液进行CRISPR/Cas12a反应，之后用时间分辨铕标微球免疫层析试纸条进行检测。

本发明还提供一种检测人型支原体的试剂盒，包括上述的基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原体检测系统。

进一步地，所述试剂盒还包括胶体金侧流层析试纸条或时间分辨铕标微球免疫层析试纸条。

进一步地，所述试剂盒通过检测荧光强度显示检测结果。

胶体金快速检测诊断技术是一种新型体外诊断技术，将已知的抗原或者抗体通过胶体金标记后，通过抗原抗体特异性结合反应使胶体金聚集显色达到肉眼可见的识别目标检测物是否存在于样品中。该技术便捷，稳定性好，不需要特殊仪器设备，结果直观。但在微生物检测上，由于微生物抗原抗体检测的代表性差，特别是针对需早期诊断的病原体，抗原量少，抗体检测不出来，因此很大程度限制了胶体金试纸条在微生物检测的广泛运用。为了解决这种局限性，我们将CRISPR/Cas12a与胶体金试纸条的原理结合，通过RPA特异性引物等温扩增后进行Cas12a检测，切割被胶体金抗体标记的探针复合物，实现可视化判读结果。相较于RPA-LPS(基于RPA的胶体金免疫层析试纸条)技术，RPA-Cas12a-LPS不需要特异性标记的探针，没有抗原抗体的限制，具有操作简便，成本低，快速，灵敏等特点，有利于病原体的诊断。

时间分辨荧光免疫层析方法是以稀土元素离子螯合物的时间分辨荧光微球作为荧光标材料，具有制备简单、球体比表面积大和吸附性强等特点,并且具有稳定的形态结构和高效的发光效率，在许多领域尤其是生物医学领域有着重要的应用。利用其荧光衰变期长和发射光谱窄的特点，可使有效信号与非特异性的背景荧光信号区分，减少非特异性荧光的干扰，提高灵敏度的特点，我们将CRISPR/Cas12a与时间分辨荧光微球免疫层析试纸条的原理结合，通过RPA特异性引物等温扩增后进行Cas12a检测，切割被时间分辨荧光微球偶联抗体标记的探针复合物，实现可视化判读结果。

本发明公开了以下技术效果：

(1)等温37℃反应：与常规核酸检测所需要的PCR技术相比，等温条件使RPA反应摆脱了对加热相关仪器设备如PCR仪的依赖，短时间内完成核酸扩增反应，具有操作简便、快速的特点。

(2)反应迅速；RPA技术以T4噬菌体核酸复制机制为原理，利用重组酶uvsX以及辅助蛋白uvsY和单链结合蛋白在常温下实现引物和模板的特异结合，从而实现目标序列的扩增。利用了多种工程酶，大大缩短了扩增过程所需要的时间，达到快速检测的要求。

(3)针对与RPA/Cas12a荧光检测法，可以配套小型化和便携式的荧光仪器，对操作者要求低，简单培训实验室工作人员即可完成。

(4)RPA/Cas12a荧光检测法和RPA/Cas12a-LPS法都具有较高的特异性和灵敏度，引物只对人型支原体核酸片段进行扩增。

(5)通过侧向层析技术试纸条方法，实现肉眼可视化检测，方便快捷，准且可靠。

阴性(-)：仅在质控线上出现一条红色条带或者紫外灯下荧光条带，检测线无，证明检测样品无人型支原体感染。

阳性(+)：两种情况，但只有检测线上有红色条带或者紫外灯下荧光条带，质控线上无，说明检测样品中含有高拷贝数的人型支原体核酸，提示有感染：当检测线和质控线均出现红色线时或者紫外灯下有荧光条带，证明检测样品中含有人型支原体感染。

(6)应用范围广：无需大型仪器设备，恒温即可反应，结果肉眼可判读，适合大规模筛查使用。

(7)本发明构建的三种基于RPA-CRISPR/Cas12a快速核酸检测人型支原体的方法及其应用，增加了检测的灵敏度，并且相比于其他在临床和实验室中容易造成假阳性的检测方法，本发明方法显示出具有极高的特异性，为人型支原体的检测提供了新的技术平台。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为引物筛选图，其中M：marker，1泳道代表表1的第一对引物，2泳道代表表1的第二对引物，3泳道代表表1的第三对引物；

图2为重组质粒pMD 19Tgap的PCR产物，其中，M：DNAMarker DL2000；1：重组质粒全长PCR；2：质粒加gap引物PCR产物；

图3为RPA/Cas12a体系建立检测结果，1为检测体系中假crRNA代替目标crRNA；2为检测体系中无活性蛋白代替AsCas12a蛋白；3为完整检测体系；4为DNas和DNA荧光探针(n＝3)；

图4为crRNA筛选图，利用RPA与CRISPR/Cas12a检测体系荧光检测；

图5为RPA-CRISPR/Cas12a灵敏度分析图，按比例稀释质粒，(a)先利用琼脂糖凝胶电泳鉴定RPA扩增的结果；1-7泳道分别为1.3e10；2.3e9；3.3.e7；4.3e5；5.3e3；6.3e1；7.H₂O；(b)将RPA扩增的产物通过RPA与CRISPR/Cas12a检测体系荧光检测系统检测下限；

图6为RPA-CRISPR/Cas12a特异性分析图，其中，1，人型支原体；2，金黄色葡萄球菌；3，腐生葡萄球菌；4，肺炎克雷伯菌；5，白色念球；6，大肠杆菌；7，福氏志贺菌；8，解脲脲原体；9，空白对照水；

图7基于CRISPR-Cas12a系统利用RPA扩增技术结合胶体金侧流流动试纸条(LFD)方法的检测原理；

图8为实施例2的胶体金侧流层析试纸条方法的灵敏度分析图；

图9为时间优化分析图；

图10为为基于CRISPR-Cas12a系统利用RPA扩增技术结合时间分辨荧光微球免疫层析试纸的检测原理；

图11为RPA-CRISPR/Cas12a联合时间分辨荧光微球免疫层析试纸的临床样品实施案例，其中Sample1-6分别为水，阴性样品，阳性样品1，阳性样品2，阳性样品3，阳性样品4；

图12为本发明检测方法总流程示意图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实验材料：

菌株：从汕头市第二人民医院收集30例临床经培养方法确认人型支原体阳性的宫颈拭子和30例临床经培养方法确认人型支原体阴性的宫颈拭子，由汕头市第二人民医院分离培养、鉴定并赠与的其他与生殖道相关的病原体：白色念珠菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、福氏志贺菌、腐生葡萄球菌、解脲脲原体；

试剂：自制试纸条相关材料均来自sigma公司。

仪器：Biospectrum510凝胶成像仪；Eppendorf5424离心机(德国Eppendorf公司)；多功能酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

实施例1

1.构建实施基于RPA扩增和CRISPR-Cas12a的人型支原体核酸检测方法

1.1人型支原体基因序列分析寻找人型支原体CRISPR/Cas核酸检测靶点

方法：根据文献报道查找人型支原体的特异性保守基因序列，分别是16srRNA、gap基因，并分别设计相应恒温扩增引物进行验证。

1.2恒温扩增引物的设计和合成

NCBI数据库中查获人型支原体16sRNA以及gap基因序列，应用Primer 5设计特异性引物，同时并且在NCBI上对所设计出的引物进行特异性筛选，要求引物序列：避免引物中存在不寻常的序列，如一段长序列全由一种特定的核苷酸组成，或存在许多重复的短序列；扩增产物长度：对于超快速的RPA分析，扩增子长度不超过500bp。引物GC％最小20％，最大70％；引物Tm最小50，最大100；最大允许的单核苷酸重复长度设定为5；BLAST验证；设计了三对引物，引物序列见表1。

表1引物序列

所有的引物交由苏州金唯智生物工程公司合成。

1.3RPA反应

使用basic kit(TwistDx Inc.,Cambridge,UK)对各靶点基因进行扩增，按照表2的方案配制恒温扩增体系。将各反应溶液加入酶反应干粉管中。充分混匀，置于37℃反应20min，产物于4℃保存备用。

表2 RPA反应体系

各引物对的核酸扩增效果可通过DNA凝胶电泳鉴定检测判定。

结果：通过RPA对三对引物进行扩增，只有第二对引物扩增出相应的目的条带，如图1所示，通过DNA凝胶图检测判定。图1中，M:marker，1泳道代表第一对引物，2泳道代表第二对引物，3泳道代表第三对引物。

1.4crRNA的设计和筛选

方法：根据筛选出最优的RPA扩增引物序列，对待检测的靶标核酸以及CRISPR/Cas12核酸检测系统，设计靶点特异性的crRNA。crRNA序列由两部分构成：5’端的保守基因序列(scaffold/repeat部分)，以及3’端的靶基因序列的互补序列构成。crRNA序列可由生物公司直接合成，或通过T7体外转录的方式获得。本发明主要通过T7体外转录的方式得到各核酸检测靶点的crRNA，下面将对该过程进行详细介绍。

1.4.1设计并合成crRNA的T7体外转录模板

在CRISPR-Cas12a系统中，依据双链DNA中目标基因序列的互补基因序列，在其5’端插入CRISPR-Cas12a核酸检测系统的保守基因序列，即可得到该检测靶点的crRNA序列。在该crRNA序列的5’端插入T7启动子基因序列：TAATACGACTCACTATAGGG，将该基因序列反向互补后即可得到该检测靶点的T7体外转录单链DNA模板，如表3所示，体外转录模板序列中划线的部分为T7启动子的反向互补序列。表3中，crRNA序列中划线部分为CRISPR-Cas12a核酸检测系统的保守基因序列。

表3 IVT模板crRNA template序列如下：

1.4.2crRNA的体外转录(IVT)

1.4.2.1退火生成T7体外转录需要的双链DNA

将设计的T7体外转录设计的序列交给江苏金唯智公司合成根据表4配置退火反应体系。将反应至于PCR仪器中反应95℃5min，55℃30s，4℃降温后-20℃保存。

表4退火反应体系

1.4.2.2crRNAT7转录

将退后产物作为模板，使用T7体外转录试剂盒(HiScribe T7快速高效RNA合成试剂盒，NEB)进行体外转录，体外转录反应体系如表5所示。将配好的反应体系至于37℃金属浴中反应16h，随后缓慢冷却至4℃。

表5转录反应体系

1.4.2.3crRNA的纯化

利用Total RNACleanup Kit(Foregene,RE-03014)进行RNA产物的纯化，具体步骤如下：

(1)将转录后的产物加163μL ddH₂O混匀转移至DNA-Cleaning Column中，12000rpm离心2min，弃柱子，保留收集管内的上清。

(2)随后将向上述上清液(约200μL)中加入1.6倍体积(约320μL)Buffer RL2，轻柔混匀。

(3)将700μL混合液转移至RNA-only Column中，12000rpm离心1min，弃废液。

(4)将纯化柱放回收集管中，将剩余混合液全部加入纯化柱中，12000rpm离心1min，弃废液。

(5)向纯化柱中加入500μLBuffer RW1，12000rpm离心1min，弃废液。

(6)向纯化柱中加入700μLBuffer RW2，12000rpm离心1min，弃废液。

(7)再重复加入700μLBuffer RW2，12000rpm离心1min，弃废液。

(8)将纯化柱放回收集管中，12000rpm空柱离心2min，弃掉残余的废液。

(9)将纯化柱转移至去RNA酶的离心管中，向膜中央滴加30μL已于65℃预热的RNase-Free ddH₂O，室温放置2min，12000rpm离心1min，收集RNA溶液。

(10)产物保存在-80℃冰箱备用。

结果：根据CRISPR/Cas12a系统检测原理，设计对应靶标3条不同的crRNA和crRNAT7体外转录单链DNA序列，通过直接合成或T7体外转录的方式得到检测靶点的crRNA。具体基因序列详见表6。

表6 crRNA序列

1.5质粒标准品的构建

方法：将包括gap基因CRISPR-Cas12a核酸检测靶点的目的基因序列，插入pMD-19T质粒骨架中合成相应核酸检测靶点的阳性质粒，用于评价RPA-CRISPR荧光检测的灵敏度/检测下限。在本发明的一个具体实施方案中，插入的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，pUC57质粒序列见SEQ ID NO:15。通过测序，结果与预期一致，将构建成功的阳性质粒命名为pMD-19T MH gap，-20℃保存备用。pMD-19TMHgap质粒的质粒图谱如图2所示，经检测，重组质粒大小在3000bp左右，条带位置符合质粒全长大小，引物扩增产物大小在280bp，发现质粒构建成功。Target标识处为插入序列所在位置，插入序列和质粒测序结果如下表7所述。

表7

1.5.1目的基因gap的扩增及鉴定

由于我们构建的质粒是需要后续用于RPA/CRISPR-Cas12a系统检测，所以我们使用了RPA筛选出最优的引物进行目的基因的扩增根据premix Taq试剂盒的要求，给产物片段加上polyA尾，便于后续与载体质粒进行连接。

根据表8，将反应需要的物质混合置于PCR管中：

表8

反应条件：

2-4循环8次。

1.5.2目的基因与载体连接

1.5.2.1按照无缝克隆试剂盒的标准操作步骤将目的基因与载体连接，体系(10μL)如表9所示.

按表9将反应需要的物质混合置于PCR管中：

表9

注：当插入目的片段与载体的摩尔比为2:1时，融合效率最高。

加入5μL的solution I，连接产物转化DH5a感受态细胞，冰上放置30min，42℃加热45s，再冰上放置1min，加入LB培养基890μL转化约24h后，可见大小适中的单克隆菌落。取3个摇菌管，加入5mL LB培养基和5μL氨苄霉素，挑单克隆于摇菌管中，将摇菌管置于摇床培养过夜。如图2所示，使用PCR法确认载体中插入片段大小。

1.5.2.2送去测序。

1.5.3稀释质粒备用

方法：使用分光光度计测定质粒标准品OD值为：579.3ng/μL，拷贝数计算公式：拷贝(copies/μL)＝(6.02×10²³×质粒浓度×10^-9)/(660×碱基数)，根据公式计算579.3ng/μLpMD-19T MH gap标准品的拷贝数为3×10¹⁰copies/μL。对质粒浓度进行十倍梯度稀释，直至稀释到单拷贝每微升为止。

1.6基于CRISPR-Cas12a系统的核酸检测

1.6.1合成单链DNA荧光报告探针

方法：单链DNA基因序列的两端分别标记FAM荧光基团和BHQ荧光淬灭集团，即可构成单链DNA探针。报告探针的基因序列为5’-FAM-TTTTTT-BHQ-3’(SEQ ID NO:16)，由广州博莱斯生物科技有限公司合成。

1.6.2CRISPR-Cas12a系统的荧光检测(图12①)

方法：对建立的CRISPR-Cas12a核酸检测体系对人型支原体gap基因各检测靶点的基因扩增产进行检测，按照表10配制荧光检测体系。将配制好的反应液加入384孔板中，使用多功能酶标仪或荧光定量PCR仪进行荧光强度检测，其中酶标仪设置激发光波长495nm、发射光波长520nm。反应温度为37℃，每隔5分钟检测一次荧光值，连续检测40分钟，观察各靶点CRISPR检测反应中荧光强度升高情况。

表10 RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测分析

1.6.3阳性结果判定

如图3所示，与阴性对照相比，检测40min时荧光强度有明显升高，经统计学，三次重复实验的荧光强度值与阴性对照有统计学差异。

1.7RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测法的优化

1.7.1crRNA的筛选

方法：针对检测gap基因我们设计了三条crRNA,获得方式如上。使用筛选得到的MH-gap检测靶点的扩增引物，进行恒温扩增后与CRISPR/Cas12a体系对三种不同crRNA验证，根据荧光信号的强弱选择出最佳crRNA。

结果如图4所示，检测40min时，crRNA3显示出最强的荧光信号，以此作为后续实验的常用crRNA序列，用于后续侧流层析试纸条的实验。

1.7.2RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测法敏感度实验

方法：将MH gap基因靶点的阳性质粒作为标准品，用于评价RTPA-CRISPR/Cas12a荧光检测的灵敏度。

结果：将标准质粒进行10倍稀释电泳条带1-8依次是3×10¹⁰copies/μL、3×10⁹copies/μL、3×10⁷copies/μL、3×10⁵copies/μL、3×10³copies/μL、3×10¹copies/μL、阴性对照。荧光信号结果图5也提示灵敏度达3×10¹copies/μL，说明本发明方法敏感性较好。如图5所示，两种方法可检出最小3×10¹copies/μL的DNA对七种不同的病原体进行两种方法检测，只有人型支原体检测出相应的荧光信号和胶体金阳性条带，CRISPR检测荧光值与阴性对照相比P＜0.05。这一结果提示了这两种方法具有较好的灵敏度和特异性。

1.7.3RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测法特异性实验

方法：对其他与生殖道相关的病原体，如白色念珠菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、福氏志贺菌、腐生葡萄球菌、解脲脲原体进行特异性分析。使用筛选出的最优引物与crRNA进行RPA-CRISPR/Cas12a体系检测，观察荧光值升高情况。

结果如图6所示，MH，gap靶点的特异性较好，检测40min时，除人型支原体阳性质粒荧光值升高外，其他生殖道相关病原体的荧光均无升高。

1.8临床样品核酸提取

使用索莱宝细菌DNA提取试剂盒。步骤如下：

(1)将收集到的标本14000rpm离心1min，吸净上清，保留菌体沉淀。

(2)向菌体沉淀中加入200μL溶液A，振荡彻底混匀，向各管加入20μLProteinase K和RNaseA(10mg/mL)，55℃放置15min。

(3)加入200μL的溶液B液，75℃15min，溶液变清亮，加入020μL无水乙醇，充分混匀。

(4)将EP管中的液体分两次通过附柱CB312000转离心30sec。

(5)倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中，向CB3中加入600μL漂洗液，GD使用前应先按要求加入规定量的无水乙醇，12000转离心30sec。

(6)倒掉废液，将CB3放回收集管，重复上一步。

(7)将装有CB3的收集管放入离心机，12000转离心2min空转。

(8)倒掉废液，将CB3置室温数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，CB3放入干净的EP管中，向吸附膜的中间部分悬空加入30μLddH₂O，室温放置2～5分钟，12000转离心2min。

(9)将核酸溶液收集到EP管中，-20℃冰冻保存备用。

1.9应用实施人型支原体核酸检测

方法：使用上述建立的RPA-CRISPR/Cas12a对MH gap基因的核酸检测平台，对经过临床检测法“液体培养法”确认的人型支原体样本进行检测，验证RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测对实际核酸样本的检出情况。

液体培养法：使用珠海丽珠试剂有限公司的人型支原体、解脲脲原体支原体鉴定试剂盒(培养法)，对人型支原体进行培养鉴定，按照说明书设置，48小时培养后培基的颜色判断样品的阴阳性。

结果：收集了30例人型支原体阳性临床样品，30例人型支原体阴性的临床样品。使用本发明建立的RPA联合CRISPR/Cas12a系统，对人型支原体样品核酸的gap基因进行检测。结果如表11所示：阳性样品全部检出，阴性样品全部检出。该检测方法的检测灵敏度100％，特异度为100％，阳性预测值为100％，阴性预测值为100％，可有效检测出人型支原体样品，与液体培养的结果一致性较高。

表11 RPA-CRISPR/Cas12a临床样品分析

实施例2

一种基于RPA-CRISPR/Cas12a-胶体金侧流层析技术检测人型支原体的方法及其应用方法的建立(图12②)：

2.1胶体金侧流层析试纸条的构建：

具体参见图7，本发明是提供了一种将RPA/Cas12a结合免疫胶体金试纸条检测人型支原体的方法，核酸胶体金试纸条包括PVC背膜，样品垫，结合垫，硝酸纤维素薄膜和吸收垫。试纸条上的检测线处的硝酸纤维素膜，质控线上的硝酸纤维素膜包被着链霉亲和素包备着羊抗兔二抗(结合异硫氰酸荧光素FITC抗体的二抗，与异硫氰酸荧光素FITC的一抗结合同时固定胶体金)，所述的结合垫上包备着抗异硫氰酸荧光素FITC抗体-胶体金标记物。(图7)。首先经过RPA/Cas12a反应30min，加入的荧光探针上一端连有异硫氰酸荧光素FITC，另一端连有生物素。反应时间到后按照1：4稀释反应物，置入自制的胶体金试纸条反应。在使用的过程中，当有目的核酸序列扩增时，CRIAPR/Cas12a系统启动切割探针的功能，断了的异硫氰酸荧光素FITC端会与带有胶体金的异硫氰酸荧光素FITC抗体结合，通过检测线时被包被在上面的羊抗兔二抗抓住，显示出检测线有颜色。而当不存在目的核酸序列时，荧光探针不会被切割，带有生物素的探针会与质控线上的链霉亲和素结合，显示出质控线上有颜色。当使用过程中出现质控线无颜色时，说明核酸检测试纸条失效。根据本发明的等温扩增条件，试纸条检测的温度设置也是在37℃。

2.2合成单链DNA荧光报告探针适用于侧流层析试纸条检测

将探针SEQ ID NO:16的荧光基团和淬灭基团分别替换为FITC荧光基团和Biotin淬灭基团，构成新的FITC-Biotin探针，由广州博莱斯生物科技有限公司合成。

2.3RPA-CRISPR/Cas12a-胶体金侧流层析技术检测

使用本发明建立的CRISPR-Cas12a核酸检测体系对人型支原体gap基因扩增产物进行检测，将配制好RPA-CRISPR/Cas12a的反应液置于37℃反应20分钟后，1：4稀释加水稀释后放入胶体金侧流层析试纸条反应，五分钟后观察试纸条上C线和T线上条带结果；相对于时间分辨荧光微球免疫层析试纸条，在紫外灯下观察质控线和检测线C线和T线的条带。

如图8所示：结果判读情况：

如果质控线有红色条带而检测线无条带时，则待测样品不为人型支原体或疑似不为人型支原体感染；

如果质控线有红色条带且检测线有条带时，则待测样品为人型支原体或疑似有人型支原体感染。

2.4RPA-CRISPR/Cas12a联合胶体金侧流层析试纸条检测体系的优化

2.4.1胶体金侧流层析试纸条反应时间优化

前提是本发明先在RPA反应20分钟后将产物加入CRISPR/Cas12a检测系统，这里使用的探针是FITC-Biotin探针，针对CRISPR/Cas12a反应时间设置了0，15，30min三个时间点，37℃下进行反应。反应时间到达后按照1:4比例稀释混合物后放置本发明制备的侧流层析试纸条，5分钟后观察试纸条结果

结果：如图9所示，15min试纸条检测线出现胶体金颜色，30分钟时反应更充分，探针酶切彻底，只有检测线有条带。说明在15min时就可以提样品病原体感染与否的情况。

2.4.2RPA-CRISPR/Cas12a联合胶体金侧流层析试纸条检测体系特异性实验

方法：对其他与生殖道相关的病原体，如白色念珠菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、福氏志贺菌、腐生葡萄球菌、解脲脲原体进行特异性分析。使用筛选出的最优引物进行RPA后，将扩增产物加入CRISPR/Cas12a体系检测，使用FITC-Biotin探针加入反应体系，反应进行15min 37℃孵育。放置本发明制备的试纸条进行后续实验。

结果：MH gap靶点的特异性较好，除人型支原体阳性质粒在试纸条检测线上出现条带外，其他生殖道相关病原体均无。

2.4.3RPA-CRISPR/Cas12a联合胶体金侧流层析试纸条检测体系灵敏度实验

方法：将MH gap靶点的阳性质粒作为标准品，用于评价RPA-CRISPR/Cas12a联合侧流层析试纸条的灵敏度。

结果：将标准质粒进行10倍稀释电泳条带1-8依次是3×10¹⁰copies/μL、3×10⁹copies/μL、3×10⁷copies/μL、3×10⁵copies/μL、3×10³copies/μL、3×10¹copies/μL、阴性对照。试纸条结果图8也提示灵敏度达3×10¹copies/μL，说明本发明方法敏感性较好。

2.5RPA-CRISPR/Cas12a联合胶体金侧流层析试纸条检测体系临床样本的检测

方法：收集了30例人型支原体阳性临床样品，30例人型支原体阴性的临床样品。使用本发明建立的RPA-CRISPR/Cas12a联合侧流层析试纸条检测体系，对人型支原体样品核酸的gap基因进行检测。结果如表12所示：阳性样品全部检出，阴性样品全部检出。该检测方法的检测灵敏度100％，特异度为100％，阳性预测值为100％，阴性预测值为100％，可有效检测出人型支原体样品，与液体培养的结果一致性较高。

表12 RPA-CRISPR/Cas12a联合胶体金侧流层析试纸条检测体系临床样品分析

实施例3

构建一种基于RPA-CRISPR/Cas12a-时间分辨铕标微球免疫层析试纸条检测人型支原体的方法及其应用方法(图12③)。

3.1时间分辨铕标微球免疫层析试纸条的构建

本发明是将RPA/Cas12a结合检测人型支原体的方法，将含有RPA-Cas12a反应体系的待测样品滴加在加样垫上，利用毛细作用层析，未存在待检测病原体核酸时，探针未被切割，羧基化铕螯合物纳米荧光微球偶联的抗FITC抗体与FITC-Biotin探针形成的复合物被质控线(C线)上的链霉亲和素捕获而固定在C线上(图10)。当存在待测病原体ssDNA核酸序列时，Cas12a蛋白激活后附带切割FITC-Biotin探针，切断了的FITC探针与结合垫上的羧基化铕螯合物纳米荧光微球偶联的抗FITC鼠抗结合形成复合物，并通过毛细作用向前层析，达到检测区域后，被T线包被的羊抗鼠二抗捕获，形成微球-抗FITC-FITC-抗体复合物并被固定在T线上。而多余的荧光微球标记物继续向前层析，最终被吸水纸吸收。当反应结束后，用便携式紫外灯照射试纸条，T线和C线上羧基化铕螯合物纳米荧光微球发出高强度的荧光。

3.1.1羧基化铕螯合物纳米荧光微球的预处理与活化

取200μL微球，4℃离心15min，去上清，加入活化试剂a和活化试剂b，混匀悬浮微球，加入活化缓冲液，室温下用磁微球混合器旋转30分钟，4℃离心30min，去上清，加入偶联缓冲液，超声重悬后4℃离心30min，去上清，重复该步骤1次。

3.1.2标记抗体的预处理

取出鼠抗FITC抗体，加入50KD超滤管中，4℃离心后将浓缩的抗体原料加入200μL羧基化铕螯合物纳米荧光微球铕标与蛋白偶联缓冲液，4℃离心8分钟后弃掉滤液，再加入200μL偶联缓冲液，再次离心，此步骤重复5次，最后收集滤液。

3.1.3羧基化铕螯合物纳米荧光微球铕标与标记抗体的偶联

将上述微球分成两份加入200μL偶联缓冲液后超声重悬分散微球，加入纯化浓缩后的鼠抗FITC抗体，各加入800μL偶联缓冲液将微球稀释，混匀微球后37℃偶联反应2小时。后4℃离心15分钟，移去上清，加入1mL洗涤液重悬微球，4℃离心15分钟，移去上清，重复该步骤1次。

3.1.4硝酸纤维素膜的包被

用包被液将C线和T线需要的链霉亲和素和山羊抗鼠抗体进行洗涤处理，稀释到合适浓度后，倒吸入XYZ3060三维喷点平台的加样泵1、加样泵2、加样泵3中，设定包被参数，硝酸纤维素膜平放于三维喷点平台的操作台上，按下启动键，划线，于37℃鼓风干燥箱干燥，4小时后备用。

3.1.5羧基化铕螯合物纳米荧光微球铕标-标记抗体偶联结合物的固相化

将标记好的铕标微球抗FITC抗体经超声重悬混匀后用标记微球稀释液进行稀释，两者1:1充分混匀，用XYZ3060三维喷点平台进行喷点，将其均匀喷射在结合垫上，置于37℃鼓风干燥箱干燥，4小时后备用。

3.1.6时间分辨荧光微球免疫层析试纸条的组装

试纸条由5部分组成，分别是PVC底板、硝酸纤维素膜、吸水纸样品垫和结合垫，按顺序组装后，用切条机切成2.8mm宽的试纸条，存放于防潮柜备用。

3.2RPA-CRISPR/Cas12a联合时间分辨荧光微球免疫层析试纸条检测体系的优化

3.2.1铕螯合物纳米荧光微球的选择

根据市场常用的硝酸纤维素膜孔径的流速特征，最佳大小在200nm-500nm，综合前人的研究，选择200nm左右的铕螯合物纳米荧光微球，粒径均一性及悬浮稳定性好。

3.2.2铕螯合物纳米荧光微球与抗FITC抗体偶联缓冲液的摸索

三种不同的偶联缓冲液25mmol/LMES(PH 6.1)、25mmol/LPB(PH 7.0)、25mmol/LCBS(PH 8.0)，根据最低本底值和最小信噪比S/N值选择25mmol/LPB(PH 7.0)作为最佳铕螯合物纳米荧光微球与抗FITC抗体偶联缓冲液。

3.2.3铕螯合物纳米荧光微球与抗FITC抗体偶联比例的选择

6.25ug/mg，12.5ug/mg，25ug/mg，50ug/mg，100ug/mg。根据信噪比比值大小，选择最佳饱和浓度下偶联比例，考虑到抗体成本以及信噪比值，选择了25ug/mg。

3.2.4C线包被的链霉亲和素浓度的选择

C线包被的链霉亲和素浓度是影响本自制试纸条检测灵敏度和特异性的关键因素。当链霉亲和素量过少，会造成试纸条结果假阳性；当链霉亲和素浓度过多，会造成试纸条结果假阴性。在本实施例中，设计了一系列链霉亲和素浓度：1mg/mL，2mg/mL，3mg/mL，4mg/mL，5mg/mL，综合考虑抗体成本以及信噪比值等因素，最终选择了4mg/mL作为包被的链霉亲和素浓度。

3.2.5T线包被的羊抗鼠二抗浓度的选择

考虑到抗体成本，最终选择了1mg/mL作为包被的羊抗鼠的浓度。

3.2.6最佳反应时间的确定

为了获得最稳定的效果，需要在检测信号稳定时进行检测，最终确定反应时间为20分钟，滴加液体在试纸条后，3分钟后进行观察。

3.2.7分析特异性实验

方法：对其他与生殖道相关的病原体，如白色念珠菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、福氏志贺菌、腐生葡萄球菌、解脲脲原体进行特异性分析。使用筛选出的最优引物进行RPA后，将扩增产物加入CRISPR/Cas12a体系检测，使用FITC-Biotin探针加入反应体系，反应进行15min 37℃孵育。放置时间分辨荧光微球免疫层析试纸条检测体系进行后续实验。

结果：MH gap靶点的特异性较好，除人型支原体阳性质粒在试纸条检测线上出现条带外，其他生殖道相关病原体均无，T线和C线对的荧光值如表13所示。

表13.RPA-CRISPR/Cas12a联合时间分辨荧光微球免疫层析试纸条检测体系的分析特异性

病原体	T线荧光值	C线荧光值	结果
				人型支原体	14046.3	0	+
白色念球菌	140.46	8274.24	-
				大肠杆菌	104.47	8507.37	-
肺炎克雷伯菌	135.24	8236.36	-
				金黄色葡萄球菌	111.24	8430.1	-
链球菌	119.69	8091.88	-
				福氏志贺菌	104.47	8890.22	-
腐生葡萄球菌	133.52	8240.9	-
				解脲脲原体	143.12	8674.3	-

3.2.8分析灵敏度实验

方法：将MH gap靶点的阳性质粒作为标准品，用于评价RPA-CRISPR/Cas12a联合时间分辨荧光微球免疫层析试纸条检测体系的灵敏度，结果有T线和C线的荧光值表示。

如表14：经测定，RPA-CRISPR/Cas12a联合时间分辨荧光微球免疫层析试纸条检测体系的分析灵敏度为3copies/μL.

表14.RPA-CRISPR/Cas12a联合时间分辨荧光微球免疫层析试纸条检测体系的分析灵敏度

拷贝数	T线荧光值	C线荧光值	结果
				3×10¹⁰copies/μL	14046.3	0	+
3×10⁹copies/μL	1335.4	0	+
				3×10⁷copies/μL	11124.6	221.356	+
3×10⁵copies/μL	9663.52	1463.336	+
				3×10³copies/μL	9518.31	1452.447	+
3×10¹copies/μL	5559.56	3221.01	+
				H₂0	3326.91	8482.403	-

3.2.9如图11所示，试纸条结果判读情况：

如果紫外灯下质控线有荧光条带而检测线无条带时，则待测样品不为人型支原体或疑似不为人型支原体感染；

如果紫外灯下质控线有荧光条带且检测线有荧光条带时，则待测样品为人型支原体或疑似有人型支原体感染。

4.临床样品的检测

利用本实施例的方法进行检测，分别使用samples1：水；samples2：阴性样品；samples3：阳性样品1；sample4：阳性样品2；samples5：阳性样品3；samples6：阳性样品4为模板，检测结果见图11，结果表明，时间分辨铕标微球免疫层析试纸条紫外灯下观察到质控线清晰可见，检测区人型支原体阳性样品可见清晰的条带。

通过对已确诊人型支原体的30例样本进行检测，使用本发明的试纸条的检测结果符合率100％。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 南方医科大学

<120> 一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原体检测系统及其应用

<140> 202210128562.9

<141> 2022-02-11

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgatgtttag ccgggtcgag agactg 26

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccgaagacc ttcatcgtgc acgctg 26

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttattgaagg aactggaaga tttgta 26

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctttggtctg ctgtatatga gtgaac 26

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtttagccgg gtcgagagac tgaacg 26

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<210> 7

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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ttaatttc 68

<210> 8

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgtatatgag tgaactgttg tcaatctaca agagtagaaa ttaccctata gtgagtcgta 60

ttaatttc 68

<210> 10

<211> 63

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

uaauacgacu cacuauaggg uaauuucuac ucuuguagau ucacugcucc agcuaaaagc 60

gaa 63

<210> 11

<211> 63

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

uaauacgacu cacuauaggg uaauuucuac ucuuguagau ucaggcgcuu cauguacuac 60

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<210> 12

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<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

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<210> 14

<211> 280

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

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gtgctaaaaa ggtatttatc actgctccag ctaaaagcga aggcgttaaa acagttgttt 120

attcagtaaa cgaagatata attacaccag aagataaaat tttatcaggc gcttcatgta 180

ctactaactg tttagctcct attgccaacg tattggaaaa aaactttggt attgaaaaag 240

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<210> 15

<211> 1308

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

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gaagataaaa ttttatcagg tgcttcatgt actactaact gtttagctcc tattgccaac 240

gtattggaaa aaaactttgg tattgaaaaa ggatttatga caacagttca ctcatataca 300

gcagaccaaa gaatctctag aggatccccg ggtaccgagc tcgaattcac tggccgtcgt 360

tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca 420

tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 480

gttgcgcagc ctgaatggcg aatggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg 540

cggtatttca caccgcatat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt 600

aagccagccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc 660

ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc 720

accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt 780

taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg 840

cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca 900

ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag aatatgagta ttcaactttc 960

cgggtcgcct tattcccttt ttgcggattt tgcctcctgt tttgctcccc agaaccctgg 1020

gaaattaaaa agctgaaatc attgggggcc aaggggttac tcaaatggtt ccccggggaa 1080

aatcttgaaa atttccccga aaaatttccc aggaacttta atttttgttg gggggggtat 1140

tccgttgtcg cggggaaaac cggcccacat tttccaaaat gggggacccc ccacaaaatc 1200

ttggggtgga aaaaaaattg gcccccacag aaccccctcc cccccacaaa gaaactcttt 1260

tgggggtttg cgaaaacacc ccaaccaaca aaaacattta gagaagag 1308

<210> 16

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tttttt 6

Claims

1.一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原体检测系统，其特征在于，所述检测系统包括RPA扩增引物对、探针、crRNA和AsCas12a蛋白；

所述RPA扩增引物对的序列为如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列；

所述探针的序列为SEQ ID NO:16所示序列；

所述crRNA的序列为SEQ ID NO:12所示序列。

2.根据权利要求1所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原体检测系统，其特征在于，所述crRNA的制备方法为：先按照SEQ ID NO:9所示的DNA单链制备DNA体外转录模板，再根据所述DNA体外转录模板转录制备得到所述crRNA。

3.根据权利要求1-2任一项所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原体检测系统在制备检测人型支原体的试剂盒中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒检测人型支原体的方法包括以下步骤：

(1)以待测样品的基因组DNA为模板，采用所述的RPA扩增引物对进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；

(2)配制CRISPR/Cas12a反应液，所述CRISPR/Cas12a反应液包括所述的探针、crRNA和AsCas12a蛋白，以及步骤（1）制备的RPA扩增产物；所述探针一端标记FAM，另一端标记BHQ；

(3)利用步骤（2）制备的CRISPR/Cas12a反应液进行CRISPR/Cas12a反应，之后对荧光强度进行检测。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒检测人型支原体的方法包括以下步骤：

(2)配制CRISPR/Cas12a反应液，所述CRISPR/Cas12a反应液包括所述的探针、crRNA和AsCas12a蛋白，以及步骤（1）制备的RPA扩增产物；所述探针一端标记FITC，另一端标记Biotin；

（3）利用步骤（2）制备的CRISPR/Cas12a反应液进行CRISPR/Cas12a反应，之后用胶体金侧流层析试纸条进行检测。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒检测人型支原体的方法包括以下步骤：

（3）利用步骤（2）制备的CRISPR/Cas12a反应液进行CRISPR/Cas12a反应，之后用时间分辨铕标微球免疫层析试纸条进行检测。

7.一种检测人型支原体的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-2任一项所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原体检测系统。

8.根据权利要求7所述的检测人型支原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括胶体金侧流层析试纸条或时间分辨铕标微球免疫层析试纸条。

9.根据权利要求7所述的检测人型支原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒通过检测荧光强度显示检测结果。