KR20190124059A - 성매개 감염원인체 검출용 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 성매개 감염원인체 검출용 키트 및 방법을 제공한다. 본 발명의 키트 및 방법은 성매개 감염원인체 1-10 copies까지 검출할 수 있는 우수한 민감도를 갖으며, 유전자 증폭 장비의 호환이 가능하다. 본 발명의 키트 및 방법은 한번의 PCR 반응으로 다양한 성매개 감염원인체를 동시에 검출 할 수 있으며, 높은 민감도 및 특이도를 갖는다.

Description

성매개 감염원인체 검출용 키트{Kits for Detecting Pathogens of Sexually Transmitted Infections}
본 발명은 성매개 감염원인체 검출용 키트에 관한 것이다.
성병 또는 성매개 감염병(STI, Sexually Transmitted Infections; or STD, Sexually Transmitted Diseases)은 성 접촉을 통해 전파되는 질환이다. 성병은 전체 성인의 50% 이상이 평생 한번 이상 감염될 정도로 흔한 질환으로 세균, 바이러스, 진균 등의 병원균 감염으로 매개된다. 세균에 의해 전파되는 대표적인 성병은 매독(Syphilis), 임질(Gonorrhea), 연성하감(Chancroid), 클라미디아감염증(Chlamydial Infection), 및 비임균성요도염(Nongonorrhea urethritis)이 있으며, 바이러스 감염에 의한 성병으로는 성기단순포진(Genital herpes) 및 첨규콘딜롬(Condyloma acuminata; 성기사마귀 또는 곤지름)이 있다.
기존 성병 진단법은 직장, 요도, 구강 등 환부의 분비물을 도말하여 그람염색법이나 세균 배양법을 이용한 검사를 실시한다. 그람염색법의 경우 빠른 결과를 도출할 수 있지만 정확도가 떨어지고, 세균 배양법의 경우 그람염색법보다는 정확하지만 배양시간이 오래 걸리고 임질균의 경우는 양성임에도 불구하고 배양검사에서 검출되지 않기도 하여 정확성이 떨어진다. 또 다른 검사법으로 감염균에 의한 항체검사를 시행하기도 하지만 항체의 특성에 따른 정확도의 차이가 크다는 단점이 있다. 또한 위 검사법들은 모두 단일 병원체에 대해서만 검출이 가능하고 여러 가지의 병원체를 동시에 검출할 수는 없다는 한계가 있다. 따라서 보다 신속하고 정확하면서도 2 이상의 병원체를 동시에 검사할 수 있는 새로운 검사법이 필요한 실정이다.
대한민국 등록특허 제10-0639783호 대한민국 공개특허 제10-2013-0107881호
Thomas Meyer. Diagnostic Procedures to Detect Chlamydia trachomatis Infections. Microorganisms 2016 Sep; 4(3): 25 Bhalla P. Simultaneous detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis by PCR in genitourinary specimens from men and women attending an STD clinic. J Commun Dis. 2007 Mar; 39(1):1-6.
본 발명자들은 성매개 감염원인체를 동시 또는 단독으로 검출할 수 있는 검출용 키트를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 신속하면서 민감도가 높은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 이용하여 한번의 PCR 반응으로 다양한 성매개 감염원인체를 동시에 검출할 수 있는 검출용 키트를 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 성매개 감염원인체 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 성매개 감염원인체의 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 서열번호 1 및 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 검출용 세트;
(ii) 서열번호 4 및 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 임질구균(Neisseria gonorrhoeae) 검출용 세트;
(iii) 서열번호 7 및 8의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 임질구균 검출용 세트;
(iv) 서열번호 10 및 11의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis) 검출용 세트;
(v) 서열번호 16 및 17의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 질편모충(Trichomonas vaginalis) 검출용 세트;
(vi) 서열번호 19 및 20의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum) 검출용 세트; 및
(vii) 서열번호 22 및 23의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium) 검출용 세트; 또는
(viii) 이들의 조합을 포함하는 성매개 감염원인체 동시 검출용 키트를 제공한다.
본 발명자들은 성매개 감염원인체를 정성적으로 동시 또는 단독으로 검출할 수 있는 검출용 키트를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 신속하면서 민감도가 높은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 이용하여 한번의 PCR 반응으로 다양한 성매개 감염원인체를 동시에 검출할 수 있는 검출용 키트를 개발하였다.
본 발명의 성매개 감염원인체 검출용 키트는 프라이머 및 프로브를 이용한 유전자증폭방식을 통해 클라미디아 트라코마티스, 임질구균, 마이코플라스마 호미니스, 질편모충, 우레아플라스마 우레아리티쿰 및 마이코플라스마 제니탈리움을 검출한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머(primer)”는 핵산 가닥(템플레이트)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건 하에서, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재 시, 그리고 적합한 온도와 pH에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 (i) 내지 (vii)의 검출용 세트는 하기의 프로브를 추가적으로 포함한다:
상기 (i) 클라미디아 트라코마티스 검출용 세트는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브;
상기 (ii) 임질구균 검출용 세트는 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브;
상기 (iii) 임질구균 검출용 세트는 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브;
상기 (iv) 마이코플라즈마 호미니스 검출용 세트는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브;
상기 (v) 질편모충 검출용 세트는 서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브;
상기 (vi) 우레아플라스마 우레아리티쿰 검출용 세트는 서열번호 21의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브; 또는
상기 (vii) 마이코플라즈마 제니탈리움 검출용 세트는 서열번호 24의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브.
본 발명의 성매개 감염원인체 검출용 키트는 목적하는 균주 중 임질구군의 경우 Por A gene 혹은 Cryptic plasmid DNA 두 가지 검출 부위 중 1개의 검출부위만을 가지는 균주가 존재하여, 검출범위(Coverage) 및 안정된 민감도 위해 2개의 유전자를 채택하여 키트를 구성하였다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프로브(probe)"는 타겟 핵산 서열에 실질적으로 상보적인 부위 또는 부위들을 포함하는 단일-가닥 핵산 분자를 의미한다. 상기 "타겟 핵산", "타겟 핵산 서열" 또는 "타겟 서열"은 검출하고자 하는 핵산 서열을 의미하며, 혼성화, 어닐링, 또는 증폭 조건 하에서 프라미어 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
바람직하게는, 프로브 및 프라이머는 단일-가닥 데옥시리보뉴클레오타이드 분자이다. 본 발명에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프로브 또는 프라이머는 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍 시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)를 포함한 복수의 요소에 따라 결정될 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 템플레이트 핵산에 올리고데옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 템플레이트 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “혼성화(hybridization)”는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 완전히 일치하거나 일부 미스매치로 실질적으로 일치하는 2개의 핵산 가닥 사이에서 일어날 수 있다. 혼성화를 위한 상보성은 혼성화 조건, 특히 온도에 따라 달라질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "어닐링"과 "혼성화"는 차이가 없으며 본 명세서에서 혼용된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 유전자 증폭에 의해 실시된다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 유전자 증폭은 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR) 방식에 의해 실시된다.
본 발명의 키트는 상기 프라이머 및 프로브를 이용하여 중합효소연쇄반응 방식을 통해 클라미디아 트라코마티스, 임질구균, 마이코플라스마 호미니스, 질편모충, 우레아플라스마 우레아리티쿰 및 마이코플라스마 제니탈리움을 동시에 멀티플렉스 검출(multiplex detection or multiplexing detection)한다.
상기 "멀티플렉스 검출" 또는 "멀티플렉싱 검출"은 반응 용기(예컨대, 반응 튜브)에서 복수의 타겟 핵산서열을 동시적으로 검출하는 것을 의미한다.
상기 중합효소연쇄반응(PCR)은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)"은 반응 용기에서 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)에 의하여 복수의 타겟이 동시적으로 증폭되는 것을 의미한다.
상기 중합효소연쇄반응은 다양한 DNA 중합효소가 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 '클레나우' 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 구체적으로는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 Taq DNA 중합효소 또는 Pfu DNA 중합효소를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 Taq DNA 중합효소를 포함한다.
본 발명의 키트는 중합효소연쇄반응 산물에 의한 캐리오버(carryover) 또는 크로스오버(crossover) 오염을 차단하기 위해 dUTP(deoxyuridine triphosphate) 및 UDG(Uracil DNA Glycosilase)를 추가적으로 포함 할 수 있다. UDG는 이전 증폭산물 DNA 주형가닥에 포함된 우라실(Uracil)을 인식하고 잘라내며, 잘려진 DNA 주형가닥은 더 이상 주형가닥으로의 역할을 상실하게 됨으로써 증폭반응이 일어나지 않게 된다. 본 발명은 dUTP 및 UDG를 사용함으로써 이전 증폭산물의 오염에 의한 증폭산물의 생성을 원천 차단하여, 이전 증폭생성물의 검사실 오염에 따른 위양성 결과를 배제하여 검사의 정확도를 향상시킨다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
본 발명의 키트는 실시간 중합효소연쇄반응 방식이다.
상기 실시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al., PCR Methods Appl., 4(6): 357-62(1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링 할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 Ct 값(cycle threshold)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. 종래의 PCR 방법에 비해, 실시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.
PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 역치(threshold)를 설정하면 역치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 Ct 값이 산출된다.
실시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 interchelating 방법(SYBR 그린 I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. Interchelating 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 TaqMan 프로브 방법을 이용한다.
먼저, interchelating 방법은 이중 가닥 DNA 결합 다이를 이용하는 방법으로, 비-서열 특이적 형광 intercalating 시약(SYBR 그린 I 또는 ethidium bromide)을 이용하여 비-특이적 증폭 및 프라이머-다이머 복합체를 포함하는 앰플리콘 생산을 정량하는 것이다. 상기 시약은 ssDNA와는 결합하지 않는다. SYBR 그린 I은 이중 가닥 DNA의 마이너 그루브(minor groove)에 결합하는 형광성 다이로, 용액 상에서는 거의 형광을 보이지 않지만 이중 가닥 DNA와 결합하면 강한 형광을 나타내는 시약(interchelator)이다(Morrison TB, Biotechniques., 24(6): 954-8, 960, 962(1998)). 따라서 SYBR 그린 I과 이중 가닥 DNA 간의 결합을 통해 형광을 방출하기 때문에 증폭 산물의 생성량을 측정할 수 있다. SYBR 그린 실시간 PCR은 앰플리콘 동정을 위해 융해점(melting point) 또는 해리 곡선(dissociation curve) 분석과 같은 최적화 과정을 동반한다. 정상적으로 SYBR 그린은 싱글플렉스(singleplex) 반응에 이용되지만, 융해곡선(melting curve) 분석이 동반되면 멀티플렉스(multiplex) 반응에 이용될 수 있다(Siraj AK, et al., Clin Cancer Res., 8(12): 3832-40(2002); 및 Vrettou C., et al., Hum Mutat., Vol 23(5): 513-521(2004)).
Ct(cycle threshold) 값은 반응에서 발생된 형광이 역치(threshold)를 넘어서는 사이클 수를 의미하며, 이는 초기 카피 수의 대수에 반비례한다. 그러므로, 특정 웰에 할당된 Ct 값은 반응에서 앰플리콘의 충분한 수가 축적된 사이클의 수를 반영한다. Ct 값은 △Rn의 증가가 처음으로 검출된 사이클이다. Rn은 각 시점에서 PCR 동안 발생된 형광 시그널의 크기를 의미하며, △Rn은 레퍼런스 다이의 형광 방출 강도로 나뉘어진 리포터 다이의 형광방출 강도(표준화된 리포터 시그널)를 의미한다. Ct 값은 LightCycler에서는 Cp(crossing point)로도 명명된다. Ct 값은 시스템이 로그-선형 단계(log-linear phase)에서 PCR 생산물의 지수성장과 관련된 형광 시그널의 증가를 검출하기 시작하는 시점을 나타낸다. 이 시기는 반응에 대한 가장 유용한 정보를 제공한다. 로그-선형 단계의 기울기는 증폭 효율(amplification efficiency, Eff)을 나타낸다(www.appliedbiosystems.co.kr/).
한편, TaqMan 프로브는 전형적으로 5'-말단에 형광물질(fluorophore) 및 3'-말단에 퀀처(quencher; 예컨대, TAMRA 또는 비-형광 퀀처(NFQ))를 포함하는 프라이머(예컨대, 20-30 뉴클레오타이드) 보다 더 긴 올리고뉴클레오타이드이다. 여기된 형광물질은 형광을 내기 보다는 근처의 퀀처에 에너지를 전달한다(FRET = Frster or fluorescence resonance energy transfer; Chen, X., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94(20): 10756-61(1997)). 그러므로, 프로브가 정상인 경우, 어떠한 형광도 발생되지 않는다. TaqMan 프로브는 PCR 생산물의 내부 부위에 어닐링할 수 있도록 고안된다. 예를 들어, TaqMan 프로브는 서열번호 1 및 2에 의해 증폭되는 cryptic plasmid DNA 유전자 절편의 내부서열로 고안될 수 있다.
TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서 템플레이트 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브 상에 퀀처에 의해 형광발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 폴리머라제가 갖는 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 템플레이트에 혼성화한 TaqMan 프로브가 분해되어 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 퀀처에 의한 억제가 해제되어 형광은 나타낸다. 이 때, TaqMan 프로브의 5'-말단은 상기 연장 프라이머의 3'-말단의 다운스트림에 위치하여야 한다. 즉, 연장 프라이머의 3'-말단이 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우, 이 중합효소의 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 TaqMan 프로브의 5'-말단이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다.
TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 형광성 물질 및 비형광성 물질을 포함한다.
본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며, 그 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다): Cy2TM(506), YOPROTM-1(509), YOYOTM-1 (509), Calcein(517), FITC(518), FluorXTM(519), AlexaTM(520), rhodamine 110(520), 5-FAM(522), Oregon GreenTM500(522), Oregon GreenTM488(524), RiboGreenTM(525), RhodamineGreenTM(527), Rhodamine 123(529), Magnesium GreenTM(531), Calcium GreenTM(533), TO-PROTM-1(533), TOTO1(533), JOE(548), BODIPY530/550(550), Dil(565), BODIPY TMR(568), BODIPY558/568(568), BODIPY564/570(570), Cy3TM(570), AlexaTM546(570), TRITC(572), Magnesium OrangeTM(575), Phycoerythrin R&B(575), Rhodamine Phalloidin(575), Calcium OrangeTM(576), Pyronin Y(580), RhodamineB(580), TAMRA(582), Rhodamine RedTM(590), Cy3.5TM(596), ROX(608), Calcium CrimsonTM(615), AlexaTM594(615), Texas Red(615), Nile Red(628), YO-PROTM-3(631), YOYOTM-3(631), R-phycocyanin(642), CPhycocyanin(648), TO-PROTM-3(660), TOTO3(660), DiD DilC(5)(665), Cy5TM(670), Thiadicarbocyanine(671), Cy5.5(694), HEX(556), TET(536), VIC(546), BHQ-1(534), BHQ-2(579), BHQ-3(672), BiosearchBlue(447), CAL Fluor Gold 540(544), CAL Fluor Orange 560(559), CAL Fluor Red 590(591), CAL FluorRed 610(610), CAL Fluor Red 635(637), FAM(520), Fluorescein(520), Fluorescein-C3(520), Pulsar 650(566), Quasar 570(667), Quasar 670(705) 및 Quasar 705(610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다.
적합한 리포터-퀀처 쌍(pairs)은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH(Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES(Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS(Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE(Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 서열번호 3, 6, 9, 12, 18, 21, 및 24의 뉴클레오타이드 서열의 5'-말단은 FAM, TET, HEX, JOE, ROX, TMR, Cy5 및 Cal Red 610로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질(fluorophore)로 표지되고, 3'-말단은 BHQ-1, BHQ-2 또는 BHQ-3의 퀀처(quencher)로 변형된다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 서열번호 6, 9 및 18은 5'-말단의 형광물질로 FAM 및 3'-말단의 퀀처로 BHQ1를 이용하고, 본 발명의 서열번호 3 및 21은 5'-말단의 형광물질로 JOE 및 3’-말단의 퀀처로 BHQ1을 이용하며, 본 발명의 서열번호 12 및 21은 5'-말단의 형광물질로 JOE, 3'-말단의 퀀처로 BHQ1을 이용하고, 본 발명의 서열번호 12 및 24는 5'-말단의 형광물질로 Cy5 및 3'-말단의 퀀처로 BHQ3을 이용하며, 본 발명의 서열번호 15는 5'-말단의 형광물질로 Cal Red 610 및 3'-말단의 퀀처로 BHQ2를 이용한다.
본 발명의 성매개 감염원인체 검출용 키트는 중합효소연쇄반응이 정상적으로 실시되었는지 확인하기 위한 PCR 대조군 세트를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 키트는 서열번호 13 및 14의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 15의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 PCR 대조군 세트를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 성매개 감염원인체의 검출 방법을 제공한다:
(a) 객체로부터 분리된 생물학적 시료의 DNA를 준비하는 단계;
(b) (i) 서열번호 1 및 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 클라미디아 트라코마티스 검출용 세트;
(ii) 서열번호 4 및 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 임질구균 검출용 세트;
(iii) 서열번호 7 및 8의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 임질구균 검출용 세트;
(iv) 서열번호 10 및 11의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 마이코플라스마 호미니스 검출용 세트;
(v) 서열번호 16 및 17의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 질편모충 검출용 세트;
(vi) 서열번호 19 및 20의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 21의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 우레아플라스마 우레아리티쿰 검출용 세트; 및
(vii) 서열번호 22 및 23의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 24의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 마이코플라스마 제니탈리움 검출용 세트; 또는
(viii) 이들의 조합을 이용하여 상기 생물학적 시료 내 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 결과를 확인하는 단계.
본 명세서에서 용어 "생물학적 시료"는 소변, 조직, 생검 검체, 체액, 혈액 또는 대변으로부터 분리한 DNA 시료이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 소변, 혈액, 타액, 요도분비물, 물집(vesicle) 및 물집 내 체액(예컨대 림프액, 혈청, 혈장, 혈액 또는 고름), 궤양(ulcer), 사마귀(wart), 점액(생식기, 인두, 직장 등 점막조직의 점액), 또는 조직과 이로부터 분리한 DNA 시료이다. 예를 들어, 상기 조직은 질, 자궁경부, 요도점막 조직이다.
상기 생물학적 시료는 '면봉 기반 샘플' 또는 '소변 기반 샘플' 방식으로 채취할 수 있다.
상기'면봉 기반 샘플'은 생식기 도말 샘플로, 여성의 경우 질경을 사용하여 멸균된 면봉을 자궁경관 내 약 1.5 cm 깊이에서 벽면을 약 10초 동안 회전시킨 분비물을 흡수한다. 남성의 경우 요도의 분비물이나 2-3 cm 깊이에서 가는 면봉을 이용하여 채취한다.
상기 '소변 기반 샘플'은 첫 소변을 깨끗한 용기에 10-30 ml 채취한다.
본 발명은 생물학적 시료에서 추출한 DNA에 결합하는 프라이머 및 프로브를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.
시료로부터 DNA를 추출하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)).
본 발명의 방법은 상기 성매개 감염원인체의 검출용 키트를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 성매개 감염원인체 검출용 키트 및 방법을 제공한다.
(b) 본 발명의 키트 및 방법은 성매개 감염원인체 1-10 copies까지 검출할 수 있는 우수한 민감도를 갖으며, 유전자 증폭 장비의 호환이 가능하다.
(c) 본 발명의 키트 및 방법은 한번의 PCR 반응으로 다양한 성매개 감염원인체를 동시에 검출 할 수 있으며, 높은 민감도 및 특이도를 갖는다.
도 1은 프라이머 및 프로브 Set Ⅰ의 실시간 PCR 결과를 나타낸다.
도 2는 프라이머 및 프로브 Set Ⅱ의 실시간 PCR 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예
1) 성병 유발 원인체의 준비
본 개발 제품인 성매개 감염원인체 검출용 키트의 유효성을 증명하기 위하여 실험에 사용할 각 목표 원인체 6종을 미국 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 분양 받아 사용하였다. 목표 원인체인 클라미디아 트라코마티스, 임질구균, 마이코플라스마 호미니스, 질편모충, 우레아플라스마 우레아리티쿰 및 마이코플라스마 제니탈리움의 검출을 위해, 각 원인체의 표적 유전자를 선별하였다.
목표 원인체 원인체 서브타입 Cat # 표적 유전자
클라미디아 트라코마티스
(Chlamydia trachomatis, CT)		 Trachoma type J strain UW-36/Cx #VR-886 Cryptic plasmid DNA
임질구균
(Neisseria gonorrhoeae, NG)		 - #49226 Por A
Cryptic plasmid DNA
마이코플라스마 호미니스
(Mycoplasma hominis, MH)		 Strain PG21 #23114D GAP
질편모충
(Trichomonas vaginalis, TV)		 Strain C-1:NIH #30001D BtuB
우레아플라스마 우레아리티쿰
(Ureaplasma urealyticum, UU)		 - #27819 UreG-D
마이코플라스마 제니탈리움
(Mycoplasma genitalium, MG)		 Strain G37 #33530D gyrA
2) 목표 원인체의 검출을 위한 프라이머 설계
6종의 성매개 감염원인체를 3종씩 2세트(Set Ⅰ&Ⅱ)로 나누어 프라이머 및 형광표지된 프로브를 설계하였으며, PCR 대조군으로 식물(시금치, Spinacia) 유래 유전자를 검출할 수 있도록 설계하였다. 아래 표 2는 Set Ⅰ의 프라이머 및 프로브 혼합물이고, 표 3은 Set Ⅱ의 프라이머 및 프로브 혼합물이다.
원인체 표적 유전자 프라이머명 서열(5’-> 3’) TM
(℃)		 GC
(%)		 Mer 서열번호
CT Cryptic plasmid DNA CT-1 F GGACCAGCAAATAATCCTTGGG 66 50 32 1
CT-1 R TAAGCTTTTTCCGCATCCAAACC 66 43 23 2
CT probe JOE-ATCAACACCTGTCGCAGCCAAAATGACA-BHQ1 82 46 28 3
NG Por A NG F CTGCTACTTTCACGCTGGAAAG 66 50 22 4
NG R TCTGCCGAGCAAGAACAAAAAG 64 45 22 5
NG probe FAM-ATCATGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG-BHQ1 80 53 26 6
Cryptic plasmid DNA NG-Cry F CGCACAAAAACGTGTTGGCGTT 66 50 22 7
NG-Cry R GTTAGCGATTGATTTGGAGATAC 64 39 23 8
NG-Cry probe FAM-TTCTTTTTCCCACATCGGGACAGGGAAAT-BHQ1 84 44 29 9
MH GAP MH-2 F TTATCAGGCGCTTCATGTACTAC 66 43 23 10
MH-2 R CTTTGGTCTGCTGTATATGAGTG 66 43 23 11
MH-2 probe CY5-CAATACGTTGGCAATAGGAGCTAAACAG-BHQ3 80 42 28 12
PCR 대조군 Spinacia의 psbA S_301_PCRC F CGAATACACCAGCTACACCTAA 64 45 22 13
S_301_PCRC R TACAATGGTGGTCCTTATGAACT 64 39 23 14
S_301_PCRC probe Cal Flour Red 610-GTGAAATGGGTGCATAAGGATGTTGT-BHQ2 74 42 26 15
원인체 표적 유전자 프라이머명 서열(5’-> 3’) TM
(℃)		 GC
(%)		 Mer 서열번호
TV BtuB TV F CCGATCTTCAGCTCGAGCGC 66 65 20 16
TV R GCGGAAAAGCTGACCGAACTG 66 57 21 17
TV probe FAM-AGCCACAGGCGGCAAGTACGTCCCA-BHQ1 82 64 25 18
UU UreG-D UU F AGTAATCGCTGCCATGCTATAC 64 45 22 19
UU/P R GACCATTAATTATTGGTGTAGGTG 66 37 24 20
UU probe JOE-CAATTAACATTGTCTTTCCAGCACCAACAG-BHQ1 84 40 30 21
MG gyrA MG F ATGGCAATATATGACACCATGTCA 66 37 24 22
MG R TATCTTTTAAAAGTTCTGCTGCAAG 66 32 25 23
MG probe CY5-GTTGTGCAGCAGGTCTATCACCATCTAT-BHQ3 82 46 28 24
PCR 대조군 Spinacia의 psbA S_301_PCRC F CGAATACACCAGCTACACCTAA 64 45 22 13
S_301_PCRC R TACAATGGTGGTCCTTATGAACT 64 39 23 14
S_301_PCRC probe Cal Flour Red 610-GTGAAATGGGTGCATAAGGATGTTGT-BHQ2 74 42 26 15
3) 실시간 PCR 혼합물의 제조
냉동시약은 상온에서 녹인 후 원심 분리하여 사용하였다. 다음 사용 시약을 순서대로 넣어 혼합액을 제조하였다.
성분 부피(μl)
2×Multiplex Real-Time PCR Smart mix (with UDG) (STI 6)
(EQD95-M10h, 이원생명과학원)		 Taq-polymerase, dNTP, 10X buffer 외 혼합물 10
Primer & Probe Mixture I or II (STI 6)(EQD95-B500(OM-Ⅰ 및 OM-Ⅱ), 이원생명과학원) Oligonucleotide, Modified oligonucleotide 혼합물 5
DNA 주형 샘플 5
총 반응 부피 20
4) 실시간 PCR 조건
다음의 조건으로 실시간 PCR을 실시하였다.
No. 단계 온도(℃) 시간 사이클
1 UDG 반응 50 3 분 1
2 초기 PCR 활성화 95 15 분 1
3 변성 95 20 초 45
4 어닐링 60 40 초
5) 실시간 PCR 결과
도 1 및 2는 각각 Set Ⅰ 및 Ⅱ의 실시간 PCR 결과를 나타낸다. 각 성매개 감염원인체에 따라 프로브에 태깅된 형광(FAM, NG 및 TV; JOE, CT 및 UU; Cy5, MH 및 MG; Cal Red 610, PCR 대조군)이 다르게 지정되어 있어 증폭 곡선을 통해, 샘플 내 클라미디아 트라코마티스, 임질구균, 마이코플라스마 호미니스, 질편모충, 우레아플라스마 우레아리티쿰 및 마이코플라스마 제니탈리움, 각각의 존재 여부를 각각 확인 할 수 있었다.
실시간 PCR 결과에서, 증폭 곡선의 Ct(threshold cycle) 값이 43이상인 경우, 유의성이 없는 것으로 판단하였고, 역가(threshold)는 50,000로 지정하였다.
6) 분석적 민감도
미국 ATCC로부터 구매한 클라미디아 트라코마티스, 임질구균, 마이코플라스마 호미니스, 질편모충, 우레아플라스마 우레아리티쿰 및 마이코플라스마 제니탈리움의 지노믹(genomic) DNA, 프라이머 및 프로브를 이용하여 ABI사의 Real-Time PCR thermo cycler (Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Instrument System)로 분석적 민감도(limit of detection, LOD)를 확인하였다. CT, NG, MH, TV, UU 및 MG의 플라스미드 DNA는 각각 105 copies 부터 1/10씩 100 copy까지 희석하여 사용하였으며 기질별(소변 및 면봉)로 3 Lot, 4반복 실험을 진행하였다(1008 reactions/3 Lot).
분석적 민감도 비고
검체 기질(matrix) 소변 또는 면봉 검체 -
목적 원인체 클라미디아 트라코마티스, 임질구균, 마이코플라스마 호미니스, 질편모충, 우레아플라스마 우레아리티쿰 및 마이코플라스마 제니탈리움 -
DNA 주형 희석 단계 NTC(No Template Control), 100, 101, 102, 103, 104, 105 -
필요 Lot 수 3 Lot -
반복 설정 3 Lot, 2종 장비, 4회 반복, 기질별 별도 실험 24 반복×2
필요 반응수 336 reactions/Lot -
분석적 민감도 결과는 표 7과 같다:
목적 원인체 LOD(copies/rxn)
클라미디아 트라코마티스 1
임질구균 1
마이코플라스마 호미니스 10
질편모충 10
우레아플라스마 우레아리티쿰 10
마이코플라스마 제니탈리움 10
그 결과, 클라미디아 트라코마티스 및 임질구균은 1 copy의 LOD(limit of detection)을 나타냈고, 마이코플라스마 호미니스, 질편모충, 우레아플라스마 우레아리티쿰 및 마이코플라스마 제니탈리움은 10 copies의 LOD를 나타냈다.
7) 분석적 특이도
클라미디아 트라코마티스, 임질구균, 마이코플라스마 호미니스, 질편모충, 우레아플라스마 우레아리티쿰 및 마이코플라스마 제니탈리움의 6종 성매개 감염원인체와 위양성을 보일 수 있는 인간 gDNA(KCTC HC18802), 이스케리치아 콜라이(Escherichia coli) gDNA(KCTC-2593 및 KCTC-1682), 헤르페스 바이러스 1(Herpes simplex virus 1, ATCC-VR-260D), 헤르페스 바이러스 2(Herpes simplex virus 2, ATCC-VR-734D), 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis, ATCC-49145D-5), 매독균(Treponema pallidum, ATCC-BAA-2642SD), 칸디다 알비칸스(Candida albicans, KCTC-17712 및 KCTC-7678) 및 연성하감균(Haemophilus ducreyi, ACTT-51620)의 6종 다른 세균에서의 특이적 및 비특이적 산물 생성을 확인하였다. 표 8의 '○'는 '특이적 산물이 생성됨'을, '×'는 '특이적 산물이 생성되지 않음'을 의미한다.
No. 검체 결과
Set Ⅰ Set Ⅱ
1 클라미디아 트라코마티스 ○ ×
2 임질구균 ○ ×
3 마이코플라스마 호미니스 ○ ×
4 질편모충 × ○
5 우레아플라스마 우레아리티쿰 × ○
6 마이코플라스마 제니탈리움 × ○
7 인간 gDNA × ×
8 E. coli gDNA × ×
9 헤르페스 바이러스 1 × ×
10 헤르페스 바이러스 2 × ×
11 가드네렐라 바지날리스 × ×
12 매독균 × ×
13 칸디다 알비칸스 × ×
14 연성하감균 × ×
분석적 특이도는 성매개 감염을 일으킬 수 있으며 목표 검체(swab, urine)에서 유래 할 수 있는 미생물 중 목표 균주가 아닌 균주를 선발하여 검출 cut off 이내에 검출되지 않음을 확인하였다.
또한, 임상 검체에 포함될 수 있는 점액, 혈액 등의 9종 간섭 물질에 대한 영향을 확인하였다.
No. 간섭물질 간섭유래 사용농도 Set I
간섭효과		 Set II
간섭효과
1 Collagen 질도말(조직, 젤) 44 ng × ×
2 Urea 소변 0.04% × ×
3 Hemoglobin 질도말(혈액)소변(혈액) 2.5 μg × ×
4 Lactoferrin 질도말(점액) 25 ng × ×
5 Immunoglobulin G(IgG) 질도말(혈액-호르몬)
소변(혈액-호르몬)		 0.41 μg × ×
6 Mucin 질도말(점액) 1 μg × ×
7 BSA 질도말(조직) 5% × ×
8 Glucose 소변 0.12% × ×
9 Bilirubin 소변(헤모글로빈) 20 μM × ×
Control 과 해당 9종의 간섭물질의 영향에 의한 Target 간 Ct value 확인을 진행하였으며, 테스트 결과 해당 간섭물질에 의한 PCR 간섭효과는 아래 표 10과 같이 없거나 미비하였다.
No. Interference Conc. Matrix Set I
Set II
Target - 1반복 2반복 3반복
Target - 1반복 2반복 3반복
1 Control 0 Swab CT CT 33.6 33.6 33.1
TV CT 37.6 37.4 36.7
NG CT 34.8 34.3 34.8
UU CT 36.8 35.4 37.0
MH CT 39.0 36.5 37.1
MG CT 36.9 36.5 37.0
Urine CT CT 33.5 32.7 33.4
TV CT 37.1 39.4 39.4
NG CT 34.9 34.8 35.6
UU CT 36.5 36.3 35.7
MH CT 35.9 36.0 35.7
MG CT 37.4 36.2 36.4
2 Collagen 40ng Swab CT CT 34.2 33.1 34.3
TV CT 37.8 36.2 39.0
NG CT 35.8 32.9 36.3
UU CT 37.0 36.7 37.7
MH CT 36.6 36.4 38.0
MG CT 36.3 36.6 36.8
Urine CT CT 33.6 33.3 33.3
TV CT 36.5 36.4 36.0
NG CT 34.2 33.7 33.7
UU CT 36.9 37.2 35.8
MH CT 35.9 36.7 35.5
MG CT 36.1 35.8 36.5
3 Urea 0.04% Swab CT CT 33.9 33.1 34.2
TV CT 37.9 35.3 36.6
NG CT 35.3 35.2 34.9
UU CT 36.3 35.3 37.0
MH CT 38.5 37.0 38.4
MG CT 37.3 34.8 37.9
Urine CT CT 33.4 33.1 33.5
TV CT 39.7 36.4 38.0
NG CT 34.8 35.0 35.7
UU CT 35.9 36.2 37.4
MH CT 35.7 37.7 35.9
MG CT 37.3 36.6 37.1
4 Hemoglobin 2.5μg Swab CT CT 34.0 33.0 35.0
TV CT 37.4 36.9 37.9
NG CT 35.9 34.4 35.5
UU CT 38.0 36.2 37.1
MH CT 37.9 36.5 38.5
MG CT 36.4 35.9 37.8
Urine CT CT 33.9 33.7 34.1
TV CT 39.8 38.0 38.4
NG CT 35.3 35.6 35.4
UU CT 36.8 36.9 35.5
MH CT 35.3 36.1 35.0
MG CT 37.4 36.5 37.0
5 Lactoferrin 25ng Swab CT CT 33.7 33.2 34.2
TV CT 36.6 36.1 38.1
NG CT 34.6 33.0 35.1
UU CT 36.6 36.8 36.8
MH CT 37.7 37.7 37.8
MG CT 36.8 36.7 37.1
Urine CT CT 33.6 33.6 33.7
TV CT 39.0 38.2 38.8
NG CT 34.6 34.5 35.3
UU CT 36.9 38.0 36.6
MH CT 35.7 36.4 35.5
MG CT 37.2 37.7 37.1
6 Immuno-globulin G (IgG) 0.41μg Swab CT CT 35.2 35.4 36.4
TV CT 37.2 40.2 37.4
NG CT 37.1 35.8 37.4
UU CT 37.2 37.3 39.4
MH CT 37.2 36.5 36.7
MG CT 38.5 37.9 37.6
Urine CT CT 34.3 34.6 35.1
TV CT 37.9 39.6 41.6
NG CT 36.5 36.4 37.2
UU CT 37.0 37.6 37.1
MH CT 36.8 37.3 36.5
MG CT 38.1 38.8 40.9
7 Mucin 1μg Swab CT CT 33.4 33.5 33.8
TV CT 37.0 36.8 40.0
NG CT 35.1 34.3 35.7
UU CT 35.7 36.2 37.0
MH CT 36.0 38.6 37.3
MG CT 37.5 36.6 36.9
Urine CT CT 33.4 34.1 33.6
TV CT 39.7 39.2 39.2
NG CT 35.1 35.3 35.7
UU CT 36.0 36.4 36.1
MH CT 35.5 33.5 36.3
MG CT 37.1 37.1 36.4
8 BSA 5% Swab CT CT 33.9 34.0 33.5
TV CT 38.0 37.0 37.3
NG CT 36.8 35.5 35.5
UU CT 35.1 36.8 37.0
MH CT 36.9 37.0 38.7
MG CT 35.1 36.8 36.4
Urine CT CT 33.7 33.7 33.6
TV CT 37.7 38.6 39.1
NG CT 34.9 34.5 37.0
UU CT 37.2 36.8 37.1
MH CT 35.4 35.3 35.1
MG CT 36.8 38.5 37.6
9 Glucose 0.12% Swab CT CT 33.9 32.5 34.3
TV CT 37.0 35.8 38.2
NG CT 35.0 31.4 35.4
UU CT 36.6 35.5 36.0
MH CT 38.6 33.7 39.5
MG CT 36.9 35.9 38.4
Urine CT CT 33.3 33.7 33.3
TV CT 37.2 37.8 37.5
NG CT 33.5 32.8 33.5
UU CT 38.0 35.8 37.0
MH CT 35.6 35.1 36.4
MG CT 37.1 36.4 36.4
10 Bilirubin 20μM Swab CT CT 34.2 33.4 34.5
TV CT 38.1 36.5 37.7
NG CT 36.4 34.5 35.9
UU CT 37.0 35.6 37.9
MH CT 36.9 36.1 38.1
MG CT 36.0 36.5 36.6
Urine CT CT 33.7 33.6 33.6
TV CT 38.7 36.9 36.6
NG CT 36.3 35.3 35.8
UU CT 35.2 36.1 36.9
MH CT 35.5 36.8 35.9
MG CT 36.7 35.4 35.9
성 매개감염을 일으킬 수 있으며 목표 검체(swab, urine) 에서 유래 할 수 있는 미생물 중 목표균주가 아닌 균주를 선발하여 검출 cut off 이내에 검출되지 않음을 확인하였다.
8) 분석적 정밀도
성매개 감염원인체의 지노믹 DNA를 사용하여 Lot, 검사일 사이의 정밀도를 평가하였다. DNA 주형은 민감도 결과에 따라, 검출한계 농도인 10 copies를 포함하여 104, 103-102, 10 copies의 총 3단계로 실시하였다. 표 11 및 12는 Lot 간 정밀도의 평가한 결과이고, 표 13 및 14는 검사일 간 정밀도를 평가한 결과이다. 표 11 및 13은 면봉 기반(swab matrix) 샘플(여성의 질 도말 또는 생식기 도말 검체에서 핵산을 추출한 실험환경)을 이용하여 실시간 PCR을 실시한 결과이고, 표 12 및 14는 소변 기반(urine matrix) 샘플(소변 검체에서 핵산을 추출한 실험환경)을 이용하여 실시한 결과이다.
Swab matrix Lot 간 정밀도 실험 결과
표적 Copies no. Lot1 평균 Ct값 Lot2 평균 Ct값 Lot3 평균 Ct값 Lot 간 표준편차 Lot 간
%CV
NG 104 25.8 24.5 24.2 0.697 2.803
103-2 32.0 31.3 30.9 0.458 1.458
10 37.2 36.6 36.1 0.445 1.215
CT 104 24.5 23.7 23.7 0.368 1.534
103-2 30.7 30.1 30.0 0.315 1.040
10 35.8 35.2 35.1 0.286 0.810
MH 104 28.1 27.6 27.5 0.289 1.042
103-2 34.3 34.0 33.7 0.248 0.730
10 38.9 38.8 38.9 0.012 0.030
TV 104 28.0 27.4 27.3 0.324 1.176
103-2 34.2 33.8 33.6 0.224 0.661
10 39.0 38.9 38.9 0.051 0.130
UU 104 28.2 27.6 27.4 0.355 1.278
103-2 34.1 33.6 33.3 0.335 0.994
10 39.2 38.5 38.8 0.225 0.657
MG 104 29.3 28.8 28.5 0.348 1.206
103-2 36.1 36.1 35.7 0.187 0.521
10 39.5 39.0 38.3 0.493 1.267
표 9 내지 12의 "%CV"는 coefficient of variation(변동계수)를 의미한다.
Urine matrix Lot 간 정밀도 실험 결과
표적 Copies no. Lot1 평균 Ct값 Lot2 평균 Ct값 Lot3 평균 Ct값 Lot 간 Ct 표준편차 Lot 간
%CV
NG 104 26.3 25.5 25.4 0.416 1.616
103-2 32.3 31.8 31.2 0.416 1.308
10 38.2 36.9 36.7 0.662 1.777
CT 104 24.4 24.0 24.0 0.182 0.753
103-2 30.5 30.2 30.1 0.155 0.512
10 36.0 35.3 35.1 0.355 1.001
MH 104 27.3 27.3 27.1 0.133 0.488
103-2 33.6 33.5 33.4 0.103 0.309
10 38.2 38.1 38.6 0.201 0.525
TV 104 28.5 28.3 28.2 0.124 0.436
103-2 34.7 34.2 34.4 0.237 0.689
10 39.0 38.5 38.6 0.249 0.644
UU 104 28.5 28.0 28.0 0.214 0.758
103-2 34.6 34.0 33.7 0.391 1.146
10 39.5 39.0 39.2 0.212 0.539
MG 104 29.5 29.3 29.1 0.132 0.449
103-2 36.0 36.0 35.9 0.018 0.049
10 39.4 39.4 39.3 0.038 0.097
Swab matrix Lot 간 정밀도 실험 결과
표적 Copies no. 검사일 간 Ct 평균 값 검사일 간 Ct 표준편차 검사일 간 %CV
NG 104 24.9 0.401 1.614
103-2 31.4 0.788 2.509
10 36.6 0.826 2.256
CT 104 24.0 0.201 0.838
103-2 30.3 0.484 1.598
10 35.4 0.838 2.371
MH 104 27.7 0.279 1.006
103-2 34.0 0.397 1.167
10 38.9 0.597 1.536
TV 104 27.5 0.284 1.033
103-2 33.9 0.469 1.385
10 38.9 0.465 1.195
UU 104 27.8 0.306 1.103
103-2 33.7 0.468 1.389
10 38.8 0.716 1.844
MG 104 28.9 0.756 2.617
103-2 36.0 1.198 3.331
10 38.9 0.761 1.956
Urine matrix Lot 간 정밀도 실험 결과
표적 Copies no. 검사일 간 Ct 평균 값 검사일 간 Ct 표준편차 검사일 간 %CV
NG 104 25.7 0.411 1.599
103-2 31.8 0.778 2.448
10 37.3 0.989 2.655
CT 104 24.1 0.262 1.084
103-2 30.3 0.630 2.084
10 35.5 0.789 2.225
MH 104 27.2 0.658 2.413
103-2 33.5 0.804 2.399
10 38.3 0.850 2.217
TV 104 28.3 0.463 1.636
103-2 34.4 0.632 1.836
10 38.7 0.478 1.234
UU 104 28.2 0.640 2.272
103-2 34.1 0.731 2.143
10 39.3 0.458 1.166
MG 104 29.3 0.792 2.703
103-2 36.0 1.000 2.781
10 39.4 0.704 1.790
그 결과, Lot, 검사일 사이의 차이가 없는 것을 확인하였으며, 음성 대조군에서 오염은 발생하지 않았다.
표 11 내지 18에 각 lot 별, 검사일간 및 사용자간의 %CV값을 나타내고 있다. %CV 값의 분포는 최소값 0.030 에서 3.331 이며 이를 퍼센트로 환산하면 99.970% 에서 96.669% 의 정밀함을 나타낸다. 통계 분석에서의 유의수준인 95% 를 감안하여 해당 정밀도의 유의한 값을 만족한다.
9) 재현성
성매개 감염원인체의 지노믹 DNA를 사용하여 실험실, 시험자 사이의 재현성을 평가하였다. DNA 주형은 민감도 결과에 따라, 검출한계 농도인 10 copies를 포함하여 104, 103-102, 10 copies의 총 3단계로 실시하였다. 표 13 및 14는 실험실 간의 재현성을 평가한 결과이고, 표 15 및 16은 시험자 간의 재현성을 평가한 결과이다. 표 15 및 17는 여성의 질도말 조성 기반(swab matrix) 샘플을 이용하여 실시간 PCR을 실시한 결과이고, 표 16 및 18은 소변 조성 기반(urine matrix) 샘플을 이용하여 실시한 결과이다.
Swab matrix 실험실 간 재현성 실험 결과
표적 Copies no. 실험실1 평균 Ct값 실험실2 평균 Ct값 실험실3 평균 Ct값 실험실 간 표준편차 실험실 간
%CV
NG 104 25.6 24.3 24.3 0.634 2.563
103-2 31.2 30.2 30.3 0.470 1.538
10 36.3 35.0 35.2 0.553 1.559
CT 104 24.2 23.3 23.6 0.400 1.687
103-2 30.1 29.2 29.5 0.365 1.234
10 34.9 34.1 34.4 0.357 1.036
MH 104 27.8 27.0 27.3 0.336 1.227
103-2 34.2 33.3 33.4 0.382 1.136
10 39.1 38.4 38.2 0.377 0.979
TV 104 27.8 26.9 27.0 0.417 1.532
103-2 34.0 33.2 32.9 0.474 1.418
10 38.8 38.4 38.6 0.161 0.417
UU 104 27.2 26.2 26.4 0.423 1.592
103-2 33.1 32.4 32.3 0.360 1.105
10 38.0 37.1 37.7 0.379 1.007
MG 104 27.1 26.3 26.2 0.411 1.551
103-2 33.3 32.8 32.7 0.246 0.747
10 38.9 38.5 37.1 0.765 2.004
표 15 내지 18의 "%CV"는 coefficient of variation(변동계수)를 의미한다.
Urine matrix 실험실 간 재현성 실험 결과
표적 Copies no. 실험실1 평균 Ct값 실험실2 평균 Ct값 실험실3 평균 Ct값 실험실 간 표준편차 실험실 간
%CV
NG 104 26.0 25.3 25.0 0.416 1.635
103-2 32.2 31.6 31.2 0.386 1.220
10 37.4 36.0 36.1 0.616 1.689
CT 104 24.2 23.7 23.9 0.230 0.962
103-2 30.1 29.5 29.9 0.245 0.821
10 34.7 34.1 34.6 0.271 0.785
MH 104 26.6 26.1 26.3 0.183 0.695
103-2 32.5 31.9 32.1 0.264 0.820
10 37.7 37.2 37.6 0.188 0.502
TV 104 27.9 27.8 28.0 0.055 0.197
103-2 34.5 33.7 34.0 0.325 0.953
10 39.7 37.9 37.7 0.875 2.277
UU 104 27.1 26.5 26.7 0.261 0.974
103-2 33.6 32.7 32.6 0.460 1.396
10 38.1 37.5 37.5 0.273 0.725
MG 104 26.8 26.4 26.4 0.203 0.764
103-2 33.1 32.9 32.8 0.151 0.460
10 38.0 38.2 38.8 0.360 0.938
Swab matrix 시험자 간 재현성 실험 결과
표적 Copies no. 시험자1 평균 Ct값 시험자2 평균 Ct값 시험자 3 평균 Ct값 시험자 간 표준편차 시험자 간
%CV
NG 104 25.7 24.4 24.2 0.673 2.716
103-2 31.3 30.7 30.6 0.317 1.027
10 36.4 35.9 36.2 0.193 0.533
CT 104 24.4 23.8 23.6 0.322 1.347
103-2 30.3 30.0 29.9 0.206 0.687
10 35.5 34.7 34.8 0.327 0.935
MH 104 27.8 27.4 27.3 0.217 0.789
103-2 34.0 33.7 33.5 0.229 0.678
10 38.8 38.8 38.8 0.017 0.043
TV 104 27.8 27.2 27.0 0.364 1.332
103-2 33.9 33.4 33.3 0.290 0.864
10 38.9 39.1 38.6 0.218 0.560
UU 104 27.1 26.7 26.4 0.306 1.144
103-2 33.3 32.7 32.5 0.334 1.018
10 38.3 38.5 37.8 0.250 0.655
MG 104 26.9 26.8 26.3 0.296 1.110
103-2 33.5 33.4 32.9 0.254 0.762
10 38.6 38.9 38.3 0.245 0.635
Urine matrix 시험자 간 재현성 실험 결과
표적 Copies no. 시험자1 평균 Ct값 시험자2 평균 Ct값 시험자3 평균 Ct값 시험자 간 표준편차 시험자 간
%CV
NG 104 26.0 25.5 25.3 0.284 1.110
103-2 32.0 31.2 31.3 0.342 1.085
10 38.3 36.8 36.8 0.725 1.945
CT 104 24.4 24.0 24.0 0.165 0.685
103-2 30.3 29.9 30.0 0.147 0.491
10 35.7 35.1 35.0 0.342 0.969
MH 104 26.5 26.5 26.5 0.016 0.060
103-2 32.4 32.4 32.2 0.109 0.337
10 37.8 38.2 37.9 0.193 0.509
TV 104 28.2 27.9 27.9 0.134 0.479
103-2 34.4 34.1 34.1 0.140 0.409
10 39.4 38.7 39.0 0.289 0.742
UU 104 27.3 27.0 26.7 0.237 0.878
103-2 33.9 32.8 32.9 0.489 1.475
10 38.8 38.1 38.1 0.345 0.900
MG 104 26.9 26.8 26.5 0.157 0.586
103-2 33.2 33.0 32.9 0.123 0.372
10 38.0 38.2 38.8 0.360 0.938
9) 증폭장비별 호환성
성매개 감염원인체의 지노믹 DNA 104 copies(고농도), 103-2 copies(중농도) 및 10 copies(저농도)를 사용하여 증폭장비 별 호환성을 평가하였다. ABI 사의 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Instrument System(ABI7500) 및 Bio-Rad 사의 Real-Time PCR 장비(CFX96)의 2종 증폭장비를 이용하였다.
Matrix 표적 농도 CFX96 ABI7500
1반복 2반복 3반복 1반복 2반복 3반복
Swab NG 고농도 23.4 23.7 22.9 24.7 24.4 24.4
중농도 29.3 29.5 28.6 30.7 30.5 30.6
저농도 33.6 33.2 33.1 35.7 34.2 35.1
CT 고농도 22.2 22.5 22.4 23.9 24.0 23.5
중농도 28.0 27.4 28.4 29.9 29.6 29.9
저농도 32.1 32.2 32.1 34.6 34.3 33.6
MH 고농도 26.8 26.8 26.5 28.2 28.2 28.6
중농도 33.1 33.2 33.5 35.0 35.0 35.2
저농도 36.6 38.7 37.6 39.6 38.9 40.2
TV 고농도 26.3 26.3 26.5 27.4 27.0 27.2
중농도 32.2 32.1 31.9 33.1 33.1 33.1
저농도 39.0 37.0 37.1 37.3 38.8 37.4
UU 고농도 25.2 25.3 25.2 27.0 26.8 26.9
중농도 31.3 31.1 31.0 33.3 32.7 33.0
저농도 34.8 35.1 35.5 37.3 38.1 38.8
MG 고농도 25.2 25.3 25.6 27.1 26.9 27.0
중농도 31.4 31.2 31.3 33.3 32.7 33.0
저농도 35.8 39.0 36.0 37.4 37.7 37.8
Urine NG 고농도 23.4 24.3 24.0 25.5 25.1 25.6
중농도 29.2 29.4 30.1 31.7 31.1 31.3
저농도 34.8 33.9 34.0 35.8 36.9 35.3
CT 고농도 21.5 22.3 22.2 24.2 24.3 24.4
중농도 27.2 28.3 28.3 30.2 30.0 30.4
저농도 32.2 32.4 32.7 34.3 34.5 34.0
MH 고농도 25.1 25.8 26.0 27.4 27.4 27.5
중농도 31.7 32.2 32.3 33.7 34.1 34.0
저농도 34.9 37.6 36.1 37.8 38.1 38.5
TV 고농도 27.5 27.6 27.2 28.5 28.4 28.5
중농도 32.8 33.6 33.4 35.0 34.1 34.8
저농도 38.2 37.3 38.6 37.0 37.4 37.1
UU 고농도 25.4 25.6 25.9 26.4 26.5 26.5
중농도 31.2 31.3 31.2 31.6 32.6 32.4
저농도 36.1 36.7 35.1 36.3 36.3 36.6
MG 고농도 25.3 25.5 25.3 26.9 26.9 27.0
중농도 31.2 30.9 30.9 32.5 33.0 33.1
저농도 36.5 35.9 35.6 37.8 36.9 38.2
10) 임상적 유효성
성매개 감염원인체 검출용 키트의 임상적 유효성을 평가하기 위하여, 검체수집기관인 이원의료재단에서 성매개 감염원인체 진단을 목적으로 사용하고 남은 소변, 및 질도말 검체 1,111개를 이용하여 삼성서울병원에서 임상시험을 실시하였다. 각 목적 원인체에 대한 검출용 키트의 민감도 및 특이도를 확인하였다.
가) 클라미디아 트라코마티스 (CT)
① 전체 검체
- 확진 결과
양성 음성 전체
본 발명의 검출용 키트 결과 양성 230 0 230
음성 0 213 213
전체 230 213 443
전체 검체를 대상으로 클라미디아 트라코마티스를 진단한 결과, 진양성(True Positive) 230개, 진음성(True Negative) 213개, 위양성(False Positive) 및 위음성(False Negative) 0개로, 임상적 민감도 100%(95% CI, 98.0-100%) 및 임상적 특이도 100%(95% CI, 97.8-100%)를 나타냈다.
민감도 100%(95% CI, 98.0-100%): 95% 유의수준으로 통계검정을 진행하여 민감도가 100% 임을 나타낸다. 이때 신뢰구간은 98% ~ 100%이다. CI 는 임상시험에서 진행한 샘플을 모집단으로 추정하여 모든 데이터의 평균값(참값)이 있을 가능성이 95% 임을 나타내며, 이때 신뢰구간은 98% ~ 100% 임으로 민감도 100%는 유의한 값을 만족하였다. 즉, 신뢰구간 값 내에 검정통계량 값이 위치한다면 목표한 유의수준(95%)의 확률로 '참'을 나타낸다고 볼 수 있다.
② 질도말 검체
- 확진 결과
양성 음성 전체
본 발명의 검출용 키트 결과 양성 117 0 117
음성 0 104 104
전체 117 104 221
전체 검체 중 질도말 검체를 대상으로 클라미디아 트라코마티스를 진단한 결과, 진양성 117개, 진음성 104개, 위양성 및 위음성 0개로, 임상적 민감도 100%(95% CI, 96.0-100%) 및 임상적 특이도 100%(95% CI, 95.6-100%)를 나타냈다.
③ 소변 검체
- 확진 결과
양성 음성 전체
본 발명의 검출용 키트 결과 양성 113 0 113
음성 0 109 109
전체 113 109 222
전체 검체 중 소변 검체를 대상으로 클라미디아 트라코마티스를 진단한 결과, 진양성 113개, 진음성 109개, 위양성 및 위음성 0개로, 임상적 민감도 100%(95% CI, 95.9-100%) 및 임상적 특이도 100%(95% CI, 95.8-100%)를 나타냈다.
나) 임질구균 (NG)
① 전체 검체
- 확진 결과
양성 음성 전체
본 발명의 검출용 키트 결과 양성 164 1 165
음성 0 212 212
전체 164 213 377
전체 검체를 대상으로 임질구균을 진단한 결과, 진양성 164개, 진음성 212개, 위양성 1개 및 위음성 0개로, 임상적 민감도 100%(95% CI, 97.1-100%) 및 임상적 특이도 99.5%(95% CI, 97.0-99.9%)를 나타냈다.
② 질도말 검체
- 확진 결과
양성 음성 전체
본 발명의 검출용 키트 결과 양성 77 1 78
음성 0 103 103
전체 77 104 181
전체 검체 중 질도말 검체를 대상으로 임질구균을 진단한 결과, 진양성 77개, 진음성 103개, 위양성 1개 및 위음성 0개로, 임상적 민감도 100%(95% CI, 94.1-100%) 및 임상적 특이도 99.0%(95% CI, 94.0-99.9%)를 나타냈다.
③ 소변 검체
- 확진 결과
양성 음성 전체
본 발명의 검출용 키트 결과 양성 87 0 87
음성 0 109 109
전체 87 109 196
전체 검체 중 소변 검체를 대상으로 임질구균을 진단한 결과, 진양성 87개, 진음성 109개, 위양성 및 위음성 0개로, 임상적 민감도 100%(95% CI, 94.7-100%) 및 임상적 특이도 100%(95% CI, 95.8-100%)를 나타냈다.
다) 질편모충 (TV)
① 전체 검체
- 확진 결과
양성 음성 전체
본 발명의 검출용 키트 결과 양성 153 0 153
음성 3 213 216
전체 156 213 369
전체 검체를 대상으로 질편모충을 진단한 결과, 진양성 153개, 진음성 213개, 위양성 0개 및 위음성 3개로, 임상적 민감도 98.1%(95% CI, 94.0-99.5%) 및 임상적 특이도 100%(95% CI, 97.8-100%)를 나타냈다.
② 질도말 검체
- 확진 결과
양성 음성 전체
본 발명의 검출용 키트 결과 양성 78 0 78
음성 1 104 105
전체 79 104 183
전체 검체 중 질도말 검체를 대상으로 질편모충을 진단한 결과, 진양성 78개, 진음성 104개, 위양성 0개 및 위음성 1개로, 임상적 민감도 98.7%(95% CI, 92.2-99.9%) 및 임상적 특이도 100%(95% CI, 95.6-100%)를 나타냈다.
③ 소변 검체
- 확진 결과
양성 음성 전체
본 발명의 검출용 키트 결과 양성 75 0 75
음성 2 109 111
전체 77 109 186
전체 검체 중 소변 검체를 대상으로 질편모충을 진단한 결과, 진양성 75개, 진음성 109개, 위양성 0개 및 위음성 2개로, 임상적 민감도 97.4%(95% CI, 90.0-99.5%) 및 임상적 특이도 100%(95% CI, 95.8-100%)를 나타냈다.
라) 마이코플라스마 제니탈리움 (MG)
① 전체 검체
- 확진 결과
양성 음성 전체
본 발명의 검출용 키트 결과 양성 159 1 160
음성 4 212 216
전체 163 213 376
전체 검체를 대상으로 마이코플라스마 제니탈리움을 진단한 결과, 진양성 159개, 진음성 212개, 위양성 1개 및 위음성 4개로, 임상적 민감도 97.5%(95% CI, 93.4-99.2%) 및 임상적 특이도 99.5%(95% CI, 97.0-99.9%)를 나타냈다.
② 질도말 검체
- 확진 결과
양성 음성 전체
본 발명의 검출용 키트 결과 양성 79 1 80
음성 3 103 106
전체 82 104 186
전체 검체 중 질도말 검체를 대상으로 마이코플라스마 제니탈리움을 진단한 결과, 진양성 79개, 진음성 103개, 위양성 1개 및 위음성 3개로, 임상적 민감도 96.3%(95% CI, 88.9-99.1%) 및 임상적 특이도 99.0%(95% CI, 94.0-99.9%)를 나타냈다.
③ 소변 검체
- 확진 결과
양성 음성 전체
본 발명의 검출용 키트 결과 양성 80 0 80
음성 1 109 110
전체 81 109 190
전체 검체 중 소변 검체를 대상으로 마이코플라스마 제니탈리움을 진단한 결과, 진양성 80개, 진음성 109개, 위양성 0개 및 위음성 1개로, 임상적 민감도 98.8%(95% CI, 92.4-99.9%) 및 임상적 특이도 100%(95% CI, 95.8-100%)를 나타냈다.
마) 마이코플라스마 호미니스 (MH)
① 전체 검체
- 확진 결과
양성 음성 전체
본 발명의 검출용 키트 결과 양성 226 1 227
음성 8 212 220
전체 34 213 447
전체 검체를 대상으로 마이코플라스마 호미니스를 진단한 결과, 진양성 26개, 진음성 212개, 위양성 1개 및 위음성 8개로, 임상적 민감도 96.6%(95% CI, 93.1-98.4%) 및 임상적 특이도 99.5%(95% CI, 97.0-99.9%)를 나타냈다.
② 질도말 검체
- 확진 결과
양성 음성 전체
본 발명의 검출용 키트 결과 양성 125 1 126
음성 0 103 103
전체 125 104 229
전체 검체 중 질도말 검체를 대상으로 마이코플라스마 호미니스를 진단한 결과, 진양성 125개, 진음성 103개, 위양성 1개 및 위음성 0개로, 임상적 민감도 100%(95% CI, 96.3-100%) 및 임상적 특이도 99.0%(95% CI, 94.0-99.9%)를 나타냈다.
③ 소변 검체
- 확진 결과
양성 음성 전체
본 발명의 검출용 키트 결과 양성 101 0 101
음성 8 109 117
전체 109 109 218
전체 검체 중 소변 검체를 대상으로 마이코플라스마 호미니스를 진단한 결과, 진양성 101개, 진음성 109개, 위양성 0개 및 위음성 8개로, 임상적 민감도 92.7%(95% CI, 85.6-96.5%) 및 임상적 특이도 100%(95% CI, 95.8-100%)를 나타냈다.
바) 우레아플라스마 우레아리티쿰 (UU)
① 전체 검체
- 확진 결과
양성 음성 전체
본 발명의 검출용 키트 결과 양성 227 1 228
음성 3 212 215
전체 230 213 443
전체 검체를 대상으로 우레아플라스마 우레아리티쿰을 진단한 결과, 진양성 227개, 진음성 212개, 위양성 1개 및 위음성 3개로, 임상적 민감도 98.7%(95% CI, 95.9-99.7%) 및 임상적 특이도 99.5%(95% CI, 97.0-99.9%)를 나타냈다.
② 질도말 검체
- 확진 결과
양성 음성 전체
본 발명의 검출용 키트 결과 양성 111 1 112
음성 2 103 105
전체 113 104 217
전체 검체 중 질도말 검체를 대상으로 우레아플라스마 우레아리티쿰을 진단한 결과, 진양성 111개, 진음성 103개, 위양성 1개 및 위음성 2개로, 임상적 민감도 98.2%(95% CI, 93.1-99.7%) 및 임상적 특이도 99.0%(95% CI, 94.0-99.9%)를 나타냈다.
③ 소변 검체
- 확진 결과
양성 음성 전체
본 발명의 검출용 키트 결과 양성 116 0 116
음성 1 109 110
전체 117 109 226
전체 검체 중 소변 검체를 대상으로 우레아플라스마 우레아리티쿰을 진단한 결과, 진양성 116개, 진음성 109개, 위양성 0개 및 위음성 1개로, 임상적 민감도 99.1%(95% CI, 94.6-99.9%) 및 임상적 특이도 100%(95% CI, 95.8-100%)를 나타냈다.
<110> eone lifescience institute <120> Kits for Detecting Pathogens of Sexually Transmitted Infections <130> PN180066 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-1 F <400> 1 ggaccagcaa ataatccttg gg 22 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT-1 R <400> 2 taagcttttt ccgcatccaa acc 23 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT probe <400> 3 atcaacacct gtcgcagcca aaatgaca 28 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG F <400> 4 ctgctacttt cacgctggaa ag 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG R <400> 5 tctgccgagc aagaacaaaa ag 22 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG probe <400> 6 atcatgcccc tcattggcgt gtttcg 26 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-Cry F <400> 7 cgcacaaaaa cgtgttggcg tt 22 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-Cry R <400> 8 gttagcgatt gatttggaga tac 23 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-Cry probe <400> 9 ttctttttcc cacatcggga cagggaaat 29 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MH-2 F <400> 10 ttatcaggcg cttcatgtac tac 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MH-2 R <400> 11 ctttggtctg ctgtatatga gtg 23 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MH-2 probe <400> 12 caatacgttg gcaataggag ctaaacag 28 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S_301_PCRC F <400> 13 cgaatacacc agctacacct aa 22 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S_301_PCRC R <400> 14 tacaatggtg gtccttatga act 23 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S_301_PCRC probe <400> 15 gtgaaatggg tgcataagga tgttgt 26 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TV F <400> 16 ccgatcttca gctcgagcgc 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TV R <400> 17 gcggaaaagc tgaccgaact g 21 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TV probe <400> 18 agccacaggc ggcaagtacg tccca 25 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UU F <400> 19 agtaatcgct gccatgctat ac 22 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UU/P R <400> 20 gaccattaat tattggtgta ggtg 24 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UU probe <400> 21 caattaacat tgtctttcca gcaccaacag 30 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MG F <400> 22 atggcaatat atgacaccat gtca 24 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MG R <400> 23 tatcttttaa aagttctgct gcaag 25 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MG probe <400> 24 gttgtgcagc aggtctatca ccatctat 28

Claims (13)

  1. (i) 서열번호 1 및 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 검출용 세트;
    (ii) 서열번호 4 및 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 임질구균(Neisseria gonorrhoeae) 검출용 세트;
    (iii) 서열번호 7 및 8의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 임질구균 검출용 세트;
    (iv) 서열번호 10 및 11의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis) 검출용 세트;
    (v) 서열번호 16 및 17의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 질편모충(Trichomonas vaginalis) 검출용 세트;
    (vi) 서열번호 19 및 20의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum) 검출용 세트; 및
    (vii) 서열번호 22 및 23의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium) 검출용 세트; 또는
    (viii) 이들의 조합을 포함하는 성매개 감염원인체 동시 검출용 키트.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 (i) 내지 (vii)의 검출용 세트는 하기의 프로브를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트:
    상기 (i) 클라미디아 트라코마티스 검출용 세트는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브;
    상기 (ii) 임질구균 검출용 세트는 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브;
    상기 (iii) 임질구균 검출용 세트는 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브;
    상기 (iv) 마이코플라즈마 호미니스 검출용 세트는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브;
    상기 (v) 질편모충 검출용 세트는 서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브;
    상기 (vi) 우레아플라스마 우레아리티쿰 검출용 세트는 서열번호 21의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브; 또는
    상기 (vii) 마이코플라즈마 제니탈리움 검출용 세트는 서열번호 24의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 서열번호 3, 6, 9, 12, 18, 21, 및 24의 뉴클레오타이드 서열의 5'-말단은 FAM, TET, HEX, JOE, ROX, TMR, Cy5 및 Cal Red 610로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질(fluorophore)로 표지되고, 3'-말단은 BHQ-1, BHQ-2 또는 BHQ-3의 퀀처(quencher)로 변형된 것을 특징으로 하는 키트.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 상기 (i) 내지 (vii)의 검출용 세트 중 2종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 키트.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 유전자 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 키트.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 유전자 증폭은 실시간 PCR에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 키트.
  8. 다음의 단계를 포함하는 성매개 감염원인체의 검출 방법:
    (a) 객체로부터 분리된 생물학적 시료의 DNA를 준비하는 단계;
    (b) (i) 서열번호 1 및 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 클라미디아 트라코마티스 검출용 세트;
    (ii) 서열번호 4 및 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 임질구균 검출용 세트;
    (iii) 서열번호 7 및 8의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 임질구균 검출용 세트;
    (iv) 서열번호 10 및 11의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 마이코플라스마 호미니스 검출용 세트;
    (v) 서열번호 16 및 17의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 질편모충 검출용 세트;
    (vi) 서열번호 19 및 20의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 21의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 우레아플라스마 우레아리티쿰 검출용 세트; 및
    (vii) 서열번호 22 및 23의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 24의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 마이코플라스마 제니탈리움 검출용 세트; 또는
    (viii) 이들의 조합을 이용하여 상기 생물학적 시료 내 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 증폭 결과를 확인하는 단계.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 시료는 소변, 혈액, 타액, 요도분비물, 물집(vesicle) 및 물집 내 체액, 궤양(ulcer), 사마귀(wart), 점액, 또는 조직인 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 증폭은 실시간 PCR에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 실시간 PCR은 TaqMan 프로브 방법으로 실시되는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  13. 제 8 항에 있어서, 상기 프로브는 표지가 결합되어 있고, 상기 단계 (c)의 확인은 상기 프로브로부터 발생되는 시그널을 검출하여 실시하는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
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